CN105368904A - 一种免疫球蛋白g片段的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种免疫球蛋白G片段的制备方法及应用,所述方法包括以下步骤:(1)取IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G在缓冲液中混合,孵育;(2)酶切后分离纯化得到免疫球蛋白G?F(ab’)2片段。或(1)取IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G在缓冲液中混合,孵育;(2)酶切后分离纯化免疫球蛋白G?F(ab’)2片段;(3)分离纯化的免疫球蛋白G?F(ab’)2片段还原为Fab’片段,得到免疫球蛋白G?Fab’片段。得到的免疫球蛋白G片段可用于治疗感染性疾病、免疫性疾病和肿瘤,可用于体内疾病的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种免疫球蛋白G片段的制备方法及应用,特别涉及一种高纯度F(ab’)2抗体片段的制备方法及其应用。
背景技术
免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是机体产生的一种特殊的蛋白质,主要存在于生物体血液和其他体液(包括组织液和外分泌液)中。多数Ig具有抗体活性,可以特异性识别和结合抗原,并引发一系列生物学效应。它的理化性状稳定、生物活性明确、与抗原结合的特异性强、便于提取或者重组表达和质量控制,并且来源容易。这些优点使免疫球蛋白成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。尽管免疫球蛋白在疾病的诊断和治疗等方面有着明显的优势,但是常规免疫球蛋白应用也具有明显的局限性,主要体现在其抗原性以及分子结构的大而复杂性。前者易产生治疗中的排异等副作用,后者造成其组织的穿透力差,特异性低,表达复杂且困难。
免疫球蛋白Fab’或F(ab’)2片段,由于去掉了免疫球蛋白恒定区Fc,不受位于巨噬细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞和巨细胞等细胞上的Fc受体的影响,不易遭到吞噬细胞攻击,减少非特异性免疫反应。在使用鼠源性免疫球蛋白以及马源性免疫球蛋白用于体内治疗的时候,Fab’或F(ab’)2片段免疫原性小,使人抗鼠免疫球蛋白、人抗马免疫球蛋白反应最小化。Fab’或F(ab’)2片段分子量小,穿透性强,到达靶标部位迅速且能渗透入组织深层处,有利于快速结合至靶抗原,进行疾病的诊断和治疗。可见,抗体Fab’或F(ab’)2片段去除Fc后具有上述优点,同时还能保留对原抗原的结合能力,药物动力学性质得到改善,更有利于临床应用。
目前免疫球蛋白Fab’片段常用酶解法制备获得。CN104498576A公开了一种固化酶切制备Fab抗体的方法,包括如下步骤:1)固化酶的制备方法:在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球,使木瓜蛋白酶与活化偶联填料充分偶联;2)固化酶酶切:取2H4抗体5mg,与5ml含100μL固定化木瓜蛋白酶的EDTA-Na2消化缓冲液混合、孵育,酶浓度为0.05mg/ml;3)酶切后Fab抗体分离纯化即得Fab抗体。木瓜蛋白酶是一种半胱氨酸肽链内切蛋白酶,被广泛用于抗体片段Fab’的制备。木瓜蛋白酶主要水解IgG的部位是在铰链区的重链链间二硫键近N端侧,可将Ig裂解为2个完全相同的Fab’段和1个Fc段。Fab’段即抗原结合片段,相当于抗体分子的两个臂,由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。一个Fab’片段为单价,可与抗原结合但不发生凝集反应或沉淀反应。Fc段为可结晶片段,相当于IgG的CH2和CH3结构域。Fc无抗原结合活性,是IgG与效应分子或细胞相互作用的部位。但是由于木瓜蛋白酶是一种低特异性的蛋白水解酶,因此制备获得的Fab’产物均一性不佳。
CN1266907A公开了一种单克隆抗体双段和单段的制备方法,该方法为:粗体抗体,酶切,二次纯化和冻干,制备的F(ab)2、F(ab)的纯度可大于98%。胃蛋白酶是一种天冬氨酸型的内切蛋白酶,被广泛用于抗体片段F(ab’)2的制备。用胃蛋白酶水解IgG可获得1个F(ab’)2片段和一些小片段pFc’(Fc/2)。F(ab’)2是由2个Fab’及铰链区组成,由于IgG分子的两个臂仍由二硫键连接,因此F(ab’)2片段为双价,可同时结合两个抗原表位。由于F(ab’)2片段保留了结合相应抗原的生物学活性,又避免了Fc段抗原性可能引起的副作用,因而被广泛用作生物制品,如白喉抗毒素、破伤风抗毒素经胃蛋白酶水解后精制提纯的制品,因去掉Fc段而减少超敏反应的发生。胃蛋白酶水解IgG后所产生的pFc’最终被降解,无生物学作用。同样,胃蛋白酶的底物特异性不是很强,即可作用于铰链区的重链链间二硫键近C端侧,也可作用于铰链区的重链链间二硫键近N端侧,同时由于不同IgG亚类对胃蛋白酶消化的敏感性不一样,尤其是IgG最难消化,甚至有抗性,因此F(ab’)2得率很低。工业生产的时候需要复杂的工艺摸索和严格的酶切体系控制才能获得所需的F(ab’)2片段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫球蛋白G片段的制备方法及应用,该方法获得的F(ab’)2以及Fab’片段纯度可达95%以上。
为达到此发明的目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种免疫球蛋白G片段的制备方法,包括以下步骤:
(1)取IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G在缓冲液中混合,孵育;
(2)酶切后分离纯化得到免疫球蛋白GF(ab’)2抗体。
第二方面,本发明提供一种免疫球蛋白G片段的制备方法,包括以下步骤:
(1)取IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G在缓冲液中混合,孵育;
(2)酶切后分离纯化免疫球蛋白GF(ab’)2片段;
(3)分离纯化的免疫球蛋白GF(ab’)2片段还原为Fab’片段,得到免疫球蛋白GFab’片段。
本发明中,IdeS作用底物只有IgG类抗体,而且与胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不同,IdeS切割位点专一性高,产物均一,酶切IgG后可以获得完整的F(ab’)2片段,其中,与抗原结合的F(ab’)2片段分子量大小约为100kDa。
优选地,步骤(1)所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段,所述片段的序列如下:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTNHHHHHHSSG。
本发明中,所述IdeS蛋白酶可以特异性的酶切免疫球蛋白G,特异性好,酶切后获得单一免疫球蛋白GF(ab’)2片段。
优选地,所述IdeS蛋白酶含有319个氨基酸。
优选地,步骤(1)所述的IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G的质量比为1:(100-1000),例如可以是1:100、1:101、1:102、1:105、1:110、1:120、1:150、1:180、1:200、1:230、1:250、1:300、1:330、1:380、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或1:1000,优选为1:(200-800)。
优选地,所述免疫球蛋白G来源于人和/或动物体液中提取的IgG抗体和/或通过基因工程重组方式表达纯化获得的IgG抗体。
优选地,所述人或者动物血液/体液中提取的IgG抗体为马抗血清。
优选地,所述缓冲液为Tris-HCl、生理盐水、磷酸盐溶液或醋酸钠溶液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,步骤(1)所述孵育的温度为30-40℃,例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃,优选为35-39℃,进一步优选为37℃。
优选地,步骤(1)所述孵育的时间为10-30min,例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min。
优选地,步骤(2)所述分离纯化包括以下步骤:加入0.5-1.5%的明矾吸附热灭活的Fc片段,经过滤、超滤除盐、浓缩回收后,进行离子交换柱层析,调pH值至7-8,过滤除菌后获得高纯度免疫球蛋白GF(ab’)2。
优选地,步骤(3)所述的免疫球蛋白GF(ab’)2片段还原为Fab’片段包括如下步骤:获得高纯度的F(ab’)2后,在溶液中加入1-100mM的乙醇胺和/或半胱胺还原,只打开铰链区二硫键,超滤去除还原剂后获得均一的免疫球蛋白GFab’片段。
第三方面,本发明提供一种组合物,所述组合物包括第一方面所述的制备方法制备得到的免疫球蛋白GF(ab’)2片段。
本发明中,所述组合物不含有血清白蛋白、完整免疫球蛋白G分子及免疫球蛋白GFc片段。
优选地,所述组合物在制备治疗感染性疾病、免疫性疾病和癌症的药物制剂和/或药物组合物中的应用。
优选地,所述组合物用于免疫抗血清和/或基因工程重组单克隆和/或多克隆抗体的制备。
第四方面,本发明提供一种组合物,所述组合物包括第二方面所述的制备方法制备得到的免疫球蛋白GFab’片段。
优选地,所述免疫球蛋白GFab’片段与毒性药物和核素进行偶联。
本发明中,所述药物制剂或药物组合物不含有血清白蛋白、完整免疫球蛋白G分子及免疫球蛋白GFc片段。
优选地,所述组合物制备肿瘤和免疫性疾病的药物制剂和/或药物组合物中的应用。
第五方面,本发明提供一种组合物,所述组合物包括第一方面所述的制备方法制备得到的免疫球蛋白GF(ab’)2片段和第二方面所述的制备方法制备得到的免疫球蛋白GFab’片段。
优选地,所述免疫球蛋白GF(ab’)2片段和免疫球蛋白GFab’片段与核素进行偶联。
优选地,所述组合物在制备疾病的体内诊断和治疗药物制剂和/或药物组合物中的应用。
本发明中,得到的抗体F(ab’)2或Fab’片段,由于去掉了抗体恒定区Fc,作为体外诊断试剂,不沉淀抗原,减少假阳性率。作为体内诊断试剂,标记放射性核素以后,在正常组织中半衰期比全长抗体短,快速降解有利于减少身体正常组织的伤害。此外,由于抗体F(ab’)2或Fab’片段保留对原抗原的高度靶向性,与核素、各种小分子毒性药物以及具有生物学活性的生物毒素(如白喉外毒素、蓖麻毒素)通过各种方式进行偶联,可制备为靶向药物用于肿瘤的精准治疗,提高治疗效果。由于去除了抗体恒定区Fc,可以减少非特异性的毒副作用,和全长抗体相比,抗体F(ab’)2或Fab’片段由于分子量小,交联位点可控,交联反应产品质量比较均一,有利于生产控制,有利于保证临床效果的稳定性。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明制备免疫球蛋白G片段快速、简便,30分钟内完成消化,且无需优化反应条件,中性酶解条件可保护抗体片段不被破坏;
(2)本发明制备方法能特异性切割铰链区下方单一位点,从而产生F(ab’)2和Fc/2片段,酶解性能优异,可达到100%完全消化;
(3)本发明制备方法可有效切割人、猴、马、羊、兔,人源以及嵌合IgG,也可切割Fc融合蛋白。
附图说明
图1为本发明IdeS大肠杆菌表达菌在1000L发酵罐中的表达产物,其中,1-蛋白marker,2-诱导前表达产物,3-诱导1h后表达产物,4-诱导2h后表达产物,5-诱导3h后表达产物;
图2为本发明通过一步层析法可获得纯度高达90%以上的IdeS纯化产物,其中,1-蛋白marker,2-上样的蛋白,3-流穿的蛋白,4-洗涤后的蛋白,5-洗涤后的蛋白,6-样品洗脱后的蛋白;
图3为本发明制备的IdeS蛋白酶对免疫球蛋白G酶切的非还原电泳图,其中,1-蛋白marker,2-完整的免疫球蛋白IgG,3-免疫球蛋白IgG使用IdeS蛋白酶酶切后产生F(ab’)2片段和Fc/2片段;
图4为本发明制备的IdeS蛋白酶对免疫球蛋白G酶切的还原电泳图,其中,1-蛋白marker,2-完整的免疫球蛋白IgG,3-免疫球蛋白IgG使用IdeS蛋白酶酶切后产生Fd片段、Fc/2片段和轻链片段。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1:大肠杆菌中表达IdeS蛋白酶
通过基因合成技术获得所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列,并将IdeS蛋白酶的核苷酸序列重组到表达载体pET32a中,构建重组表达载体。将所述测序证明正确的重组表达载体转化到表达菌BL21大肠杆菌中,得到含有所述IdeS蛋白基因序列的阳性表达菌。
具体地,挑取6个单菌落37℃过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例加入5mlAmp+LB培养基中,37℃220rpm培养2-3h。取出1ml菌液作为未诱导对照,其余按照体积加入IPTG至终浓度为0.5mM,37℃180rpm培养4h。
实施例2:大肠杆菌中工业化发酵生产IdeS蛋白酶
采用大肠杆菌高密度发酵合成表达Ides蛋白酶,采用连续流离心机或碟式离心机预处理发酵液用于Ides蛋白酶纯化。
具体地,种子培养基为LB培养基,经摇瓶培养逐步扩大到1000L发酵罐规模的发酵生产。发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐、维生素及微量元素中生长,可加入消泡剂控制泡沫,如消泡剂Antifoam204。
以补料流加和深层通气培养方式生产,选择葡萄糖或甘油作为限制性碳源控制流加,同时流加蛋白胨和酵母粉的氮源补料培养基。发酵温度37℃,通过补加25%氨水控制pH7.0;发酵罐通气量选择为0.5-2.0vvm,通过控制补料速率、搅拌速率和通气量实现溶氧值在30%左右。在发酵培养过程中,定期取样,测定培养基的光密度OD600,当OD600达到60-70,降温至35℃后,加入诱导剂IPTG诱导培养6-8小时后结束发酵,发酵结束后,发酵液用自来水冷却至20℃左右,于储液罐中保存;采用连续流离心机或碟式离心机分离菌体,离心温度为4-10℃。
结果如图1所示,IdeS大肠杆菌表达菌在1000L发酵罐中的表达产物,诱导前没有产生IdeS蛋白酶,诱导2-3小时后可获得超过20%菌体蛋白百分比的产物量。
实施例3:大肠杆菌中工业化生产IdeS蛋白酶的纯化制备
大肠杆菌中表达的IdeS蛋白酶,可通过收集细胞破碎,采用包括金属螯合层析、疏水层析、阴离子交换层析以及超滤换液等步骤获得高纯度重组Ides蛋白酶。
具体地,用20mMNaH2PO4/Na2HPO4,0.5MNaCl,10mM咪唑,pH7.4的缓冲液平衡装有ChelatingSepharoseFastFlow填料的层析柱,将含有IdeS蛋白酶的样品上样层析柱后用平衡缓冲液洗涤,再用20mMNaH2PO4/Na2HPO4,0.5MNaCl,300mM咪唑,pH7.4洗脱,初步获得IdeS蛋白酶。中间纯化采用20mMNaH2PO4/Na2HPO4,1.0M(NH4)2SO4,pH7.0的缓冲液平衡装有PhenylSepharoseHP填料的层析柱,将初步获得的IdeS蛋白酶,调节溶液电导后上样,用平衡液洗涤,再用20mMNaH2PO4/Na2HPO4,0.4M(NH4)2SO4,pH7.0洗脱获得较高纯度的IdeS蛋白酶。将获得的蛋白酶用分子量截留10kDa的超滤膜置换缓冲液。用20mMNaH2PO4/Na2HPO4,pH8.0的缓冲液平衡装有Q-SepharoseFastFlow填料的层析柱后,将置换缓冲液的蛋白酶上样,用平衡缓冲液洗涤,再用20mMNaH2PO4/Na2HPO4,0.25MNaCl,pH7.5的缓冲液洗脱获得高纯度IdeS蛋白酶。
结果如图2所示IdeS蛋白酶经过纯化后,可获得纯度高达90%以上的IdeS蛋白酶。
实施例4:免疫抗血清F(ab’)2的制备
使用精制的破伤风、炭疽、白喉、肉毒以及灭活的狂犬病毒、埃博拉病毒、SARS病毒等抗原免疫马匹,常规方法制备免疫抗血清。取100mg纯化后的IdeS蛋白酶加入1L醇沉后复溶的马抗血清中,37℃消化30分钟。加入0.5-1.5%的明矾吸附热灭活的Fc片段,使用离子交换色谱柱纯化,超滤浓缩后调pH值,过滤除菌后获得高纯度F(ab’)2。
获得的马源性免疫抗血清F(ab’)2片段可保留结合免疫抗原的生物学活性。由于IdeS酶切去掉了抗体恒定区Fc,使得获得的免疫抗血清F(ab’)2片段不受位于巨噬细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞和巨细胞等细胞上的Fc受体的影响,不易遭到吞噬细胞攻击,减少非特异性免疫反应,避免了Fc段抗原性引起的过敏反应,使人抗马免疫球蛋白反应最小化。
结果如图3和图4所示,图3为本发明制备的IdeS蛋白酶对免疫球蛋白G酶切的非还原电泳图,可见免疫球蛋白IgG使用IdeS蛋白酶酶切后产生F(ab’)2片段和Fc/2片段;而图4为本发明制备的IdeS蛋白酶对免疫球蛋白G酶切的还原电泳图,可以看出免疫球蛋白IgG使用IdeS蛋白酶酶切后产生Fd片段、Fc/2片段和轻链片段,产生的F(ab’)2片段被还原为Fd片段和轻链片段。
实施例5:免疫抗血清F(ab’)2标记物的制备及应用
使用抗原免疫山羊、兔或者鸡,常规方法制备免疫抗血清。取10mg纯化后的IdeS蛋白酶加入100mL山羊、兔或者鸡抗血清中,37℃消化30分钟。使用ProteinL亲和色谱纯化,去除Fc片段分子获得针对免疫抗原的F(ab’)2片段。
将层析后获得的免疫抗血清F(ab’)2片段按照商业化标记试剂盒进行HRP、AP或者Biotin标记,去除标记液后更换缓冲体系至磷酸缓冲液。获得的标记免疫抗血清F(ab’)2片段可直接对石蜡切片或新鲜的组织切片进行免疫组化分析。
该方法制备的F(ab’)2片段标记抗体可避免与ProteinA/G或与巨噬细胞、树状突细胞、嗜中性细胞、NK细胞和B细胞表面的Fc受体结合,使检测背景清晰,无非特异性结合,无交叉反应。
该方法制备的F(ab’)2片段标记抗体由于其分子本身比较小,更容易渗透入细胞组织结构内而灵敏度更高。
实施例6:核素标记的抗体F(ab’)2片段制备及应用
使用基因工程重组单克隆Her2抗体Trastuzumab,在磷酸盐缓冲液中以1:1000的比例加入IdeS蛋白酶,37℃消化15分钟。使用ProteinL亲和色谱纯化,去除Fc片段分子获得F(ab’)2片段。
于试管中用二氯甲烷配置浓度为lg/L的Iodogen溶液,在含50ugIodogen的反应管中依次加入F(ab’)2片段l00ug,50uLPB溶液(0.5mol/L,pH7.4),Nal25I溶液37MBg轻轻摇动,25度反应5min,加入0.05moI/LPB液200ul,静置5min。标记反应结束后将反应混合物用SephadexG-25层析柱纯化,用0.05moI/L的PBS(pH7.4)洗脱,收集洗脱液后检测抗体的标记效率和放射化学纯度,过滤除菌备用。
该方法制备的靶向Her2的F(ab’)2 l25I标记片段保留完整抗体具有与肿瘤相关抗原特异性结合的特性,作为放射免疫诊断与治疗的工具,经一定的途径导入人体后,能特异性地识别Her2阳性的肿瘤细胞及肿瘤组织的相应抗原,引导放射性核素与肿瘤定向结合,使肿瘤部位出现放射性的浓聚,通过r闪烁照相机或ECT系统采集可以获得清晰的图像,根据放射性浓聚区在体内的分布,对肿瘤病灶做出定位诊断。也可与化疗药物联用,直接用于肿瘤的治疗。
该方法制备的F(ab’)2片段标记抗体由于其分子本身比较小,更容易渗透入细胞组织结构内而更好的结合至靶抗原。同时,通过去除Fc端大大降低标记抗体的体内半衰期,减小诊断治疗后的药物损伤。
实施例7:抗Her2抗体Fab’-DM1偶联物的制备及生物学活性检测
使用基因工程重组单克隆Her2抗体Trastuzumab,在磷酸盐缓冲液中以1:100的比例加入IdeS蛋白酶,37℃消化15分钟。使用ProteinL亲和色谱纯化,去除Fc片段分子获得F(ab’)2片段。
在层析后获得的高纯度F(ab’)2片段溶液中加入10mM的半胱胺还原,打开铰链区二硫键,获得高度均一、带有自由巯基的Fab’片段。用缓冲液(50mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾,50mM的NaCl,2mM的EDTA,pH6.5),经10倍体积超滤换液至最终浓度为15mg/mL,加入氩气充满保护。用2.0mL的20mM浓度的smcc(溶于DMSO或DMA),加入到35mL的抗her2抗体溶液中,室温,反应2-4小时。用SephadexG25凝胶柱过滤反应混合物,该柱先用上述缓冲液以5倍柱体积平衡。SMCC修饰后抗体以上述缓冲液稀释到3mg/mL最终浓度,然后在抗体稀释液中加入2.0mL的DMA溶解的DM1溶液(浓度为4.0mM)。在氩气保护下、室温反应15小时。将反应液经Superdex200层析,收集主峰。通过测定252nm和280nm处的吸光度来测定每个Fab’抗体片段分子平均连接的DM1个数,发现每个抗体片段分子偶联一个DM1分子,偶联物高度均一。
和全长抗体相比,Fab’-DM1片段抗体由于分子量小,交联位点可控,交联反应产品质量均一,有利于生产控制,有利于保证临床效果的稳定性。
综上所述,使用本发明中的Ides酶切纯化获得的动物源性免疫抗血清F(ab’)2片段可保留结合免疫抗原的生物学活性。由于IdeS酶切去掉了抗体恒定区Fc,减少非特异性免疫反应,避免了Fc段抗原性引起的过敏反应,使人抗动物的免疫球蛋白反应最小化。其次,Ides酶切得到的抗体F(ab’)2或Fab’片段作为体外诊断试剂,不沉淀抗原,减少假阳性率。作为体内诊断试剂,标记放射性核素以后,在正常组织中半衰期比全长抗体短,快速降解有利于减少身体正常组织的伤害。此外,由于抗体F(ab’)2或Fab’片段保留对原抗原的高度靶向性,与核素、各种小分子毒性药物(如美登素)以及具有生物学活性的生物毒素(如白喉外毒素、蓖麻毒素等)通过各种方式进行偶联,可制备为靶向药物用于肿瘤的精准治疗,提高治疗效果。由于去除了抗体恒定区Fc,可以减少非特异性的毒副作用,和全长抗体相比,抗体F(ab’)2或Fab’片段由于分子量小,交联位点可控,交联反应产品质量比较均一,有利于生产控制,有利于保证临床效果的稳定性。因此,运用Ides酶生产F(ab’)2或Fab’片段的方法具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种免疫球蛋白G片段的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G在缓冲液中混合,孵育;
(2)酶切后分离纯化得到免疫球蛋白GF(ab’)2片段。
2.一种免疫球蛋白G片段的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G在缓冲液中混合,孵育;
(2)酶切后分离纯化免疫球蛋白GF(ab’)2片段;
(3)分离纯化的免疫球蛋白GF(ab’)2片段还原为Fab’片段,得到免疫球蛋白GFab’片段。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段;
优选地,步骤(1)所述的IdeS蛋白酶与免疫球蛋白G的质量比为1:(100-1000),优选为1:(200-800);
优选地,所述免疫球蛋白G为人和/或动物体液中提取的IgG抗体和/或通过基因工程重组方式表达纯化获得的IgG抗体;
优选地,所述人或者动物血液/体液中提取的IgG抗体为马抗血清。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述缓冲液为Tris-HCl、生理盐水、磷酸盐溶液或醋酸钠溶液中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,步骤(1)所述孵育的温度为30-40℃,优选为35-39℃,进一步优选为37℃;
优选地,步骤(1)所述孵育的时间为10-30min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述分离纯化包括以下步骤:
加入0.5-1.5%的明矾吸附热灭活的Fc片段,经过滤、超滤除盐、浓缩回收后,进行离子交换柱层析,调pH值至7-8,过滤除菌后获得高纯度免疫球蛋白GF(ab’)2。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的免疫球蛋白GF(ab’)2片段还原为Fab’片段包括如下步骤:
获得高纯度的F(ab’)2后,在溶液中加入1-100mM的乙醇胺和/或半胱胺还原,只打开铰链区二硫键,超滤去除还原剂后获得均一的免疫球蛋白GFab’片段。
7.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的抗体免疫球蛋白GF(ab’)2片段。
8.根据权利要求7所述组合物在制备治疗感染性疾病、免疫性疾病和癌症的药物制剂和/或药物组合物中的应用;
优选地,所述组合物用于免疫抗血清和/或基因工程重组单克隆和/或多克隆抗体的制备。
9.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括权利要求2-6中任一项所述制备方法制备得到的免疫球蛋白GFab’片段;
优选地,且所述免疫球蛋白GFab’片段与毒性药物和核素进行偶联;
优选地,所述组合物在制备肿瘤和免疫性疾病的药物制剂和/或药物组合物中的应用。
10.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括权利要求1-6中任一项所述制备方法制备得到的免疫球蛋白GF(ab’)2片段和权利要求2-6中任一项所述制备方法制备得到的免疫球蛋白GFab’片段;
优选地,所述免疫球蛋白GF(ab’)2片段和免疫球蛋白GFab’片段与核素偶联;
优选地,所述组合物在制备疾病的体内诊断和治疗药物制剂和/或药物组合物中的应用。
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