WO2006001179A1 - ２以上のポリぺプチドから構成される蛋白質の生産方法 - Google Patents

２以上のポリぺプチドから構成される蛋白質の生産方法 Download PDF

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WO2006001179A1
WO2006001179A1 PCT/JP2005/010607 JP2005010607W WO2006001179A1 WO 2006001179 A1 WO2006001179 A1 WO 2006001179A1 JP 2005010607 W JP2005010607 W JP 2005010607W WO 2006001179 A1 WO2006001179 A1 WO 2006001179A1
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WO
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protein
dna sequence
brevibacillus
chain
dna
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PCT/JP2005/010607
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Shigezo Udaka
Akihiko Kosugi
Kazuyoshi Yajima
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Kaneka Corporation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to a DNA construct capable of efficiently producing a protein composed of two or more kinds of polypeptides, particularly a full-length antibody, using a host. Furthermore, a vector containing the DNA construct, a transformant obtained by transforming a host with the vector, and a method for producing a protein composed of two or more polypeptides using the transformant About.
  • Mammals are the cause of various diseases that are detrimental to the constant maintenance of living organisms, such as antigens (eg, viruses, bacterial toxins, chemical substances), and malignant autoantigens (eg, self-reactive lymphatics). It has a defense system that specifically captures spheres, tumor cells, and excessive factors such as in-vivo factors such as in-site force and hormones, etc.
  • antigens eg, viruses, bacterial toxins, chemical substances
  • malignant autoantigens eg, self-reactive lymphatics
  • It has a defense system that specifically captures spheres, tumor cells, and excessive factors such as in-vivo factors such as in-site force and hormones, etc.
  • an antibody is mainly produced.
  • This antibody plays a central role in the biological defense system of higher organisms, and is divided into five antibody classes of IgA, IgE, IgG, IgM, and IgD, and the basic structure is common to each class.
  • An antibody consists of two polypeptide chains (also called antibody heavy chain or H chain) with a molecular weight of 50,000-70,000 and two polypeptide chains (antibody light chain, (Also referred to as the L chain), consisting of a total of 4 polypeptide chains, each having a molecular weight of 1.5 million to 1.9 million with two homologous H chains and two L chains linked together by disulfide and non-covalent bonds It is a high molecular protein with a Y-shaped basic structure. In order for an antibody to have this Y-shaped structure, disulfide bonding between two cysteine residues in the region called the hinge region starting from about 215 residues counting from the N-terminal side in the H chain is essential. is there.
  • the N-terminal domain of the L chain and the H chain has a functional unit called a variable region whose amino acid sequence is unique to antigen binding, and an antigen as a binding partner is specified.
  • the amino acid sequence after the variable region on the C-terminal side is a domain called the constant region where each antibody class of the same species is almost constant. Has an inn.
  • This domain also called the Fc region, binds to antibody Fc region receptors such as complement, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, and macrophages.
  • the Fc region of antibody molecules plays an important role in the biological activity of antibodies in the body because it is involved in antibody-dependent cytotoxicity (ADCC activity) that requires antibodies, among the cytotoxic effects of cells. have.
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxicity
  • An antibody has long been used as a pharmaceutical having a function of capturing and eliminating a harmful antigen in a living body.
  • Early antibody drugs are antiserums or polyclonal antibodies in which various types of antibodies against so-called bacterial toxins and snake venoms are mixed.
  • this antiserum it is limited to the method of collecting from the serum, so the supply of the antiserum as an antibody drug has been limited.
  • various types of antibodies are mixed, it is very difficult to isolate a single type of antibody molecule having specificity for a specific antigen, that is, a monoclonal antibody.
  • monoclonal antibodies Compared to polyclonal antibodies such as conventional antisera, monoclonal antibodies have much superior antigen specificity and specifically inhibit the biological activity of antigens by binding, or signal transduction instead of ligands. It can be used as an extremely useful screening and medicine for the prevention and treatment of various diseases.
  • Antibody production by Escherichia coli is significantly larger than that of animal cells due to the required culture days and culture costs. In addition, the production cost can be reduced, and it can be supplied at a low cost. Therefore, it is expected as a production technique to replace animal cells.
  • E. coli since they are secreted and expressed in the periplasmic space, operations such as collecting and crushing the cells during purification are necessary, which is inconvenient in operation. Not only is it generated? There is also a negative aspect in the purification process that contamination from bacterial cell components cannot be avoided during purification of the target protein.
  • antibody proteins with more disulfide bonds are also be used.
  • MBP middle wall protein
  • an Fd 'fragment chain (a region encoding the protein from the variable region region of the H chain to the first cysteine residue in the hinge region) with MWP SD sequence and signal peptide arranged in tandem
  • the desired recombinant Fal fragment is secreted and produced into the culture medium at an extremely high efficiency of about 0.1 lg / L or more.
  • Patent Document 4 does not disclose the production of a protein such as a full-length antibody that requires accurate foam formation. Used in patent document 4, The spacer sequence intervening between the two translation units is relatively short.
  • Patent Document 1 International Publication No. 03/018771 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 63-56277
  • Patent Document 3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-238740
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 7-265094
  • Patent Document 5 US Patent No. 5665570A Specification
  • Non-Patent Document 1 Nature.1975.256: 495-497
  • Non-Patent Document 2 Chu, L, Robinson D. K, Curr Opin Biotechnol. 2000. 12: 180-187
  • Patent Document 3 Humphreys. D. P. Curr Opin Drug Discovery Dev. 2003 .6: 188-196
  • Patent Document 4 Simmons. L C. et al. J. Immunol. Method 2002.263: 133-1 47
  • Non-Patent Document 5 Carter, P. et al. Bio / Technology. 1992. 10: 163-167
  • Non-Patent Document 6 Inoue, Y et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997.48: 487-49
  • the present invention provides a DNA construct comprising a spacer sequence, wherein the spacer sequence comprises the following DNA sequence (1) or (2).
  • the present invention preferably further has one or more of the following features.
  • two or more types of translation units containing a DNA sequence encoding a polypeptide comprising any one of a DNA sequence U encoding a signal peptide and a protein composed of two or more types of polypeptides are provided.
  • the DNA construct is ligated via the spacer sequence and operably linked to a single probe motor sequence.
  • the present invention provides a light chain (L chain) or a heavy chain (H chain) comprising two translation units and each DNA sequence encoding a polypeptide of the protein constituting a full-length antibody.
  • L chain light chain
  • H chain heavy chain
  • one translation unit comprises a DNA sequence IJ encoding a signal peptide of MWP of Brevibacillus bacteria, and a DNA sequence encoding a light chain (L chain) of a full-length antibody, and A DNA translation IJ that encodes the OWP signal peptide of the Brevibacillus bacterium and a DNA sequence that encodes the heavy chain (H chain) of the full-length antibody.
  • one translation unit comprises a DNA sequence 1J encoding a signal peptide of MWP of Brevibacillus bacteria, and a DNA sequence encoding the heavy chain (H chain) of a full-length antibody, and the other
  • the translation unit contains a DNA sequence IJ that encodes the OWP signal peptide of Brevibacillus bacteria, and a DNA sequence that encodes the light chain (L chain) of the full-length antibody.
  • a DNA construct as described above is provided.
  • the present invention provides a vector comprising any of the DNA constructs described above.
  • the present invention provides a transformant obtained by introducing any of the above vectors into a host.
  • the present invention provides the transformant of any one of the above, wherein the host is a Brevibacillus genus or a Bacillus bacterium.
  • the present invention provides any one of the above transformants that produces and secretes a heterologous protein.
  • the present invention provides the transformant according to any one of the above, wherein the bacterium belonging to the genus Brevibacillus is Brevibacillus brevis, Brevibacillus bolsterensis or Brevibacillus chinensis.
  • the present invention is a method for producing a protein composed of two or more types of polypeptides, comprising culturing any one of the above transformants to produce any one of the above proteins, and Provided is a production method including a step of recovering the produced protein.
  • the present invention provides a protein obtained by the above production method.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a protein obtained by the above production method and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a target protein having a correct structure can be efficiently obtained.
  • a full-length antibody having a Y-shaped structure can be produced and accumulated in a culture solution in a substantially uniform state.
  • DNA construct refers to a DNA obtained by ligating arbitrary DNA using a recombinant DNA technique. Such DNA constructs can be prepared using techniques known to those skilled in the art.
  • the term "spacer sequence" contained in a DNA construct means a DNA sequence intervening between arbitrary translation units.
  • the spacer sequence is, for example, 20-300 nucleotides long, preferably 50-200 nucleotides long.
  • the spacer sequence is a DNA construct comprising the following DNA sequence (1) or (2).
  • any DNA sequence from immediately after the termination codon of the middle wall protein gene to immediately before the DNA sequence encoding the outer wall protein signolele peptide A DNA sequence consisting of 20 nucleotides or more.
  • DNA sequence of (1) or (2) may be referred to as “DNA arrangement or (2)”.
  • the "DNA sequence (1) or (2)" contained in the spacer sequence of the present invention has a length of 20 nucleotides or more, preferably 27 nucleotides or more, more preferably 30 nucleotides or more, more preferably 40 nucleotide length, particularly desirably 51 nucleotide length or more, preferably 60 nucleotide length or more, more preferably 80 nucleotide length or more, more preferably 100 nucleotide length or more, particularly preferably 110 nucleotide length or more, more particularly preferably 120 It is longer than the nucleotide length.
  • the length is preferably 20 or more and 127 nucleotides or less, and specifically, for example, 36 nucleotides, 51 nucleotides, or 112 nucleotides, or 127 nucleotides.
  • Brevibacillus genus bacteria that are the origin of “DNA allotment IJ (1) or (2)” contained in the spacer sequence of the present invention include Brevibacillus brevis 47 (FERM P-7224) Masle. Brevibacillus brevis 47 shares are stored as “JCM6285 shares” in the microbial material development room of the RIKEN BioResource Center.
  • a DNA encoding an OWP signal peptide in the cell wall protein operon of the genus Brevibacillus which is contained in the spacer sequence of the DNA construct of the present invention, immediately after the stop codon of the MWP gene.
  • SEQ ID NO: 14 contains Brevibacillus brevis.
  • the DNA sequence from immediately after the stop codon of the MWP gene in 47 cell wall protein operons to immediately before the DNA sequence encoding the WP signal peptide is shown (see Fig. 3).
  • a DNA sequence having an equivalent function means two or more types of translation linked via a spacer sequence under the control of an appropriate promoter sequence when used as part of the spacer sequence.
  • a DNA sequence having a function of expressing in a host two or more types of polypeptides encoded by DNA sequences contained in each unit, and the expression level ratio of the two or more types of polypeptides Means a DNA sequence in which the above polypeptides bind to each other and have a quantitative ratio suitable for constituting a single protein having the original accurate higher-order structure (or a structure similar to the original higher-order structure). To do.
  • the “DNA sequence having an equivalent function” may be a DNA sequence that hybridizes to a DNA sequence complementary to the spacer sequence under stringent conditions.
  • hybridization conditions under the stringent conditions are preferably about 7% sodium dodecinole sulfate (SDS), about 0.5M NaPO, ImM EDTA at about 50 ° C.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the "DNA binding IJ" contained in the spacer sequence of the present invention is not limited to a predetermined range of DNA binding IK1) or (2) in the cell wall protein operon of Brevibacillus sp.
  • a DNA sequence in a predetermined range in the operon having the same function as the cell wall protein operon in the genus Bibacillus may be used.
  • the "DNA construct" of the present invention includes a DNA sequence IJ encoding a signal peptide, and a DNA sequence encoding any one of proteins composed of two or more polypeptides. It is preferable that two or more types of translation units are linked via the spacer sequence and are operably linked to a single promoter sequence.
  • the “DNA binding IJ encoding a signal peptide” used in the DNA construct of the present invention is not particularly limited as long as it encodes a secretory signal peptide that functions in the host.
  • the MWP and / or OWP signal peptide of Brevibacillus brevis particularly the Brevibacillus brevis 47 DNA sequence encoding the MWP and / or OWP signal peptide of the genus Brevibacillus.
  • the DNA sequence coding is more preferred.
  • the DNA sequence encoding the OWP signal peptide of Brevibacillus' brevis 47 is shown in Fig. 3 and SEQ ID NOs: 11-13.
  • a DNA sequence encoding an improved amino acid sequence of a conventional signal peptide may be used.
  • the signal peptide of MW P of Brevibacillus' brevis 47 Met- Lys- Lys- Val- Val- Asn- Ser- Val- Leu- A la- Ser- Ala- Leu- Ala- Leu- Thr — Val— Ala— Pro— Met— Ala— Phe— Ala (SEQ ID NO: 21).
  • DNA sequence encoding a signal peptide with or without It doesn't matter.
  • the DNA sequence used does not need to be identical to the DNA sequence obtained by cloning as long as it encodes the same amino acid when translated in the host, even if the codon is replaced with a degenerate codon. .
  • polypeptide refers to a peptide chain having a plurality of peptide bonds, and refers to those having 10 or more amino acid residues.
  • a protein composed of two or more types of polypeptides is a protein formed by combining two or more types of polypeptides, and the composition ratios of the respective polypeptides are different. Are also included in this case.
  • the number of types of polypeptides constituting the protein is not particularly limited as long as it is 2 or more, but it is preferably 2 forces 4, more preferably 2 or 3, and most preferably 2. Examples of such proteins include full-length antibodies
  • polypeptides may originate from the same gene, but usually antibodies, protein hormones LH (luteinizing hormone), FSH (follicle stimulating hormone), HCG (human chorionic gonadotropin) , And encoded by different genes as in TSH (Thyroid Stimulating Hormone).
  • LH luteinizing hormone
  • FSH follicle stimulating hormone
  • HCG human chorionic gonadotropin
  • TSH thyroid Stimulating Hormone
  • a protein composed of two or more kinds of polypeptides means that, as long as the protein requires the binding of two or more different polypeptides in order to express a biological function, The same polypeptide may be included.
  • a protein composed of two different polypeptides is known as a heterodimeric protein. Further examples of such proteins are proteins such as herdarin, integrin, activin, and inhibin.
  • a “full-length antibody” is a protein produced in an animal individual by an immune response as a result of antigen stimulation to the animal individual, and is specific to the immune source (antigen). It has activity to bind to. That is, any protein may be used as long as it has an activity of specifically binding to a substance having antigenicity among proteins, polysaccharides, nucleic acids, lipids and the like, or a substance containing the aggregate.
  • full-length antibodies include, but are not limited to, those having the antibody structure (Y-shaped basic structure) described in [Background Art] and the activity of specifically binding to an antigen. Those having the biological activity of the antibody constant region described in [Background Technology] in vivo are also included.
  • a “full-length antibody” as described herein is a low molecular weight Fv, Fab, or Fa b 'and also different from small molecule antigen-binding fragments such as single chain antibodies such as scFv or dsFv.
  • the "full-length antibody” shown here is one or several structural amino acids within a range in which binding activity to an antigen and biological activity are not lost. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 or more amino acid substitutions, deletions and / or additions may be introduced, specifically mice Examples include antibodies, humanized antibodies, bispecific antibodies, toxin-fused antibodies, or mouse's human chimeric antibodies in which mouse antibodies are brought close to human antibodies by a combination thereof. More specifically, examples include mouse 'human chimeric anti-human tumor necrosis factor antibody and mouse' human chimeric anti-human CD20 antibody (hereinafter referred to as "human tumor necrosis factor” as "human TNFa", “mouse 'human chimeric anti-human tumor. "Necrosis factor antibody” is abbreviated as "anti-human TNF antibody”). However, having or not having recombination is not an important problem for the present invention.
  • a DNA sequence encoding a full-length antibody is obtained by a commonly used known method, and is obtained by cloning or a known polymerase 'chain' reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method. it can. It can also be synthesized from known chemical synthesis methods (Nucleic acids Res. 12: 4359 (1984)) and can be obtained from a single cDNA library.
  • the DNA sequence encoding the full-length antibody is identical to the DNA obtained by cloning as long as it encodes the same amino acid when translated in the host, even if the codon is replaced with a degenerate codon. There is no need.
  • translation unit means a genetic element comprising a DNA sequence encoding a polypeptide and an adjacent regulatory region.
  • the flanking control region means, for example, an SD sequence that functions in the host.
  • SD ⁇ ⁇ ⁇ IJ (Shine—Dalgarno sequence) is a common sequence found upstream of the start codon in prokaryotic mRNA, and is usually rich in purine bases (adenine and guanine) like one AGGAGG—. However, the DNA sequence capacity of 3 to 9 bases (average of 4.8 bases).
  • the number of translation units is arbitrary, and the number is 2, 3, It can be 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more. The number is preferably 2 to 4, more preferably 2 or 3, and most preferably 2.
  • promoter includes any constitutive or inducible promoter. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include the polll promoter 1, the polIII promoter, the PhoA promoter, the ⁇ -lactamase promoter, the tryptophan (trp) promoter and hybrid promoters such as the tac or trc promoter. Any promoter can be used as long as it functions in the host. Preferably, a promoter derived from Brevibacillus bacteria is used.
  • Brevibacillus' brevis especially the MWP promoter region derived from Brevibacillus' brevis 47 (FERM P-72 24) (JP 1-58950, JP 7-10822 4) or Brevibacillus' HWP promoter region derived from Chou sinensis, especially Brevibacillus' Chou sinensis HPD31 (FERM BP-1087) (same strain as Bacillus brevis H102 (FERM BP-1087)) — No. 133782), for example, the P2 promoter.
  • the number of promoters can be any number, preferably a single promoter is used.
  • operably linked means that two or more DNA sequences are linked in a physically and / or functionally related state. For example, if a promoter and a translation unit are linked via an appropriate DNA sequence, and the promoter force affects the expression level of the polypeptide encoded by the part of the translation unit, both It is “connected as possible”.
  • the above-mentioned spacer sequence, promoter sequence, SD-arrangement lj, and DNA sequence encoding the signal peptide are, for example, Brevibacillus bacteria or Brevibacillus brevis 47 (FERM P_ 7224) chromosome.
  • DNA can be obtained by using a known PCR method to specifically increase DNA in a saddle shape.
  • the "DNA construct" of the present invention there are two translation units, wherein one translation unit includes a DNA sequence encoding an L chain constituting a full-length antibody, and other translation units The unit contains a DNA sequence encoding the heavy chain that constitutes a full-length antibody.
  • a preferred embodiment of the “DNA construct” of the present invention comprises two translation units, wherein one translation unit encodes a DNA peptide IJ encoding a MWP signal peptide of Brevibacillus bacteria, and a full-length antibody.
  • the other translation unit contains a DNA sequence that encodes the L chain
  • the other translation unit contains a DNA sequence 1J that encodes the WP signal peptide of Brevibacillus bacteria, and a DNA sequence that encodes the H chain of the full-length antibody.
  • An example of a particularly preferred "DNA construct" of the present invention is that the SD sequence derived from the MWP gene and the signal peptide of the MWP are located downstream (3 'end) of the MWP promoter motor region of Brevibacillus brevis.
  • a DNA molecule capable of autonomous replication in an appropriate host cell and known to those skilled in the art can be used.
  • the vector may optionally include a marker sequence. Markers include antibiotic resistance genes such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol and neomycin.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can introduce the DNA construct of the present invention and has a function of introducing it into a host, but pHY500 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-31682) ), PNU200 (Shigezo Tsujitaka, Journal of the Agricultural Society of Enomoto 61, 669—676 (1987)), pNH301 (Shiga. Y et al. 1992. Applied and Environmental Microbiology, 58: 525-531.), PNH400 (Ishihara , T, et al., 1995. J. Bacteriol, 177: 745-749), pNY700 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • the “transformant” of the present invention can be obtained by transforming a suitable host with the vector of the present invention.
  • the host used in the present invention includes bacteria, animal cells, plant cells, or fungi and others, and is not particularly limited, but Escherichia coli, Bacillus bacteria, or Brevibacillus bacteria are preferably used. Brevibacillus bacteria can be used more suitably.
  • Bacillus bacterium examples include Bacillus subtilis, B. acidocaldarius, B. coagulans, B. polymyxa, B. alkalophilus ⁇ B. pasteurii, B. pantothenticu s, B. pasteurii, Psychrophiles ⁇ B. globispoms, B. insoli us, B. marinus, B. macquariensis, B. megaterium, B. polymyxa, B. acidocaldarius, B. schl egelii, B. stearothermophilus, B. azotoformans, B. cereus, B. laterosporu s, B. licheniformis , B. pasteurii, B.
  • stearothermophilus ⁇ B. macerans, B. polymyxa, B. macerans, B. brevis, B. cereus, B. circulans, B. laterosporu s, B. licheniformis, B. polymyxa, B. pumilus, The ability to raise B. subtilis, B. larvae B. len timorbis, B. popilliae, B. larvae and B. lentimorbis.
  • Examples of the genus Brevibacillus include Brevibacillus agri, B. borstelensis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshmensis, B. formosus, B. mvoca us, B.
  • Brevibacillus 'brevis Brevibacillus. Bolsterensis, and Brevibacillus. Choshinensis are preferred
  • Brevi Bacillus' brevis 47 (FERM P_ 7224) Brevibacillus 'brevis 47_5Q (Ud aka, S. et al., 1993. Method Enzymol, 217: 23—33)
  • Brepino chinoles' choshinensis HPD31 (FERM BP-1087) may be more suitably used.
  • mutant strains such as protease-deficient strains and high-expression strains of the above-mentioned Brevibacillus bacteria may be used depending on the purpose of improving the production amount.
  • Transformation of the host used in the present invention can be performed, for example, by the known method of Takahashi et al. (Takahashi. W et al. J. Bacteriol. 1983. 156: 1130-1134), the method of Takagi et al. (Takagi. H. et al. 1989. Agric. Biol. Chem, 53: 3099-3100), or by the method of Okamoto et al. (Okamoto. A et al. 1997. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 202-203) The method is not particularly limited.
  • a heterologous eukaryotic protein When a heterologous eukaryotic protein is highly expressed in a microorganism, the protein binds inside and / or outside of the cytoplasm and forms an aggregate called a biologically inactive insoluble substance. In particular, proteins containing many cysteine residues and having many disulfide bonds often form aggregates.
  • a target protein when expressing a target protein, it is known that degradation of the target protein aggregate and secretion efficiency can be suppressed by acting chaperone protein, disulfide-linked isomerase, proline isomerase, etc. .
  • Widely attempted methods include PPIases (peptidyl cis-trans isomerase) such as FkpA (Missiakas D et al.
  • PPIase lournal of biological chemistry y 275 22), 17100—17105, 2000
  • PPIase lournal of biological chemistry y 275 22), 17100—17105, 2000
  • FkpA protein disulfide isomerase
  • International Publication No. 01/068884 pamphlet International Publication No. 01/068884 pamphlet
  • disulfide One or more selected from the group of oxidoreductases Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-169675
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-169675 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-169675
  • the transformant transformed with the vector of the present invention expresses two or more polypeptides constituting the target protein in an appropriate quantitative ratio, and the protein itself or a similar three-dimensional structure (and (Or an original activity of the protein or an activity similar thereto).
  • the full-length antibody having an accurate Y-shaped structure can be produced and accumulated in a culture solution in a substantially uniform state.
  • the present invention is also a method for producing a protein, comprising a step of culturing the transformant of the present invention to produce the protein, and a step of recovering the produced protein.
  • the medium used for culturing the bacterial transformant of the present invention is not limited as long as it can secrete and express a protein composed of two or more kinds of polypeptides with high efficiency and high yield. Specifically, glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract
  • a carbon source such as casamino acid or a nitrogen source can be used.
  • organic salts such as potassium, sodium, phosphate, magnesium, manganese, zinc, or iron salts are added as necessary.
  • a host imparting auxotrophy if a host imparting auxotrophy is used, a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, or neomycin may be added.
  • the culture temperature is about 15 _42 ° C, preferably about 28 _32 ° C, and it is desirable to perform aerobic culture under aeration and agitation conditions. May be.
  • the protein can be collected from the culture medium and purified as desired.
  • Bacteria can be crushed and extracted by methods using ultrasonic waves, French press, alkali or SDS treatment.
  • the obtained protein can be obtained by conventional protein purification methods such as salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, gel filtration, ion exchange, hydroxyapatite, protein A, protein G, protein L, or antigen-binding affinity. It can be purified by column chromatography using a carrier such as tea.
  • a protein composed of two or more types of polypeptides contains at least two of the same polypeptides
  • the secreted amount of the polypeptides contained in the two or more can also have an effect of increasing.
  • the present invention not only expresses a protein composed of two or more kinds of polypeptides, but also includes a translation unit containing a DNA sequence encoding a polypeptide of a protein composed of one kind of polypeptide.
  • a translation unit containing a DNA sequence encoding a polypeptide of a protein composed of one kind of polypeptide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a protein produced by the method of the present invention.
  • the pharmaceutical composition can be produced by mixing a protein composed of two or more polypeptides produced according to the method of the present invention with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient.
  • the diluent, carrier, or excipient is any organic or organic material suitable for each dosage form, such as oral, enteral, transdermal, subcutaneous, parenteral (eg, intravenous) or intraperitoneal administration. obtain.
  • Diluents, carriers, and excipients are not particularly limited, e.g., water, gelatin, gum arabic, ratatoose, microcrystalline cellulose, starch, sodium starch glycolate, calcium hydrogen phosphate, magnesium stearate, talc, or colloid Silicon dioxide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also contain other pharmacologically active agents, and Z or conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, flavoring agents, or buffering agents.
  • the present invention for example, when a protein composed of two or more kinds of polypeptides is produced in a host, the protein itself or a similar three-dimensional structure (and / or its structure) It is possible to efficiently obtain a protein having the original activity of the protein or an activity similar thereto.
  • FIGS. 1 to 12 Abbreviations used in 12 are described below.
  • MWP Brevibacillus brevis cell wall protein
  • OWP Brevibacillus brevis cell wall protein
  • MWP P Brevibacillus brevis cell wall protein MWP promoter region
  • SDM Brevibacillus brevis cell wall protein MWP SD sequence
  • SPO Brevibacillus' brevis cell wall protein ⁇ DNA sequence encoding signal peptide of WP
  • VL L chain variable region
  • VH H chain variable region
  • CH1 H chain constant region
  • CH2 H chain constant region
  • FIGS. 8 to 10 Abbreviations and the like used in 10 will be described below.
  • ⁇ indicates a molecular weight marker (201, 120, 100, 55, 38, 29, 20 kDa), and pNH30l / 31OK indicates a culture supernatant from a transformant having ⁇ 301.
  • OWPT represents the culture supernatant from the transformant having L-OWPT- ⁇ / ⁇ 301.
  • OWPSD indicates a culture supernatant from a transformant having L ⁇ ⁇ WPSD_HZpNH301.
  • LH indicates a culture supernatant from a transformant having LH2 5 / pNH301.
  • LpH indicates a culture supernatant from a transformant having LpH25 / pN H301.
  • S represents the lane of anti-human TNFa antibody standard (3 nanograms). The arrow indicates the mobility of the expressed full-length anti-human TNFa antibody.
  • Example 1 Construction of anti-human TNFa antibody L chain expression vector L / pNH301 and anti-human TNFa antibody H chain expression vector H / pNH301
  • PBluescripf anti-human TNF a antibody obtained and prepared according to the gene sequence of the anti-human TNF a antibody L chain and H chain described in US Pat. No. US5698195, and the synthetic oligonucleotide TNF-LF1: 5, GCTCCCATGGCTTTCGCTGACATCTTG CTGACTCAGTCT-3 '(SEQ ID NO: 1) and TNF—LR1: 5'—TTTCTGCAGC TAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3' (SEQ ID NO: 2) are used as primers to perform PCR, and to encode the anti-human TNF antibody L chain. A 0.665 kbp fragment was obtained. The obtained L chain-encoding gene fragment was treated with restriction enzymes Ncol and Pstl.
  • TNF—HF1 5,-GCTCCCATGGCTTTCGCTGAAGTGAAA CTTGAGGAGTCT-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • TNF—HRl 5'-CCCAAGCTTT CATTTACCCGGAGACAGGGA-3 '(SEQ ID NO: 4) as anti-human.
  • An approximately 1.45 kbp fragment encoding the TNF a antibody H chain was obtained.
  • the obtained H chain-encoding gene fragment was treated with restriction enzymes Ncol and Hindlll. For each restriction enzyme The more digested anti-human TNFa antibody L chain and H chain encoding gene fragments were separated with 2% agarose and extracted from the gel to obtain gene fragments.
  • the expression vector pNH 301 shown in FIG. 1 was digested with restriction enzymes Ncol and Pstl and Ncol and Hindlll, respectively, and then treated with alkaline phosphatase (BAP), and the previously obtained anti-human TNF antibody L chain, The H chain coding gene fragment was ligated with T4 ligase to obtain L / pNH301 and HZpNH 301, respectively (FIG. 2).
  • Example 2 Full-length anti-human TNFa antibody expression vector _ 0 ⁇ ?? Ding_117 ⁇ : Construction of «301 Signal including SD sequence of 0 WP from the stop codon of MWP of Brevibacillus brevis In order to obtain a DNA sequence encoding the peptide, about 1 ⁇ g of chromosomal DNA was extracted from Brevibacillus brevis 47 (F ERM P-7224) strain according to a conventional method and purified.
  • PCR was performed using GCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 6) to obtain a gene fragment of about 0.22 kbp.
  • This gene fragment consists of the MWP and OWP operon structures of Brevibacillus brevis, the terminator after the MWP stop codon TAA, the SD sequence of OWP, and the signanole peptide (Met— Asn— Lys— Lys— Val— Val — Leu— Ser— Val— Leu— Ser-Thr-Thr-Leu-Val-Ala- Ser-Val-Ala-Ala- Ser-Ala-Phe-Al a: SEQ ID NO: 24), And the DNA sequence encoding the N-terminal G1u-Val-Lys-Leu-Glu_Glu_Ser (SEQ ID NO: 23) of the H chain of the anti-human TNF ⁇ antibody (see FIG. 3).
  • a synthetic oligonucleotide primer TNF_HF2 5, -GTTGCAGCAT CTGCATTTGCAGAAGTGAAACTTGAGGAGTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 7) was prepared using the HZpNH301 encoding the H chain of the anti-human TNF antibody obtained in Example 1 as a saddle type. PCR was performed using the primer TNF—HR1: 5′-CCCAAGCTTTCATTTACC CGGAGACAGGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 4) used in 1. Obtained 1.5kbp The PCR fragment of Fig.
  • This 1.5 kbp fragment and the above gene fragment are used as a synthetic oligonucleotide primer OWP.
  • F1 5,-CGGGGTACCGAA ATACAGTTAATTAGTTAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 5) and TNF — HR1: 5'-CC CAAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3 '(SEQ ID NO: 4) 1997.
  • Bruce A. White (eds) PCR Cloning protocols lorm molecular cloning to genetic engineering. 141-149. Humana Press, Totowa, NJ.
  • This gene fragment was digested with restriction enzymes Kpnl and Hindlll, extracted and purified with 0.8% agarose gel, and ligated between Kpnl and Hindlll of L / pNH301 obtained in Example 1 using T4 ligase.
  • OWPT—H / pNH301 was obtained (FIGS. 4 and 11) (SEQ ID NOs: 15 to 17).
  • Example 2 the sequence corresponding to the "spacer sequence" of the present invention, r c tgcaggatccgtc gactctctaggactcgaggaattcggtaccgaaatacagttaattagttagaagttagtatcgggttactaggtacagcta gaggggagttatcccctctattacccaaacaatagagaacttcctatcaacat "(eye himself ⁇ 1 J3 ⁇ 4 ⁇ " ⁇ "2 Ri) and that Do not.
  • DNA layout 1J (1) or (2) contained in the spacer sequence of the present invention is “gaaata cagttaattagttagaagttagtatcgggttactaggtacagctagaggggagttatcccctctaactcttattacccaaa caatagagaacttcctatcaacat” (SEQ ID NO: 27).
  • This SEQ ID NO: 27 is a DNA sequence from immediately after the stop codon of the MWP gene in the cell wall protein operon of Brevibacillus brevis 47 to immediately before the DNA sequence encoding the OWP signal peptide IK SEQ ID NO: 14 (4) Corresponds to a DNA sequence of 112 nucleotides in length.
  • H / pNH301 encoding the H chain of the anti-human TNFa antibody was used as a cage, and the synthetic oligonucleotide primer TNF—HF2: 5, 1 GTTGCAGCATCTGC ATTTGCAGAAGTGAAACTTGAGGAGTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and Then, PCR was performed using the previous plastic 3 ′ (SEQ ID NO: 4), and the IJ encoding the H chain of the anti-human TNFa antibody and a part of the OWP signal peptide (Val-Ala) on the 5 ′ side.
  • a 1.5 kbp gene fragment containing a sequence encoding —Ala—Ser—Ala—Phe—Ala: SEQ ID NO: 25) was obtained.
  • a synthetic oligonucleotide primer WP-F2 5 in the same manner as described in Example 2 '-CGGGGTACCTATTACCCAAACAATAGAGAACTT-3, (SEQ ID NO: 8) and primer TNF— HR1: 5'-CCCAAGCTTTCATTTACCCGG AGACAGGGA-3 '(SEQ ID NO: 4) encodes OWP SD sequence and WP signal peptide
  • About 1.6 kbp of a gene fragment containing the sequence and the sequence encoding the ⁇ chain of the anti-human TNF ⁇ antibody was obtained.
  • the sequence corresponding to the “spacer sequence” of the present invention in Example 3 is r c tgcaggatccgtc gactctctaggactcgaggaattcggtacctattacccaaacaatagagaacttcctatcaacat ”( ⁇ d column 3 ⁇ 4 ⁇ No. 28).
  • the “DNA layout 1J (1) or (2)” contained in the spacer sequence of the present invention is “ta ttacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat” (Tatsumi Ij number 29).
  • This IJ number 29 is the DNA sequence IJ (SEQ ID NO: 14) immediately after the stop codon of the MWP gene in the cell wall protein operon of Brevibacillus brevis 47 to immediately before the DNA sequence encoding the signal peptide of WP. ) In the DNA sequence consisting of 36 nucleotides in length.
  • Comparative Example 1 Construction of an anti-human TN F antibody expression vector LH25ZpNH301 not containing the Brevibacillus brevis cell wall protein operon structure
  • An expression method using one example of the “DNA construct” of the present invention which includes a DNA arrangement U consisting of at least a long length, and a spacer sequence that does not contain the above “DNA sequence” Compare the full-length antibody-forming ability with the expression method.
  • the 1.5 kbp gene fragment obtained by PCR encodes from the SD sequence of MWP derived from the H / pNH301 expression plasmid to the MWP signal peptide and the stop codon of the H chain.
  • This 1.5 kbp gene fragment was digested with the restriction enzymes Pstl and Hindlll, and ligated with T4 ligase into the restriction enzyme site of L / pNH3 01 separately digested with Pstl and Hindlll to obtain LH25 / pNH301. [ Figure 6].
  • Comparative Example 2 Construction of an anti-human TN F antibody expression vector LpH25ZpNH301 containing no Brevibacillus brevis cell wall protein operon structure
  • An expression method using one embodiment of the “DNA construct” of the present invention which includes a DNA arrangement U consisting of an arbitrary 20 nucleotides or more of the DNA sequence immediately before, and a spacer sequence.
  • a DNA arrangement U consisting of an arbitrary 20 nucleotides or more of the DNA sequence immediately before
  • a spacer sequence In contrast to the two cistron expression method (Fig. 7) in which the L chain and the H chain are individually placed under the control of a promoter (Fig. 7) Compare performance.
  • HZpNH301 constructed in Example 1 was used as a cage, and synthetic oligonucleotide primer TNF—HF4: 5′-TTTTCTGC AGGAATATACTAGAGATTT TTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10) and TNF_HR1: 5′-CCCAAGCTTTCATTTAC CCGGAGACAGGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 4) PCR was performed.
  • the approximately 1.7 kbp gene fragment obtained by PCR encodes from the MWP promoter P5, MWP SD sequence derived from the H / pNH301 expression plasmid to the signal peptide and the H chain stop codon.
  • the approximately 1.7 kbp gene fragment was digested with restriction enzymes Pstl and Hindlll and ligated into L / pNH301 separately digested with Pstl and Hindlll using T4 ligase to obtain LpH25 / pNH301 (FIG. 7).
  • Example 4 Acquisition of Brevibacillus choshinensis full-length anti-human TNFa antibody expression strain Brevibacillus choshinensis HPD31 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-56277, FERM BP 1087) was subjected to a known mutation treatment to obtain bacterial cells Brevibacillus choshinensis HPD31—OK strain (FERM BP-4573) obtained as a strain with low external protease activity was mainly used.
  • Example 5 Expression test of full-length anti-human TNFa antibody using Brevibacillus choshinensis transformant strain
  • the resulting transformant OWPT strain, OWPSD strain, LH strain, LpH strain and Brevibacillus choshinensis HPD31 _OK strain containing only the pNH301 plasmid as a control medium was produced using 3YC (polypeptone S 3%, yeast Extract 0.5%, Gnole course 3%, MgS O 70.0 0.01%, CaCl 70.0 0.01%, MnSO 40.0 0.001%, FeSO
  • the cells were cultured in a medium consisting of g / L at 30 ° C under aerobic conditions for 3-4 days.
  • the culture solution was centrifuged (10, OOOrpm, 4 ° C, 5 minutes) and then subjected to Western blotting using anti-human IgG antibody.
  • Example 6 Detection of full-length anti-human TNFa antibody in the culture supernatant obtained from the transformant
  • Each culture supernatant collected by centrifugation was subjected to non-reducing treatment and reducing treatment.
  • non-reducing treatment 0.01 ml of lOOmM odoacetic acid was added to 0.09 ml of the culture supernatant, and then 0.1 ml of 2 ⁇ SDS sample buffer (without a reducing agent) was added.
  • 0.01 ml of 1M dithiothreate was added to 0.09 ml of the supernatant, and then 0.1 ml of 2 ⁇ SDS sample buffer was added.
  • HRP horseradish rust peroxidase
  • H + L horseradish rust peroxidase
  • IgG (Fc) antibody manufactured by Rockland
  • HPR-labeled goat anti-usagi IgG antibody manufactured by Rockland
  • detection was carried out by diluting each to an appropriate concentration.
  • Signal detection can be performed using SuperSignal WestPico (PIE Chemiluminescence method using RCE).
  • an anti-human TNF antibody [infliximab (genetical recombination) manufactured by Tanabe Seiyaku Co., Ltd.] obtained from cultured cells derived from human embryonic kidney was used for the experiment.
  • OWPT and OWPSD strains expressed using the Brevibacillus brevis cell wall protein operon structure pattern are more resistant to L and H chains present in the culture supernatant than LH and LpH strains.
  • Contaminant bands such as chain monomers and dimers were reduced, and the band with a molecular weight of around 19 OkDa was specifically increased, resulting in the promotion of full-length antibody molecule formation [Fig. 8].
  • a band was detected in all transformants at positions corresponding to the L chain (molecular weight of approximately 26 kDa) and H chain (molecular weight of approximately 51 kDa) of the anti-human TNFa antibody.
  • the spacer according to one embodiment of the present invention.
  • Example 7 Purification of full-length anti-human TNFa antibody from Brevibacillus choshinensis transformant
  • Each of the transformants OWPT and OWPSD obtained in Example 4 was cultured in 30 ml of 3YC medium for 3 days at 30 ° C., and the supernatant culture solution was collected by centrifugation, and ammonium sulfate 50% 75. After salting out using the / 0 saturated fraction, dialysis was performed against 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). The dialyzate is adjusted to acidic pH, the acidic precipitate fraction is removed by high-speed centrifugation, and the supernatant is subjected to cation exchange chromatography (CM_ Sepharose: Amersham Biosciences) with a 0-1M NaCl concentration gradient. separated.
  • CM_ Sepharose Amersham Biosciences
  • the full-length antibody fraction is collected, subjected to gel filtration chromatography (Superose: Amersham Bioscience), the high molecular fraction is collected, concentrated with an ultrafiltration membrane, and then protein A affinity chromatography. Purification was carried out by GRAPHI (Amersham Bioscience). Through the above purification procedure, about 1 mg of full-length anti-human TNFa antibody could be purified and recovered.
  • Example 8 Confirmation of N-terminal amino acid sequences of L and H chains constituting recombinant anti-human TNFa antibody
  • Example 7 The full-length anti-human TNFa antibody obtained in Example 7 was reduced by the same method as in Example 6, and then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. Bands with molecular weights corresponding to molecular weights of 25 kDa and 50 kDa were cut out from the gel, and their N-terminal amino acid sequences were analyzed up to 5 residues according to a conventional method. As a result, the 25 kDa band had the same N-terminal amino acid sequence as the anti-human TNF a antibody L chain, and the 50 kDa band had the same N-terminal amino acid sequence as the anti-human TNF antibody H chain.
  • Example 9 Evaluation of binding activity of recombinant anti-human TNFa antibody to human TNF ⁇
  • the binding ability to human TNFa was determined according to the enzyme immunoassay (ELISA).
  • the ELISA measurement method was as follows: PBS buffer containing 5-10 ng of recombinant human TNF (Serotec) in each well of a 96-well microplate was left at 4 ° C overnight, then 25% Block Ace (Wako Pure Chemical) Reaction plate blocked with PBS buffer solution. Purified anti-human TNFa antibody diluted appropriately in PBS buffer was added, reacted at 37 ° C for 1 hour, then 0.01% Tween20 (substance name: polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Washed with PBS containing ICI).
  • a protein for example, a full-length antibody
  • the amount and yield can be increased significantly.
  • a protein composed of two or more polypeptides can be directly obtained as an active form. Therefore, the examples of the present invention are extremely effective in pharmaceutical production and the like that are inexpensive and require a large amount of the protein.
  • the present invention is a very effective means in the manufacture of a product (for example, a pharmaceutical or a medical diagnostic agent) containing a protein composed of two or more polypeptides.
  • FIG. 1 shows the structure of the Brevibacillus brevis protein secretion expression vector (pNH301) described in Example 1.
  • FIG. 2 shows the structure of the anti-human TNFa antibody L chain and H chain secretion expression vector constructed in Example 1.
  • FIG. 3 shows the sequence of the Brevibacillus brevis cell wall protein (OWP, MWP) operon structure described in Example 2 (SEQ ID NO: 11). 4] The anti-human TNFa antibody secretion expression vector (L—OWPT—H / p NH301) constructed in Example 2 is shown.
  • FIG. 5 shows the anti-human TNFa antibody secretion expression vector (L-OWPSD-H / PNH301) constructed in Example 3.
  • FIG. 6 shows an anti-human TNFa antibody secretion expression vector (LH25 / pNH301) constructed in Comparative Example 1.
  • FIG. 7 shows the anti-human TNFa antibody secretion expression vector (LpH25 / pNH301) constructed in Comparative Example 2.
  • FIG. 8 shows the state of the antibody in the culture supernatant (non-reducing treatment) of the anti-human TNFa antibody expression strain obtained in Example 5.
  • FIG. 9 shows the state of the antibody in the culture supernatant (reduction treatment) of the anti-human TNFa antibody expression strain obtained in Example 5.
  • FIG. 10 shows anti-human TNFa antibody expression obtained in Example 7 and measurement of the binding activity of purified antibodies obtained from culture supernatants of OWPT and OWPSD strains to human TNFa.
  • FIG. 11 shows a portion corresponding to SEQ ID NO: 15 in the full-length anti-human TNFa antibody expression vector L OWPT- H / pNH301 shown in FIG.
  • FIG. 12 shows a portion corresponding to SEQ ID NO: 18 in the full-length anti-human TNFa antibody expression vector L OWPSD- H / pNH3 01 shown in FIG.

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Abstract

真核生物由来の蛋白質のような、正確なフォーム形成が必要な、２以上のポリペプチドから構成される蛋白質を細菌に生産させることが求められている。 本発明は、翻訳ユニット間に特定のスペーサー配列を含むＤＮＡ構築体、ベクターと宿主、形質転換体、及びそれらを用いた２以上のポリペプチドで構成される蛋白質の生産方法、及びまたそのような蛋白質を含む医薬組成物に関する。

Description

明 細 書
2以上のポリペプチドから構成される蛋白質の生産方法
技術分野
[0001] 本発明は、 2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質、とりわけ完全長抗体を 、宿主を用いて効率よく製造する事を可能にする DNA構築体に関する。さらに、当 該 DNA構築体を含むベクター、当該ベクターにより宿主を形質転換して得られる形 質転換体、および、当該形質転換体を用いた 2種類以上のポリペプチドから構成さ れる蛋白質の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 哺乳動物は、生体の恒常的維持にとって有害である種々の疾患発病や病気の原因 となる抗原 (例えばウィルス、細菌毒素、化学物質等）、また悪性自己抗原 (例えば自 己反応性リンパ球、腫瘍細胞、過剰のサイト力インやホルモンなどの生体内因子など )を特異的に捕捉し生体力 排除する防御システムすなわち体液性免疫を有してい る。この体液性免疫では、上述した抗原の刺激の結果、主に抗体と呼ばれる高分子 蛋白質が産生される。
[0003] この抗体は高等生物の生体防御系において中心的な役割を担っており、 IgA、 IgE、 IgG、 IgM、 IgDの 5つの抗体クラスに分けられて、基本構造は各クラス共通である。 抗体は、分子量 5万— 7万の 2本のポリペプチド鎖（抗体重鎖、 H鎖とも呼ばれる）と 分子量約 2. 3万— 2. 5万の 2本のポリペプチド鎖（抗体軽鎖、 L鎖とも呼ばれる）との 計 4本のポリペプチド鎖により構成され、それぞれ相同な 2本の H鎖と 2本の L鎖がジ スルフイド結合及び非共有結合により結合した、分子量 150万から 190万となる Y字 型の基本構造を有する高分子蛋白質である。抗体がこの Y字型構造を有するために は、 H鎖中の N末端側から数えて約 215残基前後から始まるヒンジ部と呼ばれる領域 内の、 2つのシスティン残基同士のジスルフイド結合が必須である。
[0004] L鎖、 H鎖の N末端ドメインにはアミノ酸配列が抗原結合に固有である可変部と呼ば れる機能単位が存在し、結合相手である抗原が特定化される。その可変部以降 C末 端側のアミノ酸配列は、同種動物の各抗体クラスがほぼ一定な定常部とよばれるドメ インを有している。このドメインは Fc領域とも呼ばれ、補体、 Bリンパ球、 Tリンパ球、好 中球、マクロファージなどの抗体 Fc領域受容体と結合する。また抗体分子の Fc領域 は、細胞による細胞障害作用のうち、抗体を必要とする抗体依存性細胞障害活性 (A DCC活性）に関与することから、生体における抗体の生物学的活性に重要な役割を 持つ。
[0005] 抗体は、生体における有害な抗原の捕捉及び排除という機能を有する医薬品として 古くより利用されている。初期の抗体医薬は、いわゆる細菌毒素やへビ毒に対する様 々なタイプの抗体が混在する抗血清すなわちポリクローナル抗体である。しかしなが ら、この抗血清を取得するためには、血清からの回収による方法に限られていること から、その抗体医薬としての抗血清の供給は限りがあった。また、様々なタイプの抗 体が混在することから、特定の抗原に対する特異性を持つ単一タイプの抗体分子、 すなわちモノクローナル抗体を単離する上でも非常に困難が伴う。
[0006] これらの問題は 1975年にケーラーとミルシュタインによる細胞融合技術、すなわちハ イブリドーマ法によるモノクローナル抗体の作製の成功により解決され、均一で高い 抗原特異性と親和性を持ち、安定的に供給可能なマウスモノクローナル抗体を得る ことが可能となった (非特許文献 1参照)。この方法は特定の抗原と反応するマウス B 細胞とマウス腫瘍細胞とを融合して、特定の抗体を産生しかつ安定に増殖するハイ プリドーマを作製し、ハイプリドーマ細胞を培養することにより細胞培養液中からモノ クローナル抗体を精製、取得することを可能とする。
[0007] モノクローナル抗体は従来の抗血清のようなポリクローナル抗体に比較し、その抗原 特異性が格段に優れ、特異的に結合することにより抗原の生物活性を阻害、増強、 またはリガンドに代わるシグナル伝達の阻害や細胞間接着を阻害することが出来るこ とから、様々な疾患の予防及び治療のための極めて有用な検查薬や医薬品として用 いられている。
[0008] 近年、遺伝子工学の発展によりマウスモノクローナル抗体の一部とヒトモノクローナル 抗体との一部から成る組み換え型キメラ抗体、並びに完全ヒト化抗体が研究開発され ている。ヒトに投与したとき従来から問題とされていた HAMA (ヒト抗マウス抗体）が誘 導されること無ぐ様々な疾患治療に対し十分な効果を持つ抗体医薬品が生産され るようになっている。この遺伝子組換えによる抗体生産は、現在一般的に、動物細胞 、特にチャイニーズノ、ムスター卵巣細胞由来の CHO細胞、及びマウスミエローマー 由来の NS0細胞及び SP2/0細胞（非特許文献 2参照）で行われている。
[0009] しかし、動物細胞による組換え抗体医薬品製造は、培養に用いられる培地に掛かる 費用や多大な培養日数などのために製造コストが非常に高い。さらに安定な細胞を 樹立するには多数の細胞株から選択する必要がある。このように、生産使用可能な 安定的な抗体発現細胞株の樹立までには手間と労力とが必要となっている。従って 、もし動物細胞において目的の抗体を多量に得ようとするのであれば、生産量を上げ るため高価で大量の培地を用い、継続的な培地の添加により培養日数を増加させざ るを得ない。その製造コストはそのまま薬品価格へ反映されるのが一般的である。以 上のような背景のもと、 目的の抗体を安価かつ高生産できる技術が望まれている。
[0010] この動物細胞による抗体生産技術の問題点を克服するため、組換え抗体を微生物、 トランスジエニック植物や動物において安価に生産させる技術が開発されている。中 でも微生物では、大腸菌 (Escherichia coli)を用いた抗体生産技術が数多く報告 されており、特に抗体の抗原特異的結合性のみを利用したい場合に用いられるよう な一本鎖抗体（scFv)や、 Fab、 Fab' 、 Fvとレ、つた低分子抗体断片が比較的高収 量にて生産できる技術が開発されている (非特許文献 3、非特許文献 5参照)。また 近年、完全長抗体の発現および生産を指向する方法が報告され、抗体の L鎖及び H 鎖を個別にプロモーター下流へ配置させたプラスミドにより、 L鎖、 H鎖を別々に大腸 菌のペリプラズムスペース内に発現させ、そして抗体断片を構成させる方法により Fa 型の抗体や完全長抗体を生産させている (非特許文献 4、特許文献 1参照)。ブ レビバチルス属細菌においても本開示技術を適用することにより L鎖及び H鎖の発現 量や量比を制御できると期待された。しかし、ブレビバチルス'ブレビス細菌において L鎖及び H鎖の発現量をコントロールすることができないため、完全長抗体を効率よく 生産し得なかった (本明細書の比較例 2参照）。さらに、これらの開示は、完全長抗体 のような 2以上のポリペプチドから構成される蛋白質の生産のためには、 2プロモータ 一を使用する 2シストロン系が好適であることを指摘する。
[0011] 大腸菌による抗体生産は、必要な培養日数や培養コストから動物細胞に比較し大幅 に製造コストを削減することができ、安価で供給が可能であることから動物細胞に代 わる製造技術として期待されている。ところが、大腸菌による低分子抗体断片や完全 長抗体の発現の場合、そのペリプラズムスペースに分泌発現することから、精製時に 菌体を集め破砕処理を行うなどの操作が必要となり、操作上の不便性が生じるだけ でなぐ 目的とする蛋白質精製時に菌体成分由来の汚染が避けられないという精製 工程上のマイナス面も生じる。さらにジスルフイド結合の多い抗体蛋白質などの場合
、 目的とする抗体蛋白質の発現時、正確な高次構造形成がとれず細胞内でプロテア ーゼによる分解作用を受けることや、翻訳後、細胞内へ不活性型の封入体を形成し てしまうことが多い。この不活性型の封入体から活性型へ変換するには、複雑なリフ オールデイング操作が必要となるだけでなぐ活性型蛋白質の回収率に多大な影響 をおよぼす。
大腸菌による蛋白質生産の上記問題点を解消するため、鵜高らはブレビバチルス- ブレビス（Brevibacillus brevis)を用いた蛋白質生産に対する画期的な宿主べクタ 一系を開発し、現在までに多種類の蛋白質に対する生産系を開発している（特許文 献 2、特許文献 3参照）。この技術によるバチルス属細菌を用いた組換え抗体蛋白質 生産では、低分子抗体である抗ヒトウ口キナーゼ'マウス'ヒトキメラ Fa^ 抗体を効率 良く分泌生産させことに成功している（非特許文献 6、特許文献 4、特許文献 4の優先 権を主張した特許文献 5)。即ち、ブレビバチルス'ブレビスの細胞壁蛋白質の一つと して知られる middle wall protein (MWP)のプロモーター下流に SD配列を介し て MWPのシグナルペプチドを持つ抗ヒトウ口キナーゼ'マウス'ヒトキメラ抗体 L鎖と、 同様に MWPの SD配列及びシグナルペプチドを有した Fd'断片鎖（H鎖の可変部 領域からヒンジ部の最初のシスティン残基までの蛋白質をコードしている領域）をタン デムに配置させた発現プラスミドを用レ、、 目的とする組み換え Fal 断片を、約 0. lg /L以上と極めて高効率で培養液中へ分泌生産させる。また、ブレビバチルス'ブレ ビスにより発現された組換え Fab' 蛋白質は、その細胞壁蛋白質の分泌シグナルぺ プチドにより培養液へ分泌され、直接培養液から活性型 Fal 断片を容易に精製回 収できることを示す。しかし、特許文献 4は、正確なフォーム形成が必要とされる完全 長抗体のような蛋白質の生産を開示していない。カロえて、特許文献 4で使用される、 2つの翻訳ユニット間に介在するスぺーサー配列は比較的短い。
特許文献 1：国際公開第 03/018771号パンフレット
特許文献 2:特開昭 63— 56277号公報
特許文献 3：特開 2000— 238740号公報
特許文献 4：特開平 7— 265094号公報
特許文献 5：米国特許第 5665570A号明細書
非特許文献 1: Nature.1975.256:495-497
非特許文献 2:Chu, L, Robinson D. K, Curr Opin Biotechnol.2000. 12: 180-187
特許文献 3: Humphreys. D. P. Curr Opin Drug Discovery Dev.2003 .6:188-196
特許文献 4: Simmons. L C.ら. J. Immunol. Method 2002.263:133-1 47
非特許文献 5 : Carter, P.ら. Bio/Technology.1992. 10:163-167 非特許文献 6:Inoue, Yら Appl. Microbiol. Biotechnol.1997.48:487-49
2
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] Fab' 型抗体のような低分子抗体断片においては、特殊な発現方法を有せずとも、 公知の発現方法、すなわち目的とする抗体分子の L鎖及び Fd鎖を適当なプロモー ター下流にタンデムに、スぺーサー配列を使用せず、直接連結させる方法により発 現可能である。しかし、正確なフォーム形成が必要な蛋白質 (例えば完全長抗体）の 分泌発現のための、新規な生産方法の開発が求められていた。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは、正確なフォーム形成が必要な 2種類以上のポリペプチドから構成され る蛋白質を宿主で生産させるためには、各ポリペプチドをコードする DNA配列間に、 ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、 middle wall protein (MW P)遺伝子の終止コドンの直後から outer wall protein (OWP)のシグナルぺプチ ドをコードする DNA配列の直前までの DNA配列を含む、比較的長レ、ヌクレオチド長 のスぺーサー配列を要することを発見した。
[0015] 本発明は、スぺーサー配列を含む DNA構築体であって、該スぺーサー配列が以下 の（1)または（2)の DNA配列を含む、 DNA構築体を提供する。
(1)ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、 MWP (middle wall pr otein)遺伝子の終止コドンの直後から〇WP (outer wall protein)のシグナルぺ プチドをコードする DNA配列の直前までの DNA配列のうちの、任意の 20ヌクレオチ ド長以上からなる DNA配列。
(2) (1)の DNA配列中に、 1または数個のヌクレオチドの置換、欠失および Zまたは 付加を有する DNA配列であって、かつ（1)の DNA配列と同等の機能を有する DN A配列。
[0016] 本発明は、好ましくは、さらに以下の 1または複数の特徴を有する。
本発明は、シグナルペプチドをコードする DNA配歹 U、および 2種類以上のポリぺプ チドから構成される蛋白質のいずれか 1つのポリペプチドをコードする DNA配列を含 む翻訳ユニットの 2種類以上が、該スぺーサー配列を介して連結され、かつ単一のプ 口モーター配列に作動可能に連結されている、上記 DNA構築体を提供する。
[0017] 本発明は前記翻訳ユニットが 2個であり、かつ前記蛋白質のポリペプチドをコードす る DNA配列のそれぞれが完全長抗体を構成する軽鎖 (L鎖）又は重鎖 (H鎖）をコー ドするものである、上記 DNA構築体を提供する。
[0018] 本発明は、 1の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌の MWPのシグナルペプチド をコードする DNA配歹 IJ、および完全長抗体の軽鎖（L鎖）をコードする DNA配列を 含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌の OWPのシグナルぺプチ ドをコードする DNA配歹 IJ、および完全長抗体の重鎖（H鎖）をコードする DNA配列 を含む、上記 DNA構築体を提供する。
本発明は、 1の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌の MWPのシグナルペプチド をコードする DNA配歹 1J、および完全長抗体の重鎖（H鎖）をコードする DNA配列を 含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌の OWPのシグナルぺプチ ドをコードする DNA配歹 IJ、および完全長抗体の軽鎖（L鎖）をコードする DNA配列を 含む、上記の DNA構築体を提供する。
[0019] 本発明は、上記のいずれかの DNA構築体を含むベクターを提供する。本発明は、 上記いずれかのベクターを宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。
本発明は、前記宿主がブレビバチルス属またはバチルス属細菌である、上記いずれ かの形質転換体を提供する。
本発明は、異種蛋白質を生産し、かつ分泌する、上記いずれかの形質転換体を提 供する。
本発明は、前記ブレビバチルス属細菌がブレビバチルス ·ブレビス、ブレビバチルス · ボルステレンシス又はブレビバチルス 'チョウシネンシスである、上記のいずれかの形 質転換体を提供する。
[0020] 本発明は、 2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質の製造方法であって、上 記いずれかの形質転換体を培養し、上記いずれかの蛋白質を生産させる工程、およ び生産された該蛋白質を回収する工程を含む製造方法を提供する。
本発明は、上記製造方法によって得られる蛋白質を提供する。本発明は、上記製造 方法によって得られる蛋白質、および製薬的に許容される担体を含む医薬組成物を 提供する。
[0021] 本発明によれば、例えば、 2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質を宿主（ 細菌宿主を含む)で生産する際、正しい構造を有する目的蛋白質を効率良く得ること ができる。例えば、 Y字型構造を有する完全長抗体を、ほぼ均一な状態で培養液中 に生産蓄積させることができる。
[0022] 以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、「DNA構築体」とは、組み換え DNA技法を使用して、任意の D NAを連結させたものをいう。そのような DNA構築体の調製は、当業者にとって公知 の技術を利用して行うことができる。
[0023] 本明細書にぉレ、て、 DNA構築体に含まれる「スぺーサー配列」とは、任意の翻訳ュ ニットの間に介在する DNA配列を意味する。本発明の目的のためには、該スぺーサ 一配列は、例えば 20〜300ヌクレオチド長、好ましくは 50〜200ヌクレオチド長であ る。 該スぺーサー配列は、以下の（1)または（2)の DNA配列を含む、 DNA構築体であ る。
(1)ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、 middle wall protein遺 伝子の終止コドンの直後から outer wall proteinのシグナノレペプチドをコードする DNA配列の直前までの DNA配列のうちの、任意の 20ヌクレオチド長以上からなる DNA配列。
(2) (1)の DNA配列中に、 1または数個のヌクレオチドの置換、欠失および Zまたは 付加を有する DNA配列であって、かつ（1)の DNA配列と同等の機能を有する DN A配列。
本明細書において、以下では、上記（1)又は（2)の DNA配列を「DNA配歹 又 は（2)」と記載することがある。
[0024] 本発明のスぺーサー配列に含まれる「DNA配列（1)又は（2)」は、 20ヌクレオチド長 以上、望ましくは 27ヌクレオチド長以上、より望ましくは 30ヌクレオチド以上、更に望 ましくは 40ヌクレオチド長、特に望ましくは 51ヌクレオチド長以上、好ましくは 60ヌク レオチド長以上、より好ましくは 80ヌクレオチド長以上、更に好ましくは 100ヌクレオチ ド長以上、特に好ましくは 110ヌクレオチド長以上、より特に好ましくは 120ヌクレオチ ド長以上である。また、好ましくは 20以上 127ヌクレオチド長以下であり、具体的には 、例えば 36ヌクレオチド長、または 51ヌクレオチド長、または 112ヌクレオチド長、ま たは 127ヌクレオチド長である。
また、本発明のスぺーサー配列に含まれる「DNA配歹 IJ (1)又は（2)」の起源となるブ レビバチルス属細菌としては、ブレビバチルス 'ブレビス 47 (FERM P— 7224)力 S好 ましレ、。なお、ブレビバチルス'ブレビス 47株は、独立行政法人理化学研究所バイオ リソースセンター微生物材料開発室 CFCM)に「JCM6285株」として保存されており、 人手すること力 Sできる。
[0025] 本発明の DNA構築体のスぺーサー配列に含まれる「ブレビバチルス属細菌の細胞 壁蛋白質オペロン中の、 MWP遺伝子の終止コドンの直後力ら O WPのシグナルぺプ チドをコードする DNA配列の直前までの DNA配列のうちの、任意の 20ヌクレオチド 長以上力、らなる DNA配歹 1 の例示として、配列番号 14に、ブレビバチルス'ブレビス 47の細胞壁蛋白質オペロン中の MWP遺伝子の終止コドンの直後から〇WPのシグ ナルペプチドをコードする DNA配列の直前までの DNA配列を示した（図 3参照）。 「同等の機能を有する DNA配列」とは、スぺーサー配列の一部として使用した際、適 当なプロモーター配列の制御下で、当該スぺーサー配列を介して連結された 2種類 以上の翻訳ユニットの各々に含まれる DNA配列によってコードされる 2種類以上の ポリペプチドを、宿主において発現せしめる機能を有する DNA配列であって、さらに 、 2種類以上のポリペプチドの発現量比が、当該 2種類以上のポリペプチドが相互に 結合し、本来の正確な高次構造 (または本来の高次構造に類似する構造)を有する 1 個の蛋白質を構成するのに適した量比となる DNA配列を意味する。
上記「同等の機能を有する DNA配列」は、前記スぺーサー配列に相補的な DNA配 列に、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA配列であり得る。該ストリン ジヱントな条件下のハイブリダィゼーシヨン条件の例は、望ましくは約 7%のドデシノレ 硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO、 ImMの EDTA中で約 50°Cでハイブリ
4
ダイゼーシヨン、および約 2XSSC、約 0· 1 %の SDS中で 50°Cの洗浄；より望ましくは 約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO、約 ImMの EDTA中
4
で 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、および約 1XSSC、約 0. 1%の SDSで約 50°Cの 洗浄；更に望ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO、
4 約 ImMの EDTA中で約 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、および約 0. 5XSSC、約 0 . 1 %の SDSで約 50°Cの洗浄；好ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、 約 0. 5Mの NaPO、約 ImMの EDTA中で約 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、およ
4
び約 0. 1XSSC、約 0. 1 %の SDSで約 50°Cの洗浄；より好ましくは約 7%のドデシル 硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの NaPO、約 ImMの EDTA中で約 50。Cでハイブ
4
リダィゼーシヨン、および、約 0. 1XSSC、約 0. 1 %の3。3で約65。。の洗浄でぁる。 もっとも、該条件は、 DNA鎖の長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存 して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダィズする。核酸 のハイブリダィゼーシヨンの詳細なガイドは、例えば Tijssen (1993) Laboratory Tecnmques m Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 ' ' Overview of principles oi hybridization and the starategy of nucleic acid probe assay' ' E lsvier, New Yorkに見出される。
[0027] 本発明のスぺーサー配列に含まれる「DNA配歹 IJ」として、上記ブレビバチルス属細 菌の細胞壁蛋白質オペロン中の所定範囲の DNA配歹 IK1)又は（2)に限らず、ブレ ビバチルス属細菌における、前記細胞壁蛋白質オペロンと同様の機能を有するオペ ロン中の所定範囲の DNA配列を用いてもよい。
[0028] 本発明の「DNA構築体」は、シグナルペプチドをコードする DNA配歹 IJ、および 2種 類以上のポリペプチドから構成される蛋白質のいずれか 1つのポリペプチドをコード する DNA配列を含む翻訳ユニットの 2種類以上が、前記スぺーサー配列を介して連 結され、かつ単一のプロモーター配列に作動可能に連結されているものが好ましい。 本発明の DNA構築体に使用される「シグナルペプチドをコードする DNA配歹 IJ」は、 宿主で機能する分泌シグナルペプチドをコードするものであれば特に制限はない。 上記 DNA配列としては、ブレビバチルス属細菌の MWPおよび/または OWPのシ グナルペプチドをコードする DNA配列が好ましぐブレビバチルス'ブレビス、特にブ レビバチルス'ブレビス 47の、 MWPおよび/または OWPのシグナルペプチドをコー ドする DNA配列がより好ましレ、。ブレビバチルス 'ブレビス 47の OWPのシグナルぺ プチドをコードする DNA配列を、図 3および配列番号 11〜： 13に示した。また、分泌 効率を高めるため、従来のシグナルペプチドのアミノ酸配列を改良したものをコード する DNA配列でも構わない。具体的に言えば、ブレビバチルス 'ブレビス 47の MW Pのシグナルペプチド、 Met— Lys— Lys— Val— Val— Asn— Ser— Val— Leu— A la— Ser— Ala— Leu— Ala— Leu— Thr— Val— Ala— Pro— Met— Ala— Phe— Ala (配列番号 21)を利用するほか、このアミノ酸配列の改良例として、 Met_Lys _ Lvs— Arg— Arg— Val— Val— Asn— Asn— Ser— Va丄一 Leu— Leu— Leu— Leu — Leu— Leu— Ala— Ser— Ala— Leu— Ala— Leu— Thr— Val— Ala— Pro— M et_Ala_Phe _Ala (配列番号 22) (Sagiya. Yら. 1994. Appl Microbiol Biotechnol 42 : 358— 363 ;特許第 3433807号）の下線部（Arg— Arg— Valval および Leu _ Leu _ Leu _ Leu -Leu- Leu)のように塩基性や疎水性ァミノ 酸残基などを付加または消失させたシグナルペプチドをコードする DNA配列を用い ても構わない。使用する DNA配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても、宿主 内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、クローニングにより得られ た DNA配列と同一である必要は無い。
[0029] 本明細書にぉレ、て「ポリペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するペプチド鎖を 言レ、、アミノ酸残基数が 10以上のものを指す。
[0030] 本明細書において「2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質」とは、 2種類以 上のポリペプチドが結合して生成した蛋白質であり、それぞれのポリペプチドの構成 比が異なる場合も等しい場合も、これに包含される。当該蛋白質を構成するポリぺプ チドの種類の数は、 2以上であれば特に限定されないが、好ましくは 2力 4、より好ま しくは 2または 3、最も好ましくは 2である。当該蛋白質の例として、完全長抗体が含ま れる
[0031] 上記「2種類以上のポリペプチド」は、同じ遺伝子起源であってよいが、通常、抗体や 蛋白質ホルモン LH (黄体形成ホルモン）、 FSH (卵胞刺激ホルモン）、 HCG (ヒト絨 毛ゴナドトロピン）、および TSH (甲状腺刺激ホルモン）の場合のように異なる遺伝子 によってコードされる。本明細書において、「2種類以上のポリペプチドから構成され る蛋白質」は、蛋白質が生物学的機能を発現するために 2以上の異なるポリペプチド の結合を必要とする限り、レ、くつかの同じポリペプチドを含んでいてもよい。 2種類の 異なるポリペプチドからなる蛋白質は、ヘテロダイメリック蛋白質として知られる。その ような蛋白質のさらなる例は、例えばヘルダリン、インテグリン、ァクチビン、およびイン ヒビンのような蛋白質である。
[0032] 本明細書にぉレ、て「完全長抗体」とは、動物個体への抗原刺激の結果、免疫応答に よって動物個体内に産生される蛋白質で、免疫源 (抗原）と特異的に結合する活性を 持つものを言う。即ち、蛋白質、多糖類、核酸、脂質などのうち、抗原性を示す物質ま たは、その集合体を含むものと特異的に結合する活性を有する蛋白質であればよい 。 「完全長抗体」としては、例えば、 〔背景技術〕で述べた抗体構造 (Y字型の基本構 造）を有しているものだけでなぐ抗原と特異的に結合する活性はもちろんのこと、〔背 景技術〕で記載した、抗体の定常部が持つ生体内での生物学的活性を有するものも 含まれる。本明細書に記載の「完全長抗体」は、分子量の小さな Fv、 Fab、または Fa b' 、さらには scFvまたは dsFvといった 1本鎖抗体などの低分子抗原結合性フラグメ ントとは異なるものを指す。
[0033] ここで示す「完全長抗体」は、抗原との結合活性や生物学的活性を消失させない範 囲内にて、構造アミノ酸酉己歹' J中に 1または数個、 ί列えば 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 20、 30個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失及び/又は付加のような変異導入を 行ったものでもよく、具体的にはマウス抗体やヒト化抗体、さらには二重特異性抗体、 トキシン融合抗体、または、これらの組み合わせによってマウス抗体をヒト抗体へ近づ けたマウス'ヒトキメラ抗体などが挙げられる。更に具体的にはマウス'ヒトキメラ抗ヒト 腫瘍壊死因子抗体や、マウス'ヒトキメラ抗ヒト CD20抗体が挙げられる（以下、「ヒト腫 瘍壊死因子」を「ヒト TNF a」、「マウス'ヒトキメラ抗ヒト腫瘍壊死因子抗体」を「抗ヒト T NFひ抗体」と略す）。もっとも、組み換えを有するか有しないかは、本発明にとって重 要な問題ではない。
[0034] 完全長抗体をコードする DNA配列は、通常用いられる公知の方法で取得し、クロー ニングもしくは公知のポリメラーゼ'チェーン'リアクション（以下、 PCRと略す）法で特 異的に増やすことにより取得できる。また公知の化学合成法から合成することも可能 であり（Nucleic acids Res. 第 12卷 4359頁（1984年））、 cDNAライブラリ一力 ら得ることもできる。完全長抗体をコードする DNA配列は、コドンが縮重コドンで置換 されていても、宿主内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、クロー ニングにより得られた DNAと同一である必要は無い。
[0035] 本明細書において、「翻訳ユニット」とは、ポリペプチドをコードする DNA配列および 隣接制御領域を含む遺伝的エレメントを意味する。隣接制御領域は例えば、宿主内 で機能する SD配列を意味する。 SD酉己歹 IJ (Shine— Dalgarno sequence)とは、原 核生物の mRNAにおいて、開始コドンの上流に見られる共通配列であり、通常、一 AGGAGG—のようにプリン塩基（アデニン ·グァニン）に富んだ 3から 9塩基（平均 4. 8塩基）の DNA配列力、らなる。本発明においては、ブレビバチルス属細菌、特に、ブ レビバチルス ·ブレビス由来の SD配列の使用が好ましく、ブレビバチルス ·ブレビス 4 7株の、 MWPおよび Zまたは〇WP遺伝子に由来する SD配列の使用がより好まし レ、。本発明の DNA構築体において、翻訳ユニットの数は任意であり、該数は、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10またはそれ以上でありうる。該数は、好ましくは 2力ら 4、より好ま しくは 2または 3、およびもっとも好ましくは 2である。
[0036] 本明細書において、「プロモーター」とは、任意の構成的または誘導可能プロモータ 一を含む。原核生物宿主での使用のために好適なプロモーターは、 polllプロモータ 一、 polIIIプロモーター、 PhoAプロモーター、 β—ラクタマーゼプロモーター、トリプ トフアン（trp)プロモーターおよびハイブリッドプロモーター、例えば tacまたは trcプロ モーターを含む。プロモーターとしては宿主で機能するものであればレ、ずれでも使用 できる。好ましくは、ブレビバチルス属細菌由来のプロモーターを使用する。より好ま しくは、ブレビバチルス 'ブレビス、特にブレビバチルス 'ブレビス 47 (FERM P- 72 24)由来の MWPプロモーター領域（特公平 1— 58950号公報、特公平 7— 10822 4公報）、あるいはブレビバチルス 'チョウシネンシス、特にブレビバチルス 'チョウシネ ンシス HPD31 (FERM BP— 1087) (バチルス.ブレビス H102 (FERM BP—10 87)と同一菌株）由来の HWPプロモーター領域（特開平 4— 278091号公報、特開 平 6— 133782号公報）に含まれるプロモーター、例えば P2プロモーターを挙げるこ とができる。本発明の目的のために、プロモーター数は、任意の数であり得る力 好ま しくは単一のプロモーターを使用する。
[0037] 本明細書において、「作動可能に連結」とは、 2以上の DNA配列が物理的におよび /又は機能的に関連可能な状態で連結していることを意味する。例えば、プロモー ターと翻訳ユニットとが適当な DNA配列を介して連結されており、当該プロモーター 力 当該翻訳ユニットの一部がコードするポリペプチドの発現レベルに影響を及ぼす 場合には、両者は「作動可能に連結」されてレ、るとレ、える。
[0038] 上記のスぺーサー配列、プロモーター配列、 SD配歹 lj、およびシグナルペプチドをコ ードする DNA配列は、例えばブレビバチルス属細菌、またはブレビバチルス'ブレビ ス 47 (FERM P_ 7224)の染色体 DNAを錡型として、公知の PCR法で特異的に 増やすことにより取得できる。
[0039] 本発明の「DNA構築体」の一実施形態は、前記翻訳ユニットが 2個であり、 1の翻訳 ユニットが完全長抗体を構成する L鎖をコードする DNA配列を含み、他の翻訳ュニ ットが完全長抗体を構成する H鎖をコードする DNA配列を含むものである。本発明 の「DNA構築体」の好適な一実施形態は、前記翻訳ユニットが 2個であり、 1の翻訳 ユニットがブレビバチルス属細菌の MWPのシグナルペプチドをコードする DNA配 歹 IJ、および完全長抗体の L鎖をコードする DNA配列を含み、他の翻訳ユニットがブ レビバチルス属細菌の〇WPのシグナルペプチドをコードする DNA配歹 1J、および完 全長抗体の H鎖をコードする DNA配列を含むものである。また、本発明の「DNA構 築体」の好適な一実施形態は、前記翻訳ユニットが 2個であり、 1の翻訳ユニットがブ レビバチルス属細菌の MWPのシグナルペプチドをコードする DNA配歹 IJ、および完 全長抗体の H鎖をコードする DNA配列を含み、他の翻訳ユニットがブレビバチルス 属細菌の〇WPのシグナルペプチドをコードする DNA配歹 1J、および完全長抗体の L 鎖をコードする DNA配列を含むものである。
[0040] 特に好ましい本発明の「DNA構築体」の例は、ブレビバチルス.ブレビスの MWPプ 口モーター領域の下流（3'末端）に、同 MWP遺伝子由来の SD配列、同 MWPのシ グナルペプチドをコードする DNA配歹 U、および完全長抗体の L鎖をコードする DNA 配列からなる翻訳ユニットを配置し、その下流に、本発明のスぺーサー配列を介して 、ブレビバチルス.ブレビスの OWP遺伝子由来の SD配列、同 OWPのシグナルぺプ チドをコードする DNA配歹 IJ、および完全長抗体の H鎖をコードする DNA配列からな る翻訳ユニットを配置した構造からなる。
[0041] 本発明の DNA構築体を導入するベクターとしては、適当な宿主細胞内で自律複製 可能な DNA分子であって、当業者に公知のものを用いることができる。当該ベクター は、所望によりマーカー配列を含んでいてもよい。マーカーとしては、ペニシリン、エリ スロマイシン、クロラムフエ二コール、ネオマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げ られる。
[0042] 本発明で用いるベクターは、本発明の DNA構築体を導入することができ、更にそれ を宿主内に導入する機能を有する限り特に限定されないが、 pHY500 (特開平 2— 3 1682号公報）、 pNU200 (鵜高重三、 曰本農芸ィ匕学会誌 61 , 669— 676 (1987) ) 、 pNH301 (Shiga. Yら 1992. Applied and Environmental Microbiology , 58 : 525 - 531. ) , pNH400 (Ishihara, Tら、 1995. J. Bacteriol, 177 : 745 - 749)、 pNY700 (特開平 4— 278091号公報）、 pHT系プラスミド（特許第 2727391 号）、 pNC〇2 (特開 2002— 238569号公報）、またはこれらの誘導体が好ましレ、。ま た、宿主としてブレビバチルス属細菌を用いる場合、宿主細胞内で自立複製可能な プラスミドベクターなどを利用することなぐ本発明の DNA構築体を染色体中へ直接 組み込み、発現させる方法（特開平 9— 135693号公報）を用いても良い。
[0043] 本発明の「形質転換体」は、本発明のベクターで適当な宿主を形質転換することによ り得られる。本発明で使用される宿主は、細菌、動物細胞、植物細胞、または菌類そ の他を含み、特に限定されないが、大腸菌（Escherichia coli)、バチルス属細菌ま たはブレビバチルス属細菌が好適に使用され、ブレビバチルス属細菌がより好適に 使用され得る。
[0044] 上記バチルス属細菌としては、例えば、 Bacillus subtilis, B. acidocaldarius, B . coagulans、 B. polymyxa、 B. alkalophilus^ B. pasteurii、 B. pantothenticu s、 B. pasteurii、 Psychrophiles^ B. globispoms、 B. insoli us、 B. marinus、 B . macquariensis、 B. megaterium、 B. polymyxa、 B. acidocaldarius、 B. schl egelii、 B. stearothermophilus、 B. azotoformans、 B. cereus、 B. laterosporu s、 B. licheniformis、 B. pasteurii、 B. stearothermophilus^ B. macerans、 B. polymyxa、 B. macerans、 B. brevis、 B. cereus、 B. circulans、 B. laterosporu s、 B. licheniformis、 B. polymyxa、 B. pumilus、 B. subtilis、 B. larvae B. len timorbis、 B. popilliae、 B. larvaeおよび B. lentimorbisを挙けること力 Sできる。上 記ブレビバチルス属細菌としては、例えば、 Brevibacillus agri、 B. borstelensis, B. brevis、 B. centrosporus、 B. choshmensis、 B. formosus、 B. mvoca us、 B. laterospoms、 B. limnophilus、 B. parabrevis、 B. reuszeri、および Β· ther momberを挙げることができ、それらの中でも、ブレビバチルス'ブレビス、ブレビバ チルス.ボルステレンシス、およびブレビバチルス.チョウシネンシスが好適に、ブレビ バチルス 'ブレビス 47 (FERM P_ 7224)、ブレビバチルス 'ブレビス 47 _ 5Q (Ud aka， S.ら， 1993. Method Enzymol, 217 : 23— 33)、およびブレピノ チノレス' チョウシネンシス HPD31 (FERM BP— 1087)がより好適に使用され得る。また生 産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株 や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げればブレビバチルス'チ ヨウシネンシス HPD31由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス.チョウシネ ンシス HPD31— OK (特開平 6— 296485号公報、 FERM BP— 4573)や、ヒト唾 液アミラーゼ高生産株として取得されたブレビバチルス 'ブレビス 47K (Konishi, H. ら. Appl Microbiol. Biotechnol. 34 ; 297 - 302, 1990)力 S使用され得る。
[0045] 本発明において用いられる宿主の形質転換は、例えば、公知の Takahashiらの方 法（Takahashi. Wら. J. Bacteriol. 1983. 156： 1130— 1134)、 Takagiらの方 法（Takagi. Hら. 1989. Agric. Biol. Chem, 53： 3099— 3100)、または Okam otoらの方法（Okamoto. Aら 1997. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61 : 202 - 203)により実施することができるが、方法は特に限定されない。
[0046] 微生物において異種真核生物蛋白質を高発現させた場合、当該蛋白質が細胞質内 および/または外で結合し、生物学的に不活性な不溶性体と呼ばれるァグリゲートを 形成すること力 Sある。特に、システィン残基を多く含み、ジスルフイド結合の多い蛋白 質は、ァグリゲートを形成することが多い。一方で、 目的とする蛋白質を発現させる際 、シャペロン蛋白質やジスルフイド結合異性化酵素やプロリン異性化酵素などを作用 させることによって、 目的蛋白質のァグリゲートや分泌効率の低下を抑え得ることが知 られている。広く試みられている方法は、 FkpAなどの PPIase (ぺプチジルシストラン スイソメラーゼ）（Missiakas Dら Molecular microbiology, 21 (4) , 871— 884, 1996)及び PDI (プロテインジスルフイドイソメラーゼ）や DsbAなどのジスルフイド酸 化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法 (特開昭 63— 294796号公報、特開 平 5— 336986号公報等）である。さらにまた、ジスルフイド酸化還元活性を有する蛋 白質をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、 目的とする組換え蛋白質とジスルフィ ド酸化還元活性を有する蛋白質を同時に発現させて正しいジスルフイド結合を有す る蛋白質を製造する方法も知られている（特開 2000— 83670号公報、特表 2001— 514490号公報等）。本発明においても、例えば、完全長抗体を発現させる際、数種 類のシャペロン蛋白質やジスルフイド結合酸化還元酵素やジスルフイド異性化酵素 のようなフォールデイングを促進する酵素を同時に発現させることもできる。具体的に 挙げれば、大腸菌の DsbA (Bardwell， J. C. A.ら， 1991. Cell, 67 : 582— 589、 Kamitani, S.ら， EMBO. J. 11 : 57— 62 (1992) )、 DnaK：、 DnaJ、 GrpE (特開 平 9— 180558号公報）、 FkpAなどの PPIase lournal of biological chemistr y 275 (22) , 17100— 17105, 2000)、プロテインジスルフイドイソメラ—ゼ（国際 公開第 01/068884号パンフレット）、および、ジスルフイド酸化還元酵素（特開 200 3— 169675号公報）の群から選ばれる 1つ以上を同時に発現させ、 目的とする蛋白 質の分泌効率を上昇させることができる。
[0047] 本発明のベクターにより形質転換された形質転換体は、 目的とする蛋白質を構成す る 2以上のポリペプチドを適切な量比で発現し、その蛋白質本来またはそれと類似の 立体構造 (および/または、その蛋白質本来の活性またはそれと類似の活性)を有 する蛋白質として生産することができる。例えば完全長抗体を目的蛋白質とする場合 、正確な Y字型構造を有する完全長抗体をほぼ均一な状態で培養液中に生産蓄積 させること力できる。
[0048] 本発明はまた、本発明の形質転換体を培養し該蛋白質を生産させる工程、および生 産された該蛋白質を回収する工程を含む、蛋白質の製造方法である。
本発明の細菌形質転換体の培養に用いる培地は、 目的とする 2種類以上のポリぺプ チドから構成される蛋白質を高効率、高収量で分泌発現するものであれば制限は無 レ、。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス
、またはカザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム 塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、または鉄塩等の無 機塩類が必要に応じて添加される。また、もし栄養要求性を付与している宿主を用い る場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また必要であればぺニシ リン、エリスロマイシン、クロラムフエ二コール、またはネオマイシンなどの抗生物質が 添加されても良い。培養温度は約 15 _42°C、好ましくは約 28 _ 32°Cであり、通気攪 拌条件で好気的に培養を行うことが望ましいが、もし必要であれば通気を遮断し嫌気 的に培養してもよい。
[0049] 本発明によれば、例えば細菌形質転換体を培養することにより、 2種類以上のポリぺ プチドから構成される蛋白質が該細菌形質転換体の菌体内または外、すなわち培養 液中に大量に蓄積されるため、当該培養液から当該蛋白質を採取し、所望により精 製することが出来る。当該蛋白質が菌体内に蓄積された場合、通常の方法、例えば 超音波やフレンチプレス、アルカリまたは SDS処理などを利用した方法により菌を破 砕し、抽出することが出来る。得られた当該蛋白質は、通常の蛋白質精製方法、例え ば硫酸アンモニゥムまたは硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、ゲル濾過、イオン交換、 ハイドロキシアパタイト、プロテイン A、プロテイン G、プロテイン L、または抗原結合ァ フィニティーなどの担体を用いたカラムクロマトグラフィーなどを用いて精製することが できる。
[0050] 本発明は、「2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質」中に同一のポリべプチ ドが少なくとも 2つ以上含まれる場合には、その 2つ以上含まれるポリペプチドの分泌 量を増加させる効果も有しうる。
また、本発明は、 2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質の発現のみでなく 、 1種類のポリペプチドから構成される蛋白質のポリペプチドをコードする DNA配列 を含む翻訳ユニットを、スぺーサー配列を介して 2個以上連結して作製した DNA構 築体を用いて形質転換することにより、ポリペプチドをコードする DNA配列を 1組含 有する形質転換体と比較して、蛋白質の生産量を倍増させる効果を有し得る。
[0051] 本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造された蛋白質を含むものである 。当該医薬組成物は、本発明の方法に従い製造した 2以上のポリペプチドから構成 される蛋白質を、製薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と混合することに よって製造し得る。希釈剤、担体、または賦形剤は、経口、経腸、経皮、皮下、非経 腸 (例えば静脈内）または腹腔内投与等の各投与形態に適した任意の有機または無 機材料であり得る。希釈剤、担体、および賦形剤は特に限定されないが、例えば、水 、ゼラチン、アラビアガム、ラタトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスタ ーチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはコロ イド性二酸化ケイ素などである。また、本発明の医薬組成物は、他の薬理的に活性な 薬剤、および Zまたは慣行の添加物、例えば、安定剤、湿潤剤、乳化剤、香味剤、ま たは緩衝剤などを含み得る。
発明の効果
[0052] 本発明によれば、例えば、 2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質を宿主で 生産する際、その蛋白質本来またはそれと類似の立体構造（および/または、その 蛋白質本来の活性またはそれと類似の活性)を有する蛋白質を効率良く得ることが できる。
発明を実施するための最良の形態
[0053] 以下に参考例及び実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範 囲を制限するものでない。本発明の実施にあたり、組換え DNAの作製、組換え体の 動物細胞や微生物などへの導入は、特に断わらない限り下記の実験書に従って実 施した。 （1) Τ· Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook著、「モレキュラ^ ~ ·クロー ニング Ζァ 'ラボラトリー ·マ二ユアノレ (Molecular Cloning/A Laboratory Man ual)」、第 2版（1989)、 Cold Spring Harbor Laboratory干 lj (米国）。 （2)村松 正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第 3版（1996)、丸善株式会社刊。
[0054] 図 1〜： 12に使用されている略語について、以下に説明する。
kbp：キロ塩基対
MWP：ブレビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 MWP
OWP：ブレビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 OWP
MWP P：ブレビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 MWPプロモーター領域
SDM：ブレビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 MWPの SD配列
SDO：ブレビバチルス ·ブレビス細胞壁蛋白質 OWPの SD配列
SPM：ブレビバチルス .ブレビス細胞壁蛋白質 MWPのシグナルペプチドをコードす る DNA配歹 IJ
SPO：ブレビバチルス'ブレビス細胞壁蛋白質〇WPのシグナルペプチドをコードする DNA配列
MCS：マルチクローニングサイト
Nm：ネオマイシン耐性遺伝子コード領域
T:ターミネータ一領域
VL : L鎖可変領域
CL : L鎖定常領域
VH : H鎖可変領域
CH1 : H鎖定常領域 CH2 : H鎖定常領域
CH3 : H鎖定常領域
h :ヒンジ領域
M :分子量マーカー
S：抗ヒト TNF α抗体標準品（インフリキシマブ）
[0055] 図 8〜： 10に使用されている略語等について、以下に説明する。
Μは分子量マーカー（201 , 120, 100， 55, 38, 29, 20kDa)、 pNH30l/31OK は ρΝΗ301を有する形質転換株からの培養液上清を示す。 OWPTは L— OWPT - Η/ρΝΗ301を有する形質転換株からの培養液上清を示す。 OWPSDは L - Ο WPSD _HZpNH301を有する形質転換株からの培養液上清を示す。 LHは LH2 5/pNH301を有する形質転換株からの培養液上清を示す。 LpHは LpH25/pN H301を有する形質転換株からの培養液上清を示す。 Sは抗ヒト TNF a抗体標準品 (3ナノグラム）のレーンを示す。矢印は発現された完全長抗ヒト TNF a抗体の移動 度を示す。
[0056] 実施例 1 :抗ヒト TNF a抗体 L鎖発現ベクター L/pNH301、および抗ヒト TNF a抗 体 H鎖発現ベクター H/pNH301の構築
米国特許 US5698195号記載の抗ヒト TNF a抗体 L鎖 H鎖の遺伝子配列に従って 取得、作製された pBluescripf抗ヒト TNF a抗体 L鎖及び H鎖を铸型にし、合成ォ リゴヌクレオチド TNF— LF1 : 5，一 GCTCCCATGGCTTTCGCTGACATCTTG CTGACTCAGTCT- 3 ' (配列番号 1)及び TNF— LR1 : 5 '— TTTCTGCAGC TAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT- 3 ' (配列番号 2)をプライマーとし て PCRを行レ、、抗ヒト TNFひ抗体 L鎖をコードする約 0. 65kbpの断片を得た。得ら れた L鎖コード遺伝子断片は制限酵素 Ncolと Pstlで処理を行った。同様に合成オリ ゴヌクレオチド TNF— HF1 : 5， - GCTCCCATGGCTTTCGCTGAAGTGAAA CTTGAGGAGTCT - 3 ' (配列番号 3)及び TNF— HRl： 5 ' - CCCAAGCTTT CATTTACCCGGAGACAGGGA- 3 ' (配列番号 4)をプライマーとして PCRを 行い、抗ヒト TNF a抗体 H鎖をコードする約 1. 45kbpの断片を得た。得られた H鎖 コード遺伝子断片は制限酵素 Ncolと Hindlllで処理を行った。それぞれ制限酵素に より消化された抗ヒト TNF a抗体 L鎖、 H鎖コード遺伝子断片は 2%ァガロースで分 離後、ゲルから抽出し遺伝子断片を取得した。別に、図 1に示した発現ベクター pNH 301は制限酵素 Ncolと Pstl、及び Ncolと Hindlllでそれぞれ消化後、アルカリフォ スファターゼ（BAP)処理を行い、先に得られた抗ヒト TNFひ抗体 L鎖、 H鎖コード遺 伝子断片に対し T4リガーゼを用いて連結し、それぞれ L/pNH301及び HZpNH 301を得た〔図 2〕。
実施例 2：完全長抗ヒト TNF a抗体発現べクターし_ 0\¥?丁_117 ^^：«301の構築 ブレビバチルス.ブレビスの MWPのストップコドン以降から〇WPの SD配列を含めた シグナルペプチドをコードする DNA配列を得るため、ブレビバチルス.ブレビス 47 (F ERM P— 7224)株から定法に従い染色体 DNA約 1 μ gを抽出、精製した。この染 色体 DNAを铸型として、合成オリゴヌクレオチドプライマー OWPT—F1 : 5，一CGG GGTACCGAAATACAGTTAATTAGTTAGAAG - 3 ' (配列番号 5)と、抗ヒト TNF a抗体の H鎖の N末端 Glu— Val Lys— Leu— Glu Glu— S er (配列番号 2 3)をコードする DNA配列を 3 '末端に付加した合成オリゴヌクレオチドプライマー OW
GCAAC - 3 ' (配列番号 6)とを用いて PCRを行レ、、約 0. 22kbpの遺伝子断片を得 た。この遺伝子断片は、ブレビバチルス'ブレビスが有する MWP及び OWPオペロン 構造内の、 MWP終止コドン TAA以降のターミネータ一と、 OWPの SD配列と、シグ ナノレペプチド（Met— Asn— Lys— Lys— Val— Val— Leu— Ser— Val— Leu— Se r-Thr-Thr-Leu-Val-Ala- Ser-Val-Ala-Ala- Ser-Ala-Phe -Al a :配列番号 24)をコードする DNA配列と、上記抗ヒト TNF α抗体の H鎖の N末端 G1 u-Val- Lys - Leu - Glu _ Glu _ S er (配列番号 23 )をコ一ドする DNA配列とを 含んでいる（図 3参照）。
一方、実施例 1により得られた抗ヒト TNFひ抗体の H鎖をコードする HZpNH301を 铸型として、合成オリゴヌクレオチドプライマー TNF_HF2 : 5， -GTTGCAGCAT CTGCATTTGCAGAAGTGAAACTTGAGGAGTCT- 3 ' (配列番号 7)と、実 施例 1で使用されたプライマー TNF— HR1 : 5 ' - CCCAAGCTTTCATTTACC CGGAGACAGGGA- 3 ' (配列番号 4)とを用い PCRを行った。得られた 1. 5kbp の PCR断片は、抗ヒト TNF ct抗体の H鎖をコードする配歹 IJ、及び 5 '側には OWPの シグナルペプチドの一部（ Val— Ala— Ala— S er— Ala— Phe— Ala：配列番号 25 ) をコードする DNA配列を含んでいる。
この 1. 5kbpの断片と、上記遺伝子断片（MWPのターミネータ一、〇WPの SD配列 及びシグナルペプチドをコードする DNA配列を含む約 0. 22kbp遺伝子断片）とを 铸型とし、合成オリゴヌクレオチドプライマー OWP— F1 : 5， - CGGGGTACCGAA ATACAGTTAATTAGTTAGAAG - 3 ' (配列番号 5)と TNF— HR1 : 5 ' - CC CAAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGA- 3 ' (配列番号 4)とを用い、公 知のオーバーラップ伸長法（Horton, R. H.ら、 1997. In Bruce A. White (eds ) , PCR Cloning protocols lorm molecular cloning to genetic engine ering. 141 - 149. Humana Press, Totowa, NJ. )により再度 PCRを行った。そ の結果、 MWPのターミネータ一と、 OWPの SD配列及びシグナルペプチドをコード する配列と、抗ヒト TNF a抗体 H鎖全長鎖をコードする配列とを含んだ遺伝子断片 約 1. 7kbpを得た。
この遺伝子断片を、制限酵素 Kpnl及び Hindlllにより消化、 0. 8%ァガロースゲル により抽出精製後、 T4ライゲースを用い実施例 1にて得られた L/pNH301の Kpnl 及び Hindlllの間に連結し、 L— OWPT— H/pNH301を得た（図 4、図 11) (配列 番号 15〜： 17)。
実施例 2における、本発明の「スぺーサー配列」に対応する配列は、 rctgcaggatccgtc gactctctaggactcgaggaattcggtaccgaaatacagttaattagttagaagttagtatcgggttactaggtacagcta gaggggagttatcccctctaactcttattacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat」 (目己歹1 J¾~"^"2り)とな る。また、本発明のスぺーサー配列に含まれる「DNA配歹 1J(1)又は（2)」は、「gaaata cagttaattagttagaagttagtatcgggttactaggtacagctagaggggagttatcccctctaactcttattacccaaa caatagagaacttcctatcaaacat」（配列番号 27)となる。この配列番号 27は、ブレビバチル ス.ブレビス 47の細胞壁蛋白質オペロン中の MWP遺伝子の終止コドンの直後から O WPのシグナルペプチドをコードする DNA配列の直前までの DNA配歹 IK配列番号 1 4)のうちの、 112ヌクレオチド長力、らなる DNA配列に相当する。
実施例 3：完全長抗ヒト TNF a抗体発現ベクター L - OWPSD - H/pNH301の構 築
実施例 2と同様に、ブレビバチルス'ブレビス 47の染色体 DNAを铸型にして、合成 オリゴヌクレオチドプライマー OWP— F2 : 5， - CGGGGTACCTATTACCCAAA CAATAGAGAACTT- 3 ' (配列番号 8)と、合成オリゴヌクレオチドプライマー〇W
GCAAC- 3 ' (配列番号 6)とを用レ、 PCRを行レ、、 0. 12kbpの断片を得た。この断 片は、ブレビバチルス'ブレビスが有する MWP及び OWPのオペロン構造内の、 MW pストップコドン（TAA) 3 '下流に存在する〇WPの SD配列から OWPのシグナルぺ プチドと、抗ヒト TNF α抗体の Ν末端 Glu - Val _ Lys _ Leu _ Glu _ Glu _ S er (配 列番号 23)をコードする DNA配列とを含んでいる。ただし、実施例 2で得られたよう な MWPのターミネータ一配列は含んでいない（PCRで得られる DNA断片の範囲に つき、図 3参照）。
一方、実施例 2と同様に、抗ヒト TNF a抗体の H鎖をコードする H/pNH301を铸型 とし、合成オリゴヌクレオチドプライマー TNF— HF2 : 5， 一 GTTGCAGCATCTGC ATTTGCAGAAGTGAAACTTGAGGAGTCT- 3 ' (配列番号 7)と、先のプラ 3' (配列番号 4)とを用いて PCRを行い、抗ヒト TNF a抗体の H鎖をコードする配 歹 IJ、及び 5'側に OWPのシグナルペプチドの一部（Val—Ala—Ala— Ser—Ala— P he—Ala :配列番号 25)をコードする配列を含む 1 · 5kbpの遺伝子断片を得た。 この H鎖を含む 1. 5kbpの断片と、先の OWPの SD配列を含む 0. 12kbpの遺伝子 断片とを用い、実施例 2で記載した方法と同様に合成オリゴヌクレオチドプライマー〇 WP-F2 : 5' - CGGGGTACCTATTACCCAAACAATAGAGAACTT- 3， ( 配列番号 8)とプライマー TNF— HR1 : 5' - CCCAAGCTTTCATTTACCCGG AGACAGGGA- 3 ' (配列番号 4)とによるオーバーラップ伸長法により、 OWPの S D配列と〇WPシグナルペプチドをコードする配列と、抗ヒト TNF α抗体の Η鎖をコー ドする配列とを含む遺伝子断片約 1. 6kbpを得た。この断片は、制限酵素 Kpnl及び Hindlllにより消化し、 0. 8%ァガロースゲルにより抽出、精製した後、 T4ライゲース を用レ、実施例 1にて得られた LZpNH301の Kpnlと Hindlllの間に連結し L_ OW PSD— H/pNH301を得た（図 5、図 12) (配列番号 18〜20)。
実施例 3における、本発明の「スぺーサー配列」に対応する配列は、 rctgcaggatccgtc gactctctaggactcgaggaattcggtacctattacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat」 (酉 d列 ¾·号 28 )となる。また、本発明のスぺーサー配列に含まれる「DNA配歹 1J(1)又は（2)」は、「ta ttacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat」（酉己歹 Ij番号 29)となる。この酉己歹 IJ番号 29は、ブレ ビバチルス.ブレビス 47の細胞壁蛋白質オペロン中の MWP遺伝子の終止コドンの 直後から〇WPのシグナルペプチドをコードする DNA配列の直前までの DNA配歹 IJ ( 配列番号 14)のうちの、 36ヌクレオチド長からなる DNA配列に相当する。
[0059] 比較例 1：ブレビバチルス.ブレビス細胞壁蛋白質オペロン構造を含まない抗ヒト TN Fひ抗体発現ベクター LH25ZpNH301の構築
スぺーサー配列中に「ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、 MWP 遺伝子の終止コドンの直後から〇WPのシグナルペプチドをコードする DNA配列の 直前までの DNA配列のうちの、任意の 20ヌクレオチド長以上からなる DNA配歹 U」を 含む、本発明の「DNA構築体」の 1実施例を用いた発現方法と、スぺーサー配列の 中に上記「DNA配列」を含まないものを用いた発現方法との間で、完全長抗体形成 能を比較検討する。 H/pNH301を铸型とし合成オリゴヌクレオチドプライマー TNF — HF3 : 5 ' -TAGCTGCAGAGAGGAGGAGAACACAAG - 3 ' (配列番号 9)
' (配列番号 4)を用い PCRを行った。 PCRにより得られた 1 · 5kbpの遺伝子断片は、 H/pNH301の発現プラスミドに由来する MWPの SD配列から MWPのシグナルぺ プチド及び H鎖のストップコドンまでをコードしている。この 1. 5kbpの遺伝子断片は 制限酵素 Pstlと Hindlllにより消化し、別に Pstlと Hindlllにより消化した L/pNH3 01の制限酵素サイト内へ T4ライゲースを用レ、て連結し、 LH25/pNH301を得た〔 図 6〕。
[0060] 比較例 2：ブレビバチルス.ブレビス細胞壁蛋白質オペロン構造を含まない抗ヒト TN Fひ抗体発現ベクター LpH25ZpNH301の構築
スぺーサー配列中に「ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、 MWP 遺伝子の終止コドンの直後から〇WPのシグナルペプチドをコードする DNA配列の 直前までの DNA配列のうちの、任意の 20ヌクレオチド長以上からなる DNA配歹 U」を 含む、本発明の「DNA構築体」の 1実施例を用いた発現方法と、スぺーサー配列の 中に上記「DNA配歹 lj」を含まないものであって、 L鎖及び H鎖を個々にプロモーター 支配下に配置させた Twoシストロン型の発現方法〔図 7〕との間で、完全長抗体形成 能を比較検討する。実施例 1で構築した HZpNH301を铸型とし、合成オリゴヌタレ ォチドプライマ一 TNF— HF4 : 5 ' - TTTCTGC AGGAATATACTAGAGATTT TTAA- 3 ' (配列番号 10)及び TNF_HR1 : 5 ' - CCCAAGCTTTCATTTAC CCGGAGACAGGGA- 3 ' (配列番号 4)を用レ、 PCRを行った。 PCRより得られた 約 1. 7kbpの遺伝子断片は、 H/pNH301の発現プラスミドに由来する MWPプロ モーター P5、 MWPの SD配列からシグナルペプチド及び H鎖のストップコドンまでを コードしている。この約 1. 7kbpの遺伝子断片は制限酵素 Pstlと Hindlllにより消化 し、別に Pstlと Hindlllにより消化された L/pNH301内へ T4ライゲースを用いて連 結し LpH25/pNH301を得た（図 7)。
実施例 4 :ブレビバチルス.チョウシネンシス完全長抗ヒト TNF a抗体発現株の取得 ブレビバチルス.チョウシネンシス HPD31 (特開昭 63— 56277号公報、 FERM BP 1087)から、公知の変異処理を施し菌体外プロテアーゼ活性の低い株として得ら れたブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31— OK株（FERM BP— 4573)を宿 主として用いた。実施例 2、 3及び比較例 1、 2にて構築した L—OWPT— H/pNH3 01、 L— OWPSD— H/pNH301、 LH25/pNH301及び LpH25/pNH301の 4つの完全長抗ヒト TNF a抗体をコードしてレ、る発現ベクターを用レ、、それぞれブレ ビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— OK株に対し形質転換を行った。ブレビバチ ルス'チョウシネンシス HPD31— OK株の形質転換は、公知のエレクト口ポレーシヨン 法にて行った。エレクト口ポレーシヨンは、ジーンパルサー（BioRad社製）を用いて 1 . 5kV、 1000オーム、 25 z Fの条件で印加した後、 20mM MgClを含んだ T2培
2
地 [ポリペプトン S 1 %、酵母エキス 0. 2%、カツォ由来肉エキス 0. 5%、グルコース 1 %、 MgSO · 7Η Ο 0. 01 %、 CaCl · 7Η O 0. 01 %、 MnSO · 4Η O 0. 00
4 2 2 2 4 2 l %、FeSO - 7H O 0. 001 %、 ZnSO - 7H〇 0. 0001 % pH7. 0] lmlを直ち
4 2 4 2
に添カ卩し、 30°Cで 2時間振とう培養を行った。この培養液の一部をネオマイシン 60m g/L含有 T2寒天培地 (T2培地に 1. 5%の寒天を含む）に塗布し 30°Cで 2日間培 養を行い、出現したコロニーを形質転換体として用いた。発現プラスミド L— OWPT — H/pNH301、 L— OWPSD— H/pNH301、 LH25/pNH301、 LpH25/p NH301によって形質転換されたブレビバチルス.チョウシネンシス形質転換株はそ れぞれ〇WPT、 OWPSD, LH、 LpH株とした。
[0062] 実施例 5：ブレビバチルス ·チョウシネンシス形質転換体株による完全長抗ヒト TNF a 抗体の発現試験
得られた形質転換体 OWPT株、 OWPSD株、 LH株、 LpH株及びそれらの対照とな る pNH301プラスミドのみを有するブレビバチルス.チョウシネンシス HPD31 _〇K 株を生産培地 3YC (ポリペプトン S 3%、酵母エキス 0. 5%、グノレコース 3%、 MgS O · 7Η〇 0. 01 %、 CaCl · 7Η〇 0. 01 %、 MnSO ·4Η〇 0. 001 %、 FeSO
4 2 2 2 4 2
· 7Η Ο 0. 001 %、 ZnSO · 7Η Ο 0. 0001 %、 ρΗ7. 0)及びネオマイシン 60m
4 2 4 2
g/Lからなる培地にて 30°C、好気的条件下、 3— 4日間培養を行った。培養液は遠 心分離（10, OOOrpm, 4°C、 5分間）後、抗ヒト IgG抗体を用いたウェスタンブロット法 に供した。
[0063] 実施例 6：形質転換株から得られた培養液上清中の完全長抗ヒト TNF a抗体の検出 遠心回収したそれぞれの培養液上清は、非還元処理、還元処理を行った。非還元 処理においては培養上清 0· 09mlに lOOmMョード酢酸 0. 01ml加えた後、 2xSD Sサンプルバッファー（還元剤を含まない）を 0· 1ml加えた。還元処理サンプル調整 の場合、同様に上清 0. 09mlに 1Mジチオトレイト一ノレを 0. 01mlカ卩えた後、 2xSDS サンプルバッファーを 0. 1ml加えた。両処理を行った上清液は、沸騰水浴上にて 5 分間加熱を行った。各上清液 0. 005 -0. 01mlは 5— 20%グラジェントポリアクリル アミドゲルより分離した後、ウェスタンプロットにより培養液中に存在する完全長抗ヒト TNFひ抗体の検出を行った。検出には還元型処理培養液の場合、西洋ヮサビペル ォキシダ―ゼ（HRP)標識ゥサギ抗ヒト IgG (H + L)抗体 (Rockland社製）を用い、非 還元型処理培養液の場合はゥサギ抗ヒト IgG (Fc)抗体 (Rockland社製)及び二次 抗体として HPR標識ャギ抗ゥサギ IgG抗体 (Rockland社製）を用い、それぞれ適当 な濃度に希釈し検出を行った。シグナルの検出は、 SuperSignal WestPico (PIE RCE社製）を用いた化学発光法により行った。また抗ヒト TNF a抗体の標準品として 、ヒト胚腎臓由来の培養細胞により取得された抗ヒト TNFひ抗体 [インフリキシマブ（ 遺伝子組換え） ·田辺製薬社製]を用い実験に供した。非還元処理下、 OWPT株、〇 WPSD株の形質転換株の培養上清中にはいずれも L鎖及び Η鎖が結合していると される分子量約 190kDa付近に位置するシグナルが確認され、これらのシグナルの 位置は標準品インフリキシマブとほぼ同じ移動度を示した。一方、比較例 1、 2で構築 された発現ベクターによる形質転換体 LH株や LpH株では 190kDa付近のシグナル はほとんど認められず、代わりに L鎖及び H鎖のモノマー、 L鎖及び H鎖同士の多量 体化、または L鎖及び H鎖同士がダイマー化したと推定される同定不明のシグナル が目立ち、比較例 1、 2で構築された発現ベクターにより形質転換された株において は完全長抗体の生産効率が悪ぐまた形成不能であることが明らかとなった。加えて 、ブレビバチルス'ブレビス細胞壁蛋白質オペロン構造様式を用い発現させた形質 転換体 OWPT株や OWPSD株は、 LH株や LpH株と比較して、培養液上清中に存 在する L鎖及び H鎖のモノマーやダイマーといった夾雑するバンドが減り、分子量 19 OkDa付近のバンドが特異的に増加し完全長抗体分子形成が促進される結果となつ た〔図 8〕。還元処理を行った各株のウェスタンプロットによる結果では、すべての形 質転換株に抗ヒト TNF a抗体の L鎖（分子量約 26kDa)及び H鎖（分子量約 51kDa )に相当する位置にバンドを検出することが出来たが、 LH株や LpH株の培養液上清 においては L鎖及び H鎖の量的比の極端な不均一性が認められた〔図 9〕。カロえてゥ エスタンブロットによるシグナルの強度により OWPT株や OWPSD株の L鎖及び H鎖 の量的比率はほぼ同程度であることが明らかとなり、 L鎖及び H鎖の等しい発現量比 (ほぼ等しい発現量比である場合を含む）が完全長抗体フォーム形成において重要 であることが推察された〔図 9〕。これらの結果は、ブレビバチルス属細菌における完 全長抗体蛋白質の発現では、スぺーサー配列中にブレビバチルス属細菌の細胞壁 蛋白質オペロン中の所定の DNA配列を含まなレヽベクターによる発現方法（上記比 較例 1参照）や、個々のプロモーターにより L鎖 H鎖を別々に発現させるような Twoシ ストロン型の発現方法（上記比較例 2参照）よりも、本発明の 1実施例としての、スぺー サー配列中に細胞壁蛋白質オペロン構造の少なくとも 1部分の DNA配列を含むベ クタ一を用いた発現様式のほうが、蛋白質の発現に関して効果的な技術であることを 示していた。
[0064] 実施例 7：ブレビバチルス 'チョウシネンシス形質転換体からの完全長抗ヒト TNF a抗 体の精製
実施例 4にて得られた形質転換体 OWPT株、 OWPSD株のそれぞれを 3YC培地 2 00mlにて 3日間 30°Cで培養後、遠心分離により上清培養液を回収し、硫酸アンモ ニゥム 50%、 75。/0飽和画分を用いて塩析後、 20mMリン酸緩衝液（pH7. 0)に対し て透析を行った。この透析物は酸性 pHへ調整後、高速遠心分離により酸性沈殿画 分を除去し、上清を陽イオン交換クロマトグラフィー（CM_ Sepharose :アマシャム バイオサイエンス社製）に供し 0— 1M NaClの濃度勾配により分離した。次に完全 長抗体画分を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィー（Superose：アマシャムバイオサイ エンス社製）に供し、高分子画分を採取し限外ろ過膜により濃縮後、プロテイン Aァフ ィニティークロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製）により精製を行った。 以上の精製操作により、約 lmgの完全長抗ヒト TNF a抗体を精製、回収することが 出来た。
[0065] 実施例 8：組み換え抗ヒト TNF a抗体を構成する L鎖及び H鎖の N末端アミノ酸配列 の確認
実施例 7で得られた完全長抗ヒト TNF a抗体を、実施例 6と同様の方法で還元処理 した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。当該ゲルから、分子量 25kDa、お よび 50kDaに相当する分子量のバンドを切り出し、常法に従って、それらの N末端ァ ミノ酸配列を 5残基まで解析した。その結果、分子量 25kDaのバンドが抗ヒト TNF a 抗体の L鎖と、また分子量 50kDaのバンドが抗ヒト TNFひ抗体の H鎖と、それぞれ同 一の N末端アミノ酸配列を有してレ、た。
[0066] 実施例 9：組み換え抗ヒト TNF a抗体のヒト TNF αへの結合活性評価
実施例 7で精製品として得られた組み換え抗ヒト TNF a抗体を用いて、ヒト TNF aに 対する結合能を酵素免疫測定法 (ELISA)に従って行った。 ELISAの測定法として は、 96穴のマイクロプレートの各ゥエルに 5 _ 10ngの組換えヒト TNFひ （Serotec社 製）を含む PBS緩衝液をカ卩ぇ 4°Cにて一夜放置後、 25%ブロックエース（和光純薬 社製）を含む PBS緩衝液でブロックした反応プレートを使用した。 PBS緩衝液にて適 当な希釈した精製抗ヒト TNF a抗体を加え、 37°Cにて 1時間反応後、 0. 01 %Twe en20 (物質名：ポリオキシエチレン（20)ソルビタンモノラウレート、 ICI社製）を含む P BSで洗浄した。適当な濃度に PBSで希釈したゥサギ抗ヒト IgG (Fc)抗体を上記と同 様に反応させた後、洗浄を繰り返し、二次抗体として適当な濃度へ希釈した HPR標 識ャギ抗ゥサギ IgG抗体をカ卩え、上記同様に反応を行った。洗浄後、発色基質 [2， 2 ，—アジノジ（3—ェチルベンゾチアゾリンー 6—スルフォン酸）アンモニゥム塩 (A. B. T. S) ]溶液を力卩ぇ喑所にて 20分間反応後、 405nmにおける吸光度を測定し TNF ひ結合定数を測定した。その結果、ブレビバチルス 'ブレビスにより生産された抗ヒト TNF a抗体は、標準品であるインフリキシマブと同程度以上の値を示した〔図 10〕。
[0067] 以上説明した本発明の実施例に従えば、例えば医薬品や医療診断薬として利用さ れうる、 2以上のポリペプチドから構成される蛋白質 (例えば完全長抗体）の製造にお いて、生産量及び収率を有意に増大させることが可能になる。特に、本発明の実施 例に従えば、細菌宿主を用いる従来の方法では問題となっていた、 2以上のポリぺプ チドから構成される蛋白質のァグリゲーシヨンや多量体化を解消できるだけでなぐ 2 以上のポリペプチドから構成される蛋白質を直接活性体として得ることが可能である 。したがって、本発明の実施例は、安価、かつ大量の該蛋白質を必要とする医薬品 製造等において、極めて有効である。
産業上の利用可能性
[0068] 本発明は、 2以上のポリペプチドから構成される蛋白質を含む製品（例えば医薬品ま たは医療診断薬）の製造において、極めて有効な手段となる。
図面の簡単な説明
[0069] [図 1]実施例 1に記載のブレビバチルス'ブレビス蛋白質分泌発現ベクター（pNH30 1)の構造を示す。
[図 2]実施例 1で構築した抗ヒト TNF a抗体 L鎖及び H鎖分泌発現ベクターの構造を 示す。
[図 3]実施例 2で記載したブレビバチルス 'ブレビス細胞壁蛋白質（OWP、 MWP)ォ ペロン構造の配列を示す (配列番号 11)。 園 4]実施例 2で構築した抗ヒト TNF a抗体分泌発現ベクター（L— OWPT— H/p NH301)を示す。
園 5]実施例 3で構築した抗ヒト TNF a抗体分泌発現ベクター（L— OWPSD— H/ PNH301)を示す。
[図 6]比較例 1で構築した抗ヒト TNF a抗体分泌発現ベクター (LH25/pNH301) を示す。
[図 7]比較例 2で構築した抗ヒト TNF a抗体分泌発現ベクター (LpH25/pNH301) を示す。
[図 8]実施例 5で得られた抗ヒト TNF a抗体発現株の培養液上清 (非還元処理）の抗 体の様相を示す。
[図 9]実施例 5で得られた抗ヒト TNF a抗体発現株の培養液上清 (還元処理）の抗体 の様相を示す。
[図 10]実施例 7で得られた抗ヒト TNF a抗体発現 OWPT株及び OWPSD株培養上 清から得た精製抗体のヒト TNF aへの結合活性測定を示す。
[図 11]図 4に示す完全長抗ヒト TNF a抗体発現ベクター L OWPT— H/pNH30 1における、配列番号 15に対応する部分を示す。
[図 12]図 5に示す完全長抗ヒト TNF a抗体発現ベクター L OWPSD— H/pNH3 01における、配列番号 18に対応する部分を示す。
紙面による写し（注意 電子データが原本となります)
-1 様式 PCT/RO/134 (SAFE)
この寄託された微生物又はその他の生物
材料に関する表示（PCT規則 13の 2)は、
-1-1 右記によって作成された。 -2 国際出願番号 PCT/JP2005/01 0607
-3 出願人又は代理人の書類記号
B040302W001 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
-1 段落番号 0024
-3 寄託の表示
-3-1 寄託機関の名称
I P0D (独)産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一 ( I P0D)
-3-2 寄託機関のあて名 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1
中央第 6
-3-4 受託番号 I POD FERM P-7224
-5 この表示を行うための指定国 すべての指定国
下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
-1 段落番号 0036
-3 寄託の表示
-3-1 寄託機関の名称
I P0D (独)産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一 ( I P0D)
-3-2 寄託機関のあて名 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1
中央第 6
-3-4 受託番号 I POD FERM BP-1 087
-5 この表示を行うための指定国 すべての指定国
下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
-1 段落番号 0044
-3 寄託の表示
-3-1 寄託機関の名称 I P0D (独)産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
一 ( I P0D)
-3-2 寄託機関のあて名 〒305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1
中央第 6
-3-4 受託番号 I POD FERM BP-4573
-5 この表示を行うための指定国 すべての指定国 受理官庁記入欄
Figure imgf000033_0001
紙面による写し（注意 電子データが原本となります) 国際事務局記入欄
-5 この用紙が国際事務局に受理された日
-5-1 権限のある職員

Claims

請求の範囲 [1] スぺーサー配列を含む DNA構築体であって、該スぺーサー配列が以下の（1)また は（2)の DNA配列を含む、 DNA構築体。
(1)ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、 middle wall protein遺 伝子の終止コドンの直後から outer wall proteinのシグナノレペプチドをコードする DNA配列の直前までの DNA配列のうちの、任意の 20ヌクレオチド長以上からなる DNA配列。
(2) (1)の DNA配列中に、 1または数個のヌクレオチドの置換、欠失および/または 付加を有する DNA配列であって、かつ（1)の DNA配列と同等の機能を有する DN A配列。
[2] シグナルペプチドをコードする DNA配歹 IJ、および 2種類以上のポリペプチドから構成 される蛋白質のいずれ力 1つのポリペプチドをコードする DNA配列を含む翻訳ュニ ットの 2種類以上が、該スぺーサー配列を介して連結され、かつ単一のプロモーター 配列に作動可能に連結されている、請求項 1記載の DNA構築体。
[3] 前記翻訳ユニットが 2個であり、かつ前記蛋白質のポリペプチドをコードする DNA配 列のそれぞれが完全長抗体を構成する軽鎖 (L鎖)又は重鎖 (H鎖）をコードするもの である、請求項 2記載の DNA構築体。
[4] 1の翻訳ユニット力 ブレビバチルス属細菌の middle wall proteinのシグナルぺ プチドをコードする DNA配歹 1J、および完全長抗体の軽鎖（L鎖）をコードする DNA配 列を含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌の outer wall protei nのシグナルペプチドをコードする DNA配歹 1J、および完全長抗体の重鎖（H鎖）をコ ードする DNA配列を含む、請求項 3記載の DNA構築体。
[5] 1の翻訳ユニット力 ブレビバチルス属細菌の middle wall proteinのシグナルぺ プチドをコードする DNA配歹 1J、および完全長抗体の重鎖（H鎖）をコードする DNA 配列を含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌の outer wall prot einのシグナルペプチドをコードする DNA配歹 U、および完全長抗体の軽鎖（L鎖）を コードする DNA配列を含む、請求項 3記載の DNA構築体。
[6] 請求項 1から 5のいずれか 1項に記載の DNA構築体を含むベクター。
[7] 請求項 6記載のベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
[8] 前記宿主がブレビバチルス属またはバチルス属細菌である、請求項 7記載の形質転 換体。
[9] 異種蛋白質を生産し、かつ分泌する、請求項 8記載の形質転換体。
[10] 前記ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス'ブレビス、ブレビバチルス 'ボルステ レンシス又はブレビバチルス 'チョウシネンシスである、請求項 9記載の形質転換体。
[11] 2種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質の製造方法であって、請求項 7から
10のいずれ力 4項に記載の形質転換体を培養し前記蛋白質を生産させる工程、お よび生産された該蛋白質を回収する工程を含む製造方法。
[12] 蛋白質が完全長抗体である、請求項 11記載の製造方法。
[13] 請求項 11記載の製造方法によって得られる蛋白質。
[14] 請求項 11記載の製造方法によって得られる蛋白質、および製薬的に許容される担 体を含む医薬組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154175A (zh) * 2011-01-25 2011-08-17 周清明 一种桥石短芽孢杆菌x23及其应用
WO2022092056A1 (ja) * 2020-10-28 2022-05-05 花王株式会社 改変シグナルペプチド

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INOUE Y ET AL: "Efficient production of a functional mouse/human chimeric Fab' against human urokinase-type plasminogen activator by Bacillus brevis.", APPLIED MICROBIOLOGY BIOTECHNOLOGY., vol. 48, no. 4, October 1997 (1997-10-01), pages 487 - 492, XP000940896 *
TSUBOI A ET AL: "Characterization of the Genes Coding for Two Major Cell Wall Proteins from Protein-Producing Bacillus Brevis 47: Complete Nucleotide Sequence of the Outer Wall Protein Gene.", JOURNAL OF BACTERIOLOGY., vol. 168, no. 1, October 1986 (1986-10-01), pages 365 - 373, XP002993043 *
TSUBOI A ET AL: "Characterization of the Genes for the Hexagonally Arranged Surface Layer Proteins in Protein-Producing Bacillus Brevis 47: Complete Nucleotide Sequence of the Middle Wall Protein Gene.", JOURNAL OF BACTERIOLOGY., vol. 170, no. 2, February 1988 (1988-02-01), pages 935 - 945, XP002993044 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154175A (zh) * 2011-01-25 2011-08-17 周清明 一种桥石短芽孢杆菌x23及其应用
CN102154175B (zh) * 2011-01-25 2012-07-25 湖南农业大学 一种桥石短芽孢杆菌x23及其应用
WO2022092056A1 (ja) * 2020-10-28 2022-05-05 花王株式会社 改変シグナルペプチド

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