CN102154175B - 一种桥石短芽孢杆菌x23及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明针对现有防治青枯病菌危害作物对技术的不足，提供一套防止青枯病菌在茄科作物中生长繁殖的生产工艺技术，从而提高作物的产量。由于桥石短芽孢杆菌X23抑菌谱广，对烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病菌等多种病原真菌都有拮抗作用，环境安全性好，具有良好的开发前景和应用潜力。

Description

一种桥石短芽孢杆菌X23及其应用

技术领域

本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种土居生防菌株，具体地说涉及一种高效防治茄科作物青枯病的桥石短芽孢杆菌X23及其应用。

背景技术

青枯病由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，该菌是一个复合种(complex species)。该致病菌通过土壤传播，感染植株后在导管内大量繁殖，导致导管被堵塞，水分运输受阻，植株因缺水而萎蔫死亡；该致病菌还可分泌胞外多糖、酶和群体感应物质等多种致病因子扰乱寄主正常的代谢活动。青枯病在我国所有茄科作物生产区普遍发生，是所有茄科作物生产上共同面临的毁灭性病害，每年因青枯病导致的损失高达数十亿美元。以马铃薯为例，青枯病发病严重时可导致减产80％，甚至绝收。

青枯病的防治极为困难，目前对该病尚无有效的防治措施。寻找一种经济、安全和有效的防治方法是当务之急。利用土壤中的有益生物防治病害的研究为茄科作物青枯病的防治提供了新的途径，许多根际微生物在防治病害的同时还能促进植物的生长、诱导植物产生系统性抗性，从而增强寄主植物的抗病能力和激发其增产潜力。利用有益生物防治病害的方法完全不同于化学防治，它具有不污染环境、对人和其他生物安全、防治作用持久，易于同其他植物保护措施协调配合并节约能源等优点。

从土壤的微生物资源中挖掘能有效防治茄科作物青枯病的生防菌菌株，对茄科作物青枯病的防治具有重要的意义，但目前还没有可靠的产品可供使用。

发明内容

下述实例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种桥石短芽孢杆菌X23，是一种从土壤中分离筛选得到的对茄科作物青枯病具有拮抗作用的生防细菌菌株，能够有效地抑制茄科作物青枯病菌的生长，对茄科作物青枯病菌的防治具有重要的意义。

因此，本发明第一个发明目的是提供一种包含桥石短芽孢杆菌X23(Brevibacillus choshinensis X23)的微生态抑菌剂，所述菌株已于2011年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO：4534。

其中，所述的桥石短芽孢杆菌筛选过程：从各地采集土壤样品，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行青枯病菌抑制实验，得到抑制青枯病菌的拮抗菌株，进行菌种鉴定和毒理实验。生理学特征是1.14×0.38μm，单个着生，好氧或兼性厌氧，有荚膜，革兰氏染色阳性。芽孢0.6～0.9微米，椭圆到柱状，中生到近中生，芽孢囊不明显膨大。菌落粗糙、不透明，反光，扩张，乳白色或微带黄色。它可液化明胶、胨化牛奶，还原硝酸盐、水解淀粉，是好氧性细菌。

在一个具体实施方案中，所述的微生态抑菌剂还包括：该菌培养基质及该菌代谢产物。

本发明第二个发明目的是抑菌剂在茄子等作物生产中用于抑制青枯病等病菌的用途。

其中所述的用途包括：用微生态抑菌剂(液体制剂)拌种(茄子等作物种子)育苗工艺；用微生态抑菌剂喷施作物花期的田间管理工艺。

在一个具体实施方案中，使用上述的微生态抑菌剂(液体制剂)适量清水稀释拌种(现拌现播茄子等作物种子)育苗工艺，可抑制病菌在苗期侵害作物幼苗，提高出芽率，减少病苗。

其中，用微生态抑菌剂拌种(茄子等作物)育苗工艺：采用微生态抑菌制剂(固体粉剂)，每克含抑制青枯病等病菌生长繁殖的微生物数量1×10¹⁰cfu以上，先用清水将作物种子拌湿，撒上固体菌粉拌匀，现拌现播。采用微生态抑菌制剂(液体制剂)，每毫升含抑制青枯病等病菌生长繁殖的微生物数量1×10⁷cfu以上，用菌剂将作物种子拌湿，搅拌拌匀，现拌现播。用量是每亩的种子用抑菌剂0.5kg～1.0kg。

另外，使用微生态抑菌制剂，每亩可降低10％以上的用种量和10％用肥量。该育苗工艺作用和特征是抑制病菌在苗期侵害作物幼苗，减少病苗，同时提高出芽率10％～15％。

在另一个具体实施方案中，其中用微生态抑菌剂喷施作物生长期的田间管理工艺；该生长期田间管理工艺作用和特征是抑制青枯病等病菌在茄科作物的生长期大量繁殖，防止或减少病菌的侵入。

其中，用微生态抑菌剂喷施作物生长期的田间管理工艺：幼苗期，每1公斤抑菌剂用500～800倍清水混匀，喷施幼苗叶面。生长中期每1公斤抑菌剂用300～500倍清水混匀喷施叶面，一周喷施1次微生态抑菌剂。该生长期田间管理工艺作用和特征是抑制病菌在生长期侵害和生长繁殖，防止或减少病菌侵入叶面提高作物产量。

本发明第二个发明目的是抑菌剂在作物生产中用于抑制青枯病菌等多种病菌的用途。

本发明的另一个目的是提供了所述高效防治茄科作物青枯病的桥石短芽孢杆菌X23的制备方法。

本发明还有一个目的是提供了所述高效防治茄科作物青枯病的桥石短芽孢杆菌X23在防治其他常见的作物病害方面的多种应用。

本发明同时还提供了所述高效防治茄科作物青枯病的桥石短芽孢杆菌X23的制备方法，经平板对峙筛选获得。

本发明还提供了所述的高效防治茄科作物青枯病的桥石短芽孢杆菌X23的应用，其一是针对茄科作物青枯病3号生理小种的平板拮抗作用。

其二是对烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病病菌的拮抗作用。

本发明的有益效果是：

(1)桥石短芽孢杆菌X23为植物有益细菌，对茄科作物青枯病菌的抑制能力强。除此之外，还对多种病原真菌和病原细菌具有拮抗作用。本发明通过大量的实验证明桥石短芽孢杆菌X23菌株能够有效地抑制茄科作物青枯病菌的生长；此外，对烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病菌也具有明显的拮抗作用。桥石短芽孢杆菌X23菌株的环境安全性好，具有良好的开发前景和应用潜力，尤其是对茄科作物青枯病菌的防治具有重要的意义。

(2)本发明所述菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1 桥石短芽孢杆菌X23菌株对青枯病菌PO41的平板抑制作用

图2 桥石短芽孢杆菌X23的无菌培养液处理青枯病菌后的扫描电子显微镜观察

图3 桥石短芽孢杆菌X23菌株对烟草黑胫病菌的抑制作用

图4 桥石短芽孢杆菌X23菌株对水稻稻瘟病菌的抑制作用

图5 桥石短芽孢杆菌X23菌株对烟草赤星病菌的抑制作用

图6 桥石短芽孢杆菌X23菌株对马铃薯晚疫病菌的抑制作用

具体实施方式

下面结合具体实验例及附图对本发明作进一步详细的描述。

实施例1：桥石短芽孢杆菌的筛选

从各地采集土壤样品，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行青枯病菌等病菌的抑制实验，得到抑制青枯病菌菌株，进行菌种鉴定和毒理实验。

实施例2：枯草芽孢杆菌的生理生活特征及其保藏

将筛选的菌株于2011年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.4534。

该菌株的生理学特征：

细胞形态学：革兰氏阳性杆菌(1.14×0.38μm)，产生内生孢子。培养和生理学特征：嗜温性，在28℃-30℃下生长。耐热性好，60℃加热30分钟后仍然存活。好氧或兼性厌氧菌，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性。虽然也可以进行发酵代谢，但主要是呼吸代谢。从下列碳水化合物代谢产酸：纤维二糖，果糖，半乳糖，D-葡萄糖，甘油，甘露糖，麦芽糖，D-核糖，蔗糖，海藻糖，和D-木糖，不能从下列碳水化合物代谢产酸：阿拉伯糖，肌醇，乳糖，蜜二糖，D-棉子糖，鼠李糖，可溶性淀粉，D-山梨醇，L-山梨糖，或L-木糖。对明胶有微弱的水解液化作用，但不水解壳多糖，淀粉，酪蛋白，尿素，或纤维素。复合性营养，能在蛋白胨基本培养基中生长。生长还可能需要B-复合维生素和氨基酸。在蛋白胨基本培养基上，菌落直径1-3mm，乳白色，隆起，并具有光滑的边缘。菌落表面有反光，呈粘液状。不产生扩散性色素。

实施例3 桥石短芽孢杆菌X23菌株对茄科作物青枯病菌3号PO41的平板抑制作用实验

桥石短芽孢杆菌X23菌株经平板拮抗筛选获得，所述筛选方法为本领域常规方法。将培养青枯病菌的固体LB培养基加热熔化，待冷却至45℃时加入发酵培养的青枯菌液至终浓度为1×10⁷cfu/mL。随后倒入直径为9cm的培养皿，待固体LB培养基完全凝固后用打孔器在培养基上打4个对称的孔。其中两个对称的孔内每孔注入桥石短芽孢杆菌X23的培养液20μL，另两个对称的孔内注入未经使用的培养桥石短芽孢杆菌X23的培养基作为对照。实验设三次重复，29℃培养24小时后测定抑菌圈直径，由附图1可见桥石短芽孢杆菌X23显著抑制茄科作物青枯病菌菌株PO41的生长。

实施例4 桥石短芽孢杆菌X23的无菌培养液处理青枯病菌后的扫描电子显微镜观察

将桥石短芽孢杆菌X23接种于NB液体培养基，30℃，200rpm发酵培养48h；培养液7,000rpm离心后收集上清液，再经孔径为0.22μm的过滤器过滤，所得液体即为桥石短芽孢杆菌X23的无菌培养液。

将青枯病菌划线培养，挑取单菌落接种于LB液体培养基，28℃，200rpm过夜培养。吸取1mL青枯菌的培养液接种于100mL新鲜的LB液体培养基，按上述条件培养。至ODA₆₀₀＝0.6时，将培养液7,000rpm离心收集菌体。加入1mL桥石短芽孢杆菌X23的无菌培养液，悬浮青枯病菌，分别在10min、20min和30min取样，对照为新鲜培养的青枯菌。上述样品分别经电子扫描显微镜观察，结果表明，桥石短芽孢杆菌X23的无菌培养液可以在10min内即导致青枯菌细胞膜表面出现大量的囊泡状突起，20-30min时突起的囊泡破裂，细胞内容物外渗，进而导致青枯菌细胞死亡。由附图2可见X23的无菌培养液处理青枯病菌30min后导致青枯病菌细胞破裂、病菌死亡。

实施例5：微生态抑菌剂的制备

(1)菌株的培养

配制细菌斜面培养基，接种，放入30℃培养箱中培养48小时，保存备用。

(2)制备抑菌剂，其中根据不同的应用方面和不同剂型(液体制剂和固体粉剂)

液体制剂：参照细菌摇瓶培养基的配制，灭菌前分装三角瓶(500mL瓶、装100mL液)，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，用水洗法直接洗下斜面菌体接入发酵三角瓶中，摇瓶培养，30℃，200r/min，培养48h。马上转入发酵罐发酵，参照细菌发酵罐培养基的配制，灭菌，冷却后接种与发酵，30℃，200r/min，培养48h中止发酵，马上用罐装塑料袋包装发酵液。

固体粉剂：参照细菌摇瓶培养基的配制，灭菌前分装三角瓶(500mL瓶、装100mL液)，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，用水洗法直接洗下斜面菌体接入发酵三角瓶中，摇瓶培养，30℃，200r/min，培养48h。马上转入发酵罐发酵，参照细菌发酵罐培养基的配制，灭菌，冷却后接种与发酵，30℃，200r/min，培养48h后中止发酵，离心发酵液，得到菌体，向其中加入草木炭吸附菌体，用罐装塑料袋进行包装。

实施例6 桥石短芽孢杆菌X23对多种植物病原菌的抑制作用

采用平板对峙法，测试桥石短芽孢杆菌X23对烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病菌等4种病原真菌的拮抗效果，在PDA平板中央接入直径为5mm的靶标菌丝块，随后在距离靶标菌丝块相同的距离按“实施案例1”所述的方法打孔。对称的2孔加入按“实施案例1”制备的桥石短芽孢杆菌X23无菌发酵液各20μL，其余的2孔内加入无菌的NB液体培养基做为对照。除接种马铃薯晚疫病菌的培养皿置16℃培养箱外，其余培养皿均在28℃培养。4-5d后测量并记录抑菌圈的直径。结果表明，桥石短芽孢杆菌X23的抑菌谱广，对上述4种病原真菌均有明显的抑制作用。见附图3-6和表1。从附图3中可以观察到桥石短芽孢杆菌X23对烟草黑胫病菌有明显的抑制作用；从附图4中可以观察到桥石短芽孢杆菌X23对水稻稻瘟病菌的抑制作用；从附图5中可以观察到桥石短芽孢杆菌X23对烟草赤星病菌的抑制作用；从附图6中可以观察到桥石短芽孢杆菌X23对马铃薯晚疫病菌的抑制作用；

表1 枯草芽孢杆菌对几种病原真菌的抑制作用

-：无抑制作用

+：抑菌圈直径1-4mm

++：抑菌圈直径4-8mm

+++：抑菌圈直径＞8mm

实施例7：微生态抑菌剂用于拌种的育苗工艺

采用微生态抑菌制剂(液体制剂)，用菌剂将作物种子拌湿，搅拌均匀，现拌现播。用量是每亩的种子用抑菌剂0.5kg～1.0kg。使用后，使茄子种子的出芽率提高10％以上，使作物的产量提高5％以上。

实施例8：作物生长期喷施微生态抑菌剂的田间管理工艺

采用微生态抑菌制剂(液体制剂)在幼苗期喷施幼苗叶面，每1公斤抑菌剂用500～800倍清水混匀。生长中期每1公斤抑菌剂用300～500倍清水混匀喷施叶面，一周喷施1次微生态抑菌剂。该生长期田间管理工艺的作用和特征是抑制病原菌的生长繁殖，防止或减少病菌侵入作物叶面，提高作物产量达到4％。

Claims (6)

1.一种具有抑制青枯病菌的桥石短芽孢杆菌X23 (Brevibacillus choshinensis X23)，所述菌株已于2011年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO：4534。

2.一种包含权利要求1所述桥石短芽孢杆菌的微生态抑菌剂。

3.权利要求2所述的微生态抑菌剂，其中还包括：该菌株所代谢的产物。

4.一种权利要求1所述桥石短芽孢杆菌X23在拮抗烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病菌中的应用。

5.权利要求1所述的桥石短芽芽孢杆菌或权利要求2或3所述的抑菌剂在茄子、烟草和水稻作物生产及其产品加工中用于抑制病菌的用途，所述病菌是烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌、烟草赤星病菌和马铃薯晚疫病菌。

6.权利要求4所述的用途，其中微生态抑菌剂用适量清水稀释，与茄子、烟草和水稻作物种子混合，以现拌现播方式进行育苗，可抑制病菌在苗期侵害作物幼苗，提高出芽率，减少病苗。 

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