CN106188290B - 大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法。所述的提取方法是用含有醋酸钠、EDTA和氯化钠的提取液提取发酵获得的表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌，并在将所述的提取液与所述的发酵获得的重组大肠杆菌工程菌混合后调节pH至8.0‑9.5之间进行提取。用本发明的提取方法提取大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段，可以在保证提取目标蛋白质收量的基础上尽量提高提取目标蛋白质的纯度，从而降低后续蛋白质层析纯化的难度和/或成本，使后续蛋白质层析纯化的方案易于设计和实现。

Description

大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法
技术领域
本发明一般的涉及大肠杆菌表达蛋白质的提取方法，特别的涉及大肠杆菌表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法。
背景技术
抗体(antibody，Ab)是一种由抗原(例如细菌、病毒及它们的组分，异源蛋白质)诱导、由机体淋巴细胞(浆细胞)合成与分泌的，用来鉴别与中和抗原的免疫球蛋白类物质。抗体分为多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)和单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)，其中前者是由异源抗原或不同的抗原表位刺激机体产生的，后者是由同源抗原乃至相同的抗原表位刺激机体产生的。因此，单克隆抗体较多克隆抗体特异性更强，灵敏度更高，但制备难度与成本也更高。
传统的抗体分子由两条相同的轻链(light chain，LC)与两条相同的重链(heavychain，HC)形成对称的Y形结构，分子量150KD左右，轻链和重链靠近N端的一侧形成可变区(variable region，VR，不同抗体的同型可变区氨基酸序列不同)，包括重链可变区(heavychain variable region，HV)与轻链可变区(light chain variable region，LV)；靠近C端的一侧形成恒定区(constant region，CR，不同抗体的同型恒定区氨基酸序列相同)，包括重链恒定区(heavy chain constant region，Hc)与轻链恒定区(light chain constantregion，Lc)。而重链和轻链可变区又分别由交错排布的四个框架区(framework region，FR，不同抗体的氨基酸序列变化较小)与三个互补决定区(complementarity determiningregion，CDR，不同抗体的氨基酸序列变化较大，尤其是CDR3)组成。两侧的重链和轻链之间均通过二硫键连接起来，两条重链之间亦通过二硫键连接。
哺乳动物抗体分子的重链一共有五种，分别用希腊字母α、δ、ε、γ和μ来命名，相对应的抗体分别称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。不同的重链在大小和组成上有所区别，α和γ包含大约450个氨基酸，而μ和ε则有大约550个氨基酸。
哺乳动物抗体分子轻链只有λ型和κ型两种类型。轻链的长度大约为211～217个氨基酸。
抗体分子可以被蛋白水解酶如木瓜蛋白酶水解成2个Fab段和一个Fc段，或者被胃蛋白酶从铰链区(用于连接Fab和Fc段的富含脯氨酸的结构区域，其包含了重链间的二硫键)断开，水解成一个F(ab)2段和一个Fc段。Fab片段是由重链Fd段和完整轻链通过链间二硫键形成的异二聚体，质量约占抗体分子的1/3。由于缺少Fc段，Fab段既不会和抗原发生沉淀，也不会在活体研究中被免疫细胞捕获。
传统的单克隆抗体是通过杂交瘤细胞技术制备的，属于鼠源性抗体。为了降低乃至消除鼠源性抗体用于人体引起的人抗鼠抗体(HAMA)反应，自上世纪80年代中后期开始，研究者探索以基因工程方法改造鼠源性单克隆抗体，从而制备出了包括嵌合抗体(将鼠抗体的恒定区替换为人抗体的恒定区)与人源化抗体(在嵌合抗体的基础上进一步将可变区的框架区替换为人抗体的框架区)的基因工程抗体，并在此基础上进一步制备获得了重组的全人序列的全人抗体。同时，鉴于完整的抗体分子因表达量及产量低、纯化及质控难、成本高等原因较难以制备，分子量过大难以穿过细胞外间隙进入细胞，容易引起免疫反应等原因，所以又采用基因工程方法使抗体分子小型化，制备出了各种小分子抗体，包括单链抗体(scFv，由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成)、Fab抗体等。
抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。截至2014年底，全球共有针对37种靶标的59个抗体药物产品被批准上市，针对包括各种肿瘤、自身免疫性疾病在内的36种适应症，形成了847亿美元的年市场销售额，且当年全球销售额排名前10的药物中有6个是抗体药物。而在这37种靶标中，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是最热门的靶标，仅此一个靶标的抗体药物2014年全球销售额就达到了345亿美元，高居所有靶标抗体药物销售额之首，也使自身免疫性疾病适应症力压肿瘤适应症成为抗体药物销售额最高的适应症。
以TNF为靶点的抗体药物主要针对以类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、节段性肠炎(Crohn′s disease，CD)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis，PA)为代表的自身免疫性疾病的治疗。目前上市的抗TNF抗体药物主要有5种，分别为infliximab(英夫利昔单抗，商品名Remicade，嵌合抗体)、adalimumab(阿达木单抗，商品名Humira，全人抗体)、golimumab(戈利木单抗，商品名Simponi，全人抗体)、certolizumab(赛妥珠单抗，商品名Cimzia，人源化PEG修饰的Fab抗体)以及etanercept(依那西普，商品名Enbrel，TNF受体与抗体Fc段的融合蛋白)，其中adalimumab、infliximab、etanercept在2014年全球销售排名前10的药物中分别排名第1、3、4位，而certolizumab在2014年的全球销售额也达到了10亿美元以上的规模。
鉴于如前所述的小分子抗体相较于完整分子抗体的优势，类比certolizumab先制备抗TNF抗体Fab片段的小分子抗体，再用PEG修饰以克服小分子抗体半衰期短、稳定性差的缺点就有了相当的可行性。
虽然Fab抗体可以利用诸多表达系统，如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫和植物表达系统表达，但应用最为广泛的还是大肠杆菌(E.coli)表达系统。但大肠杆菌表达Fab抗体最大的问题是容易形成包涵体表达造成表达产物不溶解和无活性，由此必须进一步进行的变复性过程更容易造成Fab抗体的错误折叠和二硫键(Fab抗体有4个链内和1个链间二硫键)的错误配对。解决这一问题的方法是尽量让Fab抗体表达在大肠杆菌周质空间(periplasm space)中。且如果将Fab抗体与分子伴侣(molecular chaperones)类物质，例如Skp、FkpA、二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)、二硫键合成酶(DsbA、DsbB、DsbC)、核酸酶(Nuclease)、肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl prolyl isomerase)等共表达在大肠杆菌周质空间中，还可以进一步降低因过量表达而引起的错误折叠和二硫键错误配对的问题。
大肠杆菌周质空间表达的蛋白质，尤其是Fab抗体在后续的分离纯化过程中首先必须选择适宜的提取方法使表达的目标蛋白质，尤其是Fab抗体选择性高效率的释放到提取溶液中，即在尽量减少菌体杂蛋白、菌体DNA的同时释放之外也要尽量保证表达蛋白质的充分释放。显然，出于这一目的，传统的高压匀浆法、球磨法、超声破碎法、溶菌酶法等提取方法就不适于大肠杆菌周质空间表达的目标蛋白质，尤其是Fab抗体的提取，有必要研究更高效的提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，以在保证提取目标蛋白质收量的基础上尽量提高提取目标蛋白质的纯度，从而降低后续蛋白质层析纯化的难度和/或成本，使后续蛋白质层析纯化的方案易于设计和实现。
在基础的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其是用含有醋酸钠、EDTA和氯化钠的提取液提取发酵获得的表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌，并在将所述的提取液与所述的发酵获得的重组大肠杆菌工程菌混合后调节pH至8.0-9.5之间进行提取。
本发明的重组大肠杆菌工程菌可以利用商业化的大肠杆菌工程菌转化重组表达载体后制备，也可以对商业化的大肠杆菌工程菌做进一步的改造后转化重组表达载体制备，制备方法是本领域技术人员公知的。商业化的大肠杆菌工程菌例如BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、Arctic Express、Origami B(DE3)。其中BL21菌株及其衍生菌株被广泛用于重组蛋白的表达，该类菌株为蛋白酶基因缺陷型菌株，能够有效避免重组蛋白酶解。BL21(DE3)工程菌包含整合在BL21菌株染色体上的λ噬菌体DE3区，该区的lacUV5启动子可以调控T7RNA聚合酶的表达，尤其适用于T7启动子系统。
制备本发明的重组大肠杆菌工程菌的表达载体可以选择质粒载体、噬菌体载体、病毒载体，但优选质粒载体。用于转化大肠杆菌的质粒载体包括，例如pET23b、pET24a、pET28a、pET30a、pET32a、pCDFDuet-1、pET15b、pET21a、pETDuet-1、pACYC184、pTXB1、pTYB21。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中提取液中醋酸钠的浓度为20-100mM，EDTA的浓度为10-50mM，氯化钠的浓度为20-100mM。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中所述的发酵获得的表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌与所述的提取液的质量体积比(g/ml)为1:5-1:15。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中提取温度为4-37℃。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中提取时间为16-48小时。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中所述的抗TNF抗体Fab片段的重链氨基酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:3、SEQ ID No:5或SEQ ID No:7所示，与之对应的轻链氨基酸序列分别如SEQ ID No:2、SEQID No:4、SEQ ID No:6或SEQ ID No:8所示。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中所述的抗TNF抗体Fab片段的重链氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，与之对应的轻链氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中所述的重组大肠杆菌工程菌中抗TNF抗体Fab片段与分子伴侣类物质共表达。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中所述的分子伴侣类物质选自二硫键合成酶(示例性氨基酸序列如SEQ IDNo:13所示)、二硫键异构酶(示例性氨基酸序列如SEQ ID No:11所示)、肽基脯氨酰顺反异构酶(示例性氨基酸序列如SEQ ID No:14所示)、Skp(示例性氨基酸序列如SEQ ID No:15所示)、核酸酶(示例性氨基酸序列如SEQ ID No:12所示)中的一种或几种。
在一种优选的实施方案中，本发明提供大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其中所述的分子伴侣类物质是人二硫键异构酶(hPDI)，氨基酸序列如SEQ IDNo:11所示。
本发明中使用的术语“大肠杆菌工程菌”是指经过人工改造，易于接受外源基因，进行外源产物表达的大肠杆菌。
本发明中使用的术语“重组大肠杆菌工程菌”是通过染色体整合，表达载体传递等方式接受了外源基因，能够进行外源产物表达的大肠杆菌。重组大肠杆菌工程菌与大肠杆菌工程菌的区别是前者已经接受了外源基因，能够进行外源产物表达；但后者只是具备接受外源基因，表达外源产物的能力，但尚未接受外源基因，尚不能表达外源产物。
本发明中使用的术语“表达载体”是经过人工改造，能够载有表达外源产物的基因，如果转入外源基因并转入大肠杆菌工程菌形成重组大肠杆菌工程菌则能够在实现自我复制的同时表达外源产物的DNA分子。常见的表达载体包括细菌质粒、噬菌体和病毒等。
本发明中使用的术语“重组表达载体”是指经过人工改造，载有表达外源产物的基因，如果通过转入大肠杆菌工程菌形成重组大肠杆菌工程菌则能够在实现自我复制的同时表达外源产物的DNA分子。重组表达载体与表达载体的区别是前者已经转入外源基因，但后者只是具备转入外源基因的能力，但尚未转入外源基因。
本发明中使用的术语“Fab片段”，也即“Fab抗体”，是指广义的Fab片段或Fab抗体，即包括不含重链铰链区的Fab片段或Fab抗体，也包括含有重链铰链区的Fab’片段或Fab’抗体。
本发明中使用的术语“提取”(extraction)是指侠义的提取，即仅指将周质空间表达的目的蛋白质转移到大肠杆菌细胞外提取液中的过程，而不包括进一步分分离纯化，例如层析(chromatography)的过程。
具体实施方式
通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。
实施例1：表达SEQ ID No:7的重链氨基酸序列和SEQ ID No:8的轻链氨基酸序列的Fab片段的重组大肠杆菌工程菌的构建
Fab抗体在大肠杆菌的周质空间分泌表达是通过在空质粒表达载体中导入目的基因，构建重组质粒表达载体，然后转入大肠杆菌工程菌构建重组大肠杆菌工程菌来实现的。
1)目的基因的构建与扩增
在Fab抗体的重链基因序列(对应的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示)前引入一段OmpA信号肽基因序列(对应的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示)，之后插入一段包含核糖体结合位点的连接序列，之后再在引入一段OmpA信号肽基因序列后连接Fab抗体的轻链基因序列(对应的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示)，由此构建表达Fab抗体的目的基因(对应序列如SEQ ID No:10所示)。
表达Fab抗体的目的基因通过基因全合成的方式获得，并进行了针对大肠杆菌BL21(DE3)偏爱密码子的优化。
通过PCR方式扩增合成的表达Fab抗体的目的基因cDNA，5’端引物包含NdeⅠ酶切位点，3’引物包含EcoRⅠ酶切位点，将这两个酶切位点分别加到目的基因的5’端和3’端。具体的PCR反应条件为：反应模版(100ng/μl)1μl，5’引物(50ng/μl)与3’引物(50ng/μl)各2μl，PCR反应混合液(北京天根生物科技有限公司)12.5μl，加dd H2O至25μl；循环开始前94℃5分钟，循环开始后94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共30个循环，循环结束后72℃10分钟。
具体采用的引物如下：
5’引物：GGGTTTCATATGAAAAAGACAGCT
3’引物：CGGGGTACCGAATTCTTAGCAT
2)重组质粒表达载体HL-pET30a的构建
pET系列空质粒载体的蛋白表达区域是由T7启动子引导的，后面连接乳糖操纵子(lac operator)序列，之后有一段核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)，之后的序列中包含包括Nde I、Bgl II、Kpn I、Nco I、EcoR V、BamH I、EcoR I、Sac I、Sal I、HindIII、Not I、Xho I在内的一系列酶切位点。pET系列载体为氨苄霉素(Ampicillin)或卡那霉素(kanamycin)抗性标记的。通过用Nde I和EcoR I酶切空质粒载体后连接如上PCR扩增的目的基因，可以构建表达SEQ ID No:7的重链氨基酸序列和SEQ ID No:8的轻链氨基酸序列的Fab片段的重组质粒表达载体，且由于质粒载体中有乳糖操纵子序列，因此可以通过IPTG或乳糖调控目的基因的表达。
具体的Nde I和EcoR I酶切空质粒载体pET30a和表达Fab抗体的目的基因的条件为：空质粒载体或目的基因1μg，Nde I 2μl，EcoR I 2μl，10×H buffer 4μl，加dd H2O至40μl；37℃反应过夜。
酶切后经琼脂糖电泳回收5400bp左右的空质粒载体片段和1500bp左右的目的基因片段，然后进行连接反应，反应条件为：酶切回收后的空质粒载体0.06pmol，表达Fab抗体的目的基因0.6pmol，T4 DNA ligase 2μl，T4 buffer 2.5μl，加dd H2O至25μl；16℃反应过夜。
由此制备获得的重组质粒表达载体命名为HL-pET30a，其进一步的扩增方法如下：
大肠杆菌Top10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。先将连接产物转化至大肠杆菌Top10克隆感受态细胞中，具体的转化条件为：
向100μl Top10感受态细胞中加入连接产物10μl，混匀，冰浴30min。离心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷却2-3min。向每管加入900μl的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床上震荡培养45min(200rpm)。离心后用100μl LB培养基重悬活化后的菌体，用涂布棒在LB(kanamycin+)平板上轻轻涂匀。将平板倒置于37℃培养箱，培养16h。
经37℃过夜培养后提取质粒，测定质粒浓度为82ng/μl，用Nde I和EcoR I对重组质粒表达载体进行酶切后的琼脂糖电泳鉴定，结果表明有正确大小的表达Fab抗体的目的基因被扩增与分离。
3)重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/BL21(DE3)的构建
大肠杆菌工程菌来源为感受态的大肠杆菌BL21(DE3)(购自北京天根生物科技有限公司)。BL21菌株及其衍生菌株被广泛用于重组蛋白的表达，该类菌株为蛋白酶基因缺陷型菌株，能够有效避免重组蛋白酶解。BL21(DE3)工程菌包含整合在BL21菌株染色体上的λ噬菌体DE3区，该区的lacUV5启动子可以调控T7 RNA聚合酶的表达，尤其适用于T7启动子系统。
将HL-pET30a转化到感受态的BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/BL21(DE3)。具体的转化条件为：
向100μl BL21(DE3)感受态细胞中加入HL-pET30a质粒2μl，混匀，冰浴30min。离心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷却2-3min。向每管加入900μl的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床上震荡培养45min(200rpm)。取100μl活化后的菌液，用涂布棒在LB(kanamycin+)平板上轻轻涂匀。将平板倒置于37℃培养箱，培养16h。
实施例2：共表达hPDI与SEQ ID No:7的重链氨基酸序列、SEQ ID No:8的轻链氨基酸序列的Fab片段的重组大肠杆菌工程菌的构建
1)目的基因的构建与扩增：
表达Fab抗体的目的基因的构建、扩增方法同实施例1。
构建的表达hPDI的目的基因对应的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，其中已经包含一段信号肽序列。
表达Fab抗体的目的基因与表达hPDI的目的基因均通过基因全合成的方式获得，并进行了针对大肠杆菌BL21(DE3)偏爱密码子的优化。
通过PCR方式扩增合成的表达hPDI的目的基因cDNA，5’端引物包含NdeⅠ酶切位点，3’引物包含XhoⅠ酶切位点，将这两个酶切位点分别加到目的基因的5’端和3’端。具体的PCR反应条件为：反应模版(100ng/μl)1μl，5’引物(50ng/μl)与3’引物(50ng/μl)各2μl，PCR反应混合液(北京天根生物科技有限公司)12.5μl，加dd H2O至25μl；循环开始前94℃5分钟，循环开始后94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共30个循环，循环结束后72℃10分钟。
具体采用的引物如下：
5’引物：GGGTTTCATATGCTGCGTCGTGCTCT
3’引物：CCGCTCGAGTCATTACTTATCGT
2)重组质粒表达载体HL-pET30a的构建：同实施例1的“2)重组质粒表达载体HL-pET30a的构建”。
3)重组质粒表达载体hPDI-pCDFDuet的构建
pCDFDuet-1空质粒载体中有两组启动子和多克隆位点，本发明选用的是其中一组，蛋白表达区域是由T7启动子引导的，后面连接乳糖操纵子(lac operator)序列，之后有一段核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)。多克隆位点包含Nde I、Bgl II、MfeI、EcoR V、Fse I、AsiS I、Zral I、Aat II、Acc65 I、Kpn I、Ava I、Xho I、Pac I、Avr I。pCDFDuet-1载体为链霉素(Streptomycin)抗性标记的。通过用Nde I和Xho I酶切空质粒载体后连接如上PCR扩增的目的基因，可以构建表达SEQ ID No:9的氨基酸序列的hPDI的重组质粒表达载体，且由于质粒载体中有乳糖操纵子序列，因此可以通过IPTG或乳糖调控目的基因的表达。
具体的Nde I和Xho I酶切空质粒载体pCDFDuet-1和表达hPDI的目的基因的条件为：空质粒载体或目的基因1μg，Nde I 2μl，Xho I 2μl，10×H buffer 4μl，加dd H2O至40μl；37℃反应过夜。
酶切后经琼脂糖电泳回收3800bp左右的空质粒载体片段和1500bp左右的目的基因片段，然后进行连接反应，反应条件为：酶切回收后的空质粒载体0.06pmol，表达hPDI的目的基因0.6pmol，T4 DNA ligase 2μl，T4 buffer 2.5μl，加dd H2O至25μl；16℃反应过夜。
由此制备获得的重组质粒表达载体命名为hPDI-pCDFDuet，其进一步的扩增方法如下：
向100μl Top10感受态细胞中加入连接产物10μl，混匀，冰浴30min。离心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷却2-3min。向每管加入900μl的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床上震荡培养45min(200rpm)。离心后用100μl LB培养基重悬活化后的菌体，用涂布棒在LB(Streptomycin+)平板上轻轻涂匀。将平板倒置于37℃培养箱，培养16h。
经37℃过夜培养后提取质粒，测定质粒浓度为214ng/μl，用Nde I和Xho I对重组质粒表达载体进行酶切后的琼脂糖电泳鉴定，结果表明有正确大小的表达hPDI的目的基因被扩增与分离。
4)重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)的构建
将hPDI-pCDFduet转化到感受态的BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌中间菌株hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)。具体的转化条件为：
向100μl BL21(DE3)感受态细胞中加入hPDI-pCDFduet质粒2μl，混匀，冰浴30min。离心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷却2-3min。向每管加入900μl的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床上震荡培养45min(200rpm)。取100μl活化后的菌液，用涂布棒在LB(Streptomycin+)平板上轻轻涂匀。将平板倒置于37℃培养箱，培养16h。
将hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)转接至12ml LB(Streptomycin+)培养基活化扩增，分装至1.5ml离心管中，冰浴20分钟。于4℃8000rpm×45s离心回收细胞。每1.5ml培养液离心后的菌体用预冷的0.1M CaCl2 500μl重悬洗涤。于4℃5000rpm×45s离心回收细胞。每1.5ml培养液离心后的菌体用冰预冷的85μl 0.1M CaCl2重悬，使之成为感受态细胞。
将HL-pET30a转化到hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组大肠杆菌工程菌株HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)。具体的转化条件为：
向85μl hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)中间感受态细胞中加入HL-pET30a质粒2μl，混匀，冰浴30min。离心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷却2-3min。向每管加入900μl的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床上震荡培养45min(200rpm)。取100μl活化后的菌液，用涂布棒在LB(kanamycin+，Streptomycin+)平板上轻轻涂匀。将平板倒置于37℃培养箱，培养16h。
实施例3：重组大肠杆菌工程菌的发酵
重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/BL21(DE3)与HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)的发酵均采用如下方法：
发酵培养基组成如下：胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖10g/L、柠檬酸钠3g/L、KH2PO4·3H2O 5.2g/L、(NH4)2SO4 1.5g/L、Na2HPO4 4.05g/L、MgSO4·7H2O 1.0g/L，NaH2PO4·2H2O 3.0g/L、NH4Cl 0.2g/L、FeSO4·7H2O 5.45μg/L、ZnSO4·7H2O 2.55μg/L、CaCl2·2H2O 3.8μg/L、MnSO4·5H2O 1.5μg/L、CuSO4·5H2O 0.8μg/L、AlCl3·6H2O 0.3μg/L、(NH4)6IMo7O24·4H2O 0.1μg/L、H3BO3 0.5μg/L，Vitamin B1 2μg/L。
补料培养基组成如下：葡萄糖750g/L、MgSO4·7H2O 20g/L、柠檬酸3g/L、KH2PO4·3H2O 7.15g/L、(NH4)2SO4 4.8g/L、Na2HPO4·12H2O 4g/L。
将重组大肠杆菌工程菌株HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)或HL-pET30a/BL21(DE3)克隆活化后保存甘油菌，成为一级种子。取10μl甘油菌至100ml LB培养基(kanamycin+，Streptomycin+，终浓度分别为100μg/ml、50μg/ml)中，于37℃、200rpm条件下过夜摇菌活化至OD＝4.0。成为二级种子。
将活化后的菌液以1:100的比例用无菌针筒接种至NBS(型号BioFlo III)发酵罐3.5L的发酵培养基(kanamycin+，Streptomycin+，终浓度分别为100μg/ml、50μg/ml)中，于37℃，搅拌速度250rpm开始培养，初始pH调整至7.0。利用Biocommand软件(NBS发酵罐自带控制软件)记录实时发酵参数：搅拌速度(Agitation)，溶解氧浓度(DO)，pH值，温度(Temp)。每隔1小时取样检测OD600数值。
当溶氧下降到40％以下时，程序调整转速由250rpm上升至400rpm，通入压缩空气，通气量至1升/分钟。5.5-6h，pH明显上升，提示初始加入的葡萄糖被菌体消耗完毕，菌体开始利用含氮有机物作为碳源，产生的铵离子使发酵液pH上升，pH上升到7.05时使用Biocommand软件程序自动补料，pH低于7.05时停止补料，pH下降到6.98时程序设定补充28％氨水调整pH值。从6h开始，溶氧下降到20％以下，此时增大通气量至4升/分钟。至OD600为12.0时，降温到30℃，加入α-乳糖(20g/L)作为诱导剂进行诱导，加入速度为10g/L·h，流加结束后加入IPTG(1mM)进行进一步诱导，诱导时间为18h，总发酵时间为24h。
实施例4：周质空间发酵表达Fab抗体的提取
实施例3的两种重组大肠杆菌工程菌的发酵液分别经4℃，6000rpm离心处理30分钟后分别取沉淀，分成不同部分后分别按不同设计的提取方法进行提取试验，即分别按设计的质量体积比(g/ml)加入设计组成的提取液，按设计的温度、提取震荡转速(置摇床震荡)、提取时间提取后分别4℃，6000rpm离心处理30分钟后取上清即分别得提取液，用于如下实施例6的检测，各提取方法的具体设计提取条件如下表1所示。
表1周质空间发酵表达Fab抗体的设计提取条件
注：
提取液1组成为：20mM Tris-HCl，10mM EDTA，20mM NaCl
提取液2组成为：100mM Tris-HCl，50mM EDTA，100mM NaCl
提取液3组成为：20mM NaAc，10mM EDTA，20mM NaCl
提取液4组成为：100mM NaAc，50mM EDTA，100mM NaCl
实施例5：周质空间发酵表达Fab抗体的提取(对照例)
按如下方法对照进行周质空间发酵表达Fab抗体的提取试验：
方法45：重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/BL21(DE3)发酵液经4℃，6000rpm离心处理30分钟后取沉淀，按1:15的质量体积比(g/ml)加入组成为100mM PB，50mM EDTA，100mMNaCl，1mg/ml溶菌酶，1％Triton X-100，pH 7.4的提取液，37℃，摇床200rpm震荡48小时后4℃，6000rpm离心处理30分钟后取上清。
方法46：重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)发酵液经4℃，6000rpm离心处理30分钟后取沉淀，按1:15的质量体积比(g/ml)加入组成为100mM PB，50mM EDTA，100mM NaCl，1mg/ml溶菌酶，1％Triton X-100，pH 7.4的提取液，37℃，摇床200rpm震荡48小时后4℃，6000rpm离心处理30分钟后取上清。
方法47：重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/BL21(DE3)发酵液经4℃，6000rpm离心处理30分钟后取沉淀，按1:15的质量体积比(g/ml)加入组成为100mM Tris-HCl，50mM EDTA，100mM NaCl，pH 9.0的提取液，于4℃在超声波破碎仪上进行超声破碎处理(条件为：打5秒，歇5秒，共60分钟)，所得破碎液经4℃，6000rpm离心处理30分钟后取上清。
方法48：重组大肠杆菌工程菌HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)发酵液经4℃，6000rpm离心处理30分钟后取沉淀，按1:15的质量体积比(g/ml)加入组成为100mMTris-HCl，50mM EDTA，100mM NaCl，pH 9.0的提取液，于4℃在超声波破碎仪上进行超声破碎处理(条件为：打5秒，歇5秒，共60分钟)，所得破碎液经4℃，6000rpm离心处理30分钟后取上清。
如上提取方法得到的提取液同样用于实施例6的检测。
实施例6：周质空间发酵表达Fab抗体提取液中Fab抗体量与纯度检测
1)周质空间发酵表达Fab抗体提取液中Fab抗体量检测
采用ELISA法检测Fab抗体的量，具体方法如下：
包被抗体为羊抗人IgG(Fab段特异，Jackson ImmunoResearch 109-001-006)以碳酸盐缓冲液(50mM Na2CO3，50mM NaHCO3)稀释至100μg/ml，使用96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃过夜包被。弃去孔内溶液，PBST洗涤缓冲液200μl/孔洗3次；每孔加封闭液(5％BSA-PBS缓冲液)100μl，37℃封闭1h。弃去孔内溶液，PBST 200μl/孔洗3次。将人Fab抗体片段标准品(Jackson ImmunoResearch 009-000-007)稀释至0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08、0.06、0.05、0.04、0.02、0.01μg/ml，用PBS稀释，每孔100μl；稀释后的各实施例4的方法得到的提取液每孔100μl，37℃下孵育2h。弃去孔内溶液，PBST洗孔5次，加对人源IgG Fab’有特异性的HRP标记二抗(Sigma A0293，1:5000，溶于5％BSA-PBS溶液)，100μl/孔，室温孵育1h。弃去孔内溶液，PBST洗孔5次，每孔200μl，加TMB底物显色液，每孔100μl，室温孵育20-30min后，各孔加100μl 2M H2SO4终止反应，使用酶标仪检测OD450，绘制标准曲线，计算样品浓度。
2)周质空间发酵表达Fab抗体提取液中Fab抗体纯度检测
按《中国药典2010版(三部)》附录“蛋白质含量测定法”第二法Lowry法的规定测定周质空间发酵表达Fab抗体提取液中的总蛋白浓度，然后用如上测定得到的周质空间发酵表达Fab抗体提取液中Fab抗体的浓度除以该测定得到的总蛋白浓度，即得周质空间发酵表达Fab抗体提取液中Fab抗体的纯度。
表2各提取方法得到提取液中Fab抗体量与Fab抗体纯度的检测结果

Claims (2)

1.大肠杆菌周质空间表达抗TNF抗体Fab片段的提取方法，其特征是用含有醋酸钠、EDTA和氯化钠的提取液提取发酵获得的表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌，并在将所述的提取液与所述的发酵获得的重组大肠杆菌工程菌混合后调节pH至8.0-9.5之间进行提取，
其中：
所述的提取液中醋酸钠的浓度为20-100mM，EDTA的浓度为10-50mM，氯化钠的浓度为20-100mM；
所述的发酵获得的表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌与所述的提取液的质量体积比为1:5-1:15；
提取温度为4-37℃，提取时间为16-48小时；
所述的大肠杆菌工程菌为BL21(DE3)，表达抗TNF抗体Fab片段的基因位于重组质粒载体pET30a内；
所述的抗TNF抗体Fab片段的重链氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，与之对应的轻链氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是所述的重组大肠杆菌工程菌中抗TNF抗体Fab片段与分子伴侣类物质共表达，所述的分子伴侣类物质是人二硫键异构酶，氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，且表达人二硫键异构酶的基因位于重组质粒载体pCDFduet内。
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