CN109156477A - 枯草芽孢杆菌bab-1在防治番茄叶霉病上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物防治领域，具体公开了枯草芽孢杆菌BAB‑1在防治番茄叶霉病上的应用，以及含有枯草芽孢杆菌BAB‑1的微生物菌剂在防治番茄叶霉病上的应用。本发明枯草芽孢杆菌BAB‑1对番茄叶霉病的药效高，平均防效在89.65％以上，为番茄叶霉病的防治提供了新的有效途径；同时利用本发明方法防治番茄叶霉病专化性强，且不易产生抗药性；此外，本发明涉及的微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题。

Description

枯草芽孢杆菌BAB-1在防治番茄叶霉病上的应用
技术领域
本发明属于生物防治领域，具体涉及枯草芽孢杆菌BAB-1在防治番茄叶霉病上的应用。
背景技术
番茄叶霉病是由褐孢霉属褐孢霉(Fulvia fulva)引起的真菌性病害，该菌主要危害叶片，严重时也危害茎、花和果实。该病害为多循环病害，流行性强，一旦病害发生，蔓延极为迅速，严重影响番茄产量和质量。
番茄叶霉病在生产上以化学防治为主，目前常用的防治番茄叶霉病的化学农药主要有甲基硫菌灵、嘧菌酯、甲基托布津、氟硅唑或克菌丹等。但是长期大量使用化学农药，病原菌容易产生抗药性，致使防治效果降低，同时还会造成农产品和环境污染、以及引起新病害或次生病害大发生等问题。生物防治由于具有专化性强、药效持久性好、不易产生抗药性、不会造成环境污染以及成本低等优点，日益受到青睐。目前防治番茄叶霉病的微生物主要有：芽孢杆菌(Bacillus sp，CN105838656A)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，CN1071642851A和CN102433282A)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens，CN105483054A)、链霉菌(Strepomyces spp，CN106434499A和CN104357369A)、黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii，CN102911970A)、卡特拉链霉菌(Streptomyces katrae，CN102433281A)、淡紫灰链霉菌(Strepomyces lavendulae，CN101481669A)、杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis，CN101955894A)等，但是商品化的微生物制剂并不多。另外，番茄叶霉病的病原菌生理小种分化频繁，目前已知番茄叶霉菌至少有13个生理小种。研究表明由于番茄抗叶霉病品种的推广，导致当地番茄叶霉菌的生理小种每1～2年就会发生重大变化，番茄叶霉病抗病品种的抗性极易丧失，根据生物多样性和共同进化作用原理，需要不断筛选新的生防微生物，以应对番茄叶霉菌的的生物多样性和生理小种的不断进化。
已知枯草芽孢杆菌菌株BAB-1可用于防治棉花立枯病菌、小麦纹枯病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、玉米穗腐病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、玉米黄斑病菌和小麦全蚀病菌等(CN101148650A)。还可用于防治瓜类白粉病(CN106942276A)，但是没有发现将BAB-1用于防治番茄叶霉病的报道。
发明内容
本发明目的在于提供枯草芽孢杆菌菌株BAB-1在防治番茄叶霉病上的用途。
本发明另一目的在于提供含有BAB-1的微生物菌剂在防治番茄叶霉病上的用途。
本发明第三目的在于提供利用枯草芽孢杆菌菌株BAB-1防治番茄叶霉病的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BAB-1在防治番茄叶霉病上的应用。
所述的枯草芽孢杆菌(Baci11us subtilis)菌株BAB-1的保藏编号为CGMCCNo.2099(参见CN101148650A)。
上述应用中所述的番茄叶霉病的病原菌为褐孢霉属的褐孢霉(Fulvia fulva)(本文中称为：番茄叶霉菌)。
本发明还提供了含有枯草芽孢杆菌BAB-1的微生物菌剂在防治番茄叶霉病上的应用。
所述的微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌BAB-1菌体。
所述的微生物菌剂为液体制剂。
所述的微生物菌剂的制备方法，参见CN101148650A说明书。
上述应用中所述的番茄叶霉病的病原菌为褐孢霉属褐孢霉(Fulvia fulva)(本文中称为：番茄叶霉菌)。
本发明还提供了利用含有枯草芽孢杆菌BAB-1的微生物菌剂防治番茄叶霉病的方法，包括将含有枯草芽孢杆菌BAB-1的微生物菌剂用水稀释至活菌体数为107cfu/mL，于番茄叶霉病发病前进行叶面喷雾。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治番茄叶霉病提供了一种有效生物防治方法；(2)枯草芽孢杆菌BAB-1对番茄叶霉病的药效高，平均防效在89.65％以上；(3)利用枯草芽孢杆菌BAB-1及其菌剂防治番茄叶霉病专化性强，且不易产生抗药性；(4)本发明涉及的微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题。
具体实施方式
下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
实施例1 BAB-1微生物菌剂的制备
按照如下步骤进行：
(1)菌种活化：将保存于-80℃的枯草芽孢杆菌(Baci11us subtilis)菌株BAB-1(保藏编号为CGMCC No.2099)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL)上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比同LB平板培养基)上在32℃下培养20小时，得活化的菌株；
(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化好的菌株，在32℃、摇床转速180rpm的条件下进行振荡培养24h小时，得种子液；
(3)蔗糖豆饼培养基的制备：按照重量百分比将蔗糖3.0％，豆饼粉2％，NaCl0.1％，CaCO3 0.3％，KH2PO4 0.02％和MgSO4·7H2O 0.03％加入水中，搅拌混合均匀，即得蔗糖豆饼培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；
(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速190rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率(芽孢率(％)＝成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)×100)；芽孢率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养约48h，得枯草芽孢杆菌BAB-1的液体制剂。
实施例2 枯草芽孢杆菌BAB-1对番茄叶霉菌的拮抗作用试验
(一)试验时间和地点：2014年4月在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。
(二)试验方法：
(1)供试番茄叶霉菌来源：番茄叶霉菌FF-1菌株采自河北省保定市徐水县高林村镇白塔铺村番茄病叶，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化鉴定为褐孢霉(Fulvia fulva)，致病力测定表现为强致病力。
(2)平板对峙实验：
首先将番茄叶霉菌FF-1菌株划线接入PDA斜面培养基，25℃培养15d后置于4℃冰箱备用。取一管番茄叶霉菌FF-1加入7mL的无菌水，将斜面表面的孢子刮下，制成菌悬液(浓度为107个/mL)。将该菌悬液加入到70mL预冷至45℃～50℃左右的PDA培养基(琼脂含量略高于正常水平)中，充分混匀后倒成平板。静置2小时后再将实施例1步骤(1)中活化的枯草芽孢杆菌BAB-1菌株点接在平板上，每个平板点接3处，设空白对照(不点接BAB-1菌株的番茄叶霉菌生长情况)。25℃恒温培养72h，观察抑菌圈透明程度(+++表示完全透明；++表示半透明；+表示不透明)，十字交叉法测量抑菌圈直径。以抑菌圈透明度和直径表示BAB-1菌株对番茄叶霉菌的抑菌活性。
表1 BAB-1菌株对番茄叶霉菌孢子萌发的抑制作用试验结果
菌株名称 透明圈亮度 透明圈直径(mm)
BAB-1 +++ 25.0
CK + 0.0
结果(见表1)抑菌圈透明度为完全透明，抑菌圈直径为25.0mm。说明枯草芽孢杆菌BAB-菌株对番茄叶霉菌具有强烈的抑制作用，具有防治番茄叶霉病的生防潜力。
实施例3 BAB-1微生物菌剂对番茄叶霉病防效盆栽对比试验
(一)试验处理：
(1)微生物菌剂：实施例1制备的BAB-1液体制剂；用水稀释50倍。
(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)，用水稀释500倍。
(3)空白对照：清水
(二)试验方法：本试验在河北省农林科学院植物保护研究所人工气候室内进行。在日光温室培育番茄苗(番茄L-402，辽宁园艺种苗公司，辽宁省农业科学院园艺研究所生产)，待番茄生长出8片复叶，移至控温控湿人工气候室，选取大小一致的番茄苗，将实施例1制备的BAB-1液体制剂50倍水稀释液均匀喷洒在番茄苗上，25℃培养24小时。然后在番茄苗上均匀喷洒实施例2中制备的番茄叶霉菌孢子悬浮液(106个/mL)，保湿培养(光照14小时，黑暗10小时)，设化学药剂对照和空白对照。待空白对照叶片充分发病后，调查番茄叶霉病病情并计算病情指数和防效。调查方法、分级标准和防治效果计算方法参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则(二)第111部分杀菌剂防治番茄叶霉病(GB/T17980.111-2004)。
表2 BAB-1液体制剂对番茄叶霉病防效对比试验结果
处理 病情指数 防效(％)
BAB-1液体制剂 3.87bc 91.52
化学药剂 7.58b 83.37
空白对照 45.61a /
结果(见表2)经枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BAB-1液体制剂处理的番茄叶霉病的病情指数为3.87，显著低于空白对照的病情指数45.61，BAB-1液体制剂对番茄叶霉病的防效为91.52％，优于化学药剂嘧菌酯悬浮剂(250克/升)的防效(83.37％)。说明枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂对番茄叶霉病具有突出的防治效果。
实施例4 BAB-1微生物菌剂对番茄叶霉病防效田间对比试验
(一)试验处理：
(1)微生物菌剂：实施例1制备的BAB-1液体制剂，用水稀释50倍。
(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)，用水稀释500倍。
(3)空白对照：清水
(二)试验方法：2015年2月-6月在河北省定州市杨家庄乡辛兴村杨增跃种植的番茄棚开展。番茄品种为“保罗塔”。上一年度棚内番茄叶霉病发生较重。开始试验时整个棚内番茄叶部灰霉病尚未发生。试验设置每小区三行，四次重复，随机排列。采用背负式电动喷雾器接种实施例1所制备的枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂(用水进行稀释，含菌体107cfu/mL)；另设化学药剂对照和空白对照。待空白对照区番茄叶霉病发生较重时调查病情并计算病情指数和防效。调查方法、分级标准和防治效果计算方法参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则(二)第111部分杀菌剂防治番茄叶霉病(GB/T17980.111-2004)。
表3枯草芽孢杆菌BAB-1对番茄叶霉病防效的对比试验结果
处理 病情指数 防效(％)
BAB-1液体制剂 4.16c 84.76
化学药剂 11.29b 58.69
空白对照 27.32a /
结果(见表3)经枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂处理后番茄叶霉病的病情指数(4.16)显著低于化学药剂处理的病情指数(11.29)，极显著低于空白对照的病情指数(27.32)，对番茄叶霉病防治效果达到84.76％。说明枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂对番茄叶霉病具有很好的防治效果。
实施例5 BAB-1微生物菌剂对番茄叶霉病防效田间对比试验
(一)试验处理：
(1)微生物菌剂：实施例1制备的BAB-1液体制剂，用水稀释50倍。
(2)空白对照：清水
(二)试验方法：2016年3月-6月在河北省保定市徐水县高林村镇白塔铺村贾书义种植的两个番茄大棚进行。1号大棚种植番茄品种为“圆丽”，2号大棚种植番茄品种为“东圣华宝”。上一年度两个大棚内番茄叶霉病均发生严重。开始试验时整个棚内番茄叶霉病尚未发生。试验设置每小区三行，四次重复，随机排列。采用背负式电动喷雾器接种实施例1制备的枯草芽孢杆菌BAB-1菌剂(用水进行稀释，含菌体107cfu/mL)；设喷施等量清水处理为空白对照。待空白对照区番茄叶霉病发生较重时，调查病情并计算病情指数和防效。调查方法、分级标准和防治效果计算方法参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则(二)第111部分杀菌剂防治番茄叶霉病(GB/T17980.111-2004)。
结果(见表4)1号大棚中经枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂处理后番茄叶霉病的病情指数为7.34，空白对照为59.39，防病效果达87.64％；2号大棚中经枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂处理后番茄叶霉病的病情指数为3.49，空白对照为65.51，防病效果达94.67％。说明枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂对番茄叶霉病具有突出的防治效果。
表4枯草芽孢杆菌BAB-1对番茄叶霉病防效的对比试验结果

Claims (5)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BAB-1在防治番茄叶霉病上的应用；所述的枯草芽孢杆菌菌株BAB-1的保藏编号为CGMCC No.2099。
2.含有枯草芽孢杆菌BAB-1的微生物菌剂在防治番茄叶霉病上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌BAB-1菌体。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂。
5.利用含有枯草芽孢杆菌BAB-1的微生物菌剂防治番茄叶霉病的方法，其特征在于包括将含有枯草芽孢杆菌BAB-1的微生物菌剂用水稀释至活菌体数为107cfu/mL，于番茄叶霉病发病前进行叶面喷雾。
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