CN104745483A - 一种宛氏拟青霉菌株sj1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）菌株SJ1，是沙棘真菌、该沙棘内生真菌及其提取物的制备方法及沙棘真菌提取物的用途，促进玉米，水稻等作物生长、根系发育、提高抗冻能力、增加产量。根据其形态学及遗传分析鉴定SJ1菌株为宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1及其应用。
背景技术
随着人口的膨胀和人们生活水平的提高，人们对农产品需求量越来越大。中国是人口大国，人均耕地面积不足2亩，常年掠夺式的生产经营加上落后的技术使农业生态系统不堪重负，土壤退化、水土流失、化学农药和化肥的过度使用、极端性气候频发正严重影响着我国粮食生产的安全，作为重要的资源性物质，粮食也不可能依赖于国际市场。不节制地给农业生态系统施加压力，其结果是将压力转嫁给了整个生态系统，导致水体污染、沙尘频发、物种消失速度加快等等。针对这些情况，加快农业技术的更新、选择环境友好的技术及产品，在一定程度上缓解农业生态系统压力，保持其持续发展的能力，是当前急需解决的问题。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供了一种宛氏拟青霉菌株SJ1及其应用，促进玉米，水稻等作物作物生长、根系发育、提高抗冻能力、增加产量。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1，于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号是CGMCCNO.10114。
所述宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1菌落形态菌落在查氏培养基上于 25℃条件下培养 4 天直径 3cm，生长较慢，菌落圆形，藏青 黄色，质地平坦绒状，无渗出液，反面黄褐色。分生孢子形成交织的长链，呈椭圆形，长约 5μm，宽 2.5-3μm，壁光滑。瓶梗宽 3μm，光滑。该菌具有拟青霉属的特征，初步判定为宛氏拟青霉菌。
SJ1真菌与宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 的同源相似性达到99%，氨基酸序列的相似性也达到了96%。
本发明同时提供了宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1，应用于促进作物生长、根系发育、提高抗冻能力、增加产量。
本发明的有益效果是：
本发明从野生沙棘中分离的能产生促进玉米等作物生长的内生菌，该菌为拟青霉，从该菌的菌丝提取物其活性来分析：由于其活性非常高，推测不是现有已知的五大类激素。而此前还没有关于从沙棘内生菌宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 产生高活性植物生长促进物质的报道，尤其是这些活性成分除促进根系生长外，还具有诱导植物耐旱、耐低温、促进根际微生物生长等功能。本发明的沙棘内生真菌可与植物共生进化来促进植物的生长发育，植物内生菌在与植物共生进化的过程中，形成了互惠的机制，这些机制通过对内生菌产生的活性成分的分析会逐步清楚。通过人工生产大量植物内生菌来获得有益作物生长的活性物质是一项经济有效环境友好的产业。
绝对用量少,本专利中菌丝提取物的使用浓度均是纳克级别的，实验表明1毫克提取物能够拌种40公斤，浸种200公斤，可喷施1亩作物起到明显在增产作用，同时由于促进根系生长、提高根际微生物数量、抗旱、提高矿物肥料利用效率等。
附图说明
图1所示是SJ1菌株菌落形态和孢子形态（40×0.65）；
图2所示是SJ1菌株菌落形态和孢子形态（100×1.4）；
图3所示是该真菌引物ITS1,ITS4扩增DNA序列；
图4所示是菌株SJ1通过ITS序列分析建立的系统发育树；
图5所示是SJ1菌种菌丝提取物生产工艺流程图；
图6所示是SJ1菌丝醇提取物在生菜上的使用效果（图中左侧为对照，右为SJ1菌丝醇提取物处理）；
图7所示是SJ1菌丝醇提取物在苦菊上的使用效果（图中左侧为对照，右为SJ1菌丝醇提取物处理）；
图8所示是SJ1菌丝醇提取物对拟南芥生根的影响；
图9所示是抗冻试验处理前的西红柿苗；
图10所示是抗冻试验处理后的西红柿苗。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1的分离与鉴定
（1）沙棘内生真菌的分离
①健康的野生沙棘样品采集后立即处理、洗净，然后将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗18分钟，最后用无菌水冲洗4次；
② 将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28℃度培养箱培养5天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板（孟加拉红培养基）反复分离、纯化，最后得到宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1；孟加拉红培养基配方及制作方法如下：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g，琼脂20g，1/3000孟加拉红溶液100mL，蒸馏水1000mL，氯霉素0.1g。上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min。
（2） 沙棘内生真菌的鉴定
①野生沙棘内生真菌SJ1菌种形态和分类依据 SJ1菌落形态菌落在查氏培养基上于 25℃条件下培养 4 天直径 3cm，生长较慢，菌落圆形，藏青 黄色，质地平坦绒状，无渗出液，反面黄褐色。分生孢子形成交织的长链，呈椭圆形，长约 5μm，宽 2.5-3μm，壁光滑。瓶梗宽 3μm，光滑，该菌具有拟青霉属的特征，初步判定为宛氏拟青霉菌。
②分子生物学鉴定
本专利以ITS1和ITS4为引物，对从沙棘根部中分离的真菌SJ1菌株进行了扩增，并对扩增产物进行了测序（见图2）。基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用Mega6.0软件通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树（如图3所示）。结果表明SJ1真菌与宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 的同源相似性达到99%，氨基酸序列的相似性也达到了96%。
实施例2宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1的促生实验
（1）沙棘内生真菌液体发酵培养：
将沙棘内生真菌分离得到的宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1接到平板PDA培养基上，25℃培养6天 ，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液（为PDA培养基不加琼脂做成）的250mL三角烧瓶，于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150mL发酵培养基（发酵培养基为：马铃薯提取液 1.0 L,酵母膏 1.0 g,蛋白胨 3.0 g,葡萄糖 15.0 g,琼脂 17.0 g,马铃薯提取液的制备： 取去皮马铃薯200克，切成小块，加海水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。）的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，放入4℃冰箱中保存备用。
（2）宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1提取物的制备方法
将（1）培养得到的菌丝体洗涤后60℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，用同体积乙醇浸提24h，浸提3次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡1h，真空抽滤，收集滤液备用，滤液即为宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1的提取物。得到的宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1的提取物可用于促进包括玉米等主要农作物生长、提高抗逆性和提高产量等方面。图4为SJ1菌种菌丝提取物生产工艺：
玉米使用案例如下：
取两块距离不远的地作为对比试验田，分别为对比组和实验组，两块地距离不远会尽量的满足两块地的生长环境一致，每块地为一亩，实验地点为北方普通的适于玉米生长的田地，然后取北方黄玉米的种子，对对比组的种子进行常规的播种，对实验组的种子利用本发明的宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1菌丝提取物进行处理，处理步骤为：
（1）玉米浸种：该菌丝提取物5ng/ml-10ng/ml对玉米种子进行浸泡1天；将两块地的种子同时进行播种，
（2）叶片喷施：在开花前2周左右对实验组喷施作物叶面，或在结实初期喷施作物叶面；喷施过程选择晴天的傍晚进行，以免雨水或阳光的因素，影响作物对喷施物的吸收，喷施的标准是尽量使叶面均匀的布满喷施物。
在150天观察两组实验进入成熟期的比例，发现对比组的成熟期为70%，而实验组的成熟期为80%，由此可以看出，实验组的玉米生长期较对比组提前10%左右；产量方面，对比组为近1350斤的亩产量，而实验组的产量则接近1525斤的亩产量，也就是说应用本发明的沙棘内生真菌提取物的实验组可以明显的提前玉米的成熟时间和提高亩产量。
水稻苗使用案例：
水稻，做3个处理（含CK），采用盆栽的方式，每个处理20个重复，试验选在辽宁省农科院院内温室中，土壤采用的是沙壤土
水稻苗处理1：清水喷根（CK），
处理2： SJ1（S）菌丝醇提取物10ng/mL喷根，
处理3：复合肥料（F）在插秧前施作基肥25公斤/亩。
将需要药剂喷根处理的，均匀喷淋至秧苗根部，用报纸盖上，第二天插秧。
在水稻试验结果中，对株高，分蘖数，叶片数，鲜重，干重进行测定分析，在株高，分蘖数，鲜重，干重上SJ1菌丝醇提取物处理效果比其他组处理效果好。分别比CK增加了8.9%，110.7%，122%和193%。
表1不同处理对水稻各指标的影响
| 处理 | 株高(m) | 分蘖数 | 叶片数 | 鲜重(g) | 干重(g) |
| CK | 0.56b | 1.68b | 3.47c | 4.53e | 1.2e |
| F | 0.58ab | 2b | 4.44a | 6.98c | 1.66d |
| S | 0.61a | 3.54a | 3.92abc | 10.06a | 3.51a |
注：小写字母表示多重比较中5%水平以下的显著性差异，有相同字母表示差异不明显，无相同字母表示差异明显。
大豆使用案例：
大豆浸种处理1：清水喷根（CK），处理2： SJ1菌丝醇提取物10ng/mL喷根，处理3：复合肥料（F）在接种后种子10cm处施肥，在大豆处理上，测定株高，茎粗，根瘤数，主茎节数，有效荚数，鲜荚重指标数据进行比对分析，SJ1醇提取物的处理在茎粗上比CK增加了25%，在主茎节数上比CK增加了34%，根瘤数，有效荚数和鲜荚重上分别比CK增加了250%，113%和124%。为所有处理中效果最好的。
表2不同处理对大豆各指标的影响
| 处理 | 株高(cm) | 茎粗(mm) | 根瘤数 | 主茎节数 | 有效荚数 | 鲜荚重（g） |
| CK | 38.21ab | 2.32c | 1.93c | 4.84b | 0.39bc | 0.33b |
| F | 36.77b | 2.43b | 2.25c | 4.8b | 0.12c | 0.11c |
| S | 33.26c | 2.91a | 6.90a | 5.18a | 0.83a | 0.74a |
注：小写字母表示多重比较中5%水平以下的显著性差异，有相同字母表示差异不明显，无相同字母表示差异明显。
SJ1菌丝醇提取物在生菜、苦菊上的使用效果（如图6、7所示）
实验对象：生菜、苦菊（定植后）
观察时间：20天
实验结果：定植覆膜后使用SJ1菌丝醇提取物，生菜、苦菊的分蘖数增多，叶片大且厚，增产效果明显。
SJ1菌丝醇提取物对拟南芥生根的影响（如图8所示）
将杀菌消毒后的拟南芥种子点在1/2 MS固体培养基上，于24℃光照培养箱中培养7天后，移植到事先加入2.5ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml的SJ1菌丝醇提取物的1/4 MS液体培养基中继续培养，10天后观察植株长势，并测鲜重。图为拟南芥液体培养10天后的整体形态及鲜重数据。
由图可以看出，加入SJ1菌丝醇提取物的处理，植株叶片、主根长、毛细根数量均优于对照，5.0、10.0、20.0ng/ml鲜重比对照分别高18%、64.5%、38.5%。
SJ1菌丝醇提取物的抗冻试验（西红柿如图9、10所示）
试验材料：2014年11月1日实验做的西红柿苗
由左往右依次是：SJ1菌丝醇提取物6000倍灌根、3000倍灌根、CK、6000倍喷雾、6000倍灌根+3000喷雾
试验背景：于2014年11月28日搬到公司展厅展览，由于展厅温度低且光照不足，12月5日观察到，经受长时间的地温、寡照，使用SJ1菌丝醇提取物的西红柿苗表现出了明显的抗冻效果，而未使用SJ1菌丝醇提取物的处理则受冻害很明显。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1，其特征在于：于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号是CGMCCNO.10114。
2.权利要求1所述的一种宛氏拟青霉 （Paecilomyces variotii） 菌株SJ1的应用，其特征在于：应用于促进作物生长、根系发育、提高抗冻能力、增加产量。
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