CN103131646A - 一种微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物农药技术领域，具体的说是一种微生物菌剂及其制备方法和应用。所述菌剂由灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)组成；所述灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010253；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010254。本发明的菌剂高效、无毒、环境友好且制备工艺简单，该菌剂对大豆根腐病及大豆胞囊线虫都具有很好的防治效果，可用大豆根腐病及胞囊线虫病的生物防治。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体的说是一种微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
大豆根腐病是一种世界性土传真菌病害，分布广、危害重、病原菌种类繁多。该病1955年由Suhovecky等人在美国俄亥俄州首次报道，此后，日本、埃及、加拿大、俄罗斯及中国相继报道了根腐病的发生及危害。在我国大豆根腐病主要集中在东北和黄淮海大豆产区，减产10-30％左右，重病地可减产60％甚至绝收，大豆根腐病每年给国家造成数亿元的损失。大豆胞囊线虫是大豆生产中一种常见的病害，危害大豆根部，造成植株生长迟缓、根系萎缩、结瘤数量减少、结荚率低、豆粒干瘪，从而严重影响大豆的产量和品质，且感染后的大豆植株很容易被土壤中病原菌侵害，引发或加重其它病害。大豆胞囊线虫病的流行一般造成大豆减产10％-20％，重者达50％，甚至绝产。
针对大豆胞囊线虫及根腐病，通常使用化学农药进行防治，但目前所使用的化学农药多数为高毒、高残留农药，用药复杂，线虫及病原菌易产生抗药性，农药对土壤微生物、植物、水源和大气层造成严重的污染和破坏，同时农药在植物体内残留会直接对人类和其他生物造成危害，破坏生态环境。因此，研究高效、低毒、低残留生物农药对于保护生态环境，维持农业可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物菌剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种微生物菌剂，所述菌剂由灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)组成；所述灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)KJA04-02，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010253；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010254。
所述菌剂为灰色链霉菌和枯草芽孢杆菌与两种菌总重量10-15倍的麸皮或草碳土混合制得，所述灰色链霉菌和枯草芽孢杆菌按重量份数计，灰色链霉菌∶枯草芽孢杆菌＝5-7∶3-5。
微生物菌剂的制备方法，1)将灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11分别培养，待枯草芽孢杆菌KJB04-11菌液中菌数达到2-8×108个/mL，灰色链霉菌KJA04-02菌液中菌体湿重达到20-30g/L；将上述各菌种分别过滤或离心得到菌体，待用；
2)将上述待用菌体混合，菌体按重量份数计，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)∶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)＝3-7∶3-5；
3)将上述混合的菌体加入其8-15倍重量的麸皮或草碳土中，即得微生物菌剂。
所述培养灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02的培养基为淀粉20g，硫酸镁0.5g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，水1000mL，pH7.2-7.4；所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KJB04-11培养基为牛肉膏3-5g，蛋白胨8～12g，氯化钠3-6g，pH6.8-7.4，水1000mL。
微生物菌剂的应用，所述微生物菌剂可作为线虫真菌菌剂。所述微生物菌剂可作为防治大豆胞囊线虫、大豆根腐病菌剂。
本发明所具有的优点：
1、本发明菌剂为纯生物制剂，对人体无害，不污染环境，可以解决化学农药污染带来的环境问题。同时菌种施入土壤后可以定殖、存活，对改善土壤质量，降低后茬作物病害发生具有积极的作用。
2、本发明菌剂可以同时防治根结线虫病害和植物真菌病害，且防效显著。对大豆胞囊线虫的防效可以达到80％以上，对大豆根腐病的防治效果可达到80％以上。
3、采用放线菌和细菌复配而成，两种微生物互惠互利，相互促进繁殖，可以决单一菌种在土壤中定殖差和萌发时间长等问题。
具体实施方式
实施例1
微生物菌剂由灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及两种菌总重量10倍的麸皮或草碳土混合制得；灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010253；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010254。
灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02菌株基丝无隔，不断裂，孢子丝呈链状直丝。菌落圆形，表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈放射状扩散，粉状；气生菌丝单叉分支，孢子丝波曲形。可液化明胶，水解淀粉，可产生硫化氢，产生黑色素，在纤维素上不能生长，对木糖、山梨醇、甘露醇半乳糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖都有不同程度的利用能力。
枯草芽孢杆菌KJB04-11单细胞呈杆状，长2.5-3.0μm，宽0.8～1.0μm，其芽孢长1.0-1.5μm，宽0.7～0。8μm。菌落圆形，淡黄色，表面粗糙，边缘不整齐。革兰氏染色阳性；接触酶、V-P测定、硝酸盐还原反应呈阳性；可水解淀粉、酪素；可液化明胶；能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇产酸。
实施例2
微生物菌剂制备：
1)微生物斜面种子的制备：将放线菌灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)KJA04-02的菌丝或孢子接种到高氏培养基斜面上，25-28℃培养7天后获得种子斜面。高氏培养基配方为淀粉2克，硫酸镁0.05克，硝酸钾0.1克，氯化钠0.05克，磷酸氢二钾0.05克，硫酸亚铁0.001克，琼脂2克，水100毫升，pH7.2-7.4。
将细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11的菌体接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，28-37℃培养1天后获得种子斜面。
牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏0.3-0.5克，蛋白胨1克，氯化钠0.5克，琼脂2克，水100毫升。
2)微生物液体种子的培养：将放线菌灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)KJA04-02斜面种子转接到盛有高氏培养基的三角瓶液体中，于200r/min，28℃培养7天。
将细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11斜面种子转接到承有牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中，于200r/min，37℃培养2天，得到液体种子。牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏0.3-0.5克，蛋白胨1克，氯化钠0.5克，水100毫升。
3)生物体扩大培养：将放线菌液体种子接入20-50升全自动发酵罐，培养基为高氏培养基，接种量为10％，28℃培养7天，使菌液中菌体湿重达到25克/L。
将细菌液体种子转接入20-50升全自动发酵罐，培养基为PDB培养基，接种量为10％，200r/min，37℃培养2天，得到大量的微生物菌体，菌液中菌种达到4×108个/mL。
4)微生物菌剂：将上述液体扩大培养后两种微生物菌体分别用板框过滤的方法收集菌体，将过滤后两种菌体按照重量比5∶3的比例混合。然后在上述菌体中加入菌体混合后10倍重量的麸皮，混合均匀，得到微生物菌剂。
实施例2
与实施例1不同之处在于
将上述枯草芽孢杆菌KJB04-11培养后，菌液中菌数达到6×108个/mL，灰色链霉菌KJA04-02菌液中菌体湿重达到20克/L。按重量份数计，灰色链霉菌∶枯草芽孢杆菌＝3∶4的比例混合，混合后菌体中加入菌体总质量10倍的草碳土，混合均匀，得到微生物菌剂。
实施例3
与实施例1不同之处在于
将上述枯草芽孢杆菌KJB04-11培养后，菌液中菌数达到2×108个/mL，灰色链霉菌KJA04-02菌液中菌体湿重达到30克/L。按重量份数计，灰色链霉菌∶枯草芽孢杆菌＝7∶4的比例混合，混合后菌体中加入菌体总质量10倍的草碳土，混合均匀，得到微生物菌剂。
应用例
采用上述实施例所得菌剂对大豆胞囊线虫及根腐病的防治应用情况。
试验在黑龙江八五三农场大豆胞囊线虫和大豆根腐病病病害发生较重地区进行，田间同常规管理，小区垄距65cm，每小区设8条垄，长10m，小区面积52m2，设3次重复，随机排列。播种时施用菌剂，用量为15kg/hm2，以化学农药50％多菌灵用种子量的0.3％包衣处理和空白处理为对照。播种播种30天后调查病情指数，并计算菌剂对大豆根腐病和大豆胞囊线虫的防治效果。收获期统计大豆产量，计算增产效果。以未施加微生物菌剂作为对照(表1)。
表1
由上表可见，本发明实施例菌剂对大豆胞囊的防治效果达到82.47％，对黄瓜枯萎病的防治效果为82.41％。大豆产量增加28.02％。
Claims (6)
1.一种微生物菌剂，其特征在于：所述菌剂由灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)组成；所述灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010253；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11，已于2010年9月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2010254。
2.按权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述菌剂为灰色链霉菌和枯草芽孢杆菌与两种菌总重量10-15倍的麸皮或草碳土混合制得，所述灰色链霉菌和枯草芽孢杆菌按重量份数计，灰色链霉菌∶枯草芽孢杆菌＝5-7∶3-5。
3.一种权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：
1)将灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11分别培养，待枯草芽孢杆菌KJB04-11菌液中菌数达到2-8×108个/mL，灰色链霉菌KJA04-02菌液中菌体湿重达到20-30g/L；将上述各菌种分别过滤或离心得到菌体，待用；
2)将上述待用菌体混合，菌体按重量份数计，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)∶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)＝3-7∶3-5；
3)将上述混合的菌体加入其8-15倍重量的麸皮或草碳土中，即得微生物菌剂。
4.按权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述培养灰色链霉菌(Streptomyces griseus)KJA04-02的培养基为淀粉20g，硫酸镁0.5g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，水1000mL，pH7.2-7.4；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KJB04-11培养基为牛肉膏3-5g，蛋白胨8～12g，氯化钠3-6g，pH6.8-7.4，水1000mL。
5.一种权利要求1所述的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂可作为线虫真菌菌剂。
6.按权利要求5所述的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂可作为防治大豆胞囊线虫、大豆根腐病菌剂。
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