CN104628434A - 一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，包括：将枯草芽孢杆菌制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；将黑果枸杞健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施枯草芽孢杆菌高密度菌悬液，经发酵后得到抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。本发明中，产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌是对黑果枸杞起抗病促生作用的植物益生菌，将其加入堆肥中，显著加强对黑果枸杞病害真菌的生物防治作用，并提高黑果枸杞产量。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治肥的制备领域，具体涉及一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr)属于茄科枸杞属，为多棘刺灌木，多分枝，枝条坚硬，常呈之字形弯曲，白色，分布于中国西北和欧洲中亚。黑果枸杞味甘、性平，富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等多种营养成分，特别是含有丰富的黑果色素——天然原花青素(OPC)，其OPC含量超过蓝莓(黑果枸杞含OPC 3690mg/100g；蓝莓含OPC330～3380mg/100g)，是迄今为止发现的OPC含量最高的天然野生植物。原花青素OPC是最有效的天然水溶性自由基清除剂，其功效是VC的20倍、VE的50倍，属天然的水溶性花色甙黄酮类。黑果枸杞被收载于《四部医典》、《晶珠本草》等藏药经典著作中，被誉为“软黄金”。
危害黑果枸杞主要病害有黑果病、根腐病等病理性真菌。植物病理真菌主要存在于土壤中，在植物生长中感染植物，引起植物病害、造成生产损失。因此，要从生物防治的角度消除植物真菌病害，杀灭或抑制土壤中的病理真菌至关重要，而使用具有生物防治功效的生物肥是实现这一目的的有效途径。在各种生物肥中，长久以来我国应用的都是无芽孢菌类。但是无芽孢菌抗逆性低，对于干燥高温的抵抗能力差，所以当制成液体或者吸附剂时稳定性不高。生物肥发展的新趋势应是大力发展抗逆性高、能够长期稳定生存的芽孢杆菌。特别是芽孢杆菌能够产生多种抗真菌物质，对植物病原菌有显著抑制作用，并且对人畜无害，也不会污染环境，将在防治植物真菌病害中起重要作用。
芽孢杆菌形态上呈直或者近直的杆状，好氧或者兼性厌氧，革兰氏阳性，在特定环境条件下能产生抗逆性内生孢子。芽孢杆菌在植物中广泛定殖，被认为是公认的食品级安全微生物(generally regarded as safety,GRAS)。枯草芽抱杆菌是一种典型的芽孢杆菌，产生抗菌蛋白、多肽类物质、脂类物质及beta葡聚糖酶等抗菌物质，特别是beta葡聚糖酶等水解酶类与其抗植物病理真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的组成是葡聚糖。
发明内容
本发明提供了一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，通过将产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)融入黑果枸杞天然菌群中，制成能够通过生物防治途径有效抑制杀灭黑果枸杞病理真菌的生物肥(即抗黑果枸杞病理真菌的生物肥)。
一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的方法，包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；
2)将黑果枸杞健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
本发明中，将黑果枸杞健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康黑果枸杞植株本身天然菌群，此菌群与黑果枸杞植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。进一步地，将能够产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)加入堆肥中，显著加强对黑果枸杞病害真菌的生物防治作用。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对黑果枸杞植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，故能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是黑果枸杞益生菌，对黑果枸杞病理真菌有显著生物防治作用。
步骤1)中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；保藏日期为2007年，菌种保持编号为10339。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)可以向中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。
将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
进一步优选，将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
进一步优选，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
液体培养基在121℃灭菌20min。
步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。
堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。
步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。所述的发酵采用自然状态下发酵。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明中，将黑果枸杞健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康黑果枸杞植株本身天然菌群，此菌群与黑果枸杞植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。
枯草芽孢杆菌(CICC 10339)产beta葡聚糖酶，强力破坏病理真菌细胞壁，对病理真菌有显著抑制杀灭作用。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中富含的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是黑果枸杞益生菌，对黑果枸杞病理真菌有显著生物防治作用。
堆肥过程在自然状态下进行，依靠微生态稳定的黑果枸杞植株天然菌群进行发酵，而枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对黑果枸杞植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，因此，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.13×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为2％，37℃振荡培养24h，菌液密度为1.75×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将黑果枸杞健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液2L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥，即抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有beta葡聚糖酶活力，对黑果枸杞病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表1。
黑果病真菌(Colletotrichum)CICC 2677、根腐病真菌(Fusarium)CICC2682购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
beta葡聚糖酶活力测定：采用还原糖测定法，beta葡聚糖酶能够将beta葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色深浅与还原糖生成量成正比，而还原糖生成量又与反应液beta葡聚酶糖活力成正比，从而利用比色测定反应液的吸光值计算还原糖生成量，得到beta葡聚糖酶活力。beta葡聚酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解beta葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，定义为一个酶活单位(IU)。
平板抑制抑菌宽带：采用平板喷雾法，待测菌株点接在NA平板，每平板2株，各3个重复，28℃培养24h，把蘸有氯仿的滤纸片放进倒置的培养皿底部熏蒸20min，重复一次，杀死待测菌；将病原真菌配成108菌悬液，用无菌喉头喷雾器迅速将其喷在接有待测菌的平板上(0.1ml/皿)，28℃继续培养48-60h后，记录形成抑菌圈大小。
平板拮抗：将NA培养基倒入平板，凝固后在培养基上成三角放置牛津杯，向牛津杯内加入发酵液100μL，28℃温箱培养，待病原真菌生长后记录抑菌圈大小。
表1
注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。
实施例2
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.65×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，菌液密度为2.82×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将黑果枸杞健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液3L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥，即抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有beta葡聚糖酶活力，对黑果枸杞病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表2。
表2
注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。
实施例3
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.44×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，菌液密度为2.56×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将黑果枸杞健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液3L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥，即抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
3)步骤2)中制备得到的生物肥对黑果枸杞具有明显促生益生作用，提高单株产量10.3％(p<0.05)，具体见下表3和表4。黑果枸杞植株为野生型，采自柴达木地区。
表3
表4
Claims (9)
1.一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；
2)将黑果枸杞健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到抗黑果枸杞病理真菌的生物肥。
2.根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
3.根据权利要求2所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
4.根据权利要求2或3所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
5.根据权利要求4所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
6.根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。
7.根据权利要求6所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。
8.根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。
9.根据权利要求1所述的抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的发酵采用自然状态下发酵。
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