CN112243444A - 具有减少的翻译后修饰的肽接头 - Google Patents

Abstract

本文报道了一种融合多肽，其包含氨基酸序列GnSGmX1X2X3(SEQ ID NO:02)，其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，其中n＝1、2、3或4，其中m＝3、4或5。

Description

具有减少的翻译后修饰的肽接头

本发明属于重组多肽生产领域。本文详细报道了一种新的肽接头，其可减少翻译后修饰，从而产生较少的产物异质性，特别是在融合多肽的重组生产中。

背景技术

在真核细胞中引入重组产生的多特异性抗体使得产生许多不同分子形式。在其中一些分子形式中，使用了域结构，其中使用接头将不同的非自然关联结构域彼此融合。如果旨在重组生产融合多肽，则这种接头必须为可编码的接头，例如肽接头。

肽接头是用于连接不同多肽结构域的合成氨基酸序列。肽接头通常由氨基酸的线性链组成，其中20种天然存在的氨基酸是通过肽键连接的单体结构嵌段。肽接头可以具有1至50个氨基酸残基的长度，在大多数情况下选择3至25个氨基酸残基的长度。肽接头可以包含重复的氨基酸序列。肽接头具有可确保组件由接头连接的功能，可以通过使结构域正确折叠并正确呈现来实现其生物学活性。通常，肽接头是合成肽接头，其被指定为富含甘氨酸残基、谷氨酰胺残基和/或丝氨酸残基。这些残基以最多五个氨基酸的小型重复单元排列，诸如GGGS或GGGGS(分别为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)。小型重复单元可以重复两次至五次以形成多聚体单元，例如(GGGS)₂或(GGGGS)₂。

遗憾的是，在真核宿主细胞中重组生产包含肽接头的融合多肽时，肽接头内的氨基酸残基可以充当体内翻译后修饰的底物。翻译后修饰的添加导致重组产生的融合多肽的异质性增加。因此，可减少或甚至消除翻译后修饰的添加的新肽接头将能够重组生产更同质的融合多肽制剂。

在Spahr等人(MAbs 9(2017)812-819)的发表文献中，报道了GGGGP(SEQ ID NO:18)接头中的羟脯氨酸。

Shi,Y.报道了有关生物化学和结构研究的信息，这些研究促进了对三大类蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶机理的理解，重点在于PP2A(Cell 139(2009)468-484)。

Baslé,E.等人报道了关于内源性氨基酸的蛋白质化学修饰的信息(Chem.Biol.17(2010)213-227)。

在WO 2003/062276中公开了多肽变体，其包含经由柔性多肽接头分子连接的细胞因子的配体结合结构域。

WO 2011/161260公开了抗癌融合蛋白。

WO 2012/088461公开了缺少氨基酸序列GSG的接头肽减少或消除向包含该接头肽的多肽添加翻译后修饰。

WO 2014/085621公开了可用于治疗溶酶体贮积病的治疗性融合蛋白及用于治疗此类疾病的方法。

WO 2015/091130公开了一种用于重组生产可溶形式多肽的方法，该方法包括以下步骤：用编码该多肽的核酸转染真核细胞，由此，该多肽已通过引入一个或多个人工糖基化位点而被修饰(与野生型多肽相比)；在培养基中培养转染的细胞；以及从培养基中回收多肽，由此，与野生型多肽相比，单体多肽的产量(在一个纯化步骤后测定)提高了至少100％。

WO 2016/115511公开了VEGF变体多肽组分。

WO 2011/161260公开了一种融合蛋白，其包含：结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段；和结构域(b)，其为促细胞凋亡效应肽的序列。

WO 2016/120216公开了一种编码包含至少一个细胞外结合结构域的嵌合抗原受体的多肽，该至少一个细胞外结合结构域至少包含由对抗原具有特异性的VH链和VL链形成的scFv，其中所述细胞外结合结构域包含至少一个mAb特异性表位。

Spencer,D.等人公开了重组蛋白中的O-木糖基化针对的是甘氨酸-丝氨酸接头的共同基序(J.Pharm.Sci 102(2013)3920-3924)。

Wen,D.等人公开了对含有(GGGGS)n(SEQ ID NO:17)接头的经工程化的蛋白中的O-木糖基化进行的研究(Anal.Chem.85(2013)4805-4812)。

J.公开了细胞表面和细胞外蛋白质被O-糖基化，其中蛋白质中O-糖基化最丰富的类型是通过糖苷键将GalNAc附着于蛋白质链中的丝氨酸或苏氨酸(Meth.Enzymol.405(2005)139-171)。

Plomp,R.等人公开了人免疫球蛋白G3的铰链区O-糖基化(Mol.Cell.Prot.14(2015)1373-1384)。

US 9,409,960公开了接头肽和包含该接头肽的多肽，其中缺少氨基酸序列GSG的接头肽减少或消除向包含该接头肽的多肽添加翻译后修饰。

发明内容

本发明至少部分基于以下发现：至少缺少C端丝氨酸残基或甚至缺少所有丝氨酸残基从而产生纯甘氨酸接头的甘氨酸-丝氨酸肽接头减少甚至消除向包含该接头肽的融合多肽添加翻译后修饰。为了实现这一点，肽接头的C端多肽不应在其N末端含有丝氨酸残基、苏氨酸残基或脯氨酸残基，即，肽接头之后的第一个氨基酸残基不应是丝氨酸残基、苏氨酸残基或脯氨酸残基。

更具体地，如本文所报道，肽接头减少或甚至消除了向包含这种肽接头的融合多肽添加翻译后修饰(诸如磷酸基团或碳水化合物部分)的酶的能力，例如减少了木糖基转移酶连接木糖与丝氨酸残基的能力。

因此，通过在融合多肽中包含如本文所报道的肽接头，可以增加重组(在真核细胞中)产生的融合多肽组分和制剂的同质性。

本发明的一个方面是包含以下氨基酸序列的融合多肽

GyX1(SEQ ID NO:04)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，并且

其中y是3至25(含)的整数。

在一个实施例中，所述融合多肽包含以下氨基酸序列

GyX1X2X3(SEQ ID NO:05)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，并且

其中y是3至25(含)的整数。

在一个实施例中，y是4至20(含)的整数。

在一个实施例中，y是5至15(含)的整数。

本发明的一个方面是包含以下氨基酸序列的融合多肽

GnSGmX1(SEQ ID NO:01)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽包含以下氨基酸序列

GnSGmX1X2X3(SEQ ID NO:02)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽包含至少三个结构域

其中三个结构域中的每一个独立于其他两个结构域而为长度至少10个氨基酸残基的多肽，并且

其中所述结构域经由肽键彼此缀合。

在本发明所有方面的一个实施例中，第一结构域的C末端经由肽键与第二结构域的N末端缀合，第二结构域的C末端经由肽键与第三结构域的N末端缀合。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽为重组融合多肽。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽是在真核细胞中产生的。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽在SEQ ID NO:01的S或X1处没有翻译后修饰。

在本发明所有方面的一个实施例中，线性融合多肽在SEQ ID NO:01的X1处没有翻译后修饰。

在本发明所有方面的一个实施例中，翻译后修饰为磷酸化(添加磷酸基团)和/或糖基化(添加碳水化合物部分)。在本发明所有方面的一个实施例中，糖基化是木糖基化(碳水化合物部分是木糖)。在本发明所有方面的一个实施例中，糖基化是葡糖基化(碳水化合物部分是葡萄糖)。

在本发明所有方面的一个实施例中，与包含以下氨基酸序列的融合多肽相比，所述融合多肽在残基S和/或X1处具有减少的翻译后修饰：

GnSGmX1X2X3(SEQ ID NO:06)

其中X1为丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

在本发明所有方面的一个实施例中，n为3并且m为3或4。在本发明所有方面的一个优选实施例中，n为3并且m为4。

在本发明所有方面的一个实施例中，n为4并且m为4或5。在本发明所有方面的一个优选实施例中，n为4并且m为5。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽包含以下氨基酸序列

GpSGnSGmX1X2X3(SEQ ID NO:03)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝3或4，

其中m＝3、4或5，并且

其中p＝3或4。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽进一步包含抗体Fc区多肽/至少一个结构域是抗体Fc区多肽。

在本发明所有方面的一个实施例中，第一结构域或/和第三结构域是抗体Fc区多肽。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽进一步包含VH结构域、VL结构域、scFv、scFab、VH-CH1对、VL-CL对、VH-CL对、VL-CH1对、其受体或细胞外结构域、配体的受体结合部分、酶、生长因子、白介素、细胞因子或趋化因子。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽进一步包含选自由以下项组成的组的至少一个结构域：VH结构域、VL结构域、scFv、scFab、VH-CH1对、VL-CL对、VH-CL对、VL-CH1对、其受体或细胞外结构域、配体的受体结合部分、酶、生长因子、白介素、细胞因子和趋化因子。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽为单体的。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述融合多肽为线性融合多肽。

本发明的另一方面是包含至少两个多肽的多聚体分子，所述至少两个多肽中的至少一个多肽是本文所报道的融合多肽。

在本发明所有方面的一个实施例中，所述至少两个多肽通过一个或多个二硫键彼此缀合。

在本发明所有方面的一个实施例中，多聚体分子为抗体。

在本发明所有方面的一个实施例中，多聚体分子为双特异性抗体。

在本发明所有方面的一个实施例中，多聚体分子进一步包含至少一条抗体轻链。

在本发明所有方面的一个实施例中，多聚体分子进一步包含至少一条抗体重链。

本发明的另一方面是药物制剂，其包括至少一种如本文所报道的融合多肽或如本文所报道的多聚体分子和任选地药学上可接受的载体。

本发明的又一方面是核酸分子，其编码如本文所报道的融合多肽。

在本发明所有方面的一个实施例中，核酸分子在表达盒中。

在本发明所有方面的一个实施例中，核酸分子在载体中。

本发明的又一方面是一组核酸分子，其编码本文所报道的多聚体分子的多肽。

在本发明所有方面的一个实施例中，核酸分子中的每一个均在表达盒中。

在本发明所有方面的一个实施例中，核酸分子中的每一个均在载体中。

在本发明所有方面的一个实施例中，核酸分子在相同载体上。

在本发明所有方面的一个实施例中，核酸分子在不同载体上。

在本发明所有方面的一个实施例中，核酸分子在两个载体上。

如本文所报道的又一方面是真核细胞，其包括如本文所报道的核酸分子或如本文所报道的一组核酸分子。

本发明的另一方面是肽接头，其包括氨基酸序列。

GyX1(SEQ ID NO:04)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，以及

其中y是3至25(含)的整数。

本发明的另一方面是肽接头，其包括氨基酸序列。

GyX1X2X3(SEQ ID NO:05)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，并且

其中y是3至25(含)的整数。

在一个实施例中，y是4至20(含)的整数。

在一个实施例中，y是5至15(含)的整数。

本发明的另一方面是肽接头，其包括氨基酸序列。

GnSGmX1(SEQ ID NO:01)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

本发明的另一方面是肽接头，其包括氨基酸序列。

GnSGmX1X2X3(SEQ ID NO:02)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

本发明的另一方面是肽接头，其包括氨基酸序列。

GpSGnSGmX1X2X3(SEQ ID NO:03)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，

其中m＝3、4或5，并且

其中p＝3或4。

本发明的另一方面是用于生产融合多肽的方法，其包括以下步骤：

-在表达融合多肽的条件下培养根据本发明的真核细胞，以及

-从真核细胞或培养基中回收融合多肽。

从而产生融合多肽。

本发明的另一方面是生产具有减少的翻译后修饰水平的融合多肽的方法，其包括：

-在表达融合多肽的条件下培养根据权利要求38所述的宿主细胞，以及

-从所述真核细胞或培养基中回收所述融合多肽，

从而产生具有减少的翻译后修饰水平的融合多肽。

本发明的又一方面是生产稳定的融合多肽的方法，所述方法包括对融合蛋白进行基因改造以使其包括本发明的肽接头，并使融合多肽由真核细胞表达，从而产生稳定的融合多肽。

本发明的又一方面是通过根据本发明的方法制备的组合物。

本发明的又一方面是治疗受试者的方法，所述受试者将从根据本发明的融合多肽或根据本发明的多聚体分子的治疗中受益，所述方法包括向受试者施用根据本发明的组合物。

本发明的又一方面是用于治疗疾病或病症的根据本发明的组合物的用途。

本发明的又一方面是用于药物生产的根据本发明的组合物的用途。

本发明的一个方面进一步是用作药物的根据本发明的融合多肽或根据本发明的多聚体分子。

本发明的又一方面是根据本发明的融合多肽或根据本发明的多聚体分子在药物生产中的用途。

本发明的最后一个方面是治疗需要治疗的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的根据本发明的融合多肽或根据本发明的多聚体分子。

具体实施方式

本发明至少部分基于以下发现：使用缺少C端丝氨酸残基的甘氨酸-丝氨酸肽接头会减少或甚至消除对所述肽接头的翻译后修饰的添加，特别是当肽接头包括在融合多肽中时。为了实现这一点，肽接头的C端多肽也不应在其N末端包含丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸。

更具体地，本文所报道的肽接头减少将二级修饰(诸如磷酸基团或碳水化合物部分)连接至包括此类肽接头的融合多肽的酶的能力，例如，减少木糖基转移酶将木糖连接至多肽的能力。

因此，通过在融合多肽中使用如本文所报道的肽接头，可以增加重组(在真核细胞中)产生的融合多肽组合物和制剂的同质性。

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文称为“根据Kabat编号”。具体地，将Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat的EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，其在本文中通过在这种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”而进一步分类)。

必须注意的是，如在本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括本领域技术人员已知的多个此类细胞及其等同物，等等。同样，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。

还应注意，术语“包括”、“包含”和“具有”可以互换使用。

对于本领域技术人员，将氨基酸序列(例如，肽接头或融合多肽)转化为相应的编码核酸序列的程序和方法是众所周知的。因此，核酸通过其由单独核苷酸组成的核酸序列表征，并且同样地，由其编码的肽接头或融合多肽的氨基酸序列表征。

重组DNA技术的使用使得能够生成核酸的衍生物。此类衍生物可以，例如，通过置换、改变、交换、缺失或插入而在单个或若干核苷酸位置上来修饰。修饰或衍生化可以，例如，通过定点诱变的方式实施。此类修饰可以由本领域技术人员容易地实施(参见，例如，Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,USA；Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acidhybridization–a practical approach(1985)IRL Press,Oxford,England)。

用于实施本发明的有用方法和技术描述于，例如，Ausubel,F.M.(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology,Volumes I to III(1997)；Glover,N.D.和Hames,B.D.编辑，DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(1985),OxfordUniversity Press；Freshney,R.I.(编辑)，Animal Cell Culture–a practicalapproach,IRL Press Limited(1986)；Watson,J.D.等人，Recombinant DNA，第二版，CHSLPress(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.编辑，Cell Biology，第二版，Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique，第二版，Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。

术语“约”表示其后跟随数值的+/-20％的范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后跟随数值的+/-10％的范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后跟随数值的+/-5％的范围。

本文所用的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们表现出所期望的抗原结合活性即可。例如，天然存在的IgG抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N端至C端，每条重链均具有可变结构域(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变区，随后为三个恒定重链结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链均具有可变结构域(VL)，亦称为可变轻链结构域或轻链可变区，随后为恒定轻链(CL)结构域。

在某些实施例中，融合多肽的至少一个结构域是抗体片段。术语“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包括保留与抗原特异性结合能力的完整抗体的一部分。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、单链Fab(scFab)、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(dAb)。关于某些抗体片段的综述，参见Holliger和Hudson，NatureBiotechnology 23(2005)1126-1136。

在一个实施例中，抗体片段是Fab、Fab'、Fab'-SH或F(ab')2片段，特别是Fab片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自包含重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为VH和VL)以及轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，术语“Fab片段”是指包括VL结构域和CL结构域的轻链以及包括VH结构域和CH1结构域的重链片段的抗体片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基端添加残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是Fab'片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。关于对包括补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

在另一实施例中，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等人在《自然医学》(Nat.Med.)9:129-134(2003)中还描述了三体抗体和四体抗体。

在又一实施例中，抗体片段是单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和肽接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N端至C端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述肽接头是至少30个氨基酸，优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab片段可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如，根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。

在一个实施例中，抗体片段是具有结构域交叉的Fab片段。如本文所用，术语“结构域交叉”表示在抗体重链VH-CH1片段及其相应的同源抗体轻链对中，即在抗体结合臂中(即在Fab片段中)，结构域序列偏离天然序列是因为至少一个重链结构域由其相应的轻链结构域置换，反之亦然。结构域交叉有三种常见类型：(i)CH1和CL结构域的交叉，其导致具有VL-CH1结构域序列的结构域交叉轻链和具有VH-CL结构域序列的结构域交叉重链片段(或具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)；(ii)VH和VL结构域的结构域交叉，其导致具有VH-CL结构域的结构域交叉轻链和具有VL-CH1结构域序列的结构域交叉重链片段；以及(iii)完整轻链(VL-CL)和完整VH-CH1重链片段的结构域交叉(“Fab交叉”)，其导致具有VH-CH1结构域序列的结构域交叉轻链和具有VL-CL结构域序列的结构域交叉重链片段(所有上述结构域序列均以N端至C端方向表示)。

如本文所用，相对于相应的重链和轻链结构域的术语“彼此取代”是指前述结构域交叉。如此，当CH1和CL结构域“彼此取代”时，是指在第(i)项中提到的结构域交叉以及所得的重链和轻链结构域序列。因此，当VH和VL“彼此取代”时，是指在第(ii)项中提到的结构域交叉；以及当CH1和CL结构域“彼此取代”并且VH1和VL结构域“彼此取代”时，是指在第(iii)项中提到的结构域交叉。包括结构域交叉的双特异性抗体，例如，在WO 2009/080251、WO2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA 108(2011)11187-11192中报道。

根据本发明的融合多肽还可以包括Fab片段，所述Fab片段包括如在以上第(i)项中所述的CH1和CL结构域的结构域交叉，或如在以上第(ii)项中所述的VH和VL结构域的结构域交叉。与相同抗原特异性结合的Fab片段构造为具有相同结构域序列。因此，在多特异性抗体中包含多个具有结构域交叉的Fab片段的情况下，所述Fab片段与相同抗原特异性结合。

“分离的”融合多肽是已从其天然环境的组分中分离的一种融合多肽。在一些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定，将融合多肽纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

“分离的”核酸是指已从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，包含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以微量存在)之外，包括该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。

抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

术语“N-连接的寡糖”表示通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺连接的方式，在天冬酰胺氨基酸残基处与肽主链连接的寡糖。N-连接的寡糖也称为“N-聚糖”。所有N-连接的寡糖均具有共同五糖核心Man3GlcNAc2。它们的不同之处在于外周糖(诸如N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖和唾液酸)的存在及其支链(也称为触角)的数量。任选地，该结构还可以包含核心岩藻糖分子和/或木糖分子。N-连接的寡糖与天冬酰胺或精氨酸侧链的氮附着。N-糖基化基序，即N-糖基化位点，包括Asn-X-Ser/Thr共有序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，N-糖基化位点中的氨基酸残基可以是Asn-X-Ser/Thr共有序列中的任何氨基酸残基，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。在一个实施例中，是N-糖基化位点Asn、Ser或Thr中的氨基酸残基。

术语“O-连接的寡糖”表示在苏氨酸或丝氨酸氨基酸残基处与肽主链连接的寡糖。在一个实施例中，是O-糖基化位点Ser或Thr中的氨基酸残基。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91页)单一VH或VL结构域可以足赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。

如本文所用，术语“翻译后修饰”通常表示翻译后对多肽进行的修饰。翻译后修饰的非限制性实例是细胞中(即体内)官能团(诸如乙酸盐、磷酸盐、脂质或碳水化合物)与多肽的附着。

更详细地，术语“翻译后修饰”表示生物合成后多肽内氨基酸残基的共价修饰。通过修饰现有官能团或引入新官能团，可以在氨基酸侧链上进行翻译后修饰。不同蛋白氨基酸的已知翻译后修饰为，例如，

Ala：N-乙酰化

Arg：去亚胺基化，甲基化

Asn：脱酰胺，N-连接的糖基化

Asp：异构化

Cys：二硫键形成，氧化，N-乙酰化

Gln：环化

Glu：环化，γ-羧化

Gly：N-肉豆蔻酰化，N-乙酰化

His：磷酸化

Lys：乙酰化，泛素化，甲基化，羟基化

Met：N-乙酰化，氧化

Pro：羟基化和随后的进一步修饰

Ser：磷酸化，O-连接的糖基化

Thr：磷酸化，O-连接的糖基化，N-乙酰化

Trp：氧化

Tyr：磷酸化

Val：N-乙酰化。

本文所用的术语“糖基化”表示一个或多个碳水化合物部分与多肽内的氨基酸残基的共价连接。通常，糖基化是翻译后事件，其可以在细胞的细胞内环境或细胞提取物中发生。术语糖基化包括，例如，在糖基化的共有位点处添加一个或多个碳水化合物部分。糖基化的一个实例涉及添加一个或多个木糖残基至多肽。例如，用于木糖添加的共有序列包括序列[D/E GSG D/E]。术语“O-糖基化”表示一个或多个碳水化合物部分与多肽中氨基酸残基的侧链中的氧原子(诸如与丝氨酸或苏氨酸的氧)共价连接。

术语“磷酸化”表示磷酸基团(PO₄)与多肽内氨基酸残基的共价连接。通常，磷酸化是翻译后事件，其可以在细胞的细胞内环境或细胞提取物中发生。术语磷酸化包括，例如，添加磷酸基团至丝氨酸的游离羟基。

如果多肽要用于治疗，则这些多肽的同质性很重要。出人意料地，如本文所证明，已发现融合多肽中肽接头的氨基酸序列的改变会减少或消除所述肽接头的C末端处的翻译后修饰。减少或甚至消除翻译后添加的修饰改善多肽的同质性。

如本文所用，术语“多肽”表示包括通过肽键彼此缀合的十个或更多个(高达650个)天然存在的氨基酸残基的聚合物。

如本文所用的术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala(三字母代码)或A(单字母代码))、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。

如本文所用，术语“肽接头”表示连接(connect/link)两个多肽序列，例如，将两个多肽结构域融合在一起的合成氨基酸序列。然后，肽接头本身代表第三结构域。因此，包括根据本发明的肽接头的融合多肽包括至少三个结构域：第一(第一多肽)结构域、第二(肽接头)结构域和第三(第二多肽)结构域。如本文所用，术语“合成的”表示非天然存在的氨基酸序列。因此，在一个实施例中，根据本发明的肽接头是合成的肽接头。

本发明的肽接头经由肽键连接两个氨基酸序列。在本发明方面的一个实施例中，本发明的肽接头以线性序列将第一生物活性多肽(第一结构域)连接至第二多肽(第三结构域)。在本发明方面的另一实施例中，肽接头连接两个生物活性多肽。

在融合多肽的背景下，“线性序列”或“序列”表示融合多肽中的氨基酸在氨基端至羧基端方向(N端至C端方向)上的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。

如本文所用，术语“缀合的”、“连接的”、“融合的”或“融合”可以互换使用。这些术语是指通过重组方式将两个或更多个多肽或结构域接合在一起。如本文所用，术语“基因融合的”、“基因连接的”或“基因融合”表示通过在真核细胞中重组表达编码融合多肽的单一核酸分子，两个或更多个多肽经由它们各自的肽主链共线、共价连接或附着。此类基因融合导致单一连续基因序列的表达。优选的基因融合在框内，即以维持原始ORF的正确阅读框的方式，将两个或更多个开放阅读框(ORF)融合以形成连续的更长ORF。因此，所得重组融合多肽是包含两个或更多个多肽结构域的单一多肽，所述两个或更多个多肽结构域对应于由原始ORF编码的多肽(其区段不是彼此天然缀合)。

本发明的肽接头与本领域的传统Gly/Ser(Gs)-肽接头的不同之处在于，目前要求保护的肽接头至少缺少C端丝氨酸氨基酸残基，并且在其后紧接的下一个氨基酸残基不应是丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸氨基酸残基。

如本文所用，术语“gly-ser接头”或“GS-肽接头”表示由甘氨酸和丝氨酸残基组成的多肽。示例性gly/ser-肽接头包括氨基酸序列(Gly₄Ser)_n。在本发明所有方面的一个实施例中，肽接头包括或由具有一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加的GS-肽接头和缺少C端丝氨酸残基的GS-肽接头组成。

在本发明方面的一个实施例中，本发明的融合多肽是“嵌合”多肽。此类嵌合融合多肽包括通过根据本发明的肽接头(第二结构域)的方式连接至第二氨基酸序列(第三结构域)的第一氨基酸序列(第一结构域)，所述第一氨基酸序列在天然界并不与所述第二氨基酸序列天然连接。可以存在于分离蛋白中或可以存在于相同蛋白中但彼此分开的第一和第三结构域多肽的氨基酸序列以新排列方式在融合多肽中结合在一起。例如，可以通过创建并翻译其中结构域以所期望的关系编码的多核苷酸来产生嵌合融合多肽。示例性嵌合融合多肽包括包含本发明的肽接头的融合多肽。

包括本发明的肽接头的融合多肽可以是单体的或多聚体的。例如，在一个实施例中，本发明的融合多肽是二聚体或四聚体。

在本发明方面的一个实施例中，本发明的融合多肽的二聚体是同源二聚体，其包括两个相同的本发明的单体融合多肽。

在本发明方面的另一实施例中，本发明的融合多肽的二聚体是异二聚体，其包括两个不同的单体亚基，其中至少一个单体亚基是根据本发明的融合多肽。

在本发明方面的另一实施例中，本发明的融合多肽的四聚体是异四聚体，其包括至少三个不同的单体亚基，其中至少一个单体亚基是根据本发明的融合多肽。

在某些实施例中，除了包括根据本发明的一个或多个肽接头以外，融合多肽还可以在融合多肽内的其他位置处包括一个或多个传统的GS-肽接头。

根据本发明方面的融合多肽包括至少一个生物活性部分。生物活性部分是指具有以下一种或多种能力的部分：在生物学背景下将分子定位或靶向至所期望的位点或细胞、执行功能、执行作用或反应。例如，术语“生物活性部分”是指与生物系统的组分(例如，血清中或细胞表面上或细胞基质中的蛋白)结合并且结合产生生物效应(例如，通过活性部分和/或其结合的组分的变化来进行测量(例如，细胞中或受试者体内活性部分和/或与其结合的组分的裂解、信号的传递或者生物反应的增强或抑制))的生物活性分子或其部分。

示例性生物活性部分包括，例如，抗体分子或其部分的抗原结合片段(例如，F(ab)、scFv、VH结构域或VL结构域)(例如，用作靶向部分或赋予、诱导或阻断生物反应)、受体的配体结合部分或配体的受体结合部分以及Fc区多肽、完整的Fc区、scFc结构域、酶等。此外，如本文所用，术语“生物活性部分”包括，例如，当以单体形式单独存在时可能不具有活性，但是在二聚分子的背景下与第二部分配对时具有生物学活性的部分。

在本发明方面的一个实施例中，本发明的融合多肽在其至少一个融合结构域中包括结合位点，或该结合位点通过融合多肽中结构域的融合获得。如本文所用的术语“结合结构域”或“结合位点”表示介导与靶分子(例如，抗原、配体、受体、底物或抑制剂)特异性相互作用的多肽的部分、区域或位点。示例性结合结构域包括抗原结合位点(例如，VH或VL结构域或其配对)或包括此类结合位点的分子(例如，抗体)、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构域或催化结构域。

在本发明方面的一个实施例中，融合多肽包括(具有)至少一个与靶标特异性结合的结合结构域。在本发明方面的一个实施例中，结合结构域包括或由抗原结合位点组成(例如，包括可变重链结构域和可变轻链结构域或来自抗体的至少六个CDR或至少其仅包括分离的VH或VL或三个CDR的功能部分。在本发明方面的一个实施例中，结合结构域充当靶向部分。

在本发明方面的一个实施例中，融合多肽是修饰的抗体链或修饰的抗体。如本文所用，术语“修饰的抗体链”和“修饰的抗体”包括抗体链或抗体的合成形式，例如，其通过改变天然结构域结构、序列或数目而经过改变以使得它们不是天然存在的。例如，包括与scFv分子接合的重链分子等。此外，术语“修饰的抗体”包括抗体的多价形式(例如，与相同抗原的三个或更多个拷贝结合的三价抗体、四价抗体等)。

在本发明所有方面的一个实施例中，融合多肽包括Fc区，或其结构域或Fc区多肽。

术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”是由Fc-受体结合介导的功能，并且是指在效应细胞存在下通过如本文所报道的抗体来裂解靶细胞。在一个实施例中，通过在效应细胞(诸如从血沉棕黄层新鲜分离的PBMC(外周血单个核细胞)或纯化的效应细胞，如单核细胞或NK(自然杀伤)细胞)存在的情况下，使用包括如本文所报道的融合多肽的抗体处理表达CD19的红系细胞(例如，表达重组人CD19的K562细胞)的制剂来测量ADCC。靶细胞以51Cr加以标记，随后与抗体孵育。将标记的细胞与效应细胞孵育，并分析上清液中释放的51Cr。对照包括将靶内皮细胞与效应细胞孵育，但不与包括融合多肽的抗体孵育。通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA)的细胞)的结合来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。在一个实施例中，测量与NK细胞上的FcγR的结合。

术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体种类而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。

Fc受体结合依赖性效应子功能可以通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用加以介导，所述Fc受体是造血细胞上的特化细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已示出可以通过免疫复合物的吞噬作用来介导去除抗体包被的病原体，并经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来介导裂解红细胞和以相应抗体包被的各种其他细胞靶标(例如，肿瘤细胞)(参见，例如，Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991),511-524)。FcR通过其对免疫球蛋白同种型的特异性来进行定义：用于IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc-受体结合，例如，如Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner,J.E.等人，Ann.Hematol.76(1998)231-248所述。

针对IgG抗体(FcγR)的Fc区的受体交联可触发多种效应子功能，所述多种效应子功能包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和炎性介质释放，以及免疫复合物清除和抗体产生的调控。在人体中，已表征出三类FcγR，它们是：

-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。在Fc区IgG中，在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329中的至少一处(根据Kabat的EU索引编号)的修饰减少与FcγRI的结合。位于233–236位的IgG2残基置换为IgG1和IgG4，与FcγRI的结合减少了10³倍，并消除人单核细胞对抗体致敏红血球的应答(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)，

-FcγRII(CD32)以中至低亲和力结合复合的IgG，并得到广泛表达。该受体可以分为两种亚型，FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA是在参与杀伤的许多细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上发现的，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且是在B-细胞、巨噬细胞上以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上发现的。在B细胞上，所述FcγRIIB似乎起到抑制进一步产生免疫球蛋白并且抑制同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB可以抑制通过FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞中，B型可能通过IgE与其各自的受体结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现对FcγRIIA的结合减少，例如，对于包括具有在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414中的至少一处的突变的IgG Fc区的抗体(根据Kabat的EU索引编号)，

-FcγRIII(CD16)以中至低亲和力结合IgG，并以两种类型存在。FcγRIIIA是在NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上发现的，并介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上高度表达。发现与FcγRIIIA的结合减少，例如，对于包括具有在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376中的至少一处的突变的IgG Fc区的抗体(根据Kabat的EU索引编号)。

人IgG1上对Fc受体的结合位点的图谱，上述突变位点和用于测量与FcγRI和FcγRIIA的结合的方法如Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604所述。

药剂(例如，药物制剂)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所期望的治疗或预防结果的量。

如本文所用，术语“Fc-受体”是指活化受体，其特征在于，存在与受体相关联的细胞质ITAM序列(参见，例如，Ravetch,J.V.和Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。此类受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。术语“不结合FcγR”表示在抗体浓度为10μg/ml时，如本文所报道的抗体与NK细胞的结合是如WO 2006/029879中报道的抗OX40L抗体LC.001的结合的10％或更少。

本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，该C端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。Fc区是两个Fc区多肽的二聚体。

抗体的Fc区直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与C1q的结合由Fc区中限定的结合位点引起。此类结合位点在现有技术中是已知的，并且，例如，由Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434所述。此类结合位点是，例如，L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常示出补体活化、C1q结合和C3活化，而IgG4不活化补体系统、不结合C1q并且不活化C3。

“抗体的Fc区”是技术人员熟知的术语，并且基于抗体的木瓜蛋白酶裂解来定义。在一个实施例中，Fc区是人Fc区。在一个实施例中，Fc区是人IgG4亚类，其包括突变S228P和/或L235E(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施例中，Fc区是人IgG1亚类，其包括突变L234A、L235A和任选的P329G(根据Kabat的EU索引编号)。

如本文所用，术语“Fc区多肽”表示在木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区中开始的单一免疫球蛋白重链的部分(即IgG中的残基216，将重链恒定区的第一残基带至114)，并在抗体的C末端终止。因此，完整的Fc区多肽至少包括铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。如本文所用，术语“Fc区”表示类似于天然抗体的Fc区的二聚化Fc区多肽(例如，无论是以传统的双多肽链形式还是作为单链Fc区制备)。

如本文所用，术语“Fc区多肽部分”包括Fc区多肽的氨基酸序列或衍生自Fc区多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，Fc区多肽部分包括以下项中的至少一个：铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或其变体、部分或片段。在其他实施例中，Fc区多肽部分包括完整的Fc区多肽(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一个实施例中，Fc区多肽部分包括与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在另一个实施例中，Fc区多肽部分包括与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在另一个实施例中，Fc区多肽部分由CH3结构域或其部分组成。在另一个实施例中，Fc区多肽部分由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在另一个实施例中，Fc区多肽部分由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在另一个实施例中，Fc区多肽部分由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在一个实施例中，Fc区多肽部分缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。

在一个实施例中，Fc区多肽包括FcRn结合所需的本领域已知的Fc区的至少一部分，在本文中称为新生儿受体(FcRn)结合配偶体。FcRn结合配偶体是可以由FcRn受体特异性结合的分子或其部分，其随后由FcRn结合配偶体的FcRn受体进行主动转运。特异性结合是指形成在生理条件下相对稳定的复合物的两个分子。特异性结合的特征在于高亲和力和低至中能力，这与通常具有低亲和力和中至高能力的非特异性结合不同。

通常，当亲和常数KA高于10⁶M^-1，或更优选地高于10⁸M^-1时，则认为结合具有特异性。

FcRn受体已从包括人在内的若干哺乳动物种属中分离。已知人FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列(Story等人，J.Exp.Med.180(1994)2377)。FcRn受体在相对低pH值下结合IgG(但不结合其他免疫球蛋白类别，诸如IgA、IgM、IgD和IgE)，在腔内向浆膜方向主动跨细胞转运IgG，然后在组织液中发现pH值相对较高时释放IgG。

FcRn结合配偶体涵盖可以由FcRn受体特异性结合的分子，其包括完整的IgG、IgG的Fc区以及包括FcRn受体的完整结合区的其他片段。已经基于X射线晶体学描述了与FcRn受体结合的IgG的Fc区的部分(Burmeister等人，Nature 372(1994)379)。Fc与FcRn的主要接触区域在CH2和CH3结构域的接合处附近。Fc-FcRn接触全部在单一Ig重链多肽内。FcRn结合配偶体包括完整IgG、IgG的Fc区、单一Fc区多肽和包括FcRn的完整结合区的IgG其他片段。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。

本发明的融合多肽包括至少一种本发明的肽接头。在一个实施例中，融合多肽包括介于1个与10个之间的肽接头(含)。在一个实施例中，本发明的融合多肽中存在两个或更多个肽接头。在另一个实施例中，本发明的融合多肽包括1、2、3或4个本发明的肽接头。

本发明的肽接头可以在给定位置出现一次，或者可以在同一融合多肽内的不同位置出现多次。

本发明的肽接头由本领域技术人员修饰，使得C端丝氨酸氨基酸被去除或由甘氨酸残基取代，条件是来自融合多肽的下一个氨基酸残基不是丝氨酸、苏氨酸、或脯氨酸氨基酸残基。

本发明的肽接头可以具有不同的长度。在一个实施例中，本发明的肽接头的长度为约6个至约75个氨基酸。在另一个实施例中，本发明的肽接头的长度为约6个至约50个氨基酸。在另一个实施例中，本发明的肽接头的长度为约10个至约40个氨基酸。在另一个实施例中，本发明的肽接头的长度为约15个至约35个氨基酸。在另一个实施例中，本发明的肽接头的长度为约15个至约20个氨基酸。在另一个实施例中，本发明的肽接头的长度为约15个氨基酸。

本发明的肽接头的位置可以取决于其连接的融合多肽的结构域而变化。尽管本文公开了包括肽接头的融合多肽的不同具体实例，但应理解，肽接头至少可以位于重组融合多肽中肽接头目前所定位的任何位置。肽接头在蛋白工程中如此频繁地使用，以至于它们已成为合成生物学中的标准装配部分。

当前本领域公认的肽接头用途的一些实例包括在以下方面中的用途中：scFv分子(Freund等人，FEBS 320(1993)97)、单链免疫球蛋白分子(Shun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)7995)、微抗体(Hun等人，Cancer Res.56(1996)3055)、CH2结构域缺失的抗体(Mueller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87(1990)5702)、单链双特异性抗体(Schertz等人，Cancer Res.65(2005)2882)、全长IgG类双特异性抗体(Marvin等人，Acta Pharm.Sin.26(2005)649,Michelson等人，MAbs 1(2009)128,Routt等人，Prot.Eng.Des.Sell.23(2006)221)、scFv融合蛋白(Degree等人，Brit.J.Canc.86(2002)811)、开发蛋白片段互补测定(Remy等人，BioTechniques 42(2008)137)和scFc分子(WO2008/143954)。

肽接头可以附着至多肽的N末端或C末端(或两者)，其中它们用于与其他多肽融合。

在另一个实施例中，本发明的肽接头可用于基因融合两个生物活性多肽(每个生物活性多肽均为结构域)，其中每个多肽均单独具有生物学活性。

在另一个实施例中，本发明的肽接头用于使两个多肽彼此融合，其中两个多肽均不单独具有生物学活性，而当基因融合时则具有生物学活性。

例如，在一个实施例中，本发明的肽接头可用于基因融合scFv分子中的VH和VL：A-L-B，其中A是VH或VL，B是VH或VL，并且L是根据本发明的肽接头或A-L-B-L，其中A是VH或VL，B是VH或VL，并且L是根据本发明的肽接头。

在另一个实施例中，肽接头可用于将生物活性多肽与完整的Fc区、Fc区多肽、Fc区多肽部分或scFc区基因融合：C-L-Fc，其中C是生物活性多肽，L是根据本发明的肽接头，并且Fc是Fc区(例如，单链或传统的双多肽链)、Fc区多肽、Fc区多肽部分或scFc区。例如，在一个实施例中，C包括scFv分子(例如，包括VH-L-VL或VL-L-VH，其中L是肽接头)，并且Fc由Fc区多肽(铰链-CH2-CH3结构域)或scFc区组成，从而形成scFv-Fc融合蛋白或scFv-scFc融合蛋白。在另一个实施例中，C包括scFv分子(例如，包括VH-L-VL或VL-L-VH，其中L是肽接头，并且Fc是CH3结构域，从而形成微抗体。在另一个实施例中，C包括两个串联的scFv分子和作为CH3结构域的Fc区多肽部分，从而形成四价微抗体。

四价微抗体还可以使用以下形式形成：A-L-B-L-Fc-L-A-L-B，其中A和B各自是VH或VL结构域中的一个，L是根据本发明的肽接头，并且Fc是CH3结构域或scFc区。

在另一个实施例中，本发明的融合多肽可以具有以下形式：D-L-A-L-B，其中D是完整的抗体分子，L是根据本发明的肽接头，并且A和B各自是VH或VL结构域。此类构建体产生C端四价抗体分子。

在另一个实施例中，本发明的融合多肽可以具有以下形式：A-L-B-L-D，其中D是完整的抗体分子，L是根据本发明的肽接头，并且A和B各自是VH或VL结构域。此类构建体产生N端四价抗体分子。在此类构建体中，分子的A-L-B(scFv)部分可以与轻链或重链可变区基因融合。

在另一个实施例中，本发明的肽接头可用于将CH3结构域与铰链区融合。在另一个实施例中，本发明的肽接头可用于将CH3结构域与CH1结构域融合。在又一个实施例中，根据本发明的肽接头可以用作介于铰链区与CH2结构域之间的间隔。根据本发明的肽接头的优选位置在Fc区或Fc区多肽与scFv或Fab之间。

在多肽中包括多于一个结合位点的情况下，应该理解的是，此类分子可以是单特异性的或多特异性的，即结合位点可以相同或可以不同。

可以使用本领域已知的技术将肽接头引入多肽序列。可以通过DNA序列分析来确认修饰。质粒DNA可用于转换宿主细胞以用于稳定产生所产生的多肽。

本发明的融合多肽包括至少一种生物活性多肽(结构域)。此类多肽可以作为单一分子而具有生物学活性，或者可能需要与另一多肽缔合(例如，当经由肽接头与第二多肽连接时或当存在于多肽二聚体中时)。

在一个实施例中，本发明的融合多肽仅包括一个生物活性多肽(结构域)(创建在该生物活性多肽方面为单体的分子，但是在多肽链数方面，该分子可以为单体的或二聚体的)。在另一个实施例中，本发明的融合多肽包括多于一个生物活性多肽(结构域)，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个生物活性多肽。

如本文所用，术语“生物活性多肽”并不意在包括可以通过化学手段添加至多肽的化学效应部分(例如，毒性部分、可检测的部分等)。

在本发明的一个实施例中，生物活性多肽经由根据本发明的肽接头可操作地连接至Fc区多肽的N末端或其部分。在另一个实施例中，生物活性多肽经由根据本发明的肽接头可操作地连接至Fc区多肽的C末端。

在其他实施例中，两个或更多个生物活性多肽彼此连续连接(例如，经由根据本发明的肽接头)。在一个实施例中，串联的生物活性多肽排列经由根据本发明的肽接头可操作地连接至Fc区多肽的C末端或N末端或其部分。

在一个实施例中，本发明的融合多肽包括抗原结合位点(例如，抗体、抗体变体或抗体片段的抗原结合位点)、配体的受体结合部分或受体的配体结合部分中的至少一个。

在一个实施例中，生物活性多肽包括抗原结合位点。

在某些实施例中，本发明的融合多肽具有至少一个对靶分子具有特异性的结合位点，其介导生物效应。在一个实施例中，结合位点调节细胞的活化或抑制(例如，通过与细胞表面受体结合并导致活化或抑制信号的传递)。在一个实施例中，结合位点能够引发信号转导，其导致细胞死亡(例如，通过细胞信号诱导的途径、通过补体固定或暴露于结合分子上存在的有效载荷(例如，毒性有效载荷))，或其调节受试者体内的疾病或病症(例如，通过介导或促进细胞杀伤、通过促进纤维蛋白凝块裂解或促进凝块形成或者通过调节可生物利用的物质的量(例如，通过增加或减少受试者体内的配体(诸如TNF)的量))。在另一个实施例中，本发明的融合多肽具有至少一个对于所要减少或消除的抗原(例如细胞表面抗原或可溶性抗原)具有特异性的结合位点。

在另一个实施例中，本发明的融合多肽与靶分子(例如，抗原)的结合导致靶分子，例如，从组织或循环中减少或消除。

在另一个实施例中，融合多肽具有至少一个对靶分子具有特异性的结合位点，并且可以用于检测靶分子的存在(例如，检测污染物或诊断病情或病症)。

在又一个实施例中，本发明的融合多肽包括至少一个结合位点，所述至少一个结合位点将分子靶向受试者体内的特定位点(例如，肿瘤细胞、免疫细胞或血凝块)。

在某些实施例中，本发明的融合多肽可以包括两个或更多个生物活性多肽。在一个实施例中，生物活性多肽相同。在另一个实施例中，生物活性多肽不同。

在某些特定的实施例中，本发明的融合多肽是多特异性的，例如，具有与分子的第一分子或表位结合的至少一个结合位点，以及与第二分子或与第一分子的第二表位结合的至少一个第二结合位点。本发明的多特异性结合分子可以包括至少两个结合位点。在某些实施例中，本发明的多特异性结合分子的至少一个结合位点是抗体或其抗原结合片段(例如，抗体或抗原结合片段)的抗原结合区。

提供了以下实例和附图以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中阐明。应该理解的是，在不脱离本发明的精神的前提下，可以对提出的程序进行修改。

实例概述：

融合蛋白1–HC1-F：

融合蛋白1包含两个肽接头，所述两个肽接头在N端至C端方向上将第一非IgG蛋白与第二非IgG蛋白和IgG重链结构域连接。已发现融合蛋白1在接头GGGGSGGGGSRE SEQ IDNO:09中具有C端末端丝氨酸残基的磷酸化(参见图1-8)。除磷酸化外，还存在木糖基化。所述磷酸化导致+79Da的质量偏移。所述木糖基化导致+132Da的质量偏移。图1示出去糖基化和还原的HC1-F的去卷积总质谱图。除了预期的HC1-F，还可以看到表明存在强+79Da HC1-F产物变体的另一个峰。通过对HC1-F的胰蛋白酶消化物进行LC-MS分析，证实该修饰存在于SEQ ID NO:09的接头中。图3示出HC1-F的(A)未修饰的(洗脱时间36.5分钟)和(B)+79.97Da修饰的(洗脱时间37.6分钟)胰蛋白酶甘氨酸-丝氨酸接头肽(X9GGGGSGGGGSR；SEQ ID NO:07)的提取离子流(EIC)色谱图(z＝2和3)。通过以HC1-F的三重质子化未修饰的和+79.97Da修饰的胰蛋白酶消化的甘氨酸-丝氨酸连接肽的碰撞诱导解离而使用离子阱MS/MS分析，以及以三重质子化修饰肽的电子转移/高能碰撞解离而使用MS/MS分析，已证实额外的79.97Da定位于肽接头的C端丝氨酸残基上(参见图4)。通过加标合成多肽和酶促去磷酸化进一步确认这一点(图5和图6)。通过使用嗜热菌蛋白酶消化和LC-MS/MS，磷酸化作用可以特异性地定位于融合蛋白1的甘氨酸-丝氨酸接头I(参见图7和图8)。

为了减少HC1-F融合蛋白的异质性，通过使用不同的残基取代肽接头的末端丝氨酸残基，而不是用脯氨酸或苏氨酸，优选地使用甘氨酸或通过简单地删除残基来去除翻译后修饰，条件是下一个残基，即与肽接头融合的多肽的第一个残基也不是丝氨酸残基、苏氨酸残基或脯氨酸残基。

融合蛋白2–HC2-F：

融合蛋白2包括一个肽接头，该肽接头将抗体重链的C末端与抗体轻链的缩短的N末端连接。已发现HC2-F在接头SLSLPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQM SEQ ID NO:10中以丝氨酸残基的O-糖基化表达(参见图9-图13)。图9示出在还原和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后的HC2-F上的O-木糖基化和O-糖基化。在图10中从HC2-F获得的提取离子色谱图中，在包括甘氨酸丝氨酸接头的肽SLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTX13(SEQ ID NO:10)中鉴别出O-聚糖。使用EThcD/HCD MS²确认GalNAc(+203Da)和GalNAc-Gal-Neu5Ac(+656Da)在GS肽接头的C端丝氨酸残基处的定位(图11和图12)。图13示出对于HC2-F，相对于未修饰的和O-木糖基化的肽的总和，SEQ ID NO:10的HC肽片段的O-聚糖的相对定量。

为了减少HC2-F融合蛋白的异质性，通过使用不同的残基取代肽接头的末端丝氨酸残基，而不是用脯氨酸或苏氨酸，优选地使用甘氨酸或通过简单地删除残基来去除翻译后修饰，条件是下一个残基，即与肽接头融合的多肽的第一个残基也不是丝氨酸残基、苏氨酸残基或脯氨酸残基。

融合蛋白3–LC3-F：融合蛋白3包括一个将抗体轻链与抗体Fc区连接的肽接头。已发现LC3-F在接头GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK SEQ ID NO:11中以苏氨酸残基的O-糖基化表达(参见图14-图16)。图14B示出在完整蛋白的N-去糖基化和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后在HEK细胞中产生的LC3-F上的O-糖基化。GalNAc-Gal-2NeuAc(+948Da)修饰量化为约20％的含量。图14C示出在完整蛋白的N-去糖基化、脱唾液酸化和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后的完整LC3-F。图14D证明在还原的融合蛋白3的N-去糖基化、脱唾液酸化和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后，O-糖基化定位于LC3-F的A链。

图15示出LC3-F内切蛋白酶消化物(衍生自艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)；OpeRATOR；Genovis)的去卷积质谱图。图16示出使用(上部XIC)或不使用(下部XIC)OpeRATOR蛋白酶进行脱唾液酸化和胰蛋白酶消化后的LC3-F的XIC。片段的质量对应于铰链区苏氨酸残基的O-糖基化。使用OpeRATOR蛋白酶消化的脱唾液酸化胰蛋白酶肽的MS/MS，其将O-糖基化定位于N端苏氨酸残基(图17)。

为了减少LC3-F融合蛋白的异质性，通过取代与肽接头融合的多肽的第一残基即苏氨酸残基，而不是使用脯氨酸或丝氨酸，优选地使用甘氨酸，来去除翻译后修饰。

在LC3-F的变体中，接头末端的苏氨酸残基被删除并由甘氨酸残基置换，使得接头包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGCPPC SEQ ID NO:23。图21示出在完整蛋白的N-去糖基化和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后的LC3-F变体。图22示出在N-去糖基化、还原和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后的LC3-F变体。LC3-F变体中不存在O-糖基化。

融合蛋白4–HC4-F：

融合蛋白4包括将非IgG蛋白与抗体Fc区连接的肽接头。已发现HC4-F在接头LGGGGSGGGGSRT SEQ ID NO:14中以丝氨酸残基的O-岩藻糖基化表达(参见图18-19)。图18示出对于在嗜热菌蛋白酶消化后的HC4-F，存在O-岩藻糖基化(+146Da)，并且该O-岩藻糖基化可以通过肽图(XIC)定位于肽LGGGGSGGGGSRT(SEQ ID NO:14)。图19示出对于HC4-F，将修饰的合成肽(27-310nM)X8LGGGGSGGGGS(+海藻糖)RT(SEQ ID NO:15)加标至胰蛋白酶消化物中的结果。修饰的合成肽与修饰的HC4-F胰蛋白酶肽X8LGGGGSGGGGSRT+146Da共洗脱，并增加曲线下面积。示出的是未加标的XIC(上图)和加标的水平增加(下图)。LC-MS/MS胰蛋白酶肽定位将O-岩藻糖基化定位于末端丝氨酸残基(图20)。为了减少HC4-F融合蛋白的异质性，通过使用不同的残基取代肽接头的末端丝氨酸残基，而不是用脯氨酸或苏氨酸，优选地使用甘氨酸或通过简单地删除残基来去除翻译后修饰，条件是下一个残基，即与肽接头融合的多肽的第一个残基也不是丝氨酸残基、苏氨酸残基或脯氨酸残基。

具体实施例：

1.一种融合多肽，其包括氨基酸序列

GyX1 (SEQ ID NO:04)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，以及

其中y是3至25(含)的整数。

2.根据实施例1的融合多肽，其中所述融合多肽包括氨基酸序列

GyX1X2X3 (SEQ ID NO:05)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，并且

其中y是3至25(含)的整数。

3.根据实施例1至2中任一项的融合多肽，其中y是4至20且包括4至20的整数。

4.根据实施例1至3中任一项的融合多肽，其中y是5至15且包括4至20的整数。

5.一种融合多肽，其包括氨基酸序列

GnSGmX1X2X3 (SEQ ID NO:02)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

6.根据实施例1至5中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽包括至少三个结构域

其中三个结构域中的每一个独立于其他两个结构域而为长度至少10个氨基酸残基的多肽，并且

其中所述结构域经由肽键彼此缀合。

7.根据实施例6的融合多肽，其中第一结构域的C末端经由肽键与第二结构域的N末端缀合，并且第二结构域的C末端经由肽键与第三结构域的N末端缀合。

8.根据实施例1至7中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽为重组融合多肽。

9.根据实施例1至8中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽是在真核细胞中产生的。

10.根据实施例1至9中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽分别在SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:04的S或X1处没有翻译后修饰。

11.根据实施例1至10中任一项的融合多肽，其中线性融合多肽在SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:04的X1处没有翻译后修饰。

12.根据实施例10至11中任一项的融合多肽，其中翻译后修饰是磷酸化(添加磷酸基)和/或糖基化(添加碳水化合物部分)。

13.根据实施例12的融合多肽，其中糖基化是木糖基化(碳水化合物部分是木糖)。

14.根据实施例12的融合多肽，其中糖基化是葡糖基化(碳水化合物部分是葡萄糖)。

15.根据实施例5至14中任一项的融合多肽，其中与包括以下项的融合多肽相比，所述融合多肽在残基S和/或X1处的翻译后修饰减少：

GpSGnSGmX1X2X3 (SEQ ID NO:06)

其中X1为丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，

其中p＝n或p＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

16.根据实施例5至15中任一项的融合多肽，其中n＝3且m＝3或4。

17.根据实施例5至15中任一项的融合多肽，其中n＝3且m＝4。

18.根据实施例5至15中任一项的融合多肽，其中n＝4且m＝4或5。

19.根据实施例5至15中任一项的融合多肽，其中n＝4且m＝5。

20.根据实施例1至19中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽包括氨基酸序列

GpSGnSGmX1X2X3 (SEQ ID NO:03)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，

其中m＝3、4或5，并且

其中p＝3或4。

21.根据实施例1至20中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽进一步包括抗体Fc区多肽/至少一个结构域是抗体Fc区多肽。

22.根据实施例6至21中任一项的融合多肽，其中第一或/和第三结构域是抗体Fc区多肽。

23.根据实施例1至22中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽进一步包含VH结构域、VL结构域、scFv、scFab、VH-CH1对、VL-CL对、VH-CL对、VL-CH1对、其受体或细胞外结构域、配体的受体结合部分、酶、生长因子、白介素、细胞因子、或趋化因子/根据实施例2至18中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽的至少一个结构域选自由以下项组成的组：VH结构域、VL结构域、scFv、scFab、VH-CH1对、VL-CL对、VH-CL对、VL-CH1对、其受体或细胞外结构域、配体的受体结合部分、酶、生长因子、白介素、细胞因子和趋化因子。

24.根据实施例1至23中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽为单体的。

25.根据实施例1至24中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽为线性融合多肽。

26.一种多聚体分子，其包括至少两个多肽，其中至少一个多肽是根据实施例1至25中任一项的融合多肽。

27.根据实施例26的多聚体分子，其中至少两个多肽通过一个或多个二硫键彼此缀合。

28.根据实施例26至27中任一项的多聚体分子，其中所述多聚体分子为抗体。

29.根据实施例26至28中任一项的多聚体分子，其中所述多聚体分子为双特异性抗体。

30.根据实施例26至29中任一项的多聚体分子，其进一步包含至少一条抗体轻链。

31.根据实施例26至30中任一项的多聚体分子，其进一步包含至少一条抗体重链。

32.一种药物组合物，其包括至少一种根据实施例1至25中任一项的融合多肽或根据实施例26至31中任一项的多聚体分子和任选地药学上可接受的载体。

33.一种核酸分子，其编码根据实施例1至26中任一项的融合多肽。

34.根据实施例33的核酸分子，其中所述核酸分子在表达盒中。

35.根据实施例34至35中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子在载体中。

36.一组核酸分子，其编码根据实施例26至31中任一项的多聚体分子的多肽。

37.根据实施例36的一组核酸分子，其中核酸分子中的每一个均在表达盒中。

38.根据实施例36至37中任一项的一组核酸分子，其中核酸分子中的每一个均在载体中。

39.根据实施例36至37中任一项的一组核酸分子，其中所述核酸分子在相同载体上。

40.根据实施例36至37中任一项的一组核酸分子，其中所述核酸分子在不同载体上。

41.根据实施例36至37中任一项的一组核酸分子，其中所述核酸分子在两个载体上。

42.一种真核细胞，其包括根据实施例33的核酸分子或根据实施例36的一组核酸分子。

43.一种肽接头，其包括氨基酸序列

GyX1 (SEQ ID NO:04)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，以及

其中y是3至25(含)的整数。

44.一种肽接头，其包括氨基酸序列

GyX1X2X3 (SEQ ID NO:05)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，并且

其中y是3至25(含)的整数。

45.根据实施例43至44中任一项的肽接头，其中y是4至20且包括4至20的整数。

46.根据实施例43至45中任一项的肽接头，其中y是5至15且包括4至20的整数。

47.一种肽接头，其包括氨基酸序列

GnSGmX1X2X3 (SEQ ID NO:01)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，并且

其中m＝3、4或5。

48.一种肽接头，其包括氨基酸序列

GpSGnSGmX1X2X3 (SEQ ID NO:03)

其中X1可以是除丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸以外的任何氨基酸残基，

其中X2和X3可以是彼此独立的任何氨基酸残基，

其中n＝1、2、3或4，

其中m＝3、4或5，并且

其中p＝3或4。

49.根据实施例47至48中任一项的融合多肽，其中n＝3且m＝3或4。

50.根据实施例47至49中任一项的融合多肽，其中n＝3且m＝4。

51.根据实施例47至48中任一项的融合多肽，其中n＝4且m＝4或5。

52.根据实施例47至48和51中任一项的融合多肽，其中n＝4且m＝5。

53.一种生产融合多肽的方法，包括以下步骤：

-在表达融合多肽的条件下培养根据实施例42的真核细胞，以及

-从真核细胞或培养基中回收融合多肽。

从而产生融合多肽。

54.一种生产具有减少的翻译后修饰水平的融合多肽的方法，其包括：

-在表达融合多肽的条件下培养根据实施例42的宿主细胞，以及

-从所述真核细胞或培养基中回收所述融合多肽，

从而产生具有减少的翻译后修饰水平的融合多肽。

55.一种生产稳定的融合多肽的方法，所述方法包括对融合蛋白进行基因改造以使其包括实施例43至52中任一项的肽接头，并使融合多肽由真核细胞表达，从而产生稳定的融合多肽。

56.根据实施例53至55中任一项的方法制备的组合物。

57.一种治疗受试者的方法，所述受试者将从根据实施例1至25中任一项的融合多肽或根据实施例26至31中任一项的多聚体分子的治疗中获益，所述方法包括向受试者施用实施例32或56中任一项的组合物。

58.根据实施例32或56中任一项的组合物用于治疗疾病或病症的用途。

59.根据实施例32或56中任一项的组合物用于药物生产的用途。

60.根据实施例1至25中任一项的融合多肽或根据实施例26至31中任一项的多聚体分子用作药物。

61.根据实施例1至25中任一项的融合多肽或根据实施例26至31中任一项的多聚体分子在药物生产中的用途。

62.一种治疗需要治疗的个体的方法，包括向个体施用有效量的根据实施例1至25中任一项的融合多肽或根据实施例26至31中任一项的多聚体分子。

附图说明

图1示出融合蛋白的总质量测定，该融合蛋白包括在人胚胎肾细胞中瞬时表达的抗体重链恒定结构域和非抗体多肽(HC1-F)。示出去糖基化和还原的HC1-F的去卷积质谱。除了预期的HC1-F，还可以看到表明存在强+79Da HC1-F产物变体的另一个峰。由于+132Da木糖产物变体，也存在较低信号强度。

图2示出HC1-F的示意图。HC1-F由两个>10kDa的非IgG蛋白组成，这些非IgG蛋白通过两个标准甘氨酸-丝氨酸[(G4S)2]接头I和II与IgG重链恒定域融合。

图3示出HC1-F的(A)未修饰的(洗脱时间36.5分钟)和(B)+79.97Da修饰的(洗脱时间37.6分钟)胰蛋白酶消化的甘氨酸-丝氨酸接头肽(X9GGGGSGGGGSR；SEQ ID NO:07)的提取离子流(EIC)色谱图(z＝2和3)。集成EIC色谱图的相对比较将修饰量量化为5.5％(包括1.1％，含O-木糖)。MA，人工积分峰；NL，归一化强度水平。

图4示出通过HC1-F的三重质子化(A)未修饰的和(B)+79.97Da修饰的胰蛋白酶消化的甘氨酸-丝氨酸接头肽的碰撞诱导解离而获得的离子阱MS/MS数据，以及(C)通过三重质子化修饰肽的电子转移/高能碰撞解离的MS/MS光谱。额外的79.97Da定位于C端丝氨酸残基。

图5示出将合成磷酸肽加标至胰蛋白酶消化物的效应。(A)不具有、(B)具有0.5μM和(C)具有1.0μM加标的合成磷酸肽(X9GGGGSGGGGpSR；SEQ ID NO:08)的HC1-F的未修饰的和+79.97Da修饰的胰蛋白酶消化的接头肽(X9GGGGSGGGGSR；SEQ ID NO:07)的提取离子流色谱图(z＝2和3)。加标样品显示磷酸化肽的峰面积增加，这证明了正确鉴别修饰的胰蛋白酶肽。NL，归一化强度水平。

图6示出使用碱性磷酸酶对HC1-F的经修饰的胰蛋白酶消化的接头肽进行的酶促去磷酸化的结果。未修饰的和+79.97Da修饰的胰蛋白酶连接肽(X9GGGGSGGGGSR；SEQ IDNO:07)的提取离子流色谱图(z＝2和3)(A)与碱性磷酸酶孵育和(B)与碱性磷酸酶孵育(对照反应)。酶促去磷酸化后，无法再检测出修饰的胰蛋白酶肽。NL，归一化强度水平。

图7示出特异性磷酸化发生在甘氨酸-丝氨酸接头I。HC1-F的(A)未修饰的(洗脱时间12.5分钟)和磷酸化(洗脱时间13.5分钟)嗜热菌蛋白酶消化的甘氨酸-丝氨酸接头I肽(XGGGGSGGGGSREX3；SEQ ID NO:09)的提取离子流色谱图(EIC)(z＝2)。集成EIC色谱图的相对比较将修饰量量化为11.3％(包括在GSG基序处含O-木糖的1.4％(未示出数据))。在(B)和(C)中分别示出双重质子化未修饰的和修饰的嗜热菌蛋白酶消化的甘氨酸-丝氨酸接头I肽的Orbitrap HCD-MS/MS数据。+79.97Da修饰定位于C端丝氨酸残基。MA，人工积分峰；NL，归一化强度水平。

图8示出在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达的HC1-F中的接头磷酸化。(A)未修饰的(洗脱时间15.6分钟)和磷酸化(洗脱时间16.85分钟)嗜热菌蛋白酶消化甘氨酸-丝氨酸接头I肽(XGGGGSGGGGSREX3；SEQ ID NO:09)的提取离子流(EIC)色谱图(z＝2)。将磷酸化肽的量量化为0.4％。(B)双重质子化修饰的嗜热菌蛋白酶消化肽的HCD-MS/MS数据。MA，人工积分峰；NL，归一化强度水平。

图9示出在还原和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后，融合蛋白2(在CHO细胞中产生；HC2-F)上的O-木糖基化和O-糖基化。

图10是使用HC2-F获得的：通过Fc-N-聚糖诱导的主要信号(RT 16分钟，62至66分钟)。对于包括甘氨酸丝氨酸接头的肽SLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTX13(SEQ ID NO:10)，鉴别出O-聚糖(RT 43至46分钟)。

图11示出对于HC2-F，包括具有O-聚糖和肽鉴别的图10的O-糖基化的肽片段的MS/MS。

图12示出对于HC2-F，用于SEQ ID NO:10的肽的MS/MS的结果。使用EThcD/HCD MS²允许将GalNAc(+203Da)和GalNAc-Gal-Neu5Ac(+656Da)定位于GS肽接头的C端丝氨酸残基。除此之外，若干O-木糖位点(+132Da)可能定位于肽接头中的其他丝氨酸残基。

图13示出对于HC2-F，相对于未修饰的和O-木糖基化的肽的总和，SEQ ID NO:10的HC肽片段的O-聚糖的相对定量。

图14A示出在完整蛋白的通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后，融合蛋白3(LC3-F；在HEK细胞中产生)上的O-糖基化。图14B示出包括在HEK细胞中产生的LC3-F的N-去糖基化的完整蛋白的去卷积质谱，图14C示出包括LC-3F的N-去糖基化和脱唾液酸化的完整蛋白的去卷积质谱，并且图14D示出N-去糖基化和LC3-F的还原的去卷积质谱。列出了N-去糖基化完整蛋白或LC-3F的带注释变体的确定分子量(注释：B:+364.8Da(GalNAc-Gal)，+656.8Da(GalNAc-Gal-Neu5Ac)，+948.2Da(GalNAc-Gal-2Neu5Ac)，+1313.1Da(2xGalNAc-Gal-Neu5Ac)，+1602.2Da(GalNAc-Gal-Neu5Ac和GalNAc-Gal-2Neu5Ac)，+1896.7(2xGalNAc-Gal-2Neu5Ac)。C:+365.7Da(GalNAc-Gal)，+731.0Da(2xGalNAc-Gal)和链A(C:+365.5Da(GalNAc-Gal),+729.8Da(2xGalNAc-Gal))。GalNAc(正方形)、Gal(圆圈)和Neu5Ac(菱形)。GalNAc-Gal-2NeuAc(+948Da)修饰量化为约20％的含量。

图15示出对于LC3-F，OpeRATOR消化物的去卷积质谱图。片段的质量对应于铰链区苏氨酸残基的O-糖基化。OpeRATOR衍生自艾克曼菌，并在大肠杆菌中表达。该酶包含His标签，分子量为42kDa。

图16示出使用(上部XIC)或不使用(下部XIC)OpeRATOR蛋白酶进行脱唾液酸化和胰蛋白酶消化后的LC3-F的XIC。可以看出O-糖基化(+365.13Da＝GalNAc-Gal)按以下序列(带下划线)GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK(SEQ ID NO:11)定位于苏氨酸残基，即GS肽接头的C末端(通过肽图分析(LC-MS/MS)来鉴别)。示出的是在O-糖基化苏氨酸残基处消化的O-糖基化胰蛋白酶肽(T(+365.13)C(+59.01)PPC(+59.01)PAPEAAGGPSVFLFPPKP；SEQ ID NO:12)和未修饰的胰蛋白酶肽(XX(+59.01)GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGTC(+59.01)PPC(+59.01)PAPEAAGGPSVFLFPPKPK；SEQ ID NO:13)的XIC。+59.01＝羧甲基化。

图17示出对于LC3-F，使用OpeRATOR蛋白酶消化的脱唾液酸化胰蛋白酶肽的MS/MS，其将O-糖基化(+365.13Da＝GalNAc-Gal)定位于N端苏氨酸残基。+59.01＝羧甲基化。

图18示出对于在嗜热菌蛋白酶消化后的融合蛋白4(HC4-F)，存在O-岩藻糖基化(+146Da)，并且可以通过肽图分析(LC-MS/MS)定位于肽LGGGGSGGGGSRT(SEQ ID NO:14)。示出的是修饰的(下部XIC，2.06％)和未修饰的(上部XIC)嗜热菌蛋白酶消化肽片段的XIC。

图19示出对于HC4-F，将修饰的合成肽(27-310nM)X8LGGGGSGGGGS(+海藻糖)RT(SEQ ID NO:15)加标至胰蛋白酶消化物中的结果。修饰的合成肽与修饰的HC4-F胰蛋白酶肽X8LGGGGSGGGGSRT+146Da共洗脱，并增加曲线下面积。示出的是未加标的XIC(上图)和加标的水平增加(下图)。

图20示出对于HC4-F，胰蛋白酶肽的MS/MS结果，该胰蛋白酶肽将O-岩藻糖基化(+146Da)定位于C端丝氨酸残基。

图21示出对于LC3-F的变体，在完整蛋白的N-去糖基化和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后的质谱图(上图为全标尺，下图为放大图)。在具有包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGCPPC(SEQ ID NO:23)的接头的LC3-F的变体中，不存在O-糖基化。

图22示出对于LC3-F变体，在还原蛋白的N-去糖基化和通过UHR-QTOF-ESI-MS分析后的质谱图(上图为全标尺，下图为放大图)。在具有包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGCPPC(SEQ ID NO:23)的接头的LC3-F的变体中，不存在O-糖基化。

实例

样品概述：

融合蛋白1–HC1-F：在接头GGGGSGGGGSRE SEQ ID NO:09中具有丝氨酸残基的磷酸化(参见图1-图8)

融合蛋白2–HC2-F：在接头SLSLPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQM SEQ ID NO:10中具有丝氨酸残基的O-糖基化(参见图9-图13)

融合蛋白3–LC3-F：在接头GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKSEQ ID NO:11中具有苏氨酸残基的O-糖基化(参见图14-图17)

融合蛋白4–HC4-F：在接头LGGGGSGGGGSRT SEQ ID NO:14中具有丝氨酸残基的O-岩藻糖基化(参见图18-图20)

融合蛋白4–HC4-F的变体：在包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGCPPC(SEQ ID NO:23)的接头中没有O-糖基化(参见图21-图22)。

来自牛肠粘膜的胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、神经氨酸酶和碱性磷酸酶购自Sigma-Aldrich。

合成肽(HPLC纯度为98％)在Biosyntan GmbH处合成。

PNGase F是从Roche Diagnostics GmbH，Custom Biotech获得的。

OpeRATOR蛋白酶是从Genovis AB(Lund，Sweden；OpeRATOR是一种O-蛋白酶，该OpeRATOR在S/T糖基化位点N端消化O-糖基化的蛋白；OpeRATOR发挥其酶促活性需要O-聚糖的存在)获得的。

实例1：

酶促消化

UHR-ESI-QTOF-MS

使用PNGase F(存在或不存在神经氨酸酶)将融合蛋白去糖基化，在100mM TCEP中还原，并使用40％乙腈和2％甲酸(v/v)作为流动相，在Sephadex G25 5x250 mm色谱柱(Amersham Biosciences)上通过HPLC脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上通过ESI-QTOF MS测定总质量。使用ESI-L低浓度Tuning Mix(Agilent Technologies)执行校准。为了使结果可视化，使用软件工具将m/z光谱转换为去卷积质谱。

OpeRATOR消化

在还原、变性和羧甲基化之前，将融合蛋白使用PNGase F进行N-去糖基化，并使用神经氨酸酶进行脱唾液酸化，最后按照供应商(OpeRATOR，Genovis AB，Sweden)的说明使用O-聚糖特异性内切蛋白酶消化。通过UHR-ESI-QTOF-MS来分析消化物。

实例2：

UPLC-MS/MS肽图分析

融合蛋白变性并在0.3M的Tris-HCl(包括6M盐酸胍和20mM二硫苏糖醇(DTT))(pH8)中在37℃下还原1小时。此后，通过添加40mM碘乙酸(C13:99％)(Sigma-Aldrich)将融合蛋白烷基化，并在室温下避光孵育15分钟。通过向反应混合物中进一步添加20mM DTT灭活过量的碘乙酸。使用NAP5凝胶过滤柱对烷基化的融合蛋白进行缓冲液交换。然后使用胰蛋白酶在50mM Tris-HCl(pH 7.5)中将融合蛋白在蛋白水解下在37℃下消化16小时(有或没有OpeRATOR蛋白酶)。通过添加甲酸至0.4％(v/v)来终止反应。使用嗜热菌蛋白酶在25mMTris-HCl、1mM CaCl₂(pH 8.3)中，在25℃下执行消化30分钟，然后通过添加EDTA至8mM来终止消化。消化后的样品储存在-80℃下，并使用联接至TriVersa NanoMate(Advion)和Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Fisher Scientific)的NanoAcquity UPLC(Waters)通过UPLC-MS/MS进行分析。以5μL的体积进样约2.4μg消化的融合蛋白。使用60μL/分钟的流速，将色谱分离通过在Acquity BEH300 C18色谱柱(1x150mm，1.7μm，

(Waters))上反相执行。流动相A和B分别在UPLC级水和乙腈中含0.1％(v/v)甲酸。使用的柱温为50℃，在90分钟内流动相B梯度为1％至40％，然后增加至99％流动相B持续2分钟，并在1％流动相B处进行6分钟的再平衡步骤。在两次进样之间使用50分钟梯度执行两次流动相A的进样以防止样品间残留。使用TriVersa NanoMate将流出物在柱后分流，并将纳升的流动部分导入质谱仪。

使用Orbitrap质量分析仪获取高分辨率MS质谱图，并在启用动态排除的情况下并行检测离子阱中CID MS/MS碎片离子谱(重复计数为1，排除时间为15s(±10ppm))。Orbitrap Fusion在数据依赖模式下使用。

MS设置为：完整MS(AGC：2x10⁵，分辨率：6x10⁴，m/z范围：300-2000，最大进样时间：100ms)；MS/MS(AGC：1x10⁴，最大进样时间：100ms，分离宽度：2Da)。归一化碰撞能量设置为35％，活化p：0.25，分离宽度：2Da，

对于仅获取HCD MS/MS谱图的方法，在对Orbitrap进行全MS扫描后，对丰度最高的离子进行多达20次HCD Orbitrap MS/MS谱图。用于MS/MS实验的AGC设置为5x10⁴，最大进样时间为500ms。将归一化的碰撞能量设置为20％，并在Orbitrap中以15x10³的分辨率设置检测出HCD碎片离子。所有其他设置均与仅使用CID碎片的方法所描述的相同。

基于HCD和ETD作为数据依赖碎片技术的互补EThcD方法涉及使用Orbitrap质量分析仪获取的全扫描MS，以及分别在离子阱和Orbitrap质量分析仪中并行检测ETD和HCD碎片离子光谱。为了使用尽可能多的数据依赖的MS/MS扫描来完整扫描，设置固定的循环时间。

完整MS：与CID和HCD相同的设置。

对于HCD，MS/MS设置与上面列出的相同。

对于ETD，MS/MS设置如下：反应时间设置为50ms，ETD试剂靶标：1x10⁶，最大进样时间：200ms。使ETD补充活化。补充活化碰撞能量设置为25％。AGC靶标设置为1×10⁴，前体分离宽度为2Da，最大进样时间设置为250ms。

使用预处理选项和PepFinder软件(Thermo Fisher Scientific)，使用PEAKSstudio 6.0和7.5软件(Bioinformatics Solutions Inc.)来对LC-MS/MS数据和翻译后修饰(PTM)鉴别执行分析。使用XCalibur软件(Thermo Fisher Scientific)来执行手动数据解读和定量。使用GPMAW(Lighthouse数据)计算理论质量，并使用8ppm的质量公差以最强的同位素质量生成XIC。

实例3：

合成肽的加标

基于计算量的修饰肽，将一定量的合成肽加标至胰蛋白酶消化物。如前所述，通过LC-MS/MS来分析有或没有加标合成肽的2.4μg胰蛋白酶消化物。

实例4：

酶促去磷酸化

通过冻干～62μg胰蛋白酶消化物，来执行+79.97Da修饰的胰蛋白酶接头肽的酶促去磷酸化。将肽重悬于25μL 100mM Tris-HCl、5mM MnCl₂(pH 8.0)中，并与250单位的碱性磷酸酶在37℃下孵育1h。消化后的样品储存在-80℃下。如前所述进行MS分析。

容易理解的是，如本文通常描述的实施例是示例性的。所呈现的一些实施例的详细描述以及所呈现的实例并非旨在限制本公开的范围，而仅是各实施例的代表。而且，在不脱离本公开的范围的情况下，可由本领域技术人员改变本文公开的方法的步骤或动作的顺序。换言之，除非实施例的正确操作需要特定的步骤或动作顺序，否则可以修改特定步骤或动作的顺序或使用。

Claims (8)

1.一种线性融合多肽，其包括第一多肽结构域、肽接头和第二多肽结构域，其中

-所述第一多肽结构域的C末端经由肽键与所述肽接头的N末端缀合，并且所述肽接头的C末端经由肽键与所述第二多肽结构域的N末端缀合，

-所述肽接头是缺少C端丝氨酸氨基酸残基的Gly/Ser肽接头，

-所述第二多肽结构域在其N末端包含除丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸以外的任何氨基酸残基，并且

-所述第一多肽结构域或所述第二多肽结构域是抗体Fc区多肽，并且相应的其他多肽选自由以下项组成的组：VH结构域、VL结构域、scFv、scFab、VH-CH1对、VL-CL对、VH-CL对、VL-CH1对、其受体或细胞外结构域、配体的受体结合部分、酶、生长因子、白介素、细胞因子或趋化因子。

2.根据权利要求1所述的线性融合多肽，其中所述线性融合多肽包含氨基酸序列

GnSGmX1(SEQ ID NO:02)

其中GnSGm是n＝3或4并且m＝3或4的肽接头，

其中X1是第二多肽的N端氨基酸残基。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的线性融合多肽，其中所述线性融合多肽与其中第二多肽结构域在其N末端具有丝氨酸或苏氨酸或脯氨酸的融合多肽相比具有减少的O-糖基化。

4.一种多聚体分子，其包括至少两个多肽，其中至少一个多肽是根据权利要求1至3中任一项所述的线性融合多肽。

5.根据权利要求4所述的多聚体分子，其中所述多聚体分子是抗体。

6.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的融合多肽。

7.一种真核细胞，其包括根据权利要求6所述的核酸分子。

8.一种生产具有减少的O-糖基化水平的线性融合多肽的方法，其包括：

-在表达所述融合多肽的条件下培养根据权利要求7所述的宿主细胞，以及

-从所述真核细胞或培养基中回收所述融合多肽，

从而产生具有减少的O-糖基化水平的融合多肽。

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