CN102465096A

CN102465096A - 一种微生物菌剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN102465096A
Application number: CN2010105434193A
Authority: CN
Inventors: 张惠文; 李旭; 苏振成; 王秀娟; 孙健; 张成刚
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-11-15
Also published as: CN102465096B

Abstract

本发明涉及生物农药技术领域，具体的说是一种微生物菌剂及其制备方法和应用。菌剂包括灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）；所述灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）KJA04-02，已于2010年9月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010253；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010254。本发明的菌剂高效、无毒、环境友好且制备工艺简单，该菌剂对蔬菜根结线虫病害及真菌病害都具有很好的防治效果，可用于蔬菜根结线虫病害及真菌病害的生物防治。

Description

一种微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物农药技术领域，具体的说是一种微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

根结线虫病害在世界范围内普遍发生，全世界每年因根结线虫危害所造成的农作物损失达1000亿美元以上，可使世界农业平均每年减产24.5%。在我国，根结线虫在多个省市发生非常严重，为害的作物有蔬菜、烟草、花卉、棉花、大豆、花生、小麦、水稻、中药材等。近年来，根结线虫病害在我国很多地区大棚、温室发病相当严重，受害蔬菜轻者减产20-30%，严重的高达70%以上甚至绝收。真菌病害也是影响蔬菜产量的重要病害，蔬菜上真菌类病害有1000种左右，常见病害200种左右。在蔬菜上危害严重的霜霉病、枯萎病、白粉病、黄萎病、锈病等都是真菌引起的病害。近几年，有些蔬菜大棚由于连做等原因根结线虫病害和真菌病害同时发生，损失相当严重，有些大棚已经无法继续进行蔬菜生产。

针对蔬菜生产中常见的根结线虫病害和真菌病害，通常采用化学农药进行防治，但目前所使用的化学农药多数为高毒、高残留农药，用药复杂，线虫及病原真菌易产生抗药性，农药对土壤微生物、植物、水源和大气层造成严重的污染和破坏，同时农药在植物体内残留会直接对人类和其他生物造成危害，破坏生态环境。因此，研究高效、低毒、低残留生物农药已是农业可持续发展中的重要课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物菌剂及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种微生物菌剂：菌剂包括灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；所述灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02，已于2010年9月28保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010253；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010254。

所述菌剂为灰色链霉菌、枯草芽孢杆菌和两种菌总重量10-15倍的麸皮或草碳土；其中灰色链霉菌和枯草芽孢杆菌按重量份数计，灰色链霉菌：枯草芽孢杆菌= 5-7：3-5。

微生物菌剂的制备方法：

1）将灰色链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) KJB04-11、分别培养于各自培养基中，待各菌种分别培养至2-6×10⁸个/mL，将上述各菌种分别过滤或离心得到菌体，待用；

2）将上述待用菌体按重量份数计的比例混合，重量份数计，灰色链霉菌（Streptomyces griseus）：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) = 5-7：3-5；

3）将上述混合的菌体加入其10-15倍重量的麸皮或草碳土中，即得微生物菌剂。

所述培养灰色链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02的培养基为淀粉 20g，硫酸镁 0.5g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾 0.5g，硫酸亚铁 0.01g，水 1000mL，pH7.2-7.4；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) KJB04-11培养基为蔗糖20～30g，蛋白胨3～5g，硝酸钠2～3g，磷酸氢二钾0.02～0.5g，硫酸镁0.02～0.5g，氯化钾0.02～0.5g，硫酸亚铁0.001～0.01g，pH7.0-7.4，水1000mL。

微生物菌剂的应用：所述微生物菌剂可作为线虫真菌菌剂。所述微生物菌剂可作为植物寄生线虫及植物真菌菌剂。所述植物寄生线虫为根结线虫（Meloidogyne sp.），真菌为镰刀菌（Fusarium sp.）。

本发明所具有的优点：

本发明菌剂具有以下优点：

1、本发明菌剂为纯生物制剂，对人体无害，不污染环境，可以解决化学农药污染带来的环境问题。同时菌种施入土壤后可以定植、存活，对改善土壤质量，降低后茬作物病害发生具有积极的作用。

2、本发明菌剂可以同时防治根结线虫病害和植物真菌病害，且防效显著。对植物根结线虫病害的防效可以达到70%以上，对真菌病害的防治效果可达到65%以上。

3、采用放线菌和细菌复配而成，两种微生物互惠互利，相互促进繁殖，可以决单一菌种在土壤中定植差和萌发时间长等问题。

具体实施方式

实施例1

微生物菌剂由灰色链霉菌（Streptomyces griseus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）以及两种菌总重量10倍的麸皮或草碳土；灰色链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02，已于2010年9月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010253；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010254。

灰色链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02菌株基丝无隔，不断裂，孢子丝呈链状直丝。菌落圆形，表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈放射状扩散，粉状；气生菌丝单叉分支，孢子丝波曲形。可液化明胶，水解淀粉，可产生硫化氢，产生黑色素，在纤维素上不能生长，对木糖、山梨醇、甘露醇半乳糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖都有不同程度的利用能力。

枯草芽孢杆菌KJB04-11单细胞呈杆状，长2.5-3.0μm，宽0.8～1.0μm，其芽孢长1.0-1.5μm，宽0.7～0。8μm。菌落圆形，淡黄色，表面粗糙，边缘不整齐。革兰氏染色阳性；接触酶、V-P测定、硝酸盐还原反应呈阳性；可水解淀粉、酪素；可液化明胶；能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇产酸。

实施例2

微生物菌剂制备：

1）微生物斜面种子的制备：将放线菌灰色链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02的菌丝或孢子接种到高氏培养基斜面上，25-28℃培养7天后获得种子斜面。高氏培养基为淀粉2克，硫酸镁0.05克，硝酸钾0.1克，氯化钠0.05克，磷酸氢二钾0.05克，硫酸亚铁0.001克，琼脂2克，水100毫升，pH7.2-7.4。

将细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KJB04-11的菌体接种到PDA培养基斜面上，28-37℃培养1天后获得种子斜面。

PDA培养基为马铃薯20克，葡萄糖2克，琼脂2克，水100毫升。

2）微生物液体种子的培养：将放线菌灰色链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02斜面种子转接到承有高氏培养基的三角瓶液体中，于200r/min，28℃培养7天。

将细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KJB04-11斜面种子转接到承有PDB培养基的三角瓶中，于200r/min，37℃培养2天，得到液体种子。PDB培养基：马铃薯20克，葡萄糖2克，水100毫升。

3）生物体扩大培养：将放线菌液体种子接入20-50升全自动发酵罐，培养基为高氏培养基，接种量为10%，28℃培养7天，使菌液中菌种达到4×10⁸个/mL。

将细菌液体种子转接入20-50升全自动发酵罐，培养基为PDB培养基，接种量为10%，200r/min，37℃培养2天，得到大量的微生物菌体，菌液中菌种达到4×10⁸个/mL。

4）微生物菌剂：将上述液体扩大培养后两种微生物菌体分别用板框过滤的方法收集菌体，将过滤后两种菌体按照重量比5：3的比例混合。然后在上述菌体中加入菌体混合后10倍重量的麸皮，混合均匀，得到微生物菌剂。

实施例2

采用上述实施例所得菌剂对黄瓜根结线虫病害及黄瓜枯萎病害的防治应用情况。

1、试验方法

选择根结线虫病和枯萎病发生严重的黄瓜大棚内进行，用营养袋培育黄瓜苗，移栽时穴施上述实施例微生物菌剂，用量为1千克/亩（菌数：4.5×10⁸个/克），采收期调查发病率和病情指数，评价防治效果，对照组未施加微生物菌剂。

2、试验结果

处理类型	根结线虫病		黄瓜枯萎病
						病情指数	防治效果	发病率	防治效果
防治区	17.6	73.2	19	67.4
					对照区	65.8		58.3

由上表可见，本发明实施例菌剂对根结线虫的防治效果达到73%，对黄瓜枯萎病的防治效果为67%。

实施例3

微生物菌剂制备：

PDA培养基为马铃薯20克，葡萄糖2克，琼脂2克，水100毫升。

3）生物体扩大培养：将放线菌液体种子接入20-50升全自动发酵罐，培养基为高氏培养基，接种量为10%，28℃培养7天，使菌液中菌种达到2×10⁸个/mL。

将细菌液体种子转接入20-50升全自动发酵罐，培养基为PDB培养基，接种量为10%，200r/min，37℃培养2天，得到大量的微生物菌体，菌液中菌种达到2×10⁸个/mL。

4）微生物菌剂：将上述液体扩大培养后两种微生物菌体分别用板框过滤的方法收集菌体，将过滤后两种菌体按照重量比7：5的比例混合。然后在上述菌体中加入菌体混合后15倍重量的麸皮，混合均匀，得到微生物菌剂。

实施例4

与实施例1不同之处在于

将上述培养后菌液中菌种分别达到6×10⁸个/mL的两种菌种枯草芽孢杆菌KJB04-11和灰色链霉菌KJA04-02，按重量份数计，灰色链霉菌：枯草芽孢杆菌= 6：5的比例混合，混合后菌体中加入菌体总质量12倍的草碳土，混合均匀，得到微生物菌剂。

实施例5

与实施例1不同之处在于

将上述培养后菌液中菌种分别达到2×10⁸个/mL的两种菌种枯草芽孢杆菌KJB04-11和灰色链霉菌KJA04-02，按重量份数计，灰色链霉菌：枯草芽孢杆菌= 6：4的比例混合，混合后菌体中加入菌体总质量13倍的草碳土，混合均匀，得到微生物菌剂。

Claims

1.一种微生物菌剂，其特征在于：菌剂包括灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；所述灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02，已于2010年9月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010253；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010254。

2.按权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述菌剂为灰色链霉菌、枯草芽孢杆菌和两种菌总重量10-15倍的麸皮或草碳土；其中灰色链霉菌和枯草芽孢杆菌按重量份数计，灰色链霉菌：枯草芽孢杆菌= 5-7：3-5。

3.一种按权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：

4.按权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述培养灰色链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02的培养基为淀粉 20g，硫酸镁 0.5g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾 0.5g，硫酸亚铁 0.01g，水 1000mL，pH7.2-7.4；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) KJB04-11培养基为蔗糖20～30g，蛋白胨3～5g，硝酸钠2～3g，磷酸氢二钾0.02～0.5g，硫酸镁0.02～0.5g，氯化钾0.02～0.5g，硫酸亚铁0.001～0.01g，pH7.0-7.4，水1000mL。

5.一种按权利要求1所述的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂可作为线虫真菌菌剂。

6.按权利要求5所述的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂可作为植物寄生线虫及植物真菌菌剂。

7.按权利要求6所述的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述植物寄生线虫为根结线虫（Meloidogyne sp.），真菌为镰刀菌（Fusarium sp.）。