CN104628428B - 一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法 - Google Patents

一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，包括：将枯草芽孢杆菌制成109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；将沙棘健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施枯草芽孢杆菌菌悬液，经堆肥固态发酵后得到能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥。本发明所制备生物肥中，枯草芽孢杆菌即是沙棘益生菌，对沙棘病理真菌有显著生物防治作用。而其中的菌群来源于健康沙棘植株本身天然菌群，此菌群与沙棘植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。

Description

一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法
技术领域
本发明涉及生物防治肥的制备领域，具体涉及一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法。
背景技术
沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名醋柳、酸刺，胡颓子科沙棘属落叶灌木或乔木，是集生态效益、经济效益和社会效益于一体的优良树种。沙棘果实、叶、皮中含有丰富生物活性物质和多种维生素、氨基酸、脂肪酸、微量元素等营养成分，具有很高营养保健和药用价值。沙棘枝繁叶茂，根系发达，有固氮根瘤，可以活化土壤中的微生物，对干旱、瘠薄、高温、低温、盐碱有很强适应性，在改善土壤肥力，防风固沙，防止水土流失方面成效显著。
沙棘病虫害种类较多，其病害主要有沙棘腐朽病、沙棘烂皮病、沙棘干枯病、沙棘叶斑病、沙棘缩叶病、沙棘猝倒病、菟丝子等；沙棘虫害有沙棘象、沙棘实蝇、沙柳木蠹蛾、柳干木蠹蛾、红缘天牛、栎黄枯叶蛾、黄褐天幕毛虫、沙棘巢蛾、舞毒蛾、沙枣尺蛾、兰目天蛾、沙棘木虱、华北蝼蛄、黑绒鳃金龟等。沙棘病虫害如不及时防治，对沙棘园及人工林造成大量减产，有的危险性病害如国外传来的沙棘干枯病，目前已在国内沙棘产区大量蔓延，造成人工林成片死亡。在虫害方面，沙棘象、红缘天牛、沙棘蝇等种实害虫和蛀干害虫危害也很严重，1990年铜川发生大面积沙棘象危害，种实被害率达80％以上，当年沙棘种子颗粒无收，部分沙棘饮料加工厂被迫停产。蛀干害虫红缘天牛在陕北长城沿线风沙区定边至神木一线危害猖獗，沙棘被害率达60％以上，平均每株有虫5头以上，常造成大面积风折，给以沙棘为主的生态林建设带来巨大损失。
沙棘干缩病也称干枯病或者枯萎病，是沙棘栽培区都可能出现的一种毁灭性病害，Fusarium moniliforme是其病原之一。沙棘干缩病病原菌潜伏时间长，侵染于花期，7月中旬为零星发病阶段，8月中下旬进入发病盛期。大多数病斑分布在树干、大枝基部。该病发生突然，传染性强，一旦发病，短时间内同一园区将有15％-80％的树发病，造成病株提前落叶，有效寿命缩短。发病一般当年不严重，第2年表现严重，第3-4年树干枯萎、干缩死亡。
植物病理真菌主要存在于土壤中，在植物生长中感染植物，引起植物病害、造成生产损失。因此，要从生物防治的角度消除植物真菌病害，除了杀灭植株上的病理真菌，杀灭或抑制土壤中的病理真菌也至关重要，而使用具有生物防治功效的生物肥是实现这一目的的有效途径。在各种生物肥中，长久以来我国应用的都是无芽孢菌类。但是无芽孢菌抗逆性低，对于干燥高温的抵抗能力差，所以当制成液体或者吸附剂时稳定性不高。生物肥发展的新趋势应是大力发展抗逆性高、能够长期稳定生存的芽孢杆菌。特别是芽孢杆菌能够产生多种抗真菌物质，对植物病原菌有显著抑制作用，并且对人畜无害，也不会污染环境，将在防治植物真菌病害中起重要作用。
芽孢杆菌形态上呈直或者近直的杆状，好氧或者兼性厌氧，革兰氏阳性，在特定环境条件下能产生抗逆性内生孢子。芽孢杆菌在植物中广泛定殖，被认为是公认的食品级安全微生物(generally regarded as safety,GRAS)。枯草芽抱杆菌是一种典型的芽孢杆菌，产生抗菌蛋白、多肽类物质、脂类物质及beta葡聚糖酶等抗菌物质，特别是beta葡聚糖酶等水解酶类与其抗植物病理真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的组成是葡聚糖。
发明内容
本发明提供了一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，通过将产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)融入沙棘天然菌群中，制成能够通过生物防治途径有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥。
一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；
2)将沙棘健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥。
本发明中，将沙棘健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康沙棘植株本身天然菌群，此菌群与沙棘植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。进一步地，将能够产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)加入堆肥中，显著加强对沙棘病害真菌的生物防治作用。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对沙棘植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，故能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是沙棘益生菌，对沙棘病理真菌有显著生物防治作用。
步骤1)中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；保藏日期为2007年，菌种保持编号为10339。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)可以向中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。
将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
进一步优选，将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
调节pH＝6.5～7.5。
进一步优选，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
调节pH＝7.0。
液体培养基在121℃灭菌20min。
步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。
堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。
步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。所述的发酵采用自然状态下发酵。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明中，将沙棘健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康沙棘植株本身天然菌群，此菌群与沙棘植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。
枯草芽孢杆菌(CICC 10339)产beta葡聚糖酶，强力破坏病理真菌细胞壁，对病理真菌有显著抑制杀灭作用。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中富含的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是沙棘益生菌，对沙棘病理真菌有显著生物防治作用。
堆肥过程在自然状态下进行，依靠微生态稳定的沙棘植株天然菌群进行发酵，而枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对沙棘植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，因此，枯草芽孢杆菌(CICC10339)能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.1×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为2％，37℃振荡培养24h，菌液密度为1.7×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将沙棘健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液2L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥，即能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥。
3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有Beta葡聚糖酶活力，对沙棘病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表1。
沙棘干缩病病原菌Fusarium moniliforme购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种编号为2490。
Beta葡聚糖酶活力测定：采用还原糖测定法，Beta葡聚糖酶能够将Beta葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色深浅与还原糖生成量成正比，而还原糖生成量又与反应液Beta葡聚酶活力成正比，从而利用比色测定反应液的吸光值计算还原糖生成量，得到Beta葡聚糖酶活力。Beta葡聚酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解Beta葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，定义为一个酶活单位(IU)。
平板抑制抑菌宽带：采用平板喷雾法，待测菌株点接在NA平板，每平板2株，各3个重复，28℃培养24h，把蘸有氯仿的滤纸片放进倒置的培养皿底部熏蒸20min，重复一次，杀死待测菌；将病原真菌配成108菌悬液，用无菌喉头喷雾器迅速将其喷在接有待测菌的平板上(0.1ml/皿)，28℃继续培养48-60h后，记录形成抑菌圈大小。
平板拮抗：将NA培养基倒入平板，凝固后在培养基上成三角放置牛津杯，向牛津杯内加入发酵液100μL，28℃温箱培养，待病原真菌生长后记录抑菌圈大小。
表1
注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。
实施例2
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.8×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，菌液密度为2.8×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将沙棘健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液3L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥。
3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有Beta葡聚糖酶活力，对沙棘病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表2。
表2
注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。
实施例3
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.5×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，菌液密度为2.4×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将沙棘健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液3L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥。
3)步骤2)中制备得到的生物肥对沙棘具有明显促生益生作用，提高单株沙棘果产量18.4％(p<0.05)，具体见下表3和表4。沙棘植株为采自柴达木地区的野生中亚沙棘。
表3
表4

Claims (7)

1.一种制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；
将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；
所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
调节pH＝6.5～7.5；
2)将沙棘健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥。
2.根据权利要求1所述的制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，其特征在于，步骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
3.根据权利要求1所述的制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，其特征在于，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
调节pH＝7.0。
4.根据权利要求1所述的制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。
5.根据权利要求4所述的制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。
6.根据权利要求1所述的制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。
7.根据权利要求1所述的制备能有效抑制杀灭沙棘病理真菌的生物肥的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的发酵采用自然状态下发酵。
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