CN114249818A - 截短的多价多元体 - Google Patents
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Abstract
截短的多价多元体。本发明涉及一种包括两个或更多个结合域的截短的多价多元体,其中每个结合域结合不同抗原或表位,且其中此类结合域中的两个经由铰链区配对,其中该多元体缺乏CH2或CH3区。本发明进一步包括在其包括两个或更多个二硫桥键的相应C末端处或附近配对的两个多肽,其中所述多肽各自包括可变结合域,该可变结合域包括可变区,其中每个可变区结合相同或不同的抗原或结合抗原上的相同或不同的抗原或表位。
Description
本申请是申请号为201980086682.3、发明名称为“截短的多价多元体”的中国专利申请的分案申请,该母案申请是2019年12月30日提交的PCT国际专利申请PCT/NL2019/050880进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明涉并具有在C末端经由铰链配对的两个或更多个结合域的多价多元体(multivalent multimer),以及用于制备此类多价多元体的方法。本发明进一步涉及能够结合两个或更多个表位或抗原的多价多元体的组成多肽,其中此类多肽经由包括二硫桥键的共价键配对。
背景技术
能够结合两种抗原或两个表位的多价抗体,诸如双特异性抗体是此项技术中已知的。此类多价结合蛋白可使用各种技术产生,此类技术包括细胞融合、化学缀合或重组DNA技术。
抗体通常包括四种蛋白质的多元体,该四种蛋白质包括两个一致重链及两个一致轻链,其中该重链包括一个可变域(VH)及三个恒定区(CH1、CH2、CH3),且其中该轻链包括一个可变轻链域(VL)及一个恒定区(CL)。通常,该轻链经由非共价相互作用的影响以及经由二硫键与该重链配对。该两个重链在铰链区处经由二硫键且经由在该两个CH3域之间的界面中的氨基酸相互作用配对。VH与VL配对形成抗原结合域,且通常在VH及VL域中的三个表面环形成区,即互补决定区或CDR中发现变化。
此项技术中已知可结合两种不同抗原,或结合同一抗原内的两个不同表位的某些多价形式,诸如具有两个不同结合域的抗体,诸如双特异性抗体。此类形式可允许使用经校准的结合,该结合将允许该多价多元体选择性靶向表达两种抗原或表位的细胞或目标,诸如肿瘤细胞,而不靶向表达一种抗原的健康细胞或以较低水平靶向表达一种抗原的此类健康细胞。类似地,在多价多元体,诸如在双特异性抗体上具有两个不同结合域可允许结合不同抗原,由此可使用该多价多元体靶向单细胞上或两个相互作用的细胞上的抑制及刺激分子,使得该多价多元体的效应增强。多价形式也可用于使细胞,例如免疫调节细胞复位向,可使此类细胞复位向至肿瘤。
尽管此项技术中已描述某些多价抗体,但此项技术中仍需要新形式、及新连接子、以及用于制备此类形式的新方法,其允许高效地制造多价抗体形式,其中可容易地制备针对一组抗原的结合域并将其高效、稳定地转化成多价多元体,且其能够结合一大组抗原和表位,包括缺乏(部分或完全地)含CH2和/或CH3区的Fc区的此类形式。
产生缺乏Fc的多特异性形式,诸如F(ab′)2或F(ab′)n(其中n=两个或更多个)形式可提供优于现有多特异性抗体的益处。例如,在可能希望经由靶向此类细胞和感兴趣的抗原来接合或复位向免疫调节细胞的情况下,此类靶向部分上Fc组分的存在可能在某些应用中不利地影响功效。
类似地,在较小尺寸优选的情况下,相较于全长形式,F(ab′)n多特异性形式可为所希望的,包括可能浸润物理肿瘤和/或提供较短半衰期,其中此类特征可有益于给药方案。重要的是,工程改造含有超过两个具有不同目标的结合域的F(ab′)n在传统上是耗时、低效和/或昂贵的。例如,此项技术中已知可经由多种方式产生F(ab′)2部分,此类方式各自具有缺点,其中目标是大量制造此类部分的均匀批料以用于治疗应用。
此项技术中已知的产生F(ab′)2的一种方式是通过化学方式实现。Nisonoff和Rivers在数十年前采用化学配对的制造。Nisonoff A,Rivers MM(1961)Arch BiochemBiophys 93:460。随后,已开发出使用同型双官能和异型双官能化学试剂的多种方法。到目前为止,归因于可经由此类化学方式制造的时间、成本、低数量和异质性,尚无化学方法能高效地或可行地用作开发治疗性多特异性F(ab′)n候选物的方法。类似地,此类化学合成F(ab′)n部分的方式还由于使用使该两个Fab域配对的合成方式而不利,该方式引起有关用于治疗应用的独立问题,以及制造问题。
例如,F(ab′)2可使用o-PDM产生。抗体“A”的Fab′片段与o-PDM反应,使得邻近二硫醇与o-PDM(R)形成复合物,且一个SH基团结合至o-PDM,并残留一个游离顺丁烯二酰亚胺基。Fab A-o-PDM与游离Fab′“B”片段反应,由此在两个Fab之间形成硫醚键。应注意,与这些合成产生方式相关的困难包括难以将此类物理纯化至均质,以及难以在不改变人类抗体铰链区情况下构建此类部分,而改变人类抗体铰链区会引起免疫原性和活体内稳定性的缺乏。
实际上,尽管此类人工抗体在2000年间就已产生且利用于化学方式配对的Fab进行了治疗各种类型癌症的临床试验,但包括其可行性缺乏在内的原因,该概念看来已经不再讨论。
产生F(ab′)2部分的另一种方式是经由用诸如木瓜蛋白酶的类非特异性蛋白酶部分蛋白水解消化IgG实行。此类酶可切割IgG抗体中含有使重链配对的二硫键以及在轻链与重链之间的二硫键位点下部的铰链区。此类技术有存在未消化的IgG、过度消化和缺乏再现性的问题。此类非特异性蛋白酶的使用还被用作一种经由消化全长抗体以裂解Fc而产生F(ab′)2部分的方式。这些技术还相当耗时且需要IgG特异性优化以及抑制蛋白酶或纯化Fab以防止其降解。另外,这些消化产生过度消化、不充分消化的部分的异质群,且缺乏有关裂解位点的精确性,使得使用此类部分进行研究和治疗应用不切实际。困难的是,控制木瓜蛋白酶消化以使仅上部铰链区裂解,且在替代性位点处不裂解,此可取决于所裂解抗体的结构及可挠性而发生。因此,对于某些应用而言,经由木瓜蛋白酶消化具有两个或更多个结合域的多价抗体是不适当且不可行的。类似地,已采用胃蛋白酶裂解抗体的下部铰链区,旨在获得完整F(ab′)2。利用胃蛋白酶的缺点与利用木瓜蛋白酶类似。
近来,文献中已描述能够裂解全长免疫球蛋白中远离Fc的部分以产生个别Fab部分或F(ab′)2的酶。已关于有限的表征应用描述此类酶,包括用于评价亲合力相对于亲和力的差异或分析给定多元体中组成部分的分子量或组成。
因此,需要具有两个或更多个人类可变区及连接子的多价抗原结合多元体的新颖且有用的形式,其用于制造截短的多价多元体,此类截短的多价多元体缺乏Fc的全部或一部分,具有天然(不以化学方式合成)铰链配对或桥连Fab区(F(ab′)n)且可高效地且均质地产生。本文描述了截短的多价多元体的产生,此类截短的多价多元体缺乏Fc区,能够靶向抗原且能够用于治疗应用。
发明内容
本发明涉及一种包括两个或更多个结合域的多价多元体,其中每个结合域结合不同抗原或表位,或结合相同抗原或表位,且其中此类结合域中的两个经由铰链区配对,其中该多元体缺乏恒定域,包括CH2或CH3区。
本发明进一步包括在含二硫桥键的相应C末端处或附近配对的两个多肽,其中此类多肽各自包括可变区,其中每个可变区结合相同或不同抗原或一种抗原上的相同或不同表位。此类结合域优选地自身与可变区配对形成结合域,通常VH-CH1与VL-CL配对,其中该VL或VH是该多元体的每个结合域中共有的共同链。
在一个实施方案中,该多价多元体包括三个或更多个人类重链可变区,其包括含一个可变区(VH1)的短臂及含两个可变区(VH2及VH3)的长臂。在另一个实施方案中,每条重链包括scFv。在另一个实施方案中,每个重链区包括CH1域。在另一个实施方案中,每个重链可变区与共同轻链(VLc)配对。在另一个实施方案中,该共同轻链包括VL-CL。在另一个实施方案中,该共同轻链包括SEQ ID NO:1的序列。在另一个实施方案中,该多元体的每条重链包括共同可变区(VHc)。
在一个实施方案中,此类可变区,优选地重链可变区中的两个是经由可变区及CH1域(参见图1中的细线)连接。在另一个实施方案中,此类可变区是经由多肽连接子连接。在另一个实施方案中,连接多肽上的可变区的连接子包括选自包括SEQ ID NO:2-25的群的序列或与此类序列中的一个具有至少约85%同一性的多肽。在另一个实施方案中,该连接子是短、长、带电、刚性或可挠性连接子。在另一个实施方案中,该连接子的氨基酸序列包括天然存在的序列或包括来源于天然存在的序列的序列。在另一个实施方案中,该连接子包括中间铰链区序列。在另一个实施方案中,该连接子包括上部铰链序列和下部铰链序列。在另一个实施方案中,该连接子包括螺旋形成序列。
在另一个实施方案中,该两个或更多个重链可变区中的两个在其相应C末端处或附近彼此配对(二聚化),该C末端优选地包括两个或更多个二硫桥键,其中此类二硫桥键与在CH1与CH2区之间存在的天然IgG抗体中的二硫桥键相同或实质上相同。此项技术中应理解,铰链二硫键的数量在免疫球蛋白亚类间不同,此类免疫球蛋白亚类各自涵盖在此处所描述的发明内(Papadea和Check,1989)。
在一个实施方案中,该多元体的每个可变区特异性结合不同表位。
在另一个实施方案中,该多价多元体结合至少两种不同抗原。
本发明还涉及一种制造多价多元体的方法,其包括:
获得一组特异性结合至两个或更多个目标的抗体,此类抗体包括共同轻链可变区及经重排的重链;
将编码共同轻链可变区及两个或更多个经重排的重链的核酸整合至宿主细胞中,其中此类经重排的重链中的两个包括恒定区,该恒定区包括能够配对的CH1、CH2和/或CH3域;
在使包括该共同轻链及两个或更多个经重排的重链的完整多价多元体表达的条件下培养该宿主细胞,其中此类经重排的重链中的两个在该两个经重排的重链各自的CH1与CH2域之间配对;以及
用裂解此类经重排的重链中的两个各自的CH2和/或CH3区的酶处理该完整多价多元体,维持此类经重排的重链中的两个进行的配对以形成该多价多元体。
在本文所公开的另一个实施方案中,通过用目标对转基因动物免疫接种获得一组抗体,该转基因动物包括编码共同轻链可变区及未经重排的重链可变区的核酸。
在本文所公开的另一个实施方案中,该配对是经由两个或更多个二硫桥键实现。
在一个实施方案中,包括CH1、CH2和/或CH3域的此类经重排的重链中的两个的重链恒定区包括促进异二聚化的修饰。在另一个实施方案中,该修饰是在免疫球蛋白CH2或CH3区中。在另一个实施方案中,该修饰是对相应两个重链的孔中节(knob into hole)修饰、静电修饰或DEKK修饰。在另一个实施方案中,该宿主细胞表达的多元体包括与第二CH3域二聚化的第一CH3域,根据EU编号,该第一CH3域在位置351及366处或在与其对应的位置处包括氨基酸残基赖氨酸,且该第二CH3域包括氨基酸残基天冬胺酸在351处及谷氨酸在368处或在与其对应的位置处。
在另一个实施方案中,宿主细胞整合有编码能够结合不同抗原的两个或更多个不同轻链可变区的核酸,且该两个或更多个重链可变区是共同的,使得此类轻链可变区的不同结合特异性赋予多特异性多元体结合两种或更多种抗原或表位的能力。
在一个实施方案中,此类共同可变区是由一核酸编码,该核酸获自、来源于或基于由在种系中包括编码经重排的可变链的核酸的转基因动物,优选地啮齿动物编码的核酸。
在一个实施方案中,该方法进一步包括回收该多价多元体。
在一个实施方案中,对裂解该两个重链的CH2和/或CH3域的酶加标签,使其可经由亲和层析法去除,且接着纯化酶、多价多元体及恒定域片段的混合物。在另一个实施方案中,该酶是带电的,使其可自多价多元体的混合物去除且经由基于电荷的层析法裂解恒定域。
本发明还涉及通过本发明的方法制造或可获得的多价多元体。
本发明还涉及一种细胞,其包括编码能够组装成本发明的多价多元体的多肽的核酸。
本发明还涉及一种药物组合物,其包括本发明的多价多元体及药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
本发明还涉及一种治疗患有医学适应症的个体的方法,其包括向该个体施用治疗有效量的本发明的多价多元体。
本发明还涉及用于治疗中的本发明的多价多元体。
附图说明
图1a:阐述先前所描述的多价多元体的示例性形式,且图1b阐述本文所公开的发明的示例性形式。本文所公开的发明的多价多元体包括在相应C末端处经由两个或更多个二硫桥键配对的两个多肽。
图2a-e:在还原性及非还原性条件下进行的IgG、Fab、F(ab′)2的SDS-PAGE分析。
图3:调蛋白依赖性MCF-7增殖分析,展示经由本文所公开的方法产生的双特异性F(ab′)2的功效。
图4a:阐述先前所公开的示例性多特异性形式,其包括一个共同轻链以及能够结合不同抗原的三个独特经重排的重链,其中此类独特重链中的两个经由DEKK异二聚化配对。参考WO 2019/190327,其以引用的方式并入本文中。图4b:阐述本文所公开的发明的示例性多价多元体,在4b1处,其包括F(ab′)3,其中两个重链在其相应C末端处经由两个二硫桥键配对。4b2还描绘2Fab′(其中使重链配对的二硫桥键裂解,且两个Fab经由本文所描述的连接子连接),且4b3描绘Fab。如本文所描述,当三价多元体在每一相应重链的CH1与CH2之间的区域处裂解时,产生2Fab′以及Fab。本图不具限制性,因为附加结合域可通过将连接子添加至VL或VH区的N末端区,连接能够与同源域配对形成附加结合域的CH1-VH或CL-VL域以模块形式添加至基础F(ab′)2部分。
图5a-d:在还原性以及非还原性条件下进行的三价IgG分子的SDS-PAGE分析,且展示IgG、Fab、F(ab′)3多元体的成功制造。
具体实施方案
本发明是基于包括两个或更多个可变区的多价多元体的新颖模块形式,其中此类可变区中的两个在其相应C末端处包括两个或更多个二硫桥键,此类二硫桥键使此类可变区如天然IgG抗体中一般配对,其中该多价多元体能够结合两个或更多个不同抗原或表位。此类多价多元体缺乏抗体Fc区(包括CH2和/或CH3域)且可制造成使得此类多价多元体包括F(ab′)n,其中n=两个或更多个。
这些多价多元体不同于典型抗体片段,诸如熟知的F(ab′)2,因为包括本文所描述的F(ab′)2或F(ab′)n在内的多价多元体可结合相同或不同抗原,且并非通过胃蛋白酶消化IgG,随后还原以及再氧化所得Fab′片段得到,而是在异二聚化配对之后获得,包括藉助于DEKK工程改造,随后酶裂解Fc获得,由此使经由二硫桥键连接F(ab′)n多肽的天然铰链保持完整。这些多价多元体任择地在每个结合域处包括共同链(重链或轻链),且使用连接子连接此类结合域中的两个或更多个。
这些多价多元体具有较短半衰期以及较快抗体浓度调整的潜在优势,该较短半衰期可与体内的较少积累相关,由此使可能由其降解产物引起的风险降低,且较快的抗体浓度调整在例如治疗性多价多元体具有临床功效但需要快速自体内清除的情况下可能为有益的。另外,此类多价多元体的免疫原性可低于完整抗体或含有用于使结合域配对的合成组分的抗体结合片段,诸如(scFv)2、二-scFv以及双功能抗体部分。本文所公开的发明F(ab′)n部分是新颖且可容易地产生的,其在每个结合域处带有共同链,诸如Fab,且包括增加稳定性的CH1/CL配对,同时经由连接子连接两个或更多个Fab,其中此类连接子优选地不包括由用于本文所描述的方法中的蛋白水解酶识别的基元。
定义
“抗体”是属于免疫球蛋白类蛋白质的蛋白质分子,其含有结合抗原上的表位的一个或多个域,其中此类域来源于抗体可变区或与该可变区共有序列同源性。抗体结合具有不同质量,包括特异性以及亲和力。特异性决定该结合域特异性结合的抗原或其表位。亲和力是对于与特定抗原或表位结合的量值的强度。此处应注意,抗体的‘特异性’是指其对特定抗原的选择性,而‘亲和力’是指抗体的抗原结合位点与其所结合的表位之间相互作用的量值。
因此,如本文所使用,“结合特异性”是指个别抗体结合位点与抗原决定子反应的能力。通常,本发明多元体的结合位点是位于Fab域中且由重链和/或轻链的高变区构建。
“亲和力”是单一抗原结合位点与其抗原之间相互作用的量值。本发明的多元体针对抗原的单抗原结合位点可以解离常数(KD)表示。通常,用于治疗应用的抗体可具有至多1×1010M或甚至更高的亲和力。
“抗原”是能够在宿主生物体中诱导免疫反应(以产生抗体)和/或作为抗体目标的分子。在分子层面上,抗原是以其被抗体的抗原结合位点所结合的能力为特征。抗原的混合物也可被视为‘抗原’,即,技术人员应理解,肿瘤细胞的溶解产物、或病毒粒子有时可视为‘抗原’,而此类肿瘤细胞溶解产物或病毒粒子制剂包括许多抗原决定子(例如表位)。抗原包括至少一个,但通常更多个表位。
“表位”或“抗原决定子”是抗原上由免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可由连续氨基酸或因蛋白质的三级折迭而相邻的非连续氨基酸形成(分别为所谓的线性以及构形表位)。由连续、线性氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保留,而通过三级折迭形成的表位通常在变性溶剂处理后消失。表位可通常包括呈特有空间构形的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括免疫球蛋白重链恒定区序列(或其功能片段),且除非另外说明,否则包括来自任何生物体的重链可变域(或其功能片段)。除非另外说明,否则术语重链可变域包括三个重链CDR以及四个构架(FR)区。重链的片段包括CDR以及FR,以及其组合。典型重链包括(自N末端至C末端)可变域、CH1域、铰链、CH2域以及CH3域。重链的功能片段包括能够特异性识别抗原且包括至少一个CDR的片段。可用于本发明的重链包括例如不选择性结合同源轻链所选择性结合的表位的重链。
术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”包括免疫球蛋白轻链可变域或VL(或其功能片段);以及来自任何生物体的免疫球蛋白恒定域,或CL(或其功能片段)序列。除非另外说明,否则术语轻链可包括选自人类κ、λ以及其组合的轻链。除非另外说明,否则轻链可变(VL)域通常包括三个轻链CDR以及四个构架(FR)区。一般而言,全长轻链自N末端至C末端包括VL域,其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4;以及轻链恒定域。可用于本发明的轻链包括不选择性结合同源重链所选择性结合的表位的轻链。
适合用于多价多元体发明的轻链包括共同轻链,诸如可通过筛选现有抗体文库(湿式文库或计算器模拟)中最常采用的轻链鉴别的轻链,其中此类轻链不会实质上干扰重链的表位结合域的亲和力和/或选择性,而且还适合与一系列重链配对。例如,适合轻链包括来自转基因动物,诸如转基因啮齿动物的轻链,该转基因动物包括整合至其基因组中的共同轻链且在暴露于抗原后,可用于产生在重链处具有多样性的多组共同轻链抗体。适合用于多价多元体发明的重链可类似地包括共同重链。
根据本发明,术语“共同轻链”是指可一致或具有一些氨基酸序列差异但不影响本发明多元体的结合特异性的轻链,即,此类差异不会显著地影响功能结合区的形成。
例如,通过例如引入并测试保守氨基酸变化、当与同源链配对时不会促成或仅部分地促成结合特异性的区域中的氨基酸变化以及类似变化来制备或发现不一致但仍在功能上等效的可变链可在如本文所使用的共同链的定义的范围内。因此,此类变异体还能够结合不同的同源链且形成功能性抗原结合域。因此,如本文所使用,术语‘共同轻链’是指可一致或具有一些氨基酸序列差异但在与重链配对之后仍保持所得抗体的结合特异性的轻链。某一共同轻链以及此类功能等效变异体的组合涵盖在术语“共同轻链”内。
术语“天然铰链区”是指在各免疫球蛋白种类的重链的中心部分中的未修饰的可挠性域间区,其通过二硫键连接此类2条链。
铰链区是在各免疫球蛋白种类的重链的中心部分中的可挠性氨基酸链段(即,该将Fab连接至Fc的部分),其通过二硫键使这些二条重链配对。其富含半胱胺酸以及脯胺酸氨基酸,且与任何其他免疫球蛋白区具有极小相似性。
“Fab域”意谓包括可变区的结合域,通常为包括配对的重链可变区以及轻链可变区的结合域。Fab域可包括恒定区域,包括CH1;以及与恒定轻链域(CL)和VL域配对的VH域。此类配对可例如经由在CH1和CL域处的二硫桥键以共价键联形式进行。
“经修饰Fab域”意谓包括CH1和VH域的结合域,其中该VH与VL域配对且不存在CL域。或者,经修饰Fab域是包括CL和VL域的结合域,其中该VL与VH域配对且不存在CH1域。为了使CH1或CL区能以不配对形式存在,可需要去除疏水性区或减小疏水性区的长度。可使用来自天然地表达单链抗体的动物物种,例如来自诸如骆马或骆驼的类骆驼科动物,或来自鲨鱼的CH1区。经修饰Fab域的其他实施例包括不与其同源区配对的恒定区CH1或CL,和/或存在不与其同源区配对的可变区VH或VL。
如本文所使用,“完整”抗体是包括抗原结合位点以及一个CL和至少重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可为天然序列恒定域(例如人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变异体。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指引入了外源性DNA的细胞。此类术语不仅是指特定个体细胞,而且还指此类细胞的后代。因为某些修饰可能因突变或环境影响而出现在随后数代中,所以此类后代可能实际上与亲本细胞不一致,但仍包括在如本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中,宿主细胞包括原核和真核细胞。在一个实施方案中,真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中,宿主细胞包括但不限于原核细胞株大肠杆菌(E.Coli);哺乳动物细胞株CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6;昆虫细胞株Sf9;以及真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
如本文所使用,术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指在哺乳动物免疫系统中的天然细胞谱系内可经活化以影响目标细胞的存活的细胞。免疫效应细胞包括淋巴谱系的细胞,诸如自然杀手(NK)细胞、包括细胞毒性T细胞在内的T细胞、或B细胞,而且骨髓谱系的细胞也可被视为免疫效应细胞,诸如单核球或巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞。优选的效应细胞包括NK细胞、T细胞、B细胞、单核球、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。
当在本文中提及核酸或氨基酸序列的“同一性百分比(%)”定义为在对准序列达到最佳比较目的之后候选序列中与选定序列中的残基一致的残基的百分比。比较核酸序列的序列同一性百分比是使用Vector NTI Program Advance 10.5.2软件的AlignX应用程序,使用默认设置测定,此类预设设置采用改进的ClustalW算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22:4673-4680)、swgapdnarnt分数矩阵、空位开放罚分15和空位延伸罚分6.66。氨基酸序列是利用Vector NTI Program Advance 11.5.2软件的AlignX应用程序,使用默认设置比对,此类预设设置采用改进的ClustalW算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson T.J.,1994)、blosum62mt2分数矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分0.1。
在本文中,术语“连接(connected)”或“连接(linked)”是指在一级氨基酸序列藉助于肽键将各域彼此接合。例如,重链中包括VH-CH1-CH2-CH3的可变区部分可经由连接子(将在CH1处重链的附加结合域连接至可变区部分的VH区)连接至重链的附加结合域VH-CH1(或将附加结合域连接至附加结合域),其一起构成一条多肽链。类似地,CH1域可连接至可变重链区且CL域可连接至可变轻链区。术语“连接子”意谓氨基酸残基或包括通过用于连接两个多肽的肽键接合的两个或更多个氨基酸残基的多肽。
“配对”是指构成本发明的多价多元体的多肽之间的相互作用,该相互作用使其可多聚化。例如,附加结合域可包括与轻链区(VL-CL)配对的重链区(VH-CH1),其中CH1与CL配对形成该结合域。类似地,两个重链多肽可在每一多肽的相应CH1与CH2域之间如IgG1所发生一般经由形成两个或更多个二硫键(或如在例如IgG3中一般经由形成更多二硫键)配对在一起,该两个重链多肽各自包括可变区、CH1、CH2和/或CH3域。两个重链多肽可在CH3域处进一步配对。如本文所描述,抗体域(例如重链和轻链)的配对可因非共价相互作用于以及经由二硫键进一步发生,且可经由本文所公开的技术以及通过此项技术中已知的方法工程改造。
在本说明书以及所附权利要求书通篇,词语“包括(comprise)”、“包括(include)”以及“具有(having)”以及变化形式,诸如“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”以及“包括(including)”拟以包容性含义解释。即,在上下文允许的情况下,这些词语意欲表示可能包括未具体叙述的其他要素或整数。
冠词“一个(种)(a/an)”在本文中用于指该冠词的语法制品中的一个(种)或多于一个(种)(即,一个(种)或至少一个(种))。例如,“一种要素”可意谓一种要素或多于一种元素。
多价多元体的不同形式
本发明提供一种截短的多价多元体,其能够经由其两个或更多个结合域结合至其一个或多个目标。本发明的多价多元体可包括能够结合抗原的两个或更多个可变区,或其部分。重要的是,该多元体缺乏Fc区的全部或一部分,优选地缺乏整个Fc。本文所公开的发明的多元体包括在其相应C末端处经由铰链,优选地经由天然铰链且更优选地包括两个或更多个二硫键配对的两个重链区。
在一些实施方案中,该多元体包括一个或多个附加结合域。在一个实施方案中,该多元体包括Fab域,其包括与VL-CL区配对的VH-CH1区。
因此,该多价多元体可包括三个VH区以及三个VL区。VH或VL中的任一个可为与同源链的经重排可变区配对的共同可变区(VHc或VLc),或非共同链赋予与表位或抗原的结合特异性者。例如,该三个VL区可为共同链(VLc),且每个VH区(VH1-VH3)可包括经重排可变区,其中该VH1、VH2以及VH3区可结合相同表位或三个不同的表位。如图1a中所示,VH1用于指短臂,VH2以及VH3用于指长臂,其中VH2是内部臂,其与VH1在其相应C末端处配对,且VH3用于指远程臂。
其中,该多价多元体包括一个共同轻链(VLc)以及三个重链可变区(VH1-VH3),包括与VLc-CL配对的VH3-CH1的附加Fab域可经由定位于VH2区或VLc与附加Fab域的CH1或附加Fab域的CL之间的连接子连接至可变区。
在另一个实施方案中,构成该多价多元体的个别多肽可在同一蛋白质内混合重链以及轻链。本发明的多价多元体可包括经修饰Fab域。经修饰Fab域可包括经修饰的CH1,由此使其不需要与CL配对。例如,CH1可为骆驼科CH1或基于骆驼科CH1,或经由此项技术中已知的技术修饰成缺乏疏水性残基。每个VH或VL可为共同或经重排可变区。
本发明的多价多元体可包括不需要与CH1配对的经修饰Fab域。例如,CL可经工程改造以去除疏水性区。经修饰Fab域的每个VH或VL可为共同或经重排可变区。附加经修饰Fab域可经由定位于可变区部分的VL与经修饰Fab域的CL之间的连接子连接至可变区部分。经修饰Fab域的VH与VL可经由半胱胺酸桥配对。本发明的多价多元体可包括不需要与CH1配对的经修饰Fab域,其包括经修饰CL。
多价多元体的产生
在一个实施方案中,此类多价多元体可通过酶消化完整多价抗体,或裂解此类多价抗体的特定区域,使该多价多元体的多肽的天然铰链或配对保持完整来制造。完整抗体可为全长免疫球蛋白,例如全长IgG、IgA、IgE、IgD或IgM部分,但优选地为IgG且更优选地为IgG1。
此类多价多元体的重链可设计成经由熟习此项技术者已知的技术,诸如工程改造完整抗体CH3区中的DEKK修饰优先配对。参见以引用的方式并入本文中的WO2013/157954以及De Nardis等人,J.Biol.Chem.(2017)292(35)14706-14717,其展示在驱动重链异二聚化的CH3区中进行的工程改造。可用于本发明中的用于驱动异二聚化的替代性方法包括孔中节形式(WO1998/050431)以及使用电荷工程改造(charge engineering)(Gunasekaran,JBC2010,第285卷,第19637-19646页),以及此项技术中已知的其他适合技术。
用于多价多元体形式中的连接子
本发明的多价多元体可包括连接一个或多个可变区的一个或多个连接子。该连接子连同连接子所连接的结合域一起可至少部分地决定该多价多元体的功能性。
该连接子可包括铰链序列或包括基于铰链序列的序列。因此,适合连接子的氨基酸序列可包括天然存在的序列或包括来源于或基于天然存在的序列的序列。使用此类序列可帮助本发明多价抗体的可开发性和/或帮助确保低免疫原性。出于本专利申请的目的,优选的是,该连接子不含用于自Fc裂解Fab或F(ab′)n的任何酶的酶识别位点,使得该酶将以类似方式裂解结合域之间的键联。例如,在制造包括含一个共同轻链(VLc)以及三个重链可变区(VH1-VH3)的三个Fab域的截短的多价多元体的情况下,优选的是,将与VLc-CL配对的VH3-CH1连接至VH1或VH2区或VLc区的连接子不包括能够将Fc自Fab、2Fab′或F(ab′)3裂解的酶所识别的氨基酸基元。
因此,将一个或多个附加结合域连接至两个或更多个可变区的适合连接子可来源于IgG或IgA铰链序列。连接子区可基于IgG1铰链区、IgG2铰链区、IgG3铰链区或IgG4铰链区。
通常,所用铰链区的类型与连接子所连接的附加Fab域的恒定区的类型,例如CH1相配。即,如果连接子是基于来自IgG1铰链区的一个或多个序列,则其所连接的附加Fab域的CH1是来自IgG1的CH1。
抗体的连接子可基于上部、中间或下部铰链区,或此类区域的子集。
IgG1铰链区具有序列:EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:26)。
上部铰链区定义为:EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:3)
中间铰链区定义为:CPPCP(SEQ ID NO:27)
下部铰链区定义为:APELLGG(SEQ ID NO:28)
因此,在本发明的多元体中,连接子可包括这些序列中的一个或多个和/或来源于或基于这些序列中的一个或多个的序列。
IgG2铰链区具有序列:ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:29)。
上部铰链区定义为:ERKCCVE(SEQ ID NO:30)
中间铰链区定义为:CPPCP(SEQ ID NO:27)
下部铰链区定义为:APPVAG(SEQ ID NO:31)
因此,在本发明的多元体中,连接子可包括这些序列中的一个或多个和/或来源于或基于这些序列中的一个或多个的序列。
IgG3铰链区具有序列:ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPEFLGG(SEQ ID NO:32)
上部铰链区定义为:ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:7)
中间铰链区定义为:CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO:33)
下部铰链区定义为:APEFLGG(SEQ ID NO:34)
IgG4铰链区具有序列:ESKYGPPCPSCPAPEFLGG(SEQ ID NO:35)。
上部铰链区定义为:ESKYGPP(SEQ ID NO:2)
中间铰链区定义为:CPSCP(SEQ ID NO:36)
下部铰链区定义为:APEFLGG(SEQ ID NO:34)。
在野生型IgG的情况下,具有共同序列CXXC的中间区连接两条IgG重链且为刚性的。这些二硫桥键并非本专利申请所需的,且因此,在连接子包括中间铰链序列的情况下,优选地,CXXC共同序列中的一个或两个Cys残基经例如Ser残基取代。因此,在一个实施方案中,CxxC可为SxxS。
适用于本发明的多价多元体中的连接子可为来源于或基于中间铰链序列的连接子,例如包括中间铰链序列但不包括下部和/或上部铰链序列的序列。适用于本发明的多价多元体中的连接子可为来源于或基于上部铰链序列的连接子,例如包括上部铰链序列但不包括下部和/或中间铰链序列的序列。适用于本发明的多价多元体中的连接子可为不包括中间铰链序列的连接子,例如包括下部与上部铰链序列的组合的序列。
因此,在本发明的多元体中,连接子可包括这些序列中的一个或多个和/或来源于或基于这些序列中的一个或多个的序列。连接子可基本上由中间铰链区序列组成或来源于或基于此类序列,或基本上由上部和下部铰链区序列组成或来源于或基于此类序列。
适用于本发明的多元体中的连接子可参照包括如本文所阐述的任何连接子序列的氨基酸序列的序列定义,在该序列中产生0至5个氨基酸插入、缺失、取代或添加(或其组合)。在一些实施方案中,该连接子包括相对于如本文所阐述的连接子序列包括0至4个、优选地0至3个、优选地0至2个、优选地0至1且优选地0个氨基酸插入、缺失、取代或添加(或其组合)的氨基酸序列。
适合连接子可为约7至约29个氨基酸长度,例如约10至约20个氨基酸长度。然而,适合连接子可为短连接子,例如长度为约7至约10个氨基酸,或可为长连接子,例如长度为约20至约29个氨基酸。
连接子可包括Ig铰链区或包括来源于或基于连接至与该连接子相同亚类的CH1区的IgG铰链区的序列,且可包括半胱胺酸用于共同轻链的共价键联。
适用于本发明的多元体中的连接子可来源于或基于IgG1铰链区、IgG2铰链区、IgG3铰链区或IgG4铰链区。
如果打算使用(G4S)n序列,则优选地,将其与来自除IgG外的同型或除IgG1外的亚类的铰链序列组合使用且包括CH1区。
在本发明的多元体中,连接子可为刚性或可挠性的,可包括带电序列,可为笔直或弯曲的。
出于本发明的目的,刚性序列是Karplus和Schulz可挠性预测值为约1.015或更低的序列。部分可挠性的序列是Karplus和Schulz可挠性预测值为约1.015至约1.04的序列。出于本发明的目的,可挠性序列是Karplus和Schulz可挠性预测值为至少约1.015的序列(Karplus PA,Schulz GE.Prediction of Chain Flexibility in Proteins-A tool forthe Selection of Peptide Antigens.Naturwissenschaften 1985;72:212-3;http://tools.immuneepitope.org/bcell/)。可挠性预测值是在沿着序列的连续7个残基的窗内(1个残基步长)计算,得到每个窗的预测“可挠性”指数。在连接子序列内的总体可挠性是以全序列的平均值给出。
IgG铰链区中Cys残基的去除或取代可基于该铰链使连接子可挠性变高,包括经由用丝胺酸(Ser)置换Cys残基。或者,鉴于螺旋形成序列的存在,连接子可为刚性连接子。因此,中间铰链区,例如保守CPPCP(SEQ ID NO:90)基元可经螺旋形成序列,例如(EAAAK)2(SEQ ID NO:91)置换,由此将在连接子中产生短刚性螺旋。因此,在本发明的多元体中,连接子可包括螺旋形成序列,例如包括氨基酸序列(EAAAK)2(SEQ ID NO:91)。使用此类序列可帮助增加刚度。
本发明的连接子可包括如SEQ ID NO:4至6、8至12或14至25中的任一个中所阐述的氨基酸序列,或与其中任一个具有至少约90%序列同一性,优选地与其中任一个具有至少约95%序列同一性,更优选地与其中任一个具有至少97%序列同一性,更优选地与其中任一个具有至少约98%序列同一性,更优选地与其中任一个具有至少约99%序列同一性的氨基酸序列。
例如,适用于本发明的多价多元体中的连接子可参照包括SEQ ID NO:2至25中的任一个的氨基酸序列的序列定义,在该序列中产生0至5个氨基酸插入、缺失、取代或添加(或其组合)。在一些实施方案中,连接子包括相对于SEQ ID NO:4至6、8至12或14至25中所阐述的序列具有0至4个、优选地0至3个、优选地0至2个、优选地0至1个且优选地0个氨基酸插入、缺失、取代或添加(或其组合)的氨基酸序列。
适用于本发明的多价多元体中的连接子可参照包括SEQ ID NO:2至25中的任一个的氨基酸序列或与其中任一个具有至少约85%序列同一性,诸如与其中任一个具有至少约90%序列同一性,例如与其中任一个具有至少约95%序列同一性,诸如与其中任一个具有至少约98%序列同一性,例如与其中任一个具有至少约99%序列同一性的氨基酸序列的序列定义。
表1:所使用的24种不同连接子/构建体的序列及其名称
使用连接子使附加结合域各区域配对
本文所使用的连接子可将一个或多个可变区连接到至少一个附加结合域。此外,在至少一个附加结合域是Fab域或包括重链可变区与轻链可变区的配对的情况下,连接子可经由共价键联,通常经由二硫桥键使重链与轻链配对。因此,在连接子连接各可变区的情况下,其形成多肽的初级氨基酸序列的一部分,例如VH1-CH1-连接子-VH2-CH1。相比的下,在连接子使两个可变域配对的情况下,其将这些域桥连在一起,包括例如通过产生接触点、共价键,例如在该两个可变域之间的二硫键将这些域桥连在一起,由此构成独立多肽。
该二硫桥键可在连接子中的半胱胺酸残基与附加结合域的可变区之间形成。该由连接子引起的配对可适用于附加结合域,包括含共同轻链和对应物经重排的重链可变区或含共同重链和对应物经重排轻链可变区的Fab域。
表2示出连接子序列如何连接至CH1和VH2区。
表2:加下划线的序列是连接子序列;侧接序列是附加Fab的CH1区的CH1区以及VH2
区
应注意,在连接子(以上加下划线者)之后的VH2序列可取决于所使用的特定可变区而变化。在其他实施方案中,在该连接子之后的序列可为轻链可变区,包括共同轻链。
多价性和多特异性
在两个或更多个可变区结合不同抗原的情况下,第一和第二抗原可为位于一个细胞上或不同细胞类型上的两个不同分子或部分。通过募集并活化内源性免疫细胞介导细胞毒性的包括两个结合域的抗体是一类新兴的抗体治疗剂。此可通过在一个分子中组合对目标细胞(即,肿瘤细胞)和效应细胞(例如T细胞、NK细胞和巨噬细胞)的抗原结合特异性来达成(参见例如WO2014/051433)。本发明的多元体包括至少两个结合域。包括三个或更多个结合域的多价多元体可靶向一个、两个、三个或更多个肿瘤相关抗原,由此允许相对于健康细胞,特异性靶向有害细胞。例如,该多价多元体的一个结合域或两个结合域可结合异常(肿瘤)细胞上的抗原,而该多价多元体的第二或第三结合域可结合免疫效应细胞上的抗原,由此可引起对表达一个或多个肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的定向杀灭。或者,该多价多元体的两个结合域可特异性结合至在肿瘤细胞上表达的一致抗原上的两个不同表位或不同抗原,同时使这些臂的亲和力衰减以减少与仅表达一个抗原的细胞的结合,或其中仅接合该多价多元体的一个结合域。或者,本发明的多价多元体的三个结合域可结合至免疫效应细胞的三种不同抗原,或结合至一致抗原但不同的表位。
类似地,包括三个或更多个结合域的多价多元体可结合功能目标,诸如配体或酶,触发生物反应或阻断该目标的功能,由此产生抑制性或促效性细胞活性。本发明的多价多元体的至少一个结合域经由连接子连接至可变区部分的结合域。
在至少一个可变区的结合域是Fab域的情况下,此可呈例如VH-CH1-连接子-VH-CH1形式,其中该连接子将重链的一个可变区连接到至少一个附加结合域,优选地Fab域。
或者,此可呈例如VL-CL-连接子-VL-CL形式,其中该连接子将轻链的一个可变区连接到至少一个附加结合域,优选地Fab域。
附加结合域,诸如Fab域,可连接至两个可变区,其各自经由独立连接子连接。连接附加可变区或附加结合域的两个或更多个连接子可为相同或不同的。另外,连接子可允许结合域各同源链配对。
如果本发明的多元体包括多于一个连接子,则此类连接子可为相同或不同的,或其组合。后一状况的实施例是多价多元体包括三个连接子,其中两个相同且第三个不同(不同于其他两个)的情形。
另外,经由连接子连接至另可变区的可变区可本身附接至经由本文所描述的连接子连接的可变区,其中此类其他可变区可通过经连接子连接至附加结合域,以及经连接子将该可变区连接至第二附加可变区等等以模块方式延伸。
以此方式,本发明的多元体能够结合两个、三个或更多个表位。
本发明的多元体能够结合两种、三种或多于三种抗原。
本发明的多元体可包括能够结合至一种抗原上的不同表位的两个或更多个可变区,诸如两个或更多个Fab域。
在一个实施方案中,本发明的多元体包括至少三个结合域,诸如三个或更多个Fab域,其中至少两个Fab是不同的。
本发明的另一方面包括含至少三个Fab域的多价多元体且因此能够结合至三个表位,该三个表位通常均彼此不同。
本发明的多元体也可为多特异性的。多价指示该抗体具有至少两个结合域且因此具有至少两个抗原结合位点。多特异性指示该抗体能够结合至少两个不同表位,例如两种不同抗原或同一抗原上的两个表位。三特异性指示该抗体能够结合三个不同表位。四特异性指示该抗体能够结合四个不同表位等等。
本发明的多元体可结合位于同一目标上的目标表位。相较于仅靶向一个表位的情况,此可更有效地抵消该目标分子的(生物)功能。例如,本发明的多元体可同时结合至抗原细胞上,例如对于肿瘤细胞增殖至关重要的生长因子受体或可溶性分子上存在的2个或3个或3个以上表位,由此有效地阻断引起不受控制的增殖的如果干非依赖性信号传导路径。
至少两种本发明多元体的任何组合可同时结合至目标分子,诸如生长因子受体或可溶性分子上存在的2、3、4个或更多个表位。在至少两种本发明多元体的组合中,两种多元体可共有至少一个共同结合域。
目标部分可为可溶性部分,或可为膜结合部分,或可为当结合时内化的细胞表面上存在的部分。
目标表位可位于不同部分上,例如两个(即,第一部分上的两个或更多个目标表位以及第二部分上的一个或多个目标表位)或三个不同部分(即,三个部分中每一个上的至少一个目标表位)上。在此情况下,此类不同目标部分各自可为可溶性部分或膜结合部分或当结合时内化的细胞表面上存在的部分。在一个实施方案中,此类不同目标部分是可溶性部分。或者,至少一个目标部分是可溶性部分,而至少一个目标部分是膜结合部分。在又一替代方案中,所有目标部分均为膜结合部分。在一个实施方案中,此类不同目标部分是在同一细胞上表达,而在其他实施方案中,此类不同目标部分是在不同细胞上表达。
作为一个非限制性实施例,任何本发明多元体或本发明多元体与附加抗体的任何组合可适合于同时阻断多种膜结合受体,中和多个可溶性分子,诸如肿瘤细胞的细胞介素或生长因子,或中和不同病毒血清型或病毒株。
在一个实施方案中,至少一个目标表位可位于肿瘤细胞上。替代地或另外,至少一个目标表位可位于效应细胞的表面上。此例如适合于募集T细胞或NK细胞进行肿瘤细胞杀灭。例如,本发明的多元体能够通过特异性结合至位于免疫效应细胞上的目标分子来募集免疫效应细胞,优选地募集人类免疫效应细胞。在另一个实施方案中,在本发明的多元体结合至目标分子后,该免疫效应细胞被活化。效应物募集机制可例如涵盖通过施用由根据本发明的方法制造的Ig样分子使免疫调节细胞毒性复位向,该Ig样分子能够结合至细胞毒性触发分子,诸如T细胞受体或Fcγ受体,由此活化下游免疫效应路径或免疫效应细胞。
共同可变区
本发明的多价多元体可在两个或更多个结合域(可变区)中的每一个处使用共同链。如所描述,在一个实施方案中,多价多元体具有结合一种抗原的第重链可变区/轻链可变区(VH/VL)组合以及结合另一抗原的第二VH/VL组合。每一附加结合域也可包括结合一种抗原上的另一表位的附加VH/VL组合。
在一个实施方案中,该多元体包括两个重链(一个或两个包括一个或多个附加CH1和VH域)以及一个与各CH1和VH域配对的轻链。在一个实施方案中,该两个重链具有兼容的异二聚化域,且该轻链是共同轻链。在另一个实施方案中,该多元体包括两个轻链(一个或两个包括一个或多个附加CL和VL域)以及一个与各CL和VL域配对的重链可变区,且该重链可变区包括共同重链可变区。
在多价多元体包括共同轻链的情况下,当该轻链是在包括编码两个或更多个重链可变区的DNA的宿主细胞内表达时,该轻链能够与每个可用重链(或CH1-VH1区)配对,由此形成至少三个功能性抗原结合域。
功能性抗原结合域(可变区)能够特异性结合至抗原上的表位。在一个实施方案中,共同轻链能够与所制造的所有重链(或CH1-VH1区)配对,由此避免或以明显低于该多价多元体的比率产生不匹配重链及轻链的错配。
在一个实施方案中,本发明的多价多元体具有共同轻链(可变区),其可与一系列重链可变区组合形成具有功能性抗原结合域的多元体(WO2004/009618、WO2009/157771)。
用于本发明的多价多元体中的共同轻链(可变区)优选地为人类轻链。在一个实施方案中,该共同轻链(可变区)具有种系序列。在一个实施方案中,该种系序列是常常用于人类谱系中且具有良好的热力学稳定性、产率和溶解度的轻链可变区。优选的种系轻链是人类IgVκ1-39*01/IGJκ1*01和人类恒定区(SEQ ID NO:1)。编码共同轻链可变区的核酸优选地为经重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(SEQ ID NO:62)。共同轻链优选地包括SEQ ID NO:63的轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:64的人类轻链恒定区氨基酸序列,其中具有0-5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。共同轻链可进一步包括轻链恒定区,优选地包括κ轻链恒定区。编码共同轻链的核酸(SEQ ID NO:1)可针对用于表达该共同轻链蛋白质的细胞系统进行密码子优化。该编码核酸可来源于种系核酸序列。
用于本发明的多价抗体中的共同轻链(可变区)可为λ轻链且因此,其还被提供于本发明之上下文中,然而,κ轻链是优选的。本发明的共同轻链可包括κ或λ轻链的恒定区。在一个实施方案中,使用κ轻链的恒定区,优选地其中该共同轻链是种系轻链,优选地为包括IgVK1-39基因区段的经重排的种系人类κ轻链,例如经重排的种系人类κ轻链IgVK1-39*01/IGJK1*01。熟习此项技术者应认识到,“共同”还指氨基酸序列不一致的轻链的功能等效物。该轻链存在许多变异体,其中存在不会显著地影响功能结合区的形成的突变(缺失、取代、添加)。
IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因的简称。该基因又称为免疫球蛋白κ可变1-39;IGKV139;IGKV1-39。该基因的外部Id是HGNC:5740;Entrez基因:28930;Ensembl:ENSG00000242371。IgVκ1-39的优选氨基酸序列是以SEQ ID NO:65给出。此列出V区的序列。该V区可与五个J区中的一个组合。共同轻链可变区优选地连接至κ轻链恒定区。在一个优选实施方案中,用于本发明的多价多元体中的轻链可变区包括κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一个优选实施方案中,该多价多元体中的共同轻链是IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。
产生共同轻链的细胞可产生例如经重排的种系人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01和包括所述轻链中与λ恒定区融合的可变区的轻链。在本文提及种系序列的情况下,在一个实施方案中,该可变区是种系序列。
用于本发明的多价多元体中的优选共同轻链是包括SEQ ID NO:1中所阐述的序列的共同轻链。
用于本发明的多价抗体中的共同链也可为重链且因此,其还被提供于本发明之上下文中。共同重链在此项技术中已被用于制备双特异性抗体,且在此处可用于制备包括三个或更多个结合域的多价多元体,此类结合域中的两个或更多个包括此项技术中已知的共同重链。例如,使用所有文库成员的重链可变域皆相同且因此多样性是基于轻链可变域的抗体文库。此类文库描述于例如PCT/US2010/035619和PCT/US2010/057780中,其各自以全文引用的方式并入本文中。熟练技术人员可产生这些和其他产生具有共同重链的结合域的技术,且此类技术可用于本发明中以产生具有本文所公开的新颖形式的多价抗体。
截短的多价多元体的制造
在一个实施方案中,宿主细胞可用编码两个或更多个重链可变区以及一个共同轻链可变区的核酸共转染以产生多价多元体,其中此类重链可变区中的两个包括恒定区,包括CH1、CH2和/或CH3,其能够异二聚化,包括经由在CH1与CH2域之间的铰链处配对而异二聚化,且其中该两个重链各自包括由能够裂解CH2和/或CH3区的蛋白水解酶所识别的该铰链的下部的氨基酸序列。或者,本发明的多价多元体可通过用一或多种基因构建体共转染个别细胞产生,该一或多种基因构建体一起编码两个或更多个轻链可变区以及一个共同重链,其中两个共同重链包括恒定区,包括CH1、CH2和/或CH3,其能够异二聚化,包括经由在CH1与CH2域之间的铰链处配对而异二聚化,且其中该两个重链各自包括由能够裂解CH2和/或CH3区的蛋白水解酶所识别的该铰链的下部的氨基酸序列。
本发明的多价多元体也可通过用两个或更多个感兴趣的抗原对含有共同可变链的转基因动物免疫接种来产生。自该转基因动物获得一组抗体,此类抗体包括共同可变链以及特异性结合感兴趣的抗原的经重排抗体链。接着,编码共同链以及可变结合链的核酸整合至宿主细胞中,此类宿主细胞产生完整多价抗体。接着,形成多价多元体。该多价多元体可包括一个共同轻链以及两个或更多个可变结合链,优选地其中此类可变结合链中的两个是包括CH1、CH2和/或CH3的重链,此类重链经由铰链,通常在CH1与CH2域之间的包括两个或更多个二硫桥键的铰链配对。接着,用酶裂解该多价多元体,该酶将CH2和/或CH3区自此类重链去除,在重链的C末端处留下铰链,使该多价多元体的重链配对,通常经由两个或更多个二硫键配对。
已公开如果干方法以有利于制造呈异二聚体形式的抗体。在本发明中,相对于制造相应同二聚体,该细胞有利于制造异二聚体。此通常通过编码重链的重链恒定区,优选地CH3区的核酸来达成,由此相对于同二聚化,其有利于异二聚化(即,具有一个重链与另一个重链组合的二聚化)。在一个优选实施方案中,本发明的多元体包括具有兼容的异二聚化域的两个不同免疫球蛋白重链。
此类相容的异二聚化域优选为相容的免疫球蛋白重链CH3异二聚化域。当使用野生型CH3域时,共表达两个不同重链(A和B)以及一个共同轻链将产生三种不同的抗体种类,即AA、AB以及BB。AA以及BB是两种同二聚体抗体的名称且AB是异二聚体抗体的名称。为增加所需异二聚体产物(AB)的百分比,可采用CH3工程改造,或换句话讲,可使用具有兼容的异二聚化域的重链。此项技术描述了能实现重链的此类异二聚化的各种方式。
如本文所使用,术语‘兼容的异二聚化域’是指经工程改造以使经工程改造的域A′优先与经工程改造的域B′形成异二聚体且反的还然的蛋白质域,使得A′-A′和B′-B′之间的同二聚化减少。
在美国申请案第13/866,747号(现以US 9,248,181颁布)、美国申请案第14/081,848号(现以US 9,358,286颁布)、WO2013/157953和WO2013/157954中,公开使用兼容的异二聚化域制造多价抗体的方法和方式。这些方式和方法也可有利地用于本发明中。确切地说,本发明的多元体优选地包括在第一和第二重链的恒定区处的残基以基本上仅产生双特异性全长IgG分子。优选的残基是第一CH3域中或与其对应的位置(‘KK变异体’重链)处的氨基酸L351K和T366K(EU编号)(其中第一个字母对应于野生型CH3域的残基且第二个字母对应于由CH3编码的能够优先参与异二聚体配对的残基)以及在第二结构域中或在与其对应的位置(‘DE变异体’重链)处的氨基酸L351D和L368E,或反的还然。先前在US 9,248,181和US9,358,286专利以及WO2013/157954 PCT申请案中展示,DE变异体与KK变异体优先配对形成异二聚体(所谓的‘DEKK’双特异性分子)。DE变异体重链(DEDE同二聚体)或KK变异体重链(KKKK同二聚体)的同二聚化不会发生或由于在一致重链之间的CH3-CH3界面中带电残基之间的斥力而仅极少量发生。
在能够表达多聚化形成多价多元体的蛋白质的本发明的一个宿主细胞中,用编码三种蛋白质的核酸转型该宿主细胞。按自N末端至C末端的次序,经编码蛋白质包括含VH3-CH1---VH2-CH1CH2-CH3的第一蛋白质,其中连接子在该第一蛋白质上沿N末端至C末端方向将CH1连接至VH2(由“---”表示);含VLc-CL的第二经编码蛋白质;含VH1-CH1-CH2-CH3的第三经编码蛋白质,其中该第一和第三经编码蛋白质的CH1域与第二经编码蛋白质的CL配对,且第一和第三蛋白质的经编码CH3区分别编码在第一CH3蛋白质中或在与其对应的位置处的氨基酸L351K和T366K(EU编号)以及在第三蛋白质中或与其对应的位置处的氨基酸L351D和L368E,或反的还然。或者,该第一和第三蛋白质包括其他兼容的异二聚化域,其引起这些蛋白质各自的CH3域的高效配对。
编码此类蛋白质的核酸可在一个或多个载体上以产生本发明的多价多元体。编码此类蛋白质的此类核酸可进一步稳定整合至宿主细胞的基因组中,优选地在已知用于高水平表达且不存在或减少基因沉默的染色体区处。
本发明的宿主细胞能够产生基于表达的总免疫球蛋白计纯度为至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%本发明的多价多元体的多价多元体。
本发明的宿主细胞能够产生该多价多元体,其中至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%的所产生的多价多元体对于所有结合位点包括与同源共同链配对的经重排可变区。
本发明的宿主细胞能够产生该多价多元体,其中至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%的所表达的共同链与该多价多元体配对且不为游离、未缔合的蛋白质。
在该多价多元体暴露于在两个二聚重链的铰链的下部裂解该多元体的蛋白水解酶后,能够获得本发明的截短的多价多元体,其中至少约50%、优选地60%、更优选地大于70%且至多大于90%浓度的原始蛋白质转化成本发明的截短的多价多元体。
非人类动物
本文所描述的方法和组合物允许制备具有获自、来源于或基于适合方法的结合域的适合多价结合蛋白。适合方法可包括噬菌体展示方法(包括对在噬菌体展示系统中产生的种系序列进行的修饰)及此项技术中已知的其他活体外方法。特别有用的方法是经由天然体细胞重组和亲和力成熟方法使经基因修饰的非人类动物产生可与共同轻链缔合并一起表达的适合重链可变域。
在一个实施方案中,用于本发明的多价多元体中的可变域获自、来源于或基于非人类转基因动物,例如共同轻链哺乳动物,诸如啮齿动物的重链和轻链可变区,该非人类转基因动物在其种系中包括未经重排的重链可变基因座且表达单一经重排人类轻链可变域。此类非人类转基因动物在暴露于抗原后将表达与共同轻链配对的多种体细胞重排的重链可变区,接着其可用于产生编码重链可变区的核酸序列,此类核酸序列获自、来源于或基于来自能够高效地转型至宿主细胞中以产生多价抗体的该转基因动物的核酸序列。
具体地讲,来自经免疫接种的共同轻链动物的适合B细胞的人类可变区序列可用作本发明的多价多元体的潜在VH域的来源,此类B细胞经基因工程改造成表达来源于人类VL基因区段的人类轻链可变域。在各种实施方案中,来自用一或多种感兴趣的抗原免疫接种的此类动物的B细胞是该多价多元体将结合的抗原。对此类动物的细胞、组织或血清、脾或淋巴材料进行筛选以获得针对感兴趣的抗原展现所需特征,例如高亲和力、低亲和力、阻断能力、活化、内化或其他特征的重链可变域(或表达其的B细胞)。由于该转基因动物中响应于抗原刺激产生的几乎所有重链可变域是与所表达的来源于优选地不超过一个或不超过两个VL基因区段的人类免疫球蛋白轻链一起产生,故此类重链可变区能够与该转基因动物中表达的共同轻链域一起表达和缔合。
在一个方面中,提供如本文所描述的表位结合蛋白,其中人类VL和VH序列是由核酸编码,该核酸是基于自本文所描述的转基因小鼠,和/或如以引用的方式并入本文中的WO2009/157771中所公开的转基因动物的B细胞获得的核酸,该转基因动物已用包括感兴趣的表位的抗原免疫接种。
核酸序列、多肽、载体和细胞
本发明进一步提供:编码可用于组装本发明的多价多元体的多肽或连接子的核酸序列;包括此类核酸序列的载体;能够产生本发明的多价多元体的细胞;以及使用此类细胞制备此类多价多元体的方法。
根据本发明的多价抗体通常是由表达编码此类多肽的核酸序列的细胞产生,此类多肽一起组装形成本发明的多元体。
因此,本发明提供一种连接子,其包括如SEQ ID NO:2-25中的任一个中所阐述的氨基酸序列或与其中任一个具有至少约85%序列同一性、与其中任一个具有至少约85%序列同一性,诸如与其中任一个具有至少约90%序列同一性,例如与其中任一个具有至少约95%序列同一性,诸如与其中任一个具有至少约98%序列同一性,例如与其中任一个具有至少约99%序列同一性的多肽。
本发明进一步提供一种多肽,其包括VH3-CH1-基于铰链的连接子-VH2-CH1。
在某些实施方案中,VH3与VH2结合同一表位。在某一实施方案中,VH3与VH2结合同一抗原,但结合不同表位。且在某些实施方案中,VH3与VH2结合独立的表位和抗原。
本发明还提供编码此类连接子或多肽的核酸序列和包括此类核酸序列的载体。
用于制备所述多肽的核酸序列可放入任何适合表达载体中且在适当情况下,以两个或更多个载体放入单一宿主细胞中。
一般而言,选殖具有适当连接子和/或恒定区的编码可变域的核酸序列并将在适合表达构建体中与启动子可操作连接的序列放入适合细胞株中进行表达。
多价多元体的表达
此项技术中已描述在重组宿主细胞中抗体的表达。编码本发明多元体的轻链和重链的核酸分子可以染色体外复本形式存在和/或稳定整合至宿主细胞的染色体中。后一情形是优选的,在此情况下,已知用于使基因沉默缺乏或减少的基因座可作为目标。
为实现编码组装为本发明多元体的多肽的核酸序列的表达,熟习此项技术者熟知,能够驱动此类表达的序列可功能性连接至编码此类多肽的核酸序列。功能性连接意图描述编码此类多肽或其前驱体的核酸序列连接至能够驱动表达的序列,由此使这些序列能够驱动此类多肽或其前驱体的表达。有用表达载体是此项技术中可获得的,例如Invitrogen的pcDNA载体系列。当关于控制经编码多肽的转录和转译的序列正确地插入编码感兴趣的多肽的序列时,由此得到的表达盒可用于产生感兴趣的多肽,称为表达。驱动表达的序列可包括启动子、强化子和类似组件,以及其组合。这些序列应能够在宿主细胞中起作用,由此驱动与其功能性连接的核酸序列的表达。启动子可为组成性的或受调控,且可获自各种来源,包括病毒、原核来源或真核来源,或为人工设计的。
本发明的核酸序列可由天然启动子或其衍生物,或由完全异源的启动子表达。一些众所周知且常用的在真核细胞中表达的启动子包括来源于病毒,诸如腺病毒的启动子,例如E1A启动子;来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子,诸如CMV立即早期(IE)启动子;来源于猴病毒40(SV40)的启动子,以及类似启动子。适合启动子也可来源于真核细胞,诸如金属硫蛋白(MT)启动子、延伸因子la(EF-la)启动子、肌蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子以及类似启动子。能够驱动本发明的核酸序列在宿主细胞中的表达的任何启动子或强化子/启动子适用于本发明中。在一个实施方案中,能够驱动表达的序列包括来自CMV启动子的区域,优选地包括CMV立即早期基因强化子/启动子的核苷酸-735至+95的区域。技术人员将意识到,用于本发明中的表达序列可适当地与可使表达稳定或增强的组件,诸如绝缘子、基质附接区、STAR组件以及类似组件组合。由此可增强表达的稳定性和/或水平。
适合表达重组核酸序列的任何细胞均可用于产生本发明的多元体。优选地,该细胞适合悬浮生长。
本发明的多价多元体可在宿主细胞中表达,通常通过培养适合的本发明细胞并自该培养物收集该抗体实现。优选地,该细胞系在无血清培养基中培养。本发明的多元体可通过熟习此项技术者一般已知的方法自此类细胞或优选地自细胞培养基回收。
回收之后,处理完整抗体以自该抗体裂解Fc域(例如CH2和/或CH3)。本发明的多元体可通过使用此项技术中已知的方法回收。此类方法可包括沈淀、离心、过滤、尺寸排阻层析法、亲和层析法、阳离子和/或阴离子交换层析法、疏水相互作用、层析法以及类似方法。可使用亲和层析法,包括基于连接子序列的亲和层析法作为分离本发明的多价多元体的一种方式。
截短的多价多元体的高效产生
此项技术已采用酶消化以及化学缀合来制造F(ab′)2。例如,已经由产生针对目标的Fab并与F(ab′)2相比较来分析抗体的亲和力与亲合力结合的差异,由此检查单价靶向引起的与抗原的接合是否少于二价靶向,并理解二价是否引起亲合力。先前经由化学缀合以及蛋白水解消化产生F(ab′)2部分的方法因低效率、不稳定或潜在地免疫原性部分以及使此类部分的分离及使用不切实际的抗体片段的异质混合物的产生而不适于研究及治疗应用。经由本文所描述的技术与使用能够特异性裂解Fc的酶的组合以高纯度表达新多价多元体形式的出现允许通过消除由胃蛋白酶消化观察到的C末端异质性而产生高浓度的此类截短的多价多元体的产物。
可使用任何适合的酶裂解和/或消化技术,结合本文所描述的方法制造包括F(ab′)n或(经修饰F(ab′)n)的多价多元体,如自任何全长多元体(例如完全单株多特异性抗体)获得。在某些实施方案中,抗体片段可通过用IdeS蛋白酶裂解获得,IdeS蛋白酶是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中裂解人类IgG1在铰链下部的特定位点,留下完整F(ab′)n多元体的IgG降解酶,其中在F(ab′)n一侧上的重链在其相应C末端与另一侧上的重链配对,其中该配对包括两个或更多个二硫桥键。(图4b1)。
或者,缺乏Fc区的多价多元体可通过使用来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyoromonasgingivalis)的半胱胺酸蛋白酶获得,该酶消化人类IgG1在铰链上部的特定位点(KSCDK/THTCPPC)(SEQ ID NO:92),产生完整Fab(图4b2)、2Fab′(图4b3)以及Fc(图4b4)片段。可通过此技术,经由表达含可变域和恒定域(例如CH1、CH2和/或CH3)的重链形成的多元体经由本文所描述的连接子连接至附加可变域,或与轻链配对,该轻链经由本文所描述的连接子连接至附加可变域,且其中蛋白水解酶,诸如来自牙龈卟啉单胞菌的蛋白水解酶裂解该重链的恒定域,取决于长臂上存在的结合域的量而留下具有较多结合域的完整截短的2Fab′或多元体。
通过使用本文所描述的宿主细胞,和异二聚化技术,可大批量高效产生双特异性和多特异性部分,其Fc区(例如CH2和/或CH3)经去除,产生能够进行高效研究和潜在治疗应用的一组高浓度F(ab′)n部分,由此提供与Fc沉默(例如不存在)、较短半衰期和较小尺寸相关的益处。
蛋白水解酶的去除
尽管不需要,但在产生截短的多价多元体后去除蛋白水解酶可能是优选的。使用固定的酶(例如固定于琼脂糖上)也可为优选的。酶的去除可经由此项技术中已知的多种方式实现,包括使用蛋白水解酶,此类酶包括在酶末端(优选地在N末端)处存在的标签,诸如HIS-NiNTI、生物素-抗生物素蛋白或VSV/FLAG-抗VSV/FLAG标签,使得该酶能经由抗标签亲和柱去除。此类抗体片段,诸如Fc,也可使用亲和层析法分离。类似地,可经由电荷层析法去除蛋白水解酶,或可制造具有增强的电荷的经修饰酶,由此使其此后可经由电荷层析法去除。
或者,可使本发明的多价多元体、蛋白水解酶和恒定域片段的混合物暴露于能够使该蛋白水解酶变性,但不会实质上干扰该多价多元体配对的pH条件或温度条件,由此促进该酶的失活和分离,同时不损害目标多价多元体。
药物组合物和使用方法
本发明还提供一种药物组合物,其包括本发明的多元体和药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
因此,本发明提供如本文所描述的多价多元体,其通过疗法治疗人类或动物身体。
本发明进一步提供一种用于治疗患有医学病况的人类或动物的方法,该方法包括向该人类或动物施用治疗有效量的如本文所描述的多价多元体。
拟施用患者的根据本发明的多元体的量通常在治疗窗中,意味着使用足够数量以获得治疗作用,同时该量不超过阈值,以免产生不可接受程度的副作用。获得所需治疗作用需要的多价多元体的量越低,则该治疗窗通常越大。因此,在低剂量下发挥足够治疗作用的根据本发明的多价多元体优选。
本文中引用的专利文献或作为现有技术给出的其他内容不应视为承认该文件或内容是已知的或其所含信息是任一权利要求书的优先权日期的公共常识的一部分。
本文阐述的每一参考文献的揭露内容以全文引用的方式并入本文中。
实施例
实施例1:多价多元体与完整抗体对应物的比较
使用GingisKHAN Fab套组和FabRICATOR套组(Genovis)消化5种不同抗体(PG6058p02(HER3 IgG Fc WT)SEQ ID NO:66和67;PG3004p04(HER2 IgG Fc WT)SEQ IDNO:68和69;双特异性PB11247 MF6058(HER3)×MF3004(HER2)Fc WT DEKK(US2017/0058035)SEQ ID NO:66-69;PG1337(TT IgG FcWT)SEQ ID NO:70和71;PB4248(TTxTT)Fc WT DEKK(WO 2017/069628)SEQ ID NO:70和71),分别产生Fab和F(ab′)2片段。抗体序列提供于表3中。
表3
在37℃下,在2mM半胱胺酸(温和还原剂)存在下,将40和200个单位的GingisKHAN酶与100和500μg/ml HER2/HER3多价抗体一起培育2小时。另外,在37℃下,在不添加还原剂情况下,将40和200个单位的FabRICrATOR LE与100和500μg/ml HER2/HER3多价抗体一起培育2小时。接着,使用CaptureSelect CH1亲和柱(Genovis)纯化两种反应物。用Octet,使用蛋白质L传感器测定IgG、Fab和F(ab′)2的浓度并显示于下表4中。
表4:由酶消化反应得到的抗体片段的定量
另外,如图2a-e中所示,通过SDS-PAGE分析测定纯度。如图2a-e中所示,未纯化的Fab消化物和其流过物样品(Fc)在非还原性凝胶中看来部分地还原。此可能在裂解缓冲液中由温和还原剂(2mM半胱胺酸)引起。在非还原性条件下,在F(ab′)2反应物中未观察到Fc。实际上,由于裂解酶切割连接该两个重链的铰链半胱胺酸下部,故出现‘半Fc’谱带。因此,‘粗’F(ab′)2片段的非还原性凝胶对于F(ab′)2产生97kDa的预期谱带尺寸且对于半Fc片段产生刚好高于25kDa的谱带尺寸。
通过FACS分析来分析完整IgG、Fab和F(ab′)2片段结合MCF7细胞的能力。由于MCF7细胞表达HER2和HER3,故选择此类细胞。
表5:MCF7细胞上IgG、Fab和F(ab′)2的Facs结合
一次染色盘1
一次染色盘2
如表5中可见,产生的Fab和F(ab′)2片段保持其结合特性且IgG和对应的F(ab′)2片段以类似亲和力结合。正如预期,Fab片段还结合,但以较低亲和力结合。由此显示,使用PB11247(MF6058(HER3)×MF3004(HER2))产生的F(ab′)2片段中的HER2和HER3臂是可用的且具有功能。
使用调蛋白(Heregulin)依赖性MCF-7增殖分析测定由IgG或biclonics得到的F(ab′)2片段保持其功能活性的能力。在以10μg/ml(如在Octet上所测量)作为100%阻断对照逐渐降低的9点半对数滴定系列中,测试抗体PG3004(Her2)、PG6058(Her3)、PG1337(TT)、MF6058(HER3)×MF3004(HER2)Fc WT DEKK(US 2017/0058035)和MF1337×MF1337)(TT×TT)以及以上抗体暴露于能够裂解铰链下部的酶后产生的F(ab′)2片段(粗500μg/ml反应混合物和经纯化F(ab′)2片段两者),星形孢菌素(Staurosporin)(1∶200)用作100%阻断对照。在每个盘上,包括两个不含调蛋白的孔、两个含调蛋白但无抑制剂的孔和两个含1∶200星形孢菌素的孔(最大抑制)。如图3中所示,PB11247F(ab′)2片段在该增殖分析中与其相应有同等作用,且在经纯化或未纯化F(ab′)2活性之间无明显差异。
实施例2:由三价IgG分子制造F(ab′)3
还对由多价多元体产生F(ab′)n片段(包括F(ab′)3、2Fab′和Fab片段)的能力进行分析。如图4中所示,F(ab′)3、2Fab′或Fab片段是基于所选蛋白酶(例如FabRICATOR或GingisKHAN)产生。分析以下包括不同抗原结合特性和共同轻链的三价多元体:PT23103p09(具有SEQ ID NO:72和73的重链VH2-连接子-CH1-VH3序列);PT23103p15(具有SEQ ID NO:74和75的重链VH2-连接子-CH1-VH3序列);PT23103p04(具有SEQ ID NO:76和77的重链VH2-连接子-CH1-VH3序列);PT23103p08(具有SEQ ID NO:78和79的重链VH2-连接子-CH1-VH3序列);PT23103p03(具有SEQ ID NO:80和81的重链VH2-连接子-CH1-VH3序列);PT23103p11(具有SEQ ID NO:82和83的重链VH2-连接子-CH1-VH3序列);以及PT23103p12(具有SEQ IDNO:84和85的重链VH2-连接子-CH1-VH3序列),其中每种PT编码以下三特异性多元体,其包括在VH3位置(顶部长臂)中的MF1337(破伤风类毒素)SEQ ID NO:70和71、在VH2位置(内部长臂)中的MF1122(纤维蛋白原)SEQ ID NO:86和87以及在VH1位置(短臂)中的MF1025(甲状腺球蛋白)SEQ ID NO:88和89,其中各VH与cLC配对。参见图4。此类三价多元体序列提供于表6中。
表6
对于每一酶反应,将最终反应体积为400μl的200μg/ml IgG与含80个单位的FabRICATOR LE或80个单位的GingisKHAN的10×稀释的还原缓冲液一起培育并在37℃下培育2小时。对于PT23103p09;PT23103p015;PT23103p04,使用250μl反应混合物,使用CaptureSelect CH1柱纯化出F(ab′)n。收集含有Fc和酶的流过物以及洗脱份。在A280nm下测量所有所得F(ab′)n制剂的蛋白质浓度。表7显示各消化的蛋白质浓度。
表7:截短的多价多元体(F(ab′)3)和Fab部分的蛋白质浓度
对于PT23103p09、PT23103p15和PT23103p04,在粗提取物中获得的F(ab′)3的百分比在55-74%范围内。对于消化粗提取物,针对该多价多元体的起始物质分析完整蛋白质浓度,以所有多价多元体计,该多价多元体产生100%的蛋白质。产率百分比是通过相对于分子量(Da)分析浓度(mg/ml)并与该多价多元体的起始物质相比较来计算,其中该多价多元体、截短的多价多元体和裂解的Fc的分子量具有表8中所示的值:
表8:多元体和片段的分子量
为确定抗体片段的特异性结合,进行ELISA反应以确定与破伤风、纤维蛋白原和甲状腺球蛋白的特异性结合。测试所产生的截短的多价多元体、Fab和未消化的IgG在滴定范围内与以2μg/ml涂布的破伤风类毒素;以10μg/ml涂布的纤维蛋白原;或以10μg/ml涂布的甲状腺球蛋白的结合。使用于2.5μg/ml涂布的huEGFR-Fc作为阴性对照。分析蛋白质浓度为7.5μg/ml的各纯化部分:F(ab′)3、Fab和2Fab′,且包括PG1337p324作为阴性和阳性对照。使用1/2000稀释的CH-1检测抗体检测经结合F(ab′)n。
如表9中所示,所有样品(未消化样品、粗样品和经纯化Fab)保持其在VH3位置、或在F(ab′)3“长臂”上的顶部位置处与破伤风类毒素的结合(参见图4)。未消化样品与消化样品的结合信号(在450nm下的Abs)极其类似。
表9:破伤风类毒素结合的ELISA分析
接下来,分析三价截短的多元体与纤维蛋白原的结合,该纤维蛋白原是位于VH2位置处,即在F(ab′)3长臂的内部位置(参见图4)。Fabricator F(ab′)3消化样品(未消化样品、粗样品和经纯化Fab)均保留其与纤维蛋白原的结合(表10)。未消化样品与消化样品的结合信号(在450nm下的Abs)极其类似。对于GingisKHAN 2Fab′(参见图4),对于连接子IgG1G4S、IgG 2AMH、IgG 2AH和IgG 2BH,结合保留,但减少。因此,具有连接子IgG1H、IgG1MH和IgG1UH的IgG皆丧失其与纤维蛋白原的结合。
表10:纤维蛋白原结合的ELISA分析
还分析三价多元体与位于VH1处,即F(ab′)3的短臂位置处的甲状腺球蛋白的结合(参见图4)。FabRICATOR F(ab′)3样品(未消化样品、粗样品和经纯化Fab)皆保留其与甲状腺球蛋白的结合(表11)。未消化样品与消化样品的结合信号(在450nm下的Abs)极其类似。此Fab是在三价截短的多元体中的VH1,即短臂位置中且不受酶消化影响。对于GingisKHAN,所有样品(未消化样品、粗样品和经纯化Fab)保留其与甲状腺球蛋白的结合。未消化样品与消化样品的结合信号(在450nm下的Abs)极其类似。
表11:甲状腺球蛋白结合的ELISA分析
还通过SDS-PAGE电泳确定片段的产生。如图5(a-d)中所示,Fabricator在产生各三价截短的多价多元体的(Fab′)3片段方面表现良好。对于PT23103p09,未处理的IgG(未还原(NR)和经还原(R))显示适当蛋白质谱带。在还原性和非还原性条件下,在FabRICATOR反应物中未观察到Fc。实际上,由于该酶切割连接该两个重链的铰链半胱胺酸下部,产生两个CH2-CH3多肽,故观察到“半Fc”谱带。未纯化的GingisKHAN反应物和其流过物样品(Fc)在非还原性凝胶中看来被还原。此可能是由裂解缓冲液中存在的温和还原剂(2mM半胱胺酸)在SDS-PAGE样品制备时使二硫键还原引起。在经纯化GingisKHAN反应物中,出现预期片段(图5a)。
对于PT23103p15,未处理的IgG(NR和R)看起来还是适当的。FabRICATOR样品显示适当的蛋白质谱带。在还原性和非还原性条件下,在FabRICATOR反应物中未观察到Fc。实际上,由于该酶切割连接该两个重链的铰链半胱胺酸下部,产生两个CH2-CH3多肽,故观察到“半Fc”谱带。未纯化的GingisKHAN反应物及其流过物样品(Fc)在非还原性凝胶中看来被还原。此可能是由裂解缓冲液中的温和还原剂(2mM半胱胺酸)在SDS-PAGE样品制备时使二硫键还原引起。在非还原性SDS-PAGE中所分析的经纯化GingisKHAN反应物中,在50kDa周围出现3个谱带。该3个谱带表示F(ab′)3的三个单个Fab且因来自长臂的两个Fab之间的连接子的部分以及连接至这些Fab的铰链的部分而延伸至不同高度。在还原性条件下,所有蛋白质延伸至约25kDa,达到VL-CL或VH-CH1多肽的高度。在ELISA中,粗反应物和纯化的反应物与纤维蛋白原的结合能力丧失,然而在ELISA中与破伤风和甲状腺球蛋白的结合能力仍完整。(图5b)。
对于PT23103p04,未处理的IgG(NR和R)看起来还是适当的。所有FabRICATOR样品均显示适当的蛋白质谱带。在非还原性条件下,在FabRICATOR反应物中未观察到Fc。实际上,由于该酶切割连接该两个重链的铰链半胱胺酸下部,产生两个CH2-CH3多肽,故出现“半Fc”谱带。未纯化的GingisKHAN反应物及其流过物样品(Fc)在非还原性凝胶中看来被还原。此可能是由裂解缓冲液中的温和还原剂(2mM半胱胺酸)在SDS-PAGE样品制备时使二硫键还原引起。在经纯化的GingisKHAN反应物中,出现预期片段(图5c)。
对于PT23103p08、PT23103p03、PT23103p11和PT23103p12,未处理的IgG(NR和R)看起来是适当的。所有FabRICATOR样品均显示适当的蛋白质谱带。在非还原性条件下,在FabRICATOR反应物中未观察到Fc。实际上,由于在SDS-PAGE样品制备时,该酶切割连接该两个重链的铰链半胱胺酸下部,使二硫键还原,故出现“半Fc”谱带。粗GingisKHAN反应物在非还原性凝胶中看来被还原。此可能是由裂解缓冲液中的温和还原剂(2mM半胱胺酸)在SDS-PAGE样品制备时使二硫键还原引起。对于PT23103p08和PT23103p03样品,正如预期,FabRICATOR反应显示F(ab′)3;而GingisKHAN反应显示无2Fab′片段,而是鉴别出大致对应于单个Fab片段的较小谱带。对于PT23103p11和PT23103p12,用FabRICATOR消化产生F(ab′)3。对于PT23103p11和PT23103p12,正如预期,GingisKHAN消化产生2Fab′片段,然而当用GingisKHAN消化时,某些组分减少(图5d)。应理解,通过调整所用时间或试剂可容易地缓解减少。
总体而言,对于FabRICATOR消化的反应,所有样品均显示预期的蛋白质谱带。在非还原性条件下,在FabRICATOR反应中未观察到Fc。实际上,由于该酶切割连接该两个重链的铰链半胱胺酸下部,产生两个CH2-CH3多肽,故出现“半Fc”或“CH2-CH3”谱带。
对于产生2Fab′的GingisKHAN消化的反应物,在一些连接子中存在的序列(KSCDK/THTCPPC)(SEQ ID NO:92)被GingisKHAN识别,且对于以下三价分子,连接子序列是类似的。
PT23103p15(连接子IgG1 H)KSCDK/THTSPPS(SEQ ID NO:93)
PT23103p08(连接子IgG1 MH)KSCDK/THTSPPS(SEQ ID NO:93)
PT23103p03(连接子IgG1 UH)KSCDK/THTSPPS(SEQ ID NO:93)
因此,可能的情况是,这些样品中的2Fab′被切割成2个独立的Fab,此与SDS-PAGE谱相关。对于这些样品,游离连接子可能阻碍结合位点,由此可以解释与纤维蛋白原的结合的损失。
总体而言,FabRICATOR表现良好,且本文所公开的方法在高浓度下产生截短的三价多元体(F(ab′)3),并维持特异性结合,且确定在高浓度下,可容易地产生在各Fab处具有共同轻链且经由异二聚化诸如DEKK配对的截短的多特异性多元体(F(ab′)n)。而对于缺乏经修饰IgG1铰链序列KSCDK/THTSPPS(SEQ ID NO:93)的连接子,使用GingisKHAN酶表现为产生2Fab′片段。
因此,使用本文所公开的传授内容,熟习此项技术者可制造出实质上纯的截短的多价(和多特异性)多元体,包括通过使用FabRICATOR酶制造。或者,使用多价多元体,在附加结合域经由缺乏GingisKHAN所识别的基元的连接子连接至该多元体情况下,遵循本文所公开的传授内容,使熟习此项技术者能够制造出nFab′和Fab的混合物,其中n等于两个或更多个,且nFab′包括重链,该重链包括经由本文所描述的连接子连接至一个或多个附加可变域的可变域,或与轻链配对,该轻链经由本文所描述的连接子连接至一个或多个附加可变域。
Claims (27)
1.一种多价多元体,包括三个或更多个结合域并且包括具有N末端和C末端的两个或更多个重链区,其中所述多元体包括使所述重链区中的两个在所述C末端处配对的铰链区。
2.根据权利要求1所述的多价多元体,包括三个或更多个人类重链可变区,其中两个在所述铰链区处配对,其中所述配对包括一个或多个二硫桥键。
3.根据权利要求1或2所述的多价多元体,其中每个重链区包括CH1域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多价多元体,其中两个或更多个重链区包括共同可变区。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的多价多元体,其中所述两个或更多个重链区与人类轻链区配对,其中所述轻链区是共同轻链。
6.根据权利要求5所述的多价多元体,其中所述共同轻链包括CL域。
7.根据权利要求5或6所述的多价多元体,其中所述共同轻链包括SEQ ID NO:1的序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多价多元体,其中所述多元体包括三个Fab域(Fab1、Fab2、Fab3),其各自包括与含可变区(VL)和恒定区(CL)的轻链配对的含可变区(VH)和恒定区(CH1)的重链,其中Fab2与Fab3经由在Fab2的重链可变区和Fab3的CH1域处的连接子连接,并且其中所述Fab1和Fab3经由铰链配对,所述铰链包括在Fab1的重链和Fab3的重链的C末端处存在的至少两个二硫键。
9.根据权利要求8所述的多价多元体,其中连接Fab2与Fab3的所述连接子包括SEQ IDNO:2-25的序列或与所述SEQ ID No:2-25具有至少约85%同一性的多肽。
10.根据权利要求8至9中任一项所述的多价多元体,其中所述连接子的氨基酸序列包括天然存在的序列或包括来源于天然存在的序列的序列。
11.根据权利要求10所述的多价多元体,其中所述连接子包括中间铰链区序列。
12.根据权利要求10所述的多价多元体,其中所述连接子包括上部铰链序列和下部铰链序列。
13.根据权利要求10所述的多价多元体,其中所述连接子包括螺旋形成序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的多价多元体,其中所述两个或更多个重链区的可变区特异性结合不同的表位。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多价多元体,其中所述多元体结合至少两种不同抗原。
16.一种制造多价多元体的方法,包括:
用两种或更多种抗原对转基因动物免疫接种,所述转基因动物包括编码共同轻链可变区和未经重排的重链可变区的核酸;
获得一组特异性结合所述两种或更多种抗原的抗体,所述抗体包括所述共同轻链可变区和经重排的重链抗体链;
将核酸整合至宿主细胞中,所述核酸编码所述共同轻链可变区以及两个或更多个经重排的重链,其特异性结合所述两种或更多种抗原,其中所述经重排的重链中的两个包括恒定区,所述恒定区包括能够经由形成二硫桥键配对的CH1、CH2和/或CH3域;
在使包括所述共同轻链以及两个或更多个经重排的重链的完整多价多元体表达的条件下培养所述宿主细胞,其中所述经重排的重链中的两个经由在所述两个经重排的重链各自的CH1与CH2域之间的二硫桥键配对;以及
用裂解出所述两个经重排的重链各自的CH2和/或CH3区的酶处理所述完整多价多元体,维持所述两个经重排的重链经由二硫桥键进行的配对以形成所述多价多元体。
17.根据权利要求16所述的方法,其中包括含CH1、CH2和/或CH3域的恒定区的所述两个重链包括促进异二聚化的互补修饰。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述修饰是在免疫球蛋白CH2或CH3区中。
19.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述互补修饰包括孔中节修饰、静电修饰或DEKK修饰。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述两个重链中的第一个包括与所述两个重链中的第二个的第二CH3域二聚化的第一CH3域,所述第一CH3在位置351和366处或在与其对应的位置处包括氨基酸残基赖氨酸并且所述第二CH3在位置351处包括氨基酸残基天冬胺酸并且在位置368处或在与其对应的位置处包括谷氨酸。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法,其中所述共同可变区是由核酸编码,所述核酸获自、来源于或基于由在种系中包括经重排的可变链核酸序列的转基因啮齿动物编码的核酸。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法,其进一步包括通过对所述酶加标签并经由抗标签亲和柱去除所述酶来回收所述多价多元体。
23.一种通过根据权利要求16至22中任一项所述的方法制造或可获得的多价多元体。
24.一种细胞,其包括编码能够组装成根据权利要求1至15中任一项所述的多价多元体的多肽的一个或多个核酸序列。
25.一种药物组合物,其包括根据权利要求1至15中任一项所述的多价多元体以及药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
26.一种治疗患有医学适应症的个体的方法,其包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的多价多元体。
27.根据权利要求1至15中任一项所述的多价多元体,其用于治疗中。
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