CN102732460B

CN102732460B - 吸水链霉菌Sh-43菌株及其发酵液生产方法和应用

Info

Publication number: CN102732460B
Application number: CN2012101940570A
Authority: CN
Inventors: 蒋冬花; 崔宇辉; 王媛媛; 林葱葱; 金梦婷
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2032-06-13
Also published as: CN102732460A

Abstract

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株拮抗水稻纹枯病菌的吸水链霉菌Sh-43菌株及其发酵液生产方法和应用。吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）Sh-43菌株，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2012172，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2012年5月18日。本发明吸水链霉菌Sh-43菌株具有拮抗效果显著、抗菌谱广、拮抗效果稳定、培养条件简单、且对水稻纹枯病有很好的防治效果，在植物病害生物防治领域将有广阔的应用前景。

Description

吸水链霉菌Sh-43菌株及其发酵液生产方法和应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株拮抗水稻纹枯病菌的吸水链霉菌Sh-43菌株及其发酵液生产方法和应用。

背景技术

水稻纹枯病俗称“花脚病”，为我国水稻三大病害之一。尤以密植矮秆杂交稻的高产田发病最为普遍而严重，它往往导致叶片枯死，结实率降低，干粒重减轻，一般发病田块能导致减产15 %~20 %，严重时可达60 %~70 %，甚至绝收。该病在早、中、晚稻上均有发生，危害性极大，在世界各稻作区普遍发生且近年来有逐年加重的趋势。

放线菌因菌落呈放线状而的得名，介于细菌和真菌之间，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。从Cohn（1872）发现放线菌至今，己经报道了69个属1687个种。到目前为止从放线菌发现的具有生物活性的物质大约有12000种，约占整个天然生物活性物质的50 %左右，其中仅仅从链霉菌属（Streptomyces）就发现近万种。放线菌具有产生抗生素的能力，使其具有抗菌作用，一般单株放线菌可以合成多种抗生素，因而具有广谱的抗菌能力，一些放线菌甚至对十余种病原菌具有拮抗作用。放线菌也是最早应用到生产中的生防微生物，在植物病害防治中发挥了巨大作用。利用放线菌的次生代谢产物—抗生素制备的新农药，由于其具有无污染、无残留、可再生、易于产业化、成本低等特点已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向。

在当前缺乏抗纹枯病的水稻品种情况下，生产上用的杀菌剂有井冈霉素、灭锈胺、苯甲丙环唑乳油等；其中最常用的井冈霉素自1973年由上海农药研究所开发应用以来，一直是抗纹枯病的当家品种，但因长期连续使用，造成纹枯病菌抗药性增强从而使防治效果不理想。所以有必要发掘新的水稻纹枯病菌的拮抗微生物进行生物防治，筛选出更多有应用价值的新菌种。

发明内容

本发明针对现今缺乏抗纹枯病的水稻品种，且水稻纹枯病菌对生产上使用的杀菌剂已经产生了抗药性等问题。本发明的第一个目的是提供一株从土壤中筛选拮抗水稻纹枯病菌的吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）Sh-43菌株。本发明的第二个目的是提供采用上述的吸水链霉菌Sh-43菌株生产发酵液的方法。本发明的第三个目的是提供上述的吸水链霉菌Sh-43菌株及其发酵液的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）Sh-43菌株，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2012172，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2012年5月18日。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种生产上述的吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液的方法，该方法包括以下的步骤：

1）在无菌条件下，用接种针挑少许吸水链霉菌Sh-43菌株试管保存菌种，转接于高氏I号的培养平板上，25 ℃~37℃活化培养100~200 h；

2）以同样方式接入活化好的菌种到高氏I号培养平板上，25 ℃~37℃培养80~160 h，作为一级种子；

3）在三角瓶装入种子培养液，接入吸水链霉菌Sh-43菌株一级种子菌饼，25 ℃~37℃摇床培养80~160 h，作为二级发酵种子；

3）在发酵罐装发酵培养液，接种量6~12 %体积比百分比二级发酵种子，转数200~300 r/min，温度25 ℃~37℃，通气量80~120 L/h，罐压0.2~0.4MPa，发酵时间为100~200 h。

作为优选，上述的种子培养液和发酵培养液中有机碳源选用葡萄糖、麦芽糖、D-甘露醇、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖和可溶性淀粉中的一种或多种，氮源选用硝酸钾、硫酸铵、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨一种或多种。

作为再优选，上述的种子培养液和发酵培养液中有机碳源选用可溶性淀粉。

作为再优选，上述的种子培养液和发酵培养液中氮源选用酵母粉。

作为优选，上述的种子培养液由以下的组分构成：

可溶性淀粉 60 g，酵母粉20 g，NaCl 1.5 g，KH₂PO₄0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，FeSO₄0.01 g，水 1000 mL，pH 7.2~7.4。

作为优选，上述的发酵培养基由以下的组分构成：可溶性淀粉 20 g，酵母粉 1 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，FeSO₄0.01 g，水 1000 mL，pH 7.2~7.4。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明所述的吸水链霉菌Sh-43菌株及其发酵液用于制备防治水稻纹枯病菌的微生物菌剂的用途。

防治水稻纹枯病菌的微生物菌剂，该微生物菌剂包括本发明所述的吸水链霉菌Sh-43菌株和吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液中的一种或两种混合。

本发明吸水链霉菌Sh-43菌株具有拮抗效果显著、抗菌谱广、拮抗效果稳定、培养条件简单、且对水稻纹枯病有很好的防治效果，在植物病害生物防治领域将有广阔的应用前景。5 mm Sh-43菌株菌丝块用9 cm培养皿对峙培养5 d对水稻纹枯病菌的抑菌圈达可达30 mm~35mm（附图6）；通过优化液体发酵培养基和发酵条件后，用牛津杯法测定100 μL发酵液培养2 d可产生32 mm~35mm的抑菌圈（附图7），发酵液的拮抗效果稳定。因此，本发明Sh-43菌株可用于植物病害生物防治微生物菌剂的生产菌株。

附图说明

图1 Sh-43菌株在高氏I号培养基上培养15 d菌落图。

图2 Sh-43菌株在高氏I号培养基上培养30 d（右）菌落图。

图3 Sh-43菌株的基内菌丝图（×400）。

图4 Sh-43菌株的气生菌丝图（×400）。

图5 Sh-43菌株的孢子丝图（×400）。

图6 Sh-43菌株对水稻纹枯病菌的拮抗效果图，Sh-43菌块（中间）对水稻纹枯病菌的拮抗效果（5 d）。

图7 Sh-43菌株对水稻纹枯病菌的拮抗效果图，Sh-43菌株发酵液（边缘）对水稻纹枯病菌的拮抗效果（2 d）。

图8 基于16S rDNA基因序列建立的链霉菌属（Streptomyces）系统发育树图。

生物材料保藏说明

具体实施方式

实施例1 吸水链霉菌Sh-43菌株的分离、纯化和筛选

1.1 培养基

（1）PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉 18 g，水 1000 mL，pH 自然。

（2）高氏I号培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO₃1 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，FeSO₄0.01 g，琼脂 20 g，水1000 mL，pH 7.2~7.4。

（3）种子培养基：可溶性淀粉 60 g，酵母粉 20 g，KH₂P0₄ 0.5 g，NaCl 1.5 g，MgS0₄ 0.5 g，FeS0₄ 0.01 g，水1000 mL，pH 7.2。

（4）发酵培养基：可溶性淀粉 20 g，酵母粉1 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，FeSO₄0.01 g，水 1000 mL，pH 7.2~7.4。

放线菌菌株的分离、纯化

吸水链霉菌Sh-43菌株分离自浙江省金华市郊二球悬铃木种植地的土壤样品。将土壤样品自然风干，30℃下放置5~7 d；取1g风干土，用研钵磨细；采用稀释涂布平板法分离纯化放线菌菌株，先制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 、10^-7不同稀释度的土壤溶液，选取10^-5、10^-6 土壤溶液各100 μL分别涂布于高氏I号培养平板表面，30℃培养5 d，挑取其中的放线菌单菌落在新的高氏I号平板上进行连续划线纯化，30℃培养5~7 d，重复上述划线分离纯化操作3次后，即可得到性状均一的放线菌纯菌株。将筛选获得的放线菌菌株保存于高氏I号试管斜面培养基上并置于4 ℃冰箱中，编号备用。

水稻纹枯病拮抗放线菌菌株的筛选

拮抗放线菌菌株的筛选采用平板对峙法。将PDA培养基融化后，倒入无菌的培养皿中凝固后制成平板，中央接入直径为5 mm的放线菌菌饼一块，其周围等距离3处各接入1块直径为5 mm的水稻纹枯病菌菌饼（附图6），每处理重复3次，置于30 ℃恒温箱中培养，5 d后测量各筛选放线菌菌株对水稻纹枯病菌的抑菌圈直径。分离得到的406株放线菌中以吸水链霉菌Sh-43菌株的抑菌效果最好，抑菌圈直径可达30 mm~35 mm（附图6）。

吸水链霉菌Sh-43菌株，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2012172，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2012年5月18日。

吸水链霉菌Sh-43菌株在高氏I号培养基上30 ℃，5 d形成菌落，菌落表面干燥、粗糙，边缘整齐，菌落初期为白色不透明，15 d后菌落开始呈灰色（附图1），培养30 d后菌落呈灰褐色（附图2）。

显微镜下观察，基内菌丝色泽较浅，呈网状交织，菌丝短，分枝多，无横隔，直径0.4 μm~0.5 μm；气生菌丝较基内菌丝色泽稍深，直、柔曲，分枝较多，无横隔，粗壮，不易断裂，菌丝直径约为0.5 μm~1 μm。孢子丝丛状分布，一般互生，钩状至2~4圈紧螺旋形成团，左旋和右旋均存在。成熟孢子呈椭圆形、长圆形，表面光洁（附图3~5）。

生理生化实验结果表明，Sh-43菌株的适宜生长温度范围为25 ℃~37 ℃，最适pH范围为7.2~7.4，能水解明胶、水解淀粉，生长速度快，不使牛奶凝固、耐高温等生物学特性。能够很好的利用各种有机碳源，如葡萄糖、麦芽糖、D-甘露醇、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等，其中最适生长碳源为可溶性淀粉；在氮源利用方面，可以利用硝酸钾、硫酸铵等无机氮源和牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多种有机氮源，在以酵母粉为氮源的培养基中生长最好。

ITS基因序列分析结果表明，与吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的相似度高达100%。根据瓦克斯曼和阎逊初的《放线菌(第二卷)属和种的分类、鉴定和描述》分种检索表、ITS基因序列Blast比对结果，鉴定Sh-43菌株为吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）（附图8）。

实施例2 发酵法生产Sh-43菌株发酵液的工艺流程

在无菌条件下，用接种针挑少许吸水链霉菌Sh-43菌株试管保存菌种，转接于高氏I号的培养平板上，30 ℃活化培养168 h。以同样方式接入活化好的菌种到高氏I号培养平板上，30 ℃培养120 h，作为一级种子。250 mL三角瓶装入50 mL 种子培养液，接入5块直径为5mm Sh-43菌株一级种子菌饼，30 ℃摇床（220 r/min）培养120 h，作为二级发酵种子。根据发酵规模大小，如3.7 L发酵罐装2.5 L发酵培养液，接种量8 %（V/V），转数220 r/min，温度30 ℃，通气量100 L/h，罐压0.3 MPa，发酵时间为168 h。

采用牛津杯法测试Sh-43菌株发酵液的抑菌效果。PDA培养基融化后倒入无菌的9 cm培养皿凝固后制成平板，中央接入一块直径为5 mm的水稻纹枯病菌菌饼，其周围等距离2处各放入1只牛津杯，往牛津杯里注入100 μL Sh-43菌株发酵液（附图7），每处理重复3次，置于30 ℃恒温箱中培养，2 d后测量牛津杯周围抑菌圈直径可达32 mm~35 mm。

综上所述，经过吸水链霉菌Sh-43菌株液体发酵，可以生产拮抗水稻纹枯病菌活性较高的发酵液，可用于水稻纹枯病防治。

Claims

1.吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）Sh-43菌株，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2012172，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2012年5月18日。

2.一种生产权利要求1所述的吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

3）在发酵罐装发酵培养液，接种量6~12%体积比百分比二级发酵种子，转数200~300 r/min，温度25 ℃~37℃，通气量80~120 L/h，罐压0.2~0.4MPa，发酵时间为100~200 h。

3.根据权利要求2所述的一种生产吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液的方法，其特征在于种子培养液和发酵培养液中有机碳源选用葡萄糖、麦芽糖、D-甘露醇、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖和可溶性淀粉中的一种或多种，氮源选用硝酸钾、硫酸铵、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨一种或多种。

4.根据权利要求2所述的一种生产吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液的方法，其特征在于种子培养液和发酵培养液中有机碳源选用可溶性淀粉。

5.根据权利要求2所述的一种生产吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液的方法，其特征在于种子培养液和发酵培养液中氮源选用酵母粉。

6.根据权利要求2所述的一种生产吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液的方法，其特征在于种子培养液由以下的组分构成：

7.根据权利要求2所述的一种生产吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液的方法，其特征在于发酵培养基由以下的组分构成：可溶性淀粉 20 g，酵母粉1 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，FeSO₄0.01 g，水 1000 mL，pH 7.2~7.4。

8.根据权利要求1所述的吸水链霉菌Sh-43菌株及其发酵液用于制备防治水稻纹枯病菌的微生物菌剂的用途。

9.防治水稻纹枯病菌的微生物菌剂，该微生物菌剂包括权利要求1所述的吸水链霉菌Sh-43菌株和吸水链霉菌Sh-43菌株发酵液中的一种或两种混合。