KR20190102271A - 다중특이적 항체를 제조하기 위한 폴리펩티드 링커 - Google Patents

다중특이적 항체를 제조하기 위한 폴리펩티드 링커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중특이적 항체를 제조하기 위한 돌연변이체 폴리펩티드 링커, 상기 다중특이적 항체 및 상기 다중특이적 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

다중특이적 항체를 제조하기 위한 폴리펩티드 링커
본 발명은 의학 분야에서 유용한, 향상된 특성을 가진 다중특이적 항체에 관한 것이다.
치료적 융합 단백질은 약물 개발에서 중요한 양식이 되었다. 종종, 펩티드 링커는 상이한 기능성 단백질 모듈로부터 다중-도메인 단백질을 제작하는데 사용된다. 생성된 다중도메인 단백질은 단리된 단일 도메인과 연관된 생물학적 효과를 높이기 위해 또는 단리된 단일 도메인에 의해 도달불가능한 새로운 생물학적 활성을 생산하기 위해 개별 모듈에 표적 동족체를 결합시키도록 (또는 개별 모듈의 생물학적 기능을 동시에 발휘하도록) 설계된다. 펩티드 링커를 이용하는 분자의 수많은 예가 있다: 항체의 단일 사슬 가변 도메인 (scFv), 면역-사이토카인 (사이토카인-항체 융합체), 이중특이적 항체 (BsAb) 등. 특정 융합 단백질에 대한 링커(들) 의 선택은 다음과 같은 고려 사항에 의해 결정된다: 1) 링커(들) 가 다양한 도메인을 특정 3 차 구조 (예를 들어, scFv-기반 항체) 로 접을 수 있는 유연성을 필요로 하는 지의 여부, 2) 링커(들) 가 단백질 도메인 사이에 필요한 분리를 제공하기 위해 강성을 필요로 하는 지의 여부, 또는 3) 원하는 활성을 생성하기 위해 생체 내에서 도메인의 분리를 허용하기 위해 링커 (들) 가 절단가능해야 하는 지의 여부 (Xiaoying Chen, et al, Adv Drug Deliv Rev. 2013. 65(10): 1357-1369). 부적절한 링커가 융합 단백질의 원하는 활성을 감소시키거나 제거할 수 있기 때문에 링커의 선택이 중요할 수 있다 (Yumi Maeda, et al, Anal. Biochem. 1997. 249(2): 147-152).
다양한 링커 서열이 융합 단백질의 제작에 사용하기 위해 확인되었다 (Richard George and Jaap Heringa, Protein Engineering. 2003. 15(11): 871-879; Xiaoying Chen et al, Adv Drug Deliv Rev. 2013. 65(10): 1357-1369). 또한 융합 단백질 제작에 사용되는 컴파일링된 링커 서열을 갖는 다양한 이용가능한 데이터베이스가 있다: 1) SynLinker compiled by the National University of Singapore (http://synlinker.syncti.org), 및 2) The International Genetically Engineered Machine Competition (http://parts.igem.org/Protein_domains/Linker); Centre for Integrative Bioinformatics at Vrije Universiteit Amsterdam (http://www.ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww).
국제 특허 출원 WO2013/005194 는 IgG1 힌지 서열, 이어서 IgG1 CH2 도메인 서열의 N-말단, 이어서 IgA1 힌지의 중심부로부터의 8 개의 아미노산 반-경질 링커 서열로부터 설계된 링커로 제작된 다중특이적 항체를 개시한다. IgA1 힌지의 중심부를 포함하는 상기 반-경질 링커는 내부 Fc-근위 Fab2 의 항원-결합 파라토프 상에 매복된 외부 Fab1 의 C-말단으로부터의 입체장애를 피하기 위해, 항체의 두 Fab 도메인의 충분한 분리를 제공하는데 중요하다.
그러나, 본 발명자는 다수의 글리코형태의 존재가 치료제의 개발에 필요한 그러한 다중특이적 항체의 일관된 제제를 생산하는 것을 그렇게 쉽게 만들지 않을 것이라는 것을 확인하였다. 또한, 그러한 제제의 특징분석은 또한 상당히 복잡할 것이며, 이는 상이한 제조된 배치의 비교를 힘들게 할 것이다.
본 발명자는 링커를 재설계함으로써, 특히 링커로부터 글리코실화 부위를 제거함으로써, 이것이 개선될 수 있음을 깨달았다.
따라서, 본 발명은 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO: 1) 을 포함하거나 이것으로 이루어지는 링커 폴리펩티드를 제공하며,
여기서, 동일 또는 상이한, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은, 본원에 정의된 임의의 아미노산이고; 단, 폴리펩티드는 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 5) 또는 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 6) 를 포함하거나 이것으로 이루어지지 않는다.
이러한 폴리펩티드는 융합 단백질, 더욱 특히 다중특이적, 특히 이중특이적 항체 중의 링커로서 유용하다.
따라서, 본 발명의 주제는 상이한 CH1 및 CL 도메인을 갖는 적어도 2 개의 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단편으로서, 각 Fab 단편은 상이한 관심의 에피토프를 인지하고, 상기 Fab 단편은 임의의 순서로 나란히 배열되며, 제 1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 폴리펩티드 링커를 통해 다음 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 연결되고,
폴리펩티드 링커 서열이 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO: 1) 를 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서, 동일 또는 상이한, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은, 임의의 아미노산이고; 단, 링커 서열은 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 5) 또는 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 6) 를 포함하거나 이것으로 이루어지지 않는 것을 특징으로 한다.
또한, 각각이 본원에 정의된 다중특이적 항원-결합 단편으로 이루어진, 2 개의 동일한 항원-결합 분지를 갖는 다중특이적 항체가 제공된다.
바람직한 구현예에서, 하기를 포함하는, 면역글로불린-유사 구조를 갖는 다중특이적 항체가 제공된다:
- 각각이 본원에 정의된 다중특이적 항원-결합 단편으로 이루어진, 2 개의 동일한 항원-결합 분지;
- 면역글로불린의 이량체화된 CH2 및 CH3 도메인;
- 항원-결합 분지의 CH1 도메인의 C-말단을 CH2 도메인의 N-말단에 연결시키는, IgA, IgG 또는 IgD 의 힌지 영역.
따라서, 본 발명은 2 개의 중쇄 및 4 개의 경쇄를 포함하는, 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 항체를 제공하며,
각각의 중쇄는 하기를 포함하고
a. 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역,
b. 이 Fc 영역은 상기 힌지 도메인에 의해 항체 1 (Ab1) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고,
c. 이것은 차례로 폴리펩티드 링커 서열에 의해 항체 2 (Ab2) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고, 폴리펩티드 링커 서열은 Ab1 의 상기 Fab 중쇄 VH 도메인의 N-말단을 Ab2 의 상기 CH1 도메인의 C-말단과 연결시킴,
4 개의 경쇄는 그들의 동족체 중쇄 도메인과 연관된 Ab1 의 경쇄 및 Ab2 의 경쇄를 포함하고;
폴리펩티드 링커 서열은 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO: 1) 을 포함하거나 이것으로 이루어지고,
여기서, 동일 또는 상이한, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은, 임의의 아미노산이고; 단, 링커 서열은 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 5) 또는 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 6) 를 포함하거나 이것으로 이루어지지 않는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2);
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3); 및
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO: 4) 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 발명의 추가의 주제는 본원에 정의된, 다중특이적 항원-결합 단편의 중쇄, 또는 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 항체를 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드이다.
본 발명은 또한 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포도 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명의 추가의 주제는 하기의 단계를 포함하는 본원에 기재된, 다중특이적 항체, 바람직하게는 이중특이적 항체의 제조 방법이다: a) 본원에 정의된 항체 중쇄 및 본원에 정의된 항체 경쇄를 발현하는 숙주 세포를 적합한 배지 및 배양 조건에서 배양하는 단계; 및 b) 상기 생산된 항체를 배양 배지로부터 또는 상기 배양된 세포로부터 회수하는 단계.
도 1 은 본 발명의 전체-길이 BiXAb 이중특이적 항체의 개략도이다.
도 2 는 Fc-도메인 없이 링커에 의해 연결된 단지 2 개의 Fab 도메인을 함유하는 이중특이적 구조물의 개략도이다 (Fab-Fab).
도 3A 는 BiXAb2b 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 3B 는 BiXAb3b 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 3C 는 Fab-Fab3b 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 4A 는 Fab-Fab3a 의 LC-MS 분석의 MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 4B 는 Fab-Fab3b 의 LC-MS 분석의 MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5A 는 BiXAb3a 의 LC-MS 분석의 MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5B 는 BiXAb3b 의 LC-MS 분석의 MS 스펙트럼을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
정의
자연적으로 발생하는 항체 분자의 기본 구조는 비-공유적 상호작용 및 사슬간 디술피드 결합에 의해 함께 지탱된, 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄로 이루어진 Y-형상의 4 량체 4 차 구조이다.
포유동물 종에는, 면역글로불린의 종류 (이소타입) 를 결정하는 α, δ, ε, γ 및 μ 의 5 가지 유형의 중쇄가 있다: 각각, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 중쇄 N-말단 가변 도메인 (VH) 에는 γ, α 및 δ 중쇄 내에 3 개의 도메인 (N-말단으로부터 C-말단으로 CH1, CH2 및 CH3 으로 번호매김) 을 함유하는 불변 영역이 이어지는 반면, μ 및 ε 중쇄의 불변 영역은 4 개의 도메인 (N-말단으로부터 C-말단으로 CH1, CH2, CH3 및 CH4 로 번호매김) 으로 구성된다. IgA, IgG 및 IgD 의 CH1 및 CH2 도메인은 가요성 힌지에 의해 분리되며, 이는 상이한 부류 사이 및 IgA 및 IgG 의 경우 상이한 서브타입들 사이에서 길이가 변한다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 는 각각 15, 12, 62 (또는 77) 및 12 개의 아미노산의 힌지를 갖고, IgA1 과 IgA2 는 각각 20 및 7 개의 아미노산의 힌지를 갖는다.
경쇄에는 두 가지 유형: λ 및 κ 가 있는데, 이것은 중쇄 이소타입 중 임의의 것과 연관될 수 있지만, 둘다 주어진 항체 분자에서 동일한 유형이다. 두 경쇄는 기능적으로 동일한 것으로 보인다. 그들의 N-말단 가변 도메인 (VL) 다음에는 CL 이라고 불리는 단일 도메인으로 이루어진 불변 영역이 이어진다.
중쇄 및 경쇄는 CH1 및 CL 도메인 사이 및 VH 및 VL 도메인 사이의 단백질/단백질 상호작용에 의해 쌍을 이루고, 두 중쇄는 그들의 CH3 도메인 사이의 단백질/단백질 상호작용에 의해 결합한다.
항원-결합 영역은 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완전한 경쇄 각각으로 이루어지는 Y-형상의 구조의 분지에 상응하며, Fab 단편 (Fragment antigen binding 에 대해) 이라고 불린다. Fab 단편은 사슬간 디술피드 결합의 아미노-말단 면 상의, 힌지 영역 중의 항체 분자를 절단하는 파파인 소화에 의해, 2 개의 동일한 항원-결합 분지를 방출시키는 천연 면역글로불린 분자로부터 처음으로 생성되었다. 펩신 (pepsin) 과 같은 다른 프로테아제 역시 힌지 영역 중의 항체 분자를 절단하지만, 사슬간 디술피드 결합의 카르복시-말단 면 상에는 2 개의 동일한 Fab 단편으로 이루어지고 디술피드 결합을 통해 연결되어 남아 있는 단편을 방출한다; F(ab')2 단편에서의 디술피드 결합의 감소는 Fab'단편을 생성한다.
VH 및 VL 도메인에 상응하는 항원-결합 영역의 일부를 Fv 단편 (Fragment variable 에 대해) 으로 부르고; 이것은 항원-결합 부위 (파라토프라고도 함) 를 형성하는 CDR (상보성 결정 영역) 을 함유한다.
면역 세포 상의 이펙터 분자에 대한 결합을 담당하는 항체의 이펙터 영역은 Y-형상의 구조의 줄기에 해당하며, 중쇄의 쌍을 이룬 CH2 및 CH3 도메인 (또는 항체의 종류에 따라, CH2, CH3 및 CH4 도메인) 을 함유하고, Fc (Fragment crystallisable 에 대해) 영역이라고 부른다.
2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄의 동일성으로 인해, 자연 발생적 항체 분자는 2 개의 동일한 항원-결합 부위를 가지며, 따라서 2 개의 동일한 에피토프에 동시에 결합한다.
본 발명의 문맥에서, "다중특이적 항원-결합 단편" 은 본원에서 각각이 상이한 에피토프를 인지하는 2 개 이상의 항원-결합 영역을 갖는 분자로서 정의된다. 상이한 에피토프는 동일한 항원 분자 또는 상이한 항원 분자에 의해 파생될 수 있다. 용어 "인지하기" 또는 "인지하다" 는 그 단편이 표적 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 보다 높은 친화도, 결합력, 보다 용이하게, 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합하는 경우, 항체는 표적 항원에 "특이적으로 결합한다". "특이적 결합" 또는 "우선적 결합" 은 반드시 독점적인 결합을 (포함할 수는 있지만) 필요로 할 필요는 없다. 일반적으로, 그러나 반드시 그런 것은 아니지만, 결합에 대한 참조는 우선적 결합을 의미한다.
용어 "대상체", "개인" 및 "환자" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 치료 및/또는 치료를 위해 평가되는 포유동물을 지칭한다. 대상체는 인간일 수도 있지만, 또한 다른 포유동물, 특히 인간 질병의 실험실 모델, 예를 들어 마우스, 쥐, 토끼, 개 등으로 유용한 포유동물을 포함한다.
용어 "치료" 또는 "치료하기" 는 인간을 포함하여 대상체가 직접적으로 또는 간접적으로 대상체의 상태를 개선할 목적으로 의학적 도움을 받는 행위, 적용 또는 요법을 의미한다. 특히, 이 용어는 일부 구현예에서 발병률의 감소, 또는 증상의 경감, 재발의 제거, 재발의 예방, 발병률의 예방, 증상의 개선, 예후의 개선 또는 이들의 조합을 의미한다. 숙련된 당업자는 치료가 반드시 증상의 완전한 부재 또는 제거를 초래하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 암과 관련하여, "치료" 또는 "치료하기" 는 신생물 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이를 늦추거나, 신생물 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 또는 이의 일부의 조합을 의미할 수 있다.
다중특이적 항체의 설계
본원에서는 다중특이적 항원-결합 단편(들) 및 상기 단편을 포함하는 다중특이적 항체 구조물을 제공하며, 여기서 각각의 다중특이적 항원-결합 단편은 본 발명의 링커에 의해 분리된, 나란히 배열된 Fab 단편으로 본질적으로 이루어진다.
이러한 단편 및 구조물은 바람직하게는 인간 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 더욱 바람직하게는 IgG1 로부터의 사슬을 포함한다.
2 개 초과의 상이한 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단편의 경우, Fab 단편을 분리하는 폴리펩티드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항체의 바람직한 구현예에 따르면, 이것은 각각이 상기 정의된 다중특이적 항원-결합 단편으로 이루어진, 2 개의 동일한 항원-결합 분지를 갖는다. 항원-결합 분지는 항체의 의도된 용도에 따라, 다양한 방법으로 함께 연결될 수 있다.
Fc-매개된 효과 없이 항체를 수득하기를 희망하는 경우, 항체는 Fc 영역을 포함하지 않을 것이다. 이 경우, 2 개의 항원-결합 분지는 예를 들어, 하기에 의해 함께 연결될 수 있다:
- Fab 단편을 분리하는 폴리펩티드 링커(들) 에 의해 제공되는 사슬간 디술피드 결합을 통한 항원-결합 분지의 동종이량체화에 의해; 및/또는
- 각각의 항원-결합 분지의 C-말단에서의 부가, 사슬간 디술피드 결합의 형성을 허용하는 시스테인 잔기를 함유하는 폴리펩티드 신장 및 힌지-유사 구조를 산출하는 상기 폴리펩티드 신장의 동종이량체화를 통해; 비-제한적인 예로써, 상기 폴리펩티드 신장은 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG3 의 힌지 서열일 수 있음;
- 2 개의 항원-결합 분지의 중쇄의 C-말단을 연결하여 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하고, 상기 항원-결합 분지를 서로 간에 충분한 거리로 유지시키는 반-강성 링커를 통해.
대안적으로, CDC, ADCC 또는 ADP 와 같은 이펙터 기능이 요구되는 경우, 본 발명의 다중특이적 항체는 이들 이펙터 기능을 제공하는 Fc 도메인을 추가로 포함할 수 있다. Fc 도메인의 선택은 원하는 이펙터 기능의 유형에 따라 다를 것이다.
이 경우, 본 발명의 다중특이적 항체는 하기를 포함하는, 면역글로불린-유사 구조를 갖는다:
- 상기 정의된 2 개의 동일한 다중특이적 항원-결합 분지;
- 면역글로불린의 이량체화된 CH2 및 CH3 도메인;
- 항원-결합 분지의 CH1 도메인의 C-말단을 CH2 도메인의 N-말단에 연결시키는, IgA, IgG 또는 IgD 의 힌지 영역, 또는 대안적으로는 CH3 도메인 다음에 이어지는 CH4 도메인이 IgM 또는 IgE 로부터 유래되는 경우, 항원-결합 분지의 CH1 도메인의 C-말단은 CH2 도메인의 N-말단에 직접 연결될 수 있음.
바람직하게는, CH2 및 CH3 도메인, 힌지 영역 및/또는 CH4 도메인은 항원-결합 분지의 CH1 도메인과 동일한 면역글로불린 또는 동일한 이소타입 및 서브클래스의 면역글로불린으로부터 유도된다.
천연 면역글로불린으로부터의 힌지 영역 뿐만 아니라, CH2, CH3 및 임의로 CH4 도메인이 사용될 수 있다. 원한다면, 예를 들어 항체의 이펙터 기능을 조절하기 위해 이들을 돌연변이시키는 것도 가능하다. 일부 경우에는, CH2 또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부가 생략될 수 있다.
본 발명은 더욱 특히, 각각의 이들의 표적에 2 개의 결합 부위를 포함하는 이중특이적 4가 항체 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 식균작용과 같은 이펙터 기능의 활성화를 허용하는 기능성 Fc 도메인을 제공한다.
본 발명의 이러한 바람직한 항체는 전체 길이 항체이다. 이들은 바람직하게는 인간 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 더욱 바람직하게는 IgG1 로부터의 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
경쇄는 람다 또는 카파 경쇄일 수 있고; 바람직하게는 이들은 카파 경쇄이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 링커는 테트라-Fab 이중특이적 항체 포맷 중에 IgG Fab 도메인을 연결하며, 이의 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 적어도 2 개의 Fab 의 중쇄 서열을 포함하고, 이어서 고유의 힌지 서열이 이어지고, 이어서 적절한 IgG 경쇄 서열과 공동-발현된 IgG Fc 서열이 이어진다.
IgG-유사 구조를 갖는 BiXAb 항체로 명명된, 본 발명의 항체의 예는 도 1 에 예시된다. 하기 기술된 BiXAb2a, BiXAb2b, BiXAb2c, 및 BiXAb3b 로 명명된 항체가 특정 예이다.
본 발명의 이중특이적 항체는 전형적으로 하기를 포함한다
- Fc (힌지-CH2-CH3) 로 구성된 연속 중쇄
- 이어서 항체 2 의 항체 1 Fab 중쇄 (CH1-VH) 및 연속적인 Fab 중쇄 (CH1-VH) 가 이어지고, 후자는 본 발명의 폴리펩티드 링커 서열에 의해 연결됨,
- 단백질 발현 중에 생성된 중쇄는 이량체로 조립되는 반면, 공동-발현된 항체 1 및 항체 2 경쇄 (VL-CL) 는 그들의 동족체 중쇄와 결합하여 최종 탠덤 F(ab)'2-Fc 분자를 형성하고,
항체 1 (Ab1) 및 항체 2 (Ab2) 는 상이함.
바람직한 구현예에서, 기재된 것은 이중특이적 항체이며, 이것은 하기를 포함한다
Figure pct00001
하기로 이루어지는 상이한 CH1 및 CL 도메인을 갖는 2 개의 Fab 단편
a) 인간 IgG1/카파로부터 유래된 CH1 및 C-카파 도메인 및 Ab1 의 VH 및 VL 도메인을 갖는 Fab 단편,
b) 인간 IgG1/카파로부터 유래된 CH1 및 C-카파 도메인 및 Ab2 의 VH 및 VL 도메인을 갖는 Fab 단편,
c) 인간 카파 불변 도메인으로부터 유래된 돌연변이된 경쇄 CL 불변 도메인,
d) 돌연변이된 중쇄 CH1 불변 도메인
Fab 단편은 다음 순서로 나란히 배열된다
- Ab1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 폴리펩티드 링커를 통해 Ab2 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 연결되고,
- Ab2 단편의 CH1 도메인의 C-말단을 CH2 도메인의 N-말단에 연결시키는 인간 IgG1 의 힌지 영역,
- 인간 IgG1 의 이량체화된 CH2 및 CH3 도메인.
Ab1 및 Ab2 는 임의의 관심 항체, 특히 임의의 치료학적 관심 항체일 수 있다.
특정 구현예에서, 상이한, Ab1 및 Ab2 는 항-EGFR 항체 및 항-HER2/neu 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상이한, Ab1 및 Ab2 는 한편으로는 세툭시맙 또는 그의 돌연변이 유도체, 및 다른 한편으로는 트라스투주맙 또는 그의 돌연변이 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
또다른 특정 구현예에서, 상이한, Ab1 및 Ab2 는 항-CD38 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
이러한 항체는 의약으로서, 보다 특히 암 치료에 유용하다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 아미노산 서열은 하기 문헌에 따라 정의된다: Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).
Fc 도메인을 함유하지 않는 다중특이적 항원-결합 단편 Fab-Fab 인 본 발명의 구조물의 또 다른 예는 도 2 에 예시된다. Fab-Fab3a 로 지정된 특정 예가 아래에 기술되어 있다.
이러한 Fab-Fab 구조물은 전형적으로 2 개의 상이한 Fab 도메인을 포함한다. 이러한 항체는 항원 1 및 항원 2 에 각각 결합하는 오직 하나의 Fab 도메인만을 보유한다. 그들은 상응하는 BiXAb 항체와 동일한 경쇄를 보유한다; 그러나, Fab-Fab 의 중쇄는 대부분의 C-말단 잔기가 시스테인-220 (EU 넘버링) 이 되도록 하는 방식으로 단축된다.
링커의 설계
본 발명에 따른 폴리펩티드 링커 서열은 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO: 1) 을 포함하거나 이것으로 이루어지며,
여기서, 동일 또는 상이한, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은, 임의의 아미노산이고; 단, 링커 서열은 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 5) 또는 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 6) 를 포함하거나 이것으로 이루어지지 않는다.
폴리펩티드 링커 서열은 80 개 미만의 아미노산, 바람직하게는 60 개 미만의 아미노산, 여전히 바람직하게는 40 개 미만의 아미노산으로 이루어진다.
특정 구현예에서, 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 은 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이다.
또다른 특정 구현예에서, 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 은 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이외의 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 은 Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여전히 바람직하게는 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 은, Ala (A) 또는 Gly (G) 일 수 있다.
대안적으로는, 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 은 Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), 바람직하게는 Leu (L), Glu (E), 또는 Gln (Q) 일 수 있다.
특정 구현예에서, 동일 또는 상이한, X4 및 X5 는 세린 (S), 시스테인 (C), 알라닌 (A) 및 글리신 (G) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산이다.
바람직한 구현예에서, X4 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이다.
바람직한 구현예에서, X5 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이다.
특정 구현예에서, 동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이외의 임의의 아미노산이다. 바람직하게는 동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대안적으로는, 동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), 바람직하게는 Leu (L), Glu (E), 또는 Gln (Q) 일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직한 구현예에서, X6 및 X7 은 동일하고, 바람직하게는 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은 서열 SEQ ID NO: 1 을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서
동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 은 트레오닌 (T), 세린 (S) 이고;
X4 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이고;
X5 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이고;
동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2);
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3); 및
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO: 4) 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
또다른 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드 링커 서열은 서열 SEQ ID NO: 1 을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서
동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 은 Ala (A) 또는 Gly (G) 이고;
X4 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이고;
X5 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이고;
동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항체의 생산
본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 코딩하는 DNA 분절은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 이러한 제어 서열은 신호 서열, 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 서열을 포함한다. 발현 벡터는 전형적으로 에피좀 또는 숙주 염색체 DNA 의 통합 부분으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 검출할 수 있도록 선별 마커, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유할 것이다.
하나의 예에서, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 (예를 들어, VH 및 VL, VH-CH1 또는 VL-CL 을 코딩하는 서열) 모두가 하나의 발현 벡터에 포함된다. 또다른 예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 각각은 개별 벡터 내로 클로닝된다. 후자의 경우, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터는, 생체 내 또는 시험관 내에서 손상되지 않은 항체를 형성하도록 조립될 수 있는 양 사슬의 발현을 위해 하나의 숙주 세포 내로 동시-트랜스펙션될 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 플라스미드와 같은 3 개의 독립적인 발현 벡터로 동시-트랜스펙션되어, 모든 3 개의 사슬 (즉, 중쇄 HC, 및 2 개의 경쇄 LC1 및 LC2, 각각) 의 공동생성 및 다중특이적 항체의 분비를 도출한다.
보다 특히, 3 개의 벡터는 하기 3:2:2 (HC : LC1 : LC2) 의 분자 비로 유리하게 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항체의 발현을 위한 재조합 벡터는 전형적으로 구성적 또는 유도성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 항체 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 함유한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는 둘 다에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 항체를 코딩하는 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의로 적어도 하나의 독립적인 종결자 서열, 진핵생물 및 원핵생물 모두에서 카세트의 복제를 허용하는 서열, 즉 셔틀 벡터 및 원핵 및 진핵 시스템 모두를 위한 선별 마커를 함유하는 일반적인 발현 카세트를 함유한다.
본원에 기재된 다중특이적 항체는 박테리아, 효모, 사상균, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 본 발명의 재조합 항체는 진핵 세포에서 글리코실화되거나 발현될 필요는 없으며; 그러나, 포유동물 세포에서의 발현이 일반적으로 바람직하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장 계통 (293 세포), 아기 햄스터 신장 세포 (BHK 세포), 중국 햄스터 난소 세포 /- 또는 + DHFR (CHO, CHO-S, CHO-DG44, Flp-in CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO 세포) 및 인간 간세포 (Hep G2 세포) 이다.
온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었기 때문에 포유동물 조직 세포 배양물이 폴리펩티드를 발현하고 생산하기 위해 바람직하고, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다.
가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 항체는 CHO 세포주, 가장 유리하게는 CHO-S 세포주를 사용하여 생성된다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 복제 기원, 프로모터 및 인핸서와 같은 발현 제어 서열, 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열과 같은 필요한 프로세싱 정보 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다.
관심의 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 및 발현 제어 서열) 을 함유하는 벡터는 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있으며, 이는 세포 숙주의 유형에 따라 다양하다. 예를 들어, 칼슘 포스페이트 처리 또는 전기천공이 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. (일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989) 참조). 중쇄 및 경쇄가 별도의 발현 벡터 상에 클로닝될 때, 벡터는 온전한 면역글로불린의 발현 및 어셈블리를 얻기 위해 동시-트랜스펙션된다.
숙주 세포는 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션되고 (예를 들어, 화학적 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해), 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 통상적인 영양 배지에서 배양 (또는 적절하게 변형) 된다.
일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 이들의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태를 추가로 단리하거나 정제하여 추가 분석 및 적용을 위해 실질적으로 균질한 제제를 얻을 수 있다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 정제 절차에는 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼에서의 분별, 에탄올 침전, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 암모늄 설페이트 침전 및 겔 여과가 포함될 수 있다 (참조, 일반적으로 Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). 약학적 용도의 경우, 적어도 약 90 내지 95% 의 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 균질성이 가장 바람직하다.
시험관 내 생산은 본 발명의 다량의 목적하는 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 항체를 제공하는 스케일-업을 가능하게 한다. 이러한 방법은 예를 들어 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상의 중공 섬유, 마이크로캡슐에서 고정되거나 포획된 세포 배양을 사용할 수 있다.
치료 적용
본 발명의 추가 양상은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 또다른 양상은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 추가 양상은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제형화된, 본원에 정의된 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 당 업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다.
상기 일반적으로 설명된 본 발명은 예시로서 제공되고 본 발명을 제한하도록 의도되지 않은 하기 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이다.
실시예
설계
본 발명의 제 1 이중특이적 항체는 다음과 같은 구조를 가지고 있는 BiXAb2a 로 지정된 항체이다:
i) 하기를 포함하는 연속 중쇄
Figure pct00002
SEQ ID NO: 7 에 해당하는 트라스투주맙 중쇄 가변 영역 (VH)
Figure pct00003
SEQ ID NO: 8 에 해당하는 인간 IgG1 유래의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 의 잔기는 트레오닌임)
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2) 로 이루어진 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커;
Figure pct00004
SEQ ID NO: 9 에 해당하는 세툭시맙 중쇄 가변 영역 (VH)
Figure pct00005
SEQ ID NO: 10 에 해당하는 인간 IgG1 유래의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산으로 돌연변이됨)
Figure pct00006
SEQ ID NO: 11 에 해당하는 인간 IgG1 유래의 야생형 힌지 영역
Figure pct00007
SEQ ID NO: 12 에 해당하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
Figure pct00008
SEQ ID NO: 13 에 해당하는 인간 IgG1 의 야생형 CH3 도메인
따라서, 본 발명의 이중특이적 항체는 SEQ ID NO: 14 의 연속 중쇄 (701 개 잔기) 를 갖는다
ii) SEQ ID NO: 15 로 이루어진 야생형 트라스투주맙 경쇄
iii) SEQ ID NO: 16 에 해당하는 인간 카파로부터 돌연변이된 불변 도메인 (Kabat 위치 Ser 114 및 Asn 137 에서의 잔기가 각각 Ala 및 Lys 로 돌연변이됨) 을 갖는 세툭시맙 경쇄.
본 발명의 제 2 이중특이적 항체는 하기 서열의 링커를 제외하고는, 동일한 서열로 구성되는 BiXAb2b 로 지정된 항체이다:
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3).
본 발명의 제 3 이중특이적 항체는 하기 서열의 링커를 제외하고는, 동일한 서열로 구성되는 BiXAb2c 로 지정된 항체이다:
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO: 4).
본 발명의 제 4 이중특이적 항체는 다음과 같은 구조를 가지고 있는 BiXAb3b 로 지정된 항체이다:
i) 하기를 포함하는 연속 중쇄
Figure pct00009
SEQ ID NO: 23 에 해당하는 아테졸리주맙 중쇄 가변 영역 (VH)
Figure pct00010
Figure pct00011
SEQ ID NO: 10 에 해당하는 인간 IgG1 유래의 돌연변이된 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 의 잔기는 트레오닌에서 글루탐산으로 돌연변이됨)
SEQ ID NO: 3 으로 이루어진 2 개의 Fab 중쇄를 연결하는 폴리펩티드 링커;
SEQ ID NO: 17 에 해당하는 다라투무맙 중쇄 가변 영역 (VH)
Figure pct00012
Figure pct00013
SEQ ID NO: 8 에 해당하는 인간 IgG1 의 야생형 CH1 불변 도메인 (Kabat 위치 192 의 잔기는 트레오닌임)
Figure pct00014
SEQ ID NO: 11 에 해당하는 인간 IgG1 유래의 야생형 힌지 영역
Figure pct00015
SEQ ID NO: 12 에 해당하는 인간 IgG1 의 야생형 CH2 도메인
Figure pct00016
SEQ ID NO: 13 에 해당하는 인간 IgG1 의 야생형 CH3 도메인
[따라서, 본 발명의 중쇄는 SEQ ID NO: 18 의 연속 중쇄를 갖는다
Figure pct00017
Figure pct00018
ii) SEQ ID NO: 19 에 해당하는 인간 카파로부터 돌연변이된 불변 도메인 (Kabat 위치 Ser 114 및 Asn 137 에서의 잔기가 각각 Ala 및 Lys 로 돌연변이됨) 을 갖는 아테졸리주맙 경쇄
Figure pct00019
iii) SEQ ID NO: 20 으로 이루어진 야생형 다라투무맙 경쇄
Figure pct00020
비교 목적으로, 하기로 이루어진 링커에 의해 BiXAb3b 항체와 상이한 BiXAb3a 로 지정된 항체가 또한 생성되었다.
Figure pct00021
본 발명의 또다른 구조물은 Fab-Fab3b 로 지정되는데; 이것은 힌지, CH2 및 CH3 도메인이 중쇄에서 누락된다는 것을 제외하고는 BiXAb3b 와 동일한 서열로 구성된다. 따라서, Fab-Fab3b 는 SEQ ID NO: 21 의 연속 중쇄를 갖는다
Figure pct00022
비교 목적으로, Fab-Fab3a 로 지정된 구조물이 또한 제조되고, 이것은 힌지, CH2 및 CH3 도메인이 중쇄에서 누락된다는 것을 제외하고는 BiXAb3a 와 동일한 서열로 구성된다.
SEQ ID NO: 7 내지 16 이 아래에 제시되어 있다.
Figure pct00023
Figure pct00024
유전자 합성
항-HER2 (트라스투주맙, 클론 humAb4D5-8) 및 항-EGFR (세툭시맙) 의 아미노산 서열을 사용하여 DNA 서열을 설계하고, 그 후 GeneScript 프로그램을 사용하여 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화하였다. 중쇄의 경우, Fab1 의 신호 펩티드, 가변 영역 및 불변 CH1 도메인을 코딩하는 DNA 에 이어, 제한 효소 소화를 위한 측면 서열을 갖는 Fab2 의 유사 힌지 링커 및 가변 영역 및 불변 CH1 도메인을 GeneScript 에 의해 합성하였다. 경쇄의 경우, 신호 펩티드 및 가변 및 불변 카파 영역을 코딩하는 DNA 를 GeneScript 에 의해 합성하였다.
삽입체를 증폭시키기 위해 Pfu Turbo Hot Start 를 사용하는 PCR 반응을 수행한 후, 이것을 중쇄 및 경쇄 각각에 대해 NotI + ApaI 및 NotI + HindIII 에 의해 소화시켰다. 이중 소화된 중쇄 단편을 인간 IgG1 CH1 + 힌지 + CH2 + CH3 도메인이 이미 삽입된 NotI + ApaI 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 로 라이게이션하였다. 이중 소화된 경쇄 단편을 NotI + HindIII 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 로 라이게이션하였다. 플라스미드 DNA 는 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.
발현 및 정제
본 발명의 이중특이적 항체는 현탁액 중의 무-혈청 배지 (Life Technologies™ 의 CHO SFM-II 배지) 에 적응된 CHO-S 세포에서 2:3:3 = HC:LC1:LC2 몰비 (1 개의 연속 중쇄 (HC) 및 2 개의 경쇄 (LC)) 로 별도의 벡터 상에 코딩된 3 개의 유전자의 동시-트랜스펙션에 의한 일시적 유전자 발현에 의해 생성되었다. 전형적으로, 50 mL 중규모 발현 시험을 위해, 총 50 ㎍ 의 플라스미드 DNA (25 ㎍ 중쇄 1, 12.5 ㎍ 의 트라투주맙 경쇄 및 12.5 ㎍ 의 세툭시맙 경쇄) 를 1.5 mL Eppendorf 튜브에서 혼합하고, 25 ㎕ 의 3 mg/mL PEI 트랜스펙션 시약 (Polyplus) pH7.0 을 함유하는 1 mL 의 CHO SFM 배지를 첨가하고, 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. DNA-PEI 의 혼합물을 125mL 진탕 플라스크 중 1~2 x 106/mL 로 49 mL 의 Life Technologies’ Invitrogen FreeStyle™ CHO-S 세포 내에 로딩하였다. 세포를 6 일 더 진탕하였다. 세포를 3,000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하여 상청액을 수확하였다. 상청액 중에서의 BiXAbs 의 발현 역가는 ForteBio 의 단백질 A 바이오센서 (Octet® Systems) 를 사용하여 결정되었다. 이어서 이중특이적 모노클론 항체 (BiXAb) 를 MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences) 를 사용하여 단백질 A 친화성 배지에서 정제하였다. 1 M TRIS 에서 중화시키면서 0.1 M 글리신 pH 3.5 를 사용하여 단백질 A 로부터 항체를 용리시켰다. Dulbecco’s PBS (Lonza BE17-512Q) 의 정제된 항체를 멸균-여과하고 (Techno Plastic Products AG 의 0.2 μM 멸균 필터) Eppendorf BioSpectrometer® 를 사용하여 280 nm 에서의 OD 판독으로 최종 농도를 결정하였다.
SDS-PAGE 분석
전기영동은 Gel Biorad Stain-Free 4 - 15% 젤과 상응하는 수행 완충액을 사용하여 환원 조건과 비-환원 조건에서 수행되었다. 정제된 BiXAb 또는 Fab-Fab 항체를 2X SDS 샘플 완충액과 조합하고 95℃ 에서 5 분 동안 가열하여 샘플을 제조하였다. 환원된 샘플의 제조는 가열 전에 NuPAGE 환원제의 첨가를 포함하였다. Ladder Precision Plus Protein Unstained Standards (Biorad) 를 사용하여 겉보기 MW 를 측정하였다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
단백질 응집은 조작된 단백질 분자에서 자주 관찰된다. 항체의 고분자량 종 함량을 분석하기 위해 분석 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 수행하였다. SEC-s3000 (300x 7.8mm) 컬럼 (BioSep) 과 Aktapurifier 10 시스템 (GE Healthcare) 을 사용하였고; PBS 완충제 pH 7.4 를 사용하여 1 mL/분의 유속에서 검정을 수행하였다.
BiXAb2b (도 3A), BiXAb3a, BiXAb3b (도 3B), Fab-Fab3a, 및 Fab-Fab3b (도 3C) 의 SEC 크로마토그램은 주 피크가 단량체 BiXAb 및 Fab-Fab 항체의 예상 크기에 해당함을 입증하였고; 이들 피크는 총 샘플의 99.9-100.0% 를 나타냈다. 따라서, 본 발명자들은 신규 링커를 함유하는 항체가 고 분자량 종을 갖지 않는다는 결론을 내렸다. 단량체 피크의 좁고 대칭적인 형상은 모든 BiXAbs 및 Fab-Fab 가 정확하게 조립되고 단일 종으로 표현되었음을 제안하였다.
시차 주사 열량측정에 의한 BiXAbs 의 특징분석
BiXAb2b 의 열 안정성을 시험하기 위해 시차 주사 열량측정 (DSC) 이 사용되었다. MicrocalTM VP-Capillary DSC system (Malvern Instruments) 을 사용하여 시차 주사 열량측정 실험을 수행하였다.
샘플을 원심분리하고 (20,000xg, 5 분, 4℃), IgG 분석 프로그램을 사용하여 Nanodrop ND-1000 분광광도계 (Thermo Scientific) 를 사용하여 DSC 분석 전에 이들의 단백질 함량을 정량화하였다. 검정을 위해, 샘플을 PBS 중에서 1 mg/mL 의 최종 농도로 희석하였다
예비-평형화 시간은 3 분이었고, 생성된 서모그램 (thermogram) 은 60℃/h 의 스캔 속도, 25 초의 필터링 주기 및 중간 피드백에서 20 내지 110℃ 에서 획득되었다. 샘플 분석 전에, 5 개의 완충제/완충제 스캔을 측정하여 기구를 안정화시키고, 각 단백질/완충제 스캔 사이에 완충제/완충제 스캔을 수행하였다. 데이터는 비-2-상태 언폴딩 모델에 적합했으며, 전- 및 후- 전환은 기준선의 차감에 의해 조정되었다.
DSC 결과는 BiXAb2b 의 DSC 프로파일이 2 개의 전환을 나타냄을 입증하였다. 더 작은 피크는 CH2 및 Fab 도메인 모두의 언폴딩에 상응하여, 96 Kcal/몰/℃ 의 Cp 최대 및 71.5℃ 의 Tm1 을 가졌고, 더 큰 피크는 CH3 도메인의 언폴딩에 상응하는 190 Kcal/몰/℃ 의 Cp 최대 및 80.5℃ 의 Tm2 를 가졌다.
액체 크로마토그래피/질량 분광법 (LC-MS) 분석
LC-MS/MS 데이터는 Q-Exactive 질량 분석기 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) 및 Proswift RP-4H 역상 컬럼 (250 mm × 1 mm; Thermo Fisher) 에 연결된 Dionex Ultimate 3000 시스템을 사용하여 획득하였다. 컬럼 오븐 온도는 65℃ 로 설정되었다. LC 분리를 위해 10 마이크로리터를 주입하였다. 0.1% 포름산을 갖는 LC-MS 등급의 물 (상 A) 및 0.1% 포름산을 갖는 아세토니트릴 (상 B) 로 이루어진 이동상의 구배를 0.2 mL/분의 유속으로 전달하였다 (총 실행 시간 20 분). 용출된 항체 종을 전자분무 이온화 (ESI) 에 의해 Q-Exactive 기기에 도입하였으며, 이는 완전-스캔 15,000 해상도를 사용하여 양이온 모드로 작동하였다. 데이터 파일의 기기 제어 및 처리에는 Xcalibur 2.2 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) 가 사용되었다.
도 4A 와 4B 는 Fab-Fab3a (SEQ ID NO: 6 를 갖는 링커 함유) 및 Fab-Fab3a (SEQ ID NO: 3 을 갖는 링커 함유) 의 LC-MS 분석을 각각 제시한다. 도 4A 는 SEQ ID NO: 6 에 해당하는 링커를 갖는 Fab-Fab3a 의 LC-MS 스펙트럼이, 오직 링커의 조성만 상이한 (SEQ ID NO: 3), 관련 Fab-Fab3b 항체의 것보다 상당히 더 불균질하다는 것을 입증한다. Fab-Fab3a 항체 내의 링커 서열은 PSTPPTPSPS (SEQ ID NO:22) 서열을 함유하며, 이는 인간 IgA1 힌지에서 발견되고 2 개의 트레오닌 및 2 개의 세린 잔기에서 O-연결 글리코실화에 적용되는 것으로 알려져 있다. 이들 부위의 글리코실화는 불균질하기 때문에, 생성물은 일반적으로 다수의 글리코형을 갖고, 그의 집단은 재조합 단백질의 발현 조건에 의해 크게 영향을 받는다. Fab-Fab3a 중의 N-연결 및 O-연결 글리코실화 부위의 총 수는 적어도 4 이며, 도 4A 에서 관찰된 복합 MS 스펙트럼을 설명한다. SEQ ID NO: 3 에 해당하는 링커의 서열은 불-균질 O-연결 글리코실화로 인한 불균질성을 감소시키도록 설계되었다. 이와 같이, O-연결 글리코실화를 겪는 것으로 알려진 인간 IgA1 의 힌지 서열의 서열과 서열이 부합하는 링커 부분 내의 몇몇 세린 및 트레오닌 잔기는 글리신 잔기로 대체되었고; 추가적으로, 다른 세린 및 트레오닌 잔기가 또한 링커에서 글리신으로 대체되었다. 도 4B 는 SEQ ID NO: 3 링커를 함유하는 Fab-Fab3b 의 MS 스펙트럼이 실질적으로 단순화되었음을 보여주고; 이는 Fab-Fab3b 분석물이 그의 스펙트럼이 도 4A 에 제시되는 Fab-Fab3a 분석물보다 덜 복잡하기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 SEQ ID NO: 6 의 링커를 SEQ ID NO: 3 링커로 대체함으로써 Fab-Fab3b 항체로부터 4 개의 O-연결 글리코실화 부위를 제거함으로써 실질적으로 더 균질한 BiXAb 제제를 생성할 수 있다고 결론지었다.
SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 3 링커를 함유하는 이중특이적 항체의 균질성의 차이는, 2 개의 링커 서열을 갖고 따라서 증가된 수의 BiXAb 제제의 글리코형을 갖는 대칭 분자인, 전체-길이 BiXAb 항체의 분석으로부터 특히 명백하였다. 부가적으로, BiXAbs 는 Fc-도메인의 각 중쇄 상에 하나씩, 2 개의 N-연결된 글리코실화 부위를 보유한다. BiXAb3a (SEQ ID NO: 6 링커로 제작됨) 및 BiXAb3b (SEQ ID NO: 3 링커로 제작됨) 의 LC-MS 스펙트럼은 도 5A 및 5B 에 각각 제시된다. BiXAb3a 는 링커 서열의 차이에 기초하여 BiXAb3b 에 비해 8 개의 부가적인 O-연결 글리코실화 부위를 함유할 것으로 예상된다. BiXAb3a 의 다수의 O-연결 글리코실화 부위는 도 5A 에서 매우 복잡한 MS 스펙트럼을 설명한다. BiXAb 항체는 둘 다 Fc-도메인에 2 개의 N-글리코실화 부위를 보유하여, BiXAb 둘 다의 불균질성에 기여하는 부가적인 글리코형을 생성하며, 이는 도 5B 에서 관찰된 BiXAb3b 에서 불균질성의 잔류량을 설명한다.
<110> BIOMUNEX pharmaceuticals <120> A polypeptide linker for preparing multispecific antibodies <130> B2412PC <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Glu Pro Lys Xaa Cys Asp Lys Xaa His Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro 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10 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 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Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 16 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 17 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 702 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala 225 230 235 240 Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 260 265 270 Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg 275 280 285 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 305 310 315 320 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 325 330 335 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu 340 345 350 Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 355 360 365 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 370 375 380 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 405 410 415 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 420 425 430 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 435 440 445 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 450 455 460 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 465 470 475 480 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 485 490 495 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 500 505 510 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 515 520 525 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 530 535 540 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 545 550 555 560 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 565 570 575 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 580 585 590 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 595 600 605 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 610 615 620 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 625 630 635 640 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 645 650 655 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 660 665 670 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 675 680 685 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 695 700 <210> 19 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 20 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 21 <211> 475 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala 225 230 235 240 Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 260 265 270 Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg 275 280 285 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 305 310 315 320 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 325 330 335 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu 340 345 350 Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 355 360 365 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 370 375 380 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 405 410 415 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 420 425 430 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 435 440 445 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 450 455 460 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 465 470 475 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (27)

  1. 상이한 CH1 및 CL 도메인을 갖는 적어도 2 개의 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단편으로서, 각 Fab 단편은 상이한 관심의 에피토프를 인지하고, 상기 Fab 단편은 임의의 순서로 나란히 배열되며, 제 1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 폴리펩티드 링커를 통해 다음 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 연결되고,
    폴리펩티드 링커 서열은 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO: 1) 을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서, 동일 또는 상이한, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은, 임의의 아미노산이고; 단, 링커 서열은 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 5) 또는 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 6) 를 포함하거나 이것으로 이루어지지 않는 것을 특징으로 하는, 다중특이적 항원-결합 단편.
  2. 각각이 제 1 항의 다중특이적 항원-결합 단편으로 이루어진, 2 개의 동일한 항원-결합 분지를 갖는 다중특이적 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, 하기를 포함하는, 면역글로불린-유사 구조를 갖는, 다중특이적 항체:
    - 각각이 제 1 항에 정의된 다중특이적 항원-결합 단편으로 이루어진, 2 개의 동일한 항원-결합 분지;
    - 면역글로불린의 이량체화된 CH2 및 CH3 도메인;
    - 항원-결합 분지의 CH1 도메인의 C-말단을 CH2 도메인의 N-말단에 연결시키는, IgA, IgG 또는 IgD 의 힌지 영역.
  4. 2 개의 중쇄 및 4 개의 경쇄를 포함하는 다중특이적 항체, 바람직하게는 이중특이적 항체로서,
    각각의 중쇄는 하기를 포함하고
    a. 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역,
    b. 이 Fc 영역은 상기 힌지 도메인에 의해 항체 1 (Ab1) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고,
    c. 이것은 차례로 폴리펩티드 링커 서열에 의해 항체 2 (Ab2) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 연결되고, 폴리펩티드 링커 서열은 Ab1 의 상기 Fab 중쇄 VH 도메인의 N-말단을 Ab2 의 상기 CH1 도메인의 C-말단과 연결시킴,
    4 개의 경쇄는 그들의 동족체 중쇄 도메인과 연관된 Ab1 의 경쇄 및 Ab2 의 경쇄를 포함하고;
    여기서 폴리펩티드 링커 서열은 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO: 1) 을 포함하거나 이것으로 이루어지고,
    여기서, 동일 또는 상이한, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은, 임의의 아미노산이고; 단, 링커 서열은 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 5) 또는 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 6) 를 포함하거나 이것으로 이루어지지 않는, 다중특이적 항체, 바람직하게는 이중특이적 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 이 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 인, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 이 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이외의 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 동일 또는 상이한, X1, X2 및 X3 이 Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일 또는 상이한, X4 및 X5 가 세린 (S), 시스테인 (C), 알라닌 (A) 및 글리신 (G) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산인, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 이 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이외의 임의의 아미노산인, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, X4 가 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 인, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, X5 가 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 인, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  12. 제 11 항에 있어서, 동일 또는 상이한, X6, X7, X8, X9, X10 은 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  13. 제 12 항에 있어서, X6 및 X7 은 동일하고, 바람직하게는 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  14. 제 12 항에 있어서, 폴리펩티드 링커 서열이
    EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3);
    EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2); 및
    EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO: 4) 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 및 HER2/neu 둘다를 인지하는, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  16. 제 4 항에 있어서, 상이한, Ab1 및 Ab2 는 한편으로는 세툭시맙 또는 그의 돌연변이 유도체, 및 다른 한편으로는 트라스투주맙 또는 그의 돌연변이 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 다중특이적 항체.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 및 PD-L1 둘다를 인지하는, 다중특이적 항원-결합 단편, 또는 다중특이적 항체.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 정의된 항원-결합 단편의 중쇄 또는 다중특이적 항체의 중쇄를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드.
  19. 제 18 항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제 19 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포.
  21. 제 20 항에 있어서, 2 개의 상이한 경쇄: 상기 중쇄의 제 1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제 1 경쇄; 상기 중쇄의 제 2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제 2 경쇄를 코딩하는 적어도 2 개의 폴리뉴클레오티드로 추가로 형질전환된, 숙주 세포.
  22. 제 21 항에 있어서, 제 1 및 제 2 경쇄와는 상이하고 상기 중쇄의 제 3 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제 3 경쇄를 코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드로 추가로 형질전환된, 숙주 세포.
  23. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 정의된 항원-결합 단편 또는 다중특이적 항체의 제조 방법으로서, 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하고 상기 배양물로부터 상기 항원-결합 단편 또는 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 다중특이적 항원-결합 단편 또는 다중특이적 항체.
  25. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 다중특이적 항원-결합 단편 또는 다중특이적 항체.
  26. 아미노산 서열 EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG (SEQ ID NO: 1) 을 포함하거나 이것으로 이루어지는 폴리펩티드로서,
    여기서, 동일 또는 상이한, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10 은, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 정의된 임의의 아미노산이고; 단, 폴리펩티드는 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 5) 또는 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: 6) 를 포함하거나 이것으로 이루어지지 않는, 폴리펩티드.
  27. 제 26 항에 있어서, 서열이
    EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3);
    EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2); 및
    EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO: 4) 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는, 폴리펩티드.
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