CN102958940A

CN102958940A - 抗癌融合蛋白

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Publication number: CN102958940A
Application number: CN2011800314145A
Authority: CN
Inventors: J·S·皮耶奇克兰; S·D·帕夫拉克; B·M·泽雷克; K·K·莱姆克
Original assignee: Adamed Sp zoo
Current assignee: Adamed Sp zoo
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-06-24
Also published as: PL391627A1; EA023005B1; CN102958940B; PL2585480T3; WO2011161260A1; SG186439A1; CA2800841C; HK1178908A1; HRP20150241T1; CA2800841A1; DK2585480T3; CY1116099T1; US9102759B2; MX2012015246A; DK2585480T5; BR112012032708A2; IL223640A; EP2585480A1; US20130164254A1; JP5911481B2

Abstract

融合蛋白，尤其是重组的融合蛋白，其包含结构域（a）和结构域（b），结构域（a）是可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少70%序列同源性的序列；结构域（b）是促细胞凋亡效应子肽的序列，结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端和/或N末端。所述融合蛋白具有抗癌活性。编码所述融合蛋白的核苷酸序列，用于制备所述融合蛋白的表达载体和宿主细胞，以及所述融合蛋白用于治疗癌症疾病的用途。

Description

抗癌融合蛋白

本发明涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本发明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白的序列片段和短的促细胞调亡肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。

细胞调亡（程序性细胞死亡）是在预防癌症和治疗癌症（使用诱导异常癌细胞的细胞调亡的试剂）中具有重要作用的过程。

细胞调亡的信号传导可以起源于细胞外部（外部或死亡受体途径）或起源于细胞内部（内部或线粒体途径）。

人类癌细胞中的外部细胞调亡途径的激活需要配体与细胞死亡受体结合以激活受体。在配体结合之后，激活的受体诱导细胞调亡信号。

通过线粒体途径的细胞内的内部细胞调亡的起始可以起始于不同水平的细胞调亡级联以最终引起促细胞调亡蛋白(细胞色素c、SmacDiablo、AIF、p53、Bcl2蛋白家族，包括BH3结构域家族)的功能的诱导或恢复，核酸降解或胱天蛋白酶的激活。

TRAIL蛋白属于细胞因子家族（肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体），也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。

TRAIL蛋白通过与促细胞调亡TRAIL表面受体1和2（TRAIL-R1/R2）结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5（死亡受体4和死亡受体5），属于TNF受体家族并且在不同类型的癌症细胞上过表达。所述受体的激活可诱导独立于抑制基因p53的外部细胞调亡信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起Bid蛋白的释放，从而间接激活线粒体途径，Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。

TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞对该蛋白是抗性的。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时不影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。

TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，其包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。同样，对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL（rhTRAIL）（在INN下称作dulanermin）的人类临床研究显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。

近期的研究显示TRAIL蛋白可具有比氨基酸114-281更短的形式，以这种形式也能结合DR家族的膜受体（死亡受体DR1、DR2、DcR1、DcR2和OPG)并通过这些受体诱导细胞调亡(F.,FANG,A.,WANG,S.,F.,YANG,Antitumor activity of a novel recombinant mutanthuman tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,ActaPharmacologica Sinica2005Nov;26(11):1373–1381)。

最近报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签相关，非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。

然而，在进一步研究和开发的过程中，很多癌症细胞似乎也显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性（见例如WO2007/022214）。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在不同水平的TRAIL诱导的细胞调亡途径表现其自己，从细胞表面上的受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶。这种抗性限制了TRAIL作为抗癌试剂的有用性。

此外，在对患者进行的临床试验中证明，TRAIL作为单一治疗的实际有效性是低下的。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(WO2009/002947;A.Almasan and A.Ashkenazi,CytokineGrowth Factor Reviews14(2003)337-348;RK Srivastava,Neoplasis,Vol3,No6,2001,535-546,Soria JC et al.,J.Clin.Oncology,Vol28,No9(2010),p.1527-1533)。在WO2009/140469中描述了rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡铂)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。

包含通过金属蛋白酶切割位点连接子连接的血管生成抑制剂血管抑制素(vasostatin)和TRAIL的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示出诱导细胞调亡的效应，见A.I.Guo et al,ChineseJournal of Biochemistry and Molecular Biology2008,vol.24(10),925-930。

包含血管生成抑制剂肿瘤抑素(tumstatin)的Tumstatin183-230和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为显示出诱导胰腺癌细胞的细胞调亡，见N.Ren et al,Academic Journal of Second MilitaryMedical University2008,vol.28(5),676-478。

US2005/244370和对应的WO2004/035794公开了TRAIL95-281的构建体，其作为效应子结构域，通过肽连接子与作为细胞表面结合结构域的TNF家族配体的另一成员CD40的细胞外部分连接。其指出该构建体的激活是通过其CD40部分的结合。

此外，与TRAIL治疗相关的问题已被证明是其低稳定性和在施用后从体内迅速被消除。

虽然目前可获得很多临床癌症治疗法，但是它们通常不够有效并且具有很多熟知的缺点，其中最令人苦恼和限制治疗的缺点之一是缺乏针对癌细胞的选择性、严重的副作用和抗性——原发性的或在治疗过程中获得的。目前，仅已知有限数目的既有效又对癌细胞具有选择性的抗癌试剂。因此，对于能够扩大可用的试剂的范围并发现更有效（细胞毒性）和选择性的试剂的需求仍然是迫切的和未满足的。也需要具有增强的稳定性和改善的药代动力学的新的选择性试剂。

本发明提出了解决该问题的方案：提供了新的融合蛋白，其包含源自TRAIL的结构域和具有内部（细胞内）或外部（细胞外）促细胞调亡活性的短的效应子肽结构域，所述短的效应子肽结构域不包括TRAIL片段，其增强或补充TRAIL的作用。此外，在很多情况下，本发明的融合蛋白被证明显示出比可溶性TRAIL及其变体（包括序列的片段）更强的活性，在很多情况下还克服了对于TRAIL的抗性。此外，效应子肽的加入引起了延长的半衰期和蛋白在肿瘤中的延长的保留并最终增强了其功效。

附图说明

现在将通过阅读附图详细描述本发明。

图1显示了根据Ex.1、Ex.2、Ex.3、Ex.4和Ex.5的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图2显示了根据Ex.6、Ex.7、Ex.8、Ex.9和Ex.10的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图3显示了根据Ex.11、Ex.12、Ex.13、Ex.14和Ex.15的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图4显示了根据Ex.16、Ex.17、Ex.18、Ex.19和Ex.20的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图5显示了根据Ex.21、Ex.22和Ex.23的本发明的融合蛋白以及Ex.24、Ex.25和Ex.26的比较性融合蛋白的示意性结构。

图6显示了根据Ex.27、Ex.28、Ex.29、Ex.30和Ex.31的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图7显示了根据Ex.32、Ex.33、Ex.34、Ex.35和Ex.36的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图8显示了根据Ex.37、Ex.38、Ex.39、Ex.40和Ex.41的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图9显示了根据Ex.42、Ex.43、Ex.44、Ex.45和Ex.46的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图10显示了根据Ex.47、Ex.48、Ex.49、Ex.50和Ex.51的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图11显示了根据Ex.52、Ex.53、Ex.54和Ex.55的本发明的融合蛋白的示意性结构。

图12显示了负载了结肠癌Colo205、以本发明的融合蛋白治疗的SCID/NOD小鼠中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图13显示了负载了结肠癌Colo205、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第29天的肿瘤生长抑制值，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图14显示了负载了人肺癌NCI-H460、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图15显示了负载了人肺癌NCI-H460、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第29天的肿瘤生长抑制，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图16显示了负载了人小细胞肺癌A549、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图17显示了负载了人小细胞肺癌A549、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第34天的肿瘤生长抑制，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图18显示了负载了人胰腺癌上皮样细胞系PANC-1、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的肿瘤体积随时间的变化，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图19显示了负载了人胰腺癌上皮样细胞系PANC-1、以本发明的融合蛋白治疗的小鼠在实验第43天的肿瘤生长抑制，与使用hTRAIL114-281治疗的小鼠比较。

图20显示了Ex.1,Ex.2,Ex.14,Ex.24,Ex.51和Ex.42的融合蛋白以及rhTRAI114-281的圆二色性光谱，以比椭圆性(specificellipticity)表示。

发明详述

本发明涉及融合蛋白，其包含：

结构域（a），其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少70%同源性的序列，和

结构域（b），其为促细胞凋亡效应子肽的序列，其通过内部细胞凋亡途径发挥其促细胞调亡作用，其中结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端和/或N末端。

术语“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”应该被理解为指可溶性hTRAIL的任何能够诱导细胞调亡信号的片段。

本领域技术人员还将认识到：TRAIL的70%的同源性的存在是本领域已知的。

根据本发明的术语“肽”应被理解为从通过肽键连接在一起的多个氨基酸的分子构建物。因此，根据本发明的术语“肽”包括寡肽、多肽和蛋白质。

应该理解，本发明的融合蛋白中的效应子肽的结构域（b）不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分。

在本发明中，肽的氨基酸序列将以本领域采纳的常规方式表示，从肽的N末端（N-端）至其C末端（C-端）。因此，任何序列均为左侧为N末端，右侧为C末端。

本发明的融合蛋白可包含效应子肽的单一结构域（b），其连接于结构域（a）的C末端或N末端。

本发明的融合蛋白也可以包含效应子肽的2个结构域（b），在这种情况下，一个结构域（b）连接于结构域（a）的C末端，另一个连接于结构域（a）的N末端。

当本发明的融合蛋白包含效应子肽的2个结构域（b）时，这些结构域可以是相同或不同的。优选地，在该情况下，结构域（b）是不同的。

在具体实施方式中，结构域（a）是hTRAIL序列的片段，始于hTRAIL114至hTRAIL121（含端点）的氨基酸，终于氨基酸hTRAIL281，或公开于GenBank登记号P50591的hTRAIL序列的其他功能片段。

特别地，结构域（a）可以选自对应于下列的序列：hTRAIL114-281(SEQ.No.27),hTRAIL119-281(SEQ.No.28)和hTRAIL121-281(SEQ.No.29),hTRAIL116-281和hTRAIL120-281。

在另一个实施方式中，结构域（a）可以是序列hTRAIL95-281。

结构域（b）的促细胞调亡效应子肽，通过内部细胞调亡途径（细胞内地）发挥其细胞调亡活性，可通过激活细胞调亡的线粒体途径的信号传导级联成分直接诱导调亡，或通过直接诱导细胞中的线粒体细胞调亡而诱导细胞调亡。

在本发明的融合蛋白的一个实施方式中，效应子肽是选自下列的通过内部细胞调亡途径作用的肽：SEQ.No.30,No.31,SEQ.No.32,SEQ.No.33,SEQ.No.34,SEQ.No.35,SEQ.No.36,SEQ.No.37,SEQ.No.38,SEQ.No.39,No.40,SEQ.No.41,SEQ.No.42,SEQ.No.43,SEQ.No.44,SEQ.No.45,SEQ.No.46,和SEQ.No47,或SEQ.No.151,SEQ.No.152,SEQ.No.153,SEQ.No.154,SEQ.No.155,SEQ.No.156,SEQ.No.157,SEQ.No.158SEQ.No.159,SEQ.No.160,No.161,SEQ.No.162,SEQ.No.163,SEQ.No.164,SEQ.No.165和SEQ.No.166。

上述组的SEQ.NO.30的效应子肽是源自Bax蛋白的BH3结构域的肽，其抑制抗细胞调亡因子，具体为如下所示的16个氨基酸的肽：

KKLSECLKRI GDELDS SEQ.No.30。

相信基于Bax蛋白的BH3结构域的序列的肽能够有效结合抗细胞调亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL。Bcl-2和Bcl-XL蛋白的抗细胞调亡活性是基于它们与存在于负责细胞调亡的起始的因子(Bax,Bak,Bad)中的BH3结构域的相互作用。BH3结构域的结合阻止蛋白Bcl-2和Bcl-XL与它们的天然配体的相互作用，并抑制它们的活性，从而促成细胞调亡的起始。

上述组的SEQ.NO.31的效应子肽是如下所示的包含Bid蛋白的BH3结构域的15个氨基酸的肽：

RNIARHLAQV GDSMD(SEQ.No.31)。

Bid蛋白属于Bcl-2家族，其主要负责促细胞调亡因子Bax的激活。相信引入到本发明的融合蛋白中的包含Bid蛋白的BH3结构域的16个氨基酸的肽将有效诱导细胞调亡。

上述组的SEQ.NO.32的效应子肽是核糖核酸酶A（RNase A）的肽同源物，如下所示：

KETA AKFERQHMDS STSAASSSNY CNQMMKSRNL TKDRCKPVNT FVHESLADVQ

AVCSQKNVAC KNGQTNCYQS YSTMSITDCR ETGSSKYPNC AYKTTQANKH

IIVACEGNPY VPVHFDASV(SEQ.No.32).

核糖核酸酶是具有潜在抗癌性质的小的蛋白，在与带负电的细胞膜结合后通过胞吞作用进入细胞，然后泄露进入细胞质，在那里它们作为酶引起RNA的降解。从10nM的浓度开始，它们阻抑细胞周期并引起细胞调亡。

上述组的SEQ.NO.33的效应子肽是如下所示的细胞色素C分子：

GDVEK GKKIFIMKCS QCHTVEKGGK HKTGPNLHGL FGRKTGQAPG YSYTAANKNK

GIIWGEDTLM EYLENPKKYI PGTKMIFVGI KKKEERADLI AYLKKATNE(SEQ.No.33)

细胞色素C从线粒体释放进入细胞质是通过所谓的线粒体途径诱导细胞调亡的主要信号之一。该蛋白是调亡体复合物的一部分，其激活胱天蛋白酶9。

上述组的SEQ.NO.34的效应子肽是粒酶(granzyme)B，如下所示：

IIGGHVAKPH SRPYMAYLMI WDQKSLKRCG GFLIRDDFVL TAAHCWGSSINVTLGAHNIK

EQEPTQQFIP VKRAIPHPAT NPKNFSNDIM LLQLERKAKR

TRAVQPLRLP SNKAQVKPGQ TCSVAGWGQT APLGKHSHTL QEVKMTVQED

RKCESDLRHY YDSTIELCVG DPEIKKTSFK GDSGGPLVCN KVAQGIVSYG

RNNGMPPRAC TKVSSFVHWI KKTMKRY(SEQ.No.34).

粒酶，在文献中也被称作断裂蛋白(fragmentin)，是Tc淋巴细胞和NK细胞的细胞颗粒性的典型的丝氨酸蛋白酶。在人类中目前鉴定了5种不同的粒酶：A,B,H,K(tryptase)和M(metioninase)。研究已经确认：这些酶是淋巴细胞针对靶细胞的细胞毒性反应的元件。已经表明这些酶激活穿孔蛋白(perforin)，穿孔蛋白是在细胞膜中产生孔并从而介导细胞毒性应答的蛋白。此外，相信这些酶直接参与靶细胞的细胞凋亡的诱导。粒酶B将选择的前胱天蛋白酶激活为它们的活性形式（例如胱天蛋白酶3），并通过蛋白水解释放Bid蛋白（属于Bcl-2蛋白家族的蛋白）的活性形式，其通过掺入线粒体膜并在膜上产生孔而起始细胞凋亡的细胞内途径，然后释放细胞调亡诱导性因子（细胞色素C、胱天蛋白酶9、Apaf）。通过与组蛋白结合，粒酶B也可参与染色质结构的松弛，其引起它的松弛并增加核酸内切酶与DNA的靠近。

上述组的SEQ.NO.35的效应子肽是Nur77蛋白的片段，如下所示：

FSRSLHSLL(SEQ.No.35)。

核受体Nur77是非常强的细胞调亡诱导子。其作用机理之一是与Bcl-2蛋白结合的能力，Bcl-2蛋白是重要的抗-细胞调亡因子。这种相互作用引起Bcl-2结构的构象变化，使其转化为细胞调亡的诱导子。上述片段是来自Nur77的序列的9个氨基酸的区域，其被鉴定为负责结合并转化Bcl-2和诱导细胞的细胞调亡(Kolluri et al,Cancer Cell14:285-298,2008)。

上述组的SEQ.NO.36的效应子肽是包含Bak蛋白的BH3结构域的15个氨基酸的肽，如下所示：

GQVGRQLAII GDDIN(SEQ.No.36)。

相信掺入本发明的融合蛋白中的该短肽将有效诱导细胞调亡信号。

上述组的SEQ.NO.37的效应子肽是蛋白PUMA/BBC3的BH3结构域，如下所示：

EEQWAREIGA QLRRMADDLN AQYE SEQ.No.37。

PUMA/BBC3(细胞调亡/Bcl-2结合成分3的p53上调的调节子)是Bcl-2蛋白家族的成员(仅-BH3亚家族)。其通过p53依赖性和非依赖性方式介导细胞调亡。PUMA/BBC3与所有已知的促存活Bcl-2蛋白的直接相互作用引起它们的失活、线粒体功能失调并由此引起胱天蛋白酶的激活和细胞死亡。PUMA还间接影响诸如Bak和Bax的分子的促细胞调亡活性的恢复。BH3结构域负责PUMA与促存活蛋白的结合。

上述组的SEQ.NO.38的效应子肽是蛋白PUMA/BBC3，如下所示：

ARAR QEGSSPEPVE GLARDGPRPF PLGRLVPSAV SCGLCEPGLA AAPAAPTLLP

AAYLCAPTAP PAVTAALGGS RWPGGPRSRP RGPRPDGPQPSLSLAEQHLE

SPVPSAPGAL AGGPTQAAPG VRGEEEQWAR EIGAQLRRMA DDLNAQYERR

RQEEQQRHRR SPWRVLYNLI MGLLPLPRGH RAPEMEPN(SEQ.No.38).

相信当被掺入本发明的融合蛋白中时，蛋白PUMA/BBC3及其BH3结构域都能有效诱导细胞调亡信号。

上述组的SEQ.NO.39的效应子肽是蛋白SMAC/Diablo的8个氨基酸的片段，如下所示：

AVPIAQKP(SEQ.No.39)。

SMAC/DIABLO(具有低PI的胱天蛋白酶/直接IAP结合蛋白的第二线粒体衍生的激活子)是从线粒体释放的胱天蛋白酶的激活子。其N末端基序竞争性结合IAP蛋白，阻止它们的BIR2和BIR3结构域使胱天蛋白酶失活。相信当掺入本发明的融合蛋白中时，该短肽将有效诱导细胞调亡信号。

上述组的SEQ.NO.40的效应子肽是buforin IIb肽，如下所示：

RAGLQFPVGR LLRRLLRRLL(SEQ.No.40)。

buforin IIb是源自组蛋白H2A的肽，其能够独立地穿透细胞膜并具有抗细菌性质(Park et al,Biochem Biophys.Res.Commun.,244:253-257,1998)。关于其用作抗癌试剂的研究表明其能够选择性结合多种癌细胞，穿透细胞并在细胞核中累积，通过线粒体途径诱导细胞调亡(Lee et al,Cancer Letters,271:47-55,2008)。

上述组的SEQ.NO.41的效应子肽是豹蛙酶（onconase）肽，如下所示：

QDWLT FQKKHITNTR DVDCDNIMST NLFHCKDKNTFIYSRPEPVK AICKGIIASK

NVLTTSEFYL SDCNVTSRPC KYKLKKSTNK FCVTCENQAP VHFVGVGSC(SEQ.NO.

41).

豹蛙酶或P-30是最初源自蛙(Rana pipiens)卵母细胞的裂解物的蛋白。其为单链蛋白，具有12kDa的分子量，是RNase A的结构同源物。关于该蛋白的研究显示其具有针对肿瘤细胞的显著的细胞毒性活性(Y Wu,SM Mikulski,W Ardelt,SM Rybak and RJ Youle,TheJournal of Biological Chemistry268,10686-10693)。关于豹蛙酶的作用机理的研究显示，在内化过程之后其进入细胞，在那里进行28S和18S核糖体rRNA的降解过程，这导致蛋白合成的抑制和细胞死亡。

上述组的SEQ.NO.42的效应子肽是p14ARF蛋白的20个氨基酸的N末端片段，其是促存活Mdm2蛋白的抑制子，如下所示：

VRRFLVTLRI RRACGPPRV(SEQ.No.42)。

P14ARF是调节Mdm2蛋白活性的蛋白，其结合肿瘤抑制子p53并导致其降解并因此引起转化的细胞的存活的可能性。P14ARF蛋白通过结合Mdm2而阻止其与p53的相互作用。据报道源自p14ARF的短肽足以阻断Mdm2与p53的相互作用并阻止后者的降解(Midgley etal,Oncogene19:2312-2323,2000)。

上述组的SEQ.NO.43的效应子肽是结合Mdm2的11个氨基酸的肽，如下所示：

PRFMDTWEGL N(SEQ.No.43)。

上述肽显示出与p53的序列的序列同源性并显著有效抑制Mdm2-p53相互作用(

et al,Oncogene13:2141-2147,1996)，从而阻止p53的降解。

上述组的SEQ.NO.44的效应子肽是lunasin肽的17个氨基酸的片段，如下所示：

CEKHIMEKIQ GRGDDDD(SEQ.No.44)。

Lunasin是源自大豆(Glycine max)的43个氨基酸的肽，具有强抗癌潜力。该分子的一般作用机理在于抑制组蛋白的乙酰化。已知具有脱乙酰酶活性的分子也具有转录过程的共抑制剂的作用(Leong et al,Cancer Lett,18:42-48,2007)。

上述组的SEQ.NO.45的效应子肽是Bik蛋白的BH3结构域，如下所示：

LALRLAC IGDEMDVS(SEQ.No.45)。

Bik蛋白与起始存活信号的细胞和病毒因子（例如Bcl-2）相互作用，从而刺激细胞调亡。与很多其它促细胞调亡蛋白一样，其包含与Bcl-2相互作用必需的BH3结构域。包含BH3结构域的源自该蛋白的肽可通过激活其它促细胞调亡蛋白或通过抑制抗细胞调亡蛋白而起始细胞调亡(Del Gaizo Moore,V,et al,Blond,111:2300-2309,2008)。

上述组的SEQ.NO.46的效应子肽是合成的肽—蛋白酶体抑制剂，如下所示：

AGAGGGAGG AGAGGGAGGA G(SEQ.No.46)。

该肽由Gly和Ala残基的一系列重复序列组成，其是蛋白酶体抑制剂，能够通过诱导TRAIL受体DR5的过表达而加强TRAIL诱导的细胞调亡。

上述组的SEQ.NO.47的效应子肽是蛋白酶体S5a的C末端片段的结构域，如下所示：

MTISQQEFG RTGLPDLSSM TEEEQIAYAM QMSLQGAEFG QAESADIDAS SAMDTSEPAK

EEDDYDVMQD PEFLQSVLEN LPGVDPNNEA IRNAMGSLAS QATKDGKKDK KEEDK

(SEQ.No.47).

来自蛋白酶体S5a片段的该结构域包含直接参与泛素结合的UIM基序并因此具有诱导细胞调亡的能力。

上述组的SEQ.NO.151的效应子肽是azurin衍生的肽。

azurin是含铜的氧化还原蛋白，由致病细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)释放，对于很多癌细胞系具有高度细胞毒性。其进入细胞质并迁移至细胞核。其活性严格依赖于癌细胞中p53的活性形式的存在。已经表明azurin结合p53并翻译后地增加p53和Bax的水平。就Mdm2-p53功能相互作用的这种表观的拮抗作用表明azurin与p53的结合可能干扰Mdm2-p53结合并因此阻止p53的降解。在结合之后，其激发线粒体细胞色素C释放进入细胞质。该过程激活胱天蛋白酶（包括胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-7）级联，从而起始细胞调亡过程(Punj V,et al Oncogene.2004Mar25;23(13):2367-78,Funari G et al.J Mol Recognit.2010Jul Aug;23(4):343-51)。关于源自azurin序列的肽的活性的详细分析揭示了负责有效的细胞穿透并激发细胞调亡的28个氨基酸的区域(Yamada i wsp.,Cell Microbiol,7:1418–1431,2005)。

上述组的SEQ.NO.152的效应子肽是全长的azurin肽。

上述组的SEQ.NO.153的效应子肽是从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计而来的肽。

在EP1309680中报告了aPP蛋白和重新设计的促细胞调亡Bak蛋白的嵌合物是人Bcl-2和Bcl-X的高度强烈的和特异性的配体(另见Chin JW,Schepartz A.Design and evolution of a miniature Bcl-2binding protein Angew Chem Int Ed Engl.2001Oct15;40(20):3806-3809)。

上述组的SEQ.NO.154的效应子肽是从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计而来的另一种肽。

上述组的SEQ.NO.155的效应子肽是Reticulon RTN1-C衍生的肽。

RTN1-C蛋白是位于ER并表达于神经系统的膜蛋白，其生物学作用尚未完全知晓。RTN1-C的C末端区域，对应于残基186-208的片段，能够结合核酸并与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)相互作用，降低它们的活性。

上述组的SEQ.NO.156的效应子肽是全长人Reticulon3(同种型a)。Reticulon(RTN)构成一组整合膜蛋白，其与其它已知的细胞调亡相关结构域不具有同源性。Reticulon3同种型a在肿瘤细胞系中过表达，使它们对于TRAIL介导的细胞调亡变得敏感。

上述组的SEQ.NO.157的效应子肽是是修饰的组成型活性的胱天蛋白酶-3(单链)(Srinivasula SM,Ahmad M,MacFarlane M,Luo Z,Huang Z,Fernandes-Alnemri T,Alnemri ES.Generation ofconstitutively active recombinant caspases-3and-6by rearrangementof their subunits.J Biol Chem.1998Apr24;273(17):10107-11)。

上述组的SEQ.NO.158的效应子肽是来自Par-4蛋白(前列腺细胞调亡应答蛋白par-4)的SAC结构域。

Par-4是具有促细胞调亡功能的肿瘤抑制子蛋白。Par-4的癌症特异性促细胞调亡作用在于位于其中心的SAC结构域。该分子的功能通过两种不同方式实现：细胞死亡机构的分子成分的激活(Fas和FasL向质膜的转位)和促存活因子的抑制(NF-κB途径)(Zhao Y,RangnekarVM.Apoptosis and tumor resistance conferred by Par-4.Cancer BiolTher.2008Dec;7(12):1867-74.Epub 2008 Dec 8.Review)。

上述组的SEQ.NO.159的效应子肽是Noxa蛋白。Noxa编码Bcl-2蛋白家族的Bcl-2仅同源物3(BH3)成员；该成员包含BH3区域但不含其它BH结构域。Noxa是p53依赖性细胞凋亡的介导子并经历BH3基序依赖性的向线粒体的定位，并与抗细胞凋亡Bcl-2家族成员相互作用，引起胱天蛋白酶-9的激活。

上述组的SEQ.NO.160的效应子肽是线粒体定位必需的Noxa蛋白的10AA(KLLNLISKLF)片段(MTD-线粒体靶向结构域或CKP—细胞杀伤肽)。其被描述于WO2006/001582和Young-Woo Seo et al.The Journal of Biological Chemistry Vol.278,No.48,Issue ofNovember 28,pp.48292–48299,2003。

上述组的SEQ.NO.161的效应子肽是短的杂合肽Antp-TPR，其被描述于WO2010055929。Antp-TPR是靶向Hsp90的工程化的杂合肽，由于抑制了Hsp90与Hop的TPR2A结构域的相互作用而具有针对癌细胞的选择性细胞毒性活性。

上述组的SEQ.NO.162的效应子肽是Stat3蛋白的SH2结构域的肽抑制剂。

Stat蛋白的SH2结构域负责一系列导致促进细胞生长和分化的事件，其是通过响应于生长因子和细胞因子的正常STAT信号传导。

上述组的SEQ.NO.163的效应子肽是源自Bak蛋白(Bcl-2家族)的BH3结构域的肽GQVGRQLAIIGDDINR(Castelli M,Reiners JJ,Kessel D.A mechanism for the proapoptotic activity ofursodeoxycholic acid:effects on Bcl-2 conformation.Cell Death Differ.2004Aug;11(8):906-14)。Bak蛋白是Bcl-2家族的促细胞凋亡成员，其参与细胞凋亡的起始。

上述组的SEQ.NO.164的效应子肽是源自Bad蛋白(Bcl-2家族)的BH3结构域的肽KNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGL(Wang JL,Zhang ZJ,Choksi S,Shan S,Lu Z,Croce CM,Alnemri ES,Korngold R,Huang Z.Cell permeable Bcl-2binding peptides:achemical approach to apoptosis induction in tumor cells.Cancer Res.2000Mar15;60(6):1498-502)。

上述组的SEQ.NO.165的效应子肽是来自Bfl1蛋白的肽ATAP。

ATAP(两性的尾部锚定肽)(双功能的Bcl2家族蛋白Bfl1的残基147-175)特异性靶向线粒体并诱导胱天蛋白酶依赖性的不需要Bax或Bak的细胞凋亡。

上述组的SEQ.NO.166的效应子肽是来自Bfl1蛋白的另一个ATAP肽。ATAP蛋白融合于来自HCCS1的MTS结构域(Ko JK,ChoiKH,Pan Z,Lin P,Weisleder N,Kim CW,Ma J.The tail-anchoringdomain of Bfl1 and HCCS1 targets mitochondrial membranepermeability to induce apoptosis.J Cell Sci.2007 Aug 15;120(Pt16):2912-23.Epub 2007Jul 31)。

如上文所描述，结构域（b）的促细胞凋亡效应子肽的第一变体可以是通过内部细胞凋亡途径（细胞内的）发挥其细胞凋亡活性的肽，其通过激活细胞凋亡的线粒体途径的信号传导级联成分而直接诱导细胞凋亡，或通过直接诱导细胞中的线粒体细胞凋亡。

在第一变体的一个实施方式中，通过内部途径发挥其活性的结构域（b）的一组促细胞凋亡效应子肽可以是在结合后抑制和/或调节细胞内抗细胞凋亡或促存活因子例如抗细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的肽。

上述组的示例性效应子肽是SEQ.NO.30所示的肽，其存在于实施例1的融合蛋白中；SEQ.NO.37所示的肽，其存在于实施例11和47的融合蛋白中；SEQ.NO.45所示的肽，其掺入实施例21的融合蛋白中；SEQ.NO.158所示的肽，其存在于实施例42和43的融合蛋白中；SEQ.NO.159所示的肽，其掺入实施例44的融合蛋白中。

在所述第一变体的另一个实施方式中，通过内部途径发挥其活性的结构域（b）的一组促细胞凋亡效应子肽可以是在细胞内发挥其直接破坏效应以阻抑细胞周期的肽。

所述的在线粒体内部途径中在细胞内的直接破坏效应可以通过效应子肽在不同水平的胱天蛋白酶级联上起始，导致细胞死亡。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的实例有：核酸的降解，特别是完整细胞RNA或DNA的降解，和降解性核酸酶的诱导。此类效应可通过例如核糖核酸酶来进行，例如胰腺RNAse A超家族的核糖核酸酶，包括人胰腺RNAse，人血管生长素(核糖核酸酶5，hAng)，人嗜曙红细胞衍生的神经毒素(EDN)和牛核糖核酸酶，以及它们的同源物和变体。RNAse同源物的实例有豹蛙酶（onconase），分离自Rana catesbiana和Rana japonica的核糖核酸酶。

上述通过降解核酸发挥作用的示例性效应子肽是：SEQ.NO.32所示的肽，其存在于实施例3、4和27的融合蛋白中；SEQ.NO.41所示的肽，其存在于实施例16、17和46的融合蛋白中；SEQ.NO.157所示的肽，其存在于实施例41的融合蛋白中。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是胱天蛋白酶激活。此类效应可通过下列来实现：例如细胞色素c(SEQ.NO.33)，其存在于实施例5和6的融合蛋白中；粒酶B(SEQ.NO.34)，其存在于实施例7和8的融合蛋白中，或源自蛋白Smac/DIABLO的肽(SEQ.NO.39)，其存在于实施例14、21、33、34和35的融合蛋白中。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是蛋白酶体抑制，由于促细胞凋亡蛋白的稳定化对于p53功能恢复的影响。

通过蛋白酶体抑制而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是SEQ.NO.46所示的肽，其掺入实施例22的融合蛋白中；SEQ.NO.47所示的肽，其掺入实施例23的融合蛋白中。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是由于促细胞凋亡蛋白的表达对于p53功能恢复的影响的增强而调节组蛋白。

通过调节组蛋白而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是buforin IIb肽，如SEQ.NO.40所示，其掺入实施例15的融合蛋白；SEQ.NO.44所示的lunasin，其掺入实施例20的融合蛋白。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是p-53功能的恢复，例如通过抑制其降解。抑制p-53降解可通过抑制p-53的负调节子例如鼠双微体2(MDM2)以破坏其负调节来实现。这可以通过MDM2结合性肽来实现，其与MDM2竞争向p-53的结合，所述结合性肽是例如Azurin，其是含铜的氧化还原蛋白；细胞周期调节子p14ARF，或SuperTIP(ThioredoxinInsert蛋白，细菌硫氧还蛋白的活性位点环内的mdm-2结合肽)，或它们的片段。

通过恢复p-53的功能而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是：SEQ.NO.42所示的肽，其掺入实施例18的融合蛋白中；SEQ.NO.43的肽，其掺入实施例19的融合蛋白中；SEQ.NO.151的肽，其存在于实施例29、30和31的融合蛋白中；SEQ.NO.152的肽，其掺入实施例32的融合蛋白中。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是影响即激活、抑制或调节Bcl-2蛋白家族，例如蛋白Bax,Bak,Bok,Bid,Bim,Bad,Bmf,Hrk,Noxa,Puma,Bik,BNIP3和Spike，更具体是仅BH3蛋白家族，包括Bid,Bim,Bad,Bmf,Hrk,Noxa,Puma,Bik,BNIP3和Spike。特别地，Bcl-2家族成员的BH3结构域的片段将是优选的效应子肽。其它组的效应子肽是细胞核受体RXR(类维生素a X受体)家族的片段，例如细胞核受体Nur77。

通过影响Bcl-2蛋白家族而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是：SEQ.NO.30所示的肽，其掺入实施例1的融合蛋白中；SEQ.NO.31所示的肽，其存在于实施例2、4和8的融合蛋白中；SEQ.NO.32所示的肽，其掺入实施例3的融合蛋白中；SEQ.NO.35所示的肽，其掺入实施例9的融合蛋白中；SEQ.NO.36所示的肽，其掺入实施例10的融合蛋白中；SEQ.NO.37所示的肽，其存在于实施例11和47的融合蛋白中；SEQ.NO.38所示的肽，其存在于实施例12和13的融合蛋白中；SEQ.NO.159所示的肽，其掺入实施例44的融合蛋白中；SEQ.NO.160所示的肽，其掺入实施例45的融合蛋白中；SEQ.NO.163所示的肽，其掺入实施例51的融合蛋白中；SEQ.NO.164所示的肽，其存在于实施例52和53的融合蛋白中；SEQ.NO.165所示的肽，其掺入实施例54的融合蛋白中；SEQ.NO.166所示的肽，其掺入实施例55的融合蛋白中。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是会聚TRAIL与TRAIL受体结合特别是通过胱天蛋白酶激活而诱导的细胞凋亡信号。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是促进凋亡体的形成。

通过促进凋亡体的形成而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是：SEQ.NO.30所示的肽，其掺入实施例1的融合蛋白中；SEQ.NO.31所示的肽，其掺入实施例2的融合蛋白中；SEQ.NO.33所示的肽，其掺入实施例5和6的融合蛋白中；SEQ.NO.35所示的肽，其掺入实施例9的融合蛋白中；SEQ.NO.36所示的肽，其掺入实施例10的融合蛋白中；SEQ.NO.37所示的肽，其掺入实施例47的融合蛋白中；SEQ.NO.39所示的肽，其存在于实施例33、34和35的融合蛋白中；SEQ.NO.40所示的肽，其掺入实施例14的融合蛋白中；SEQ.NO.45所示的肽，其掺入实施例21的融合蛋白中；SEQ.NO.153所示的肽，其存在于实施例36和37的融合蛋白中；SEQ.NO.154所示的肽，其掺入实施例38的融合蛋白中；SEQ.NO.157所示的肽，其掺入实施例41的融合蛋白中；SEQ.NO.158所示的肽，其存在于实施例42和43的融合蛋白中；SEQ.NO.159所示的肽，其掺入实施例44的融合蛋白中；SEQ.NO.160所示的肽，其掺入实施例45的融合蛋白中；SEQ.NO.163所示的肽，其掺入实施例51的融合蛋白中；SEQ.NO.164所示的肽，其存在于实施例52和53的融合蛋白中。

所述的在线粒体内部途径中效应子肽的直接破坏效应的另一个实例是促进线粒体外膜(MOMP)渗透，由此，线粒体释放的蛋白能够在胱天蛋白酶激活水平上发挥作用。

通过促进MOMP渗透而发挥作用的上述组的示例性效应子肽是：SEQ.NO.30所示的肽，其掺入实施例1的融合蛋白中；SEQ.NO.31所示的肽，其掺入实施例2和48的融合蛋白中；SEQ.NO.33所示的肽，其掺入实施例5和6的融合蛋白中；SEQ.NO.39所示的肽，其存在于实施例14、33、34和35的融合蛋白中；SEQ.NO.40所示的肽，其掺入实施例15的融合蛋白中；SEQ.NO.41所示的肽，其掺入实施例46的融合蛋白中；SEQ.NO.45所示的肽，其掺入实施例21的融合蛋白中。

如上文所描述，本发明的结构域（b）的促细胞凋亡效应子肽的第二变体是通过外部途径（细胞外地）发挥作用的促细胞凋亡效应子肽的组，它们的效应需要结合存在于癌细胞表面上的受体。

下列TNF-配体(TNF—肿瘤坏死因子)或TNF-类似物作为在细胞外作用的肽，用作比较性效应子肽：

-VANPQAEGQL十肽(SEQ.No.48)；

-LANGVE六肽(SEQ.No.49)，或

-七肽CPSEGLC(SEQ.No.50)。

SEQ.NO.48所示的十肽在JP60,226,816中被描述为TNF的类似物/激动剂。

SEQ.NO.49所示的六肽源自TNF，在DE3,841,768中已被描述。

SEQ.NO.50所示的七肽是：在C末端和N末端侧接2个半胱氨酸残基的5个氨基酸的肽，其是源自TNF细胞因子与其细胞受体TNFR55和TNFR75的相互作用的表面的TNF细胞因子的一部分。半胱氨酸残基通过形成氨基酸之间的硫桥而使肽环稳定。环化的目的是使肽稳定并改善其活性。

与癌细胞表面上存在的TRAIL受体结合之后，融合蛋白将发挥双重效应。结构域（a），TRAIL的功能性片段，将发挥其已知的激动活性，即，与细胞表面上的死亡受体结合并激活细胞凋亡的外部途径。在包含细胞内发挥作用的促细胞凋亡肽的融合蛋白通过胞吞内化之后，结构域（b）将能够潜在地在细胞内发挥其作用，与TRAIL结构域的活性平行。通过这种方式，TRAIL的抗癌活性可通过细胞凋亡的其它元件和机制的激活得以加强。

掺入了在细胞外发挥作用的促细胞凋亡肽的比较性融合蛋白应该潜在地另外地起始细胞凋亡途径，其是通过结合并激活除了TRAIL受体以外的促细胞凋亡受体。

在本发明的一个实施方式中，融合蛋白的结构域（a）和（b）可彼此直接连接。

在另一实施方式中，结构域（a）和结构域（b）通过结构域（c）连接，结构域（c）包含被存在于细胞环境、特别是肿瘤细胞环境中的蛋白酶识别的切割位点序列。

蛋白酶切割位点可以选自：

被金属蛋白酶MMP识别的序列，特别是序列PLGLAG(SEQ.No.51),PLGIAGE(SEQ.No.171)或PLGLAGQ(SEQ.No.173)；

被尿激酶uPA识别的序列，特别是RVVR序列(SEQ.No.52)；和

被弗林蛋白酶识别的序列，特别是序列RKKR(SEQ.No.53)或序列RKKRVKR(SEQ.No.172)；

以及它们的组合。

特别地，蛋白酶切割位点是被金属蛋白酶MMP识别的序列与被尿激酶uPA识别的序列的组合，以任何顺序彼此相邻。

在一个实施方式中，结构域（c）是MMP/uPA SEQ.NO.51/SEQ.NO.52的组合，即序列PLGLAGRVVR，或uPA/MMP SEQ.No52/SEQ.No.51的组合，即序列RVVRPLGLAG。

蛋白酶：金属蛋白酶、尿激酶和/或弗林蛋白酶在肿瘤环境中过表达。被蛋白酶识别的序列的存在使得构建体在内化之后能够使结构域（a）从结构域（b）切割下来，即释放功能性结构域（b）并由此实现其激活。

蛋白酶切割位点的存在允许迅速释放效应子肽，由此增加了融合蛋白被存在于细胞中的蛋白酶随机降解之前肽向其作用位点转运的机会。

另外，可以向本发明的融合蛋白的效应子肽的结构域（b）上添加转运结构域（d），其选自：

（d1）靶向内质网的序列；

（d2）穿过细胞膜转运的多聚精氨酸序列，其包含6、7、8或9个Arg残基；

（d3）铜绿假单胞菌的转位结构域(SEQ.NO.54)；

（d4）膜转运结构域；

（d5）细胞核定位结构域；和

（d6）线粒体靶向结构域；

及其组合。

结构域（d1）、（d2）和（d3）的组合可具体包含下列组合：(d1)/(d2),(d1)/(d3)或(d1)/(d2)/(d3)。

结构域(d1),(d2),(d3),(d4)和(d5)的组合可具体包含下列组合：(d1)/(d2),(d1)/(d3),(d1)/(d4),(d1)/(d5)和(d1)/(d2)/(d3),(d3)/(d5),(d2)/(d5),(d1)/(d3)/(d5),(d2)/(d3)/(d6)。

此外，结构域(d1),(d2),(d3),(d4)和(d5)的组合可包括彼此相邻并连接至结构域（b）的一个末端的结构域；和/或连接至结构域（b）的不同末端的结构域。

应该理解，在融合蛋白既具有连接至结构域（b）的转运结构域（d）又具有结构域（a）与（b）之间的切割位点结构域（c）的情况下，结构域（c）的位置是：在构建体被切割之后，转运结构域（d）仍然与结构域（b）相连。换言之，如果融合蛋白包含转运结构域（d）和切割位点结构域（c），则结构域（d）位于结构域（b）与结构域（c）之间，或位于结构域（b）的与连接了结构域（d）的位置相对的末端。本发明不包含这样的变体，其中：结构域（d）位于结构域（c）与结构域（a）之间，即，当构建体被切割之后，转运结构域仍然与TRAIL结构域相连。

转运序列可以连接于结构域（b）的N末端或C末端。在一些实施方式中，转运序列也可以是整个构建体的末端部分，例如C末端或N末端部分，这取决于结构域（a）和（b）的连接方式。

铜绿假单胞菌的转位结构域能够通过溶酶体膜转位至细胞质，并且可用于将效应子肽导入肿瘤细胞腔室。铜绿既假单胞菌的转位结构域是熟知的，如下所示：

PEGGSLA ALTAHQACHL PLETFTRHRQ PRGWEQLEQC GYPVQRLVAL YLAARLSWNQ

VDQVIANALA SPGSGGDLGE AIRESPEQAR LALTLAAAES ERFVRQGTGN

DEAGAANGPA D(SEQ.No.54)

靶向内质网的序列（d1）可以是本领域已知的靶向内质网的任何信号序列，例如但不限于KDEL,HDEL,RDEL,DDEL,ADEL,SDEL,KEDL。序列（d1）优选选自序列KDEL(SEQ.No.55)和KEDL(SEQ.No.56)。

优选地，靶向序列（d1）位于本发明的融合蛋白的C末端并构成其C末端部分。

膜转运结构域（d4）可以是本领域已知的通过质膜转运的任何信号序列，例如但不限于KPRRPY或K PRRPYR。

细胞核定位序列（d5）可以是本领域已知的靶向细胞核的任何信号序列，例如但不限于EEEAAGRKRKKRT(SEQ.No.168),FFFAAGRKRKKRT,NNNAAGRKRKKRT,YYYAAGRKRKKRT,AAKKK或GR KRKKRT。

线粒体靶向结构域(d6)可以是本领域已知的靶向线粒体的任何信号序列，例如但不限于RVSFCRPGWSAMARSRLTATSVSQVQENGFVK(SEQ.No.166)，人细胞色素氧化酶亚基IV(hCOXIV1)的片段MLATRVFSLVGKRAISTSVCVR，或鸟氨酸转氨甲酰酶先导肽。

除了融合蛋白的主要功能元件转运结构域和切割位点结构域之外，本发明的融合蛋白可包含结构域（e），即促进三聚体稳定性的多聚半胱氨酸基序，例如但不限于CAACAAAC序列(SEQ.No.177)或CAAECAAAC(SEQ.No.178)。

此外，多聚半胱氨酸结构域（e）可连接于结构域（b）的一个末端和/或连接于结构域（b）的不同末端。

应该理解，在融合蛋白既具有连接于结构域（b）的多聚半胱氨酸结构域（e）又具有结构域（a）与（b）之间的切割位点结构域（c）的情况下，结构域（c）的位置是：在构建体被切割之后，多聚半胱氨酸结构域（e）仍然与结构域（a）相连。换言之，如果融合蛋白包含多聚半胱氨酸结构域（e）和切割位点结构域（c），则结构域（e）位于结构域（a）与结构域（c）之间，或位于结构域（a）的与连接了结构域（d）的位置相对的末端。本发明不包含这样的变体，其中：结构域（e）位于结构域（c）与结构域（b）之间，即，当构建体被切割之后，多聚半胱氨酸结构域仍然与效应子肽结构域相连。

除了融合蛋白的主要功能元件转运结构域和切割位点结构域之外，本发明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空间连接子（间隔子）的序列，其包含丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸和丝氨酸残基。此类连接子/间隔子是本领域熟知的并且在文献中有描述。将它们掺入融合蛋白的序列中是为了使得通过在宿主细胞中过表达而产生的蛋白的正确折叠。

特别地，柔性空间连接子可以选自：GGSG(SEQ.No.57),GGGS(SEQ.No.58),GGGGS(SEQ.No.59),GGSGG(SEQ.No.60),GGGSGG(SEQ.No.61),GGGSGGG(SEQ.No.62),GGGSGGGS(SEQ.No.63),GGGSGGGGS(SEQ.No.64),ASGG(SEQ.No.65),GGGSASGG(SEQ.No.66)SGCGS(SEQ.No.169),GGGGSGGGG(SEQ.No.180),GGSHG(SEQ.No.182),SGGCGGS(SEQ.No.183)和AACAA(SEQ.No.184)。

在一个实施方式中，结构域（a）和结构域（b）之间另外还有：

（f）适合将本发明的融合蛋白与PEG分子连接的结构域（PEG连接子）。

此类连接子可以是已知的序列AlaSerGlyCysGlyProGlu(以单字符表示是ASGCGPE)，在序列表中表示为SEQ.NO.170。PEG连接子也可以选自AlaAlaCysAlaAla(AACAA),SerGlyGlyCysGlyGlySer(SGGCGGS)和(SGCGS)，在序列表中分别表示为SEQ.No.178,SEQ.No.177和SEQ.No.179。

在另一实施方式中，结构域(a)(b)(c)(d)(e)和(f)另外可被至多3个氨基酸残基间隔开，所述氨基酸残基特别地选自甘氨酸和谷氨酰胺。

此外，在一些实施方式中，融合蛋白可包含hTRAIL的非功能性片段，作为整个构建体的C末端部分，例如序列hTRAIL95-121，其位于允许其从构建体上被切割下来的序列、有利地是蛋白酶切割位点、优选地凝血酶识别的序列之后。此类小的hTRAIL非功能片段的掺入赋予了整个构建体更大的亲水性，因此允许在表达过程中改善蛋白的溶解性。在纯化步骤之后，hTRAIL95-121将被凝血酶切割。在这样的情况下，hTRAIL95-121将不会存在于用于制备药物组合物的融合蛋白中。

本领域已知的被凝血酶识别的任何序列都可使用，特别是序列LVPRGS(SEQ.No.174)。

在亲脂性效应子肽的情况下并且当结构域（a）起始于全TRAIL的114位氨基酸或更高位的氨基酸时，此类另外的hTRAIL95-121序列是特别优选的。

本发明的融合的蛋白的具体实例是包含在细胞内作用的促细胞凋亡肽的融合蛋白，选自：

SEQ.No.1,SEQ.No.2,SEQ.No.3,SEQ.No.4,SEQ.,No.5,SEQ.No.6,SEQ.No.7,SEQ.No.8,SEQ.No.9,SEQ.No.10,SEQ.No.11,SEQ.No.12,SEQ.No.13,SEQ.No.14,SEQ.No.15,SEQ.No.16,SEQ.No.17,SEQ.No.18,SEQ.No.19,SEQ.No.20,SEQ.No.21,SEQ.No.22,SEQ.No23,SEQ.No.93,SEQ.No.94,SEQ.No.95,SEQ.No.96,SEQ.,No.97,SEQ.No.98,SEQ.No.99,SEQ.No.100,SEQ.No.101,SEQ.No.102,SEQ.No.103,SEQ.No.104,SEQ.No.105,SEQ.No.106,SEQ.No.107,SEQ.No.108,SEQ.No.109,SEQ.No.110,SEQ.No.111,SEQ.No.112,SEQ.No.113,SEQ.No.114,SEQ.No115,SEQ.No.116,SEQ.No.117,SEQ.No.118,SEQ.No.119,SEQ.No.120和SEQ.No.121。

本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含在细胞外作用的促细胞凋亡肽的融合蛋白，选自：SEQ.No.24,SEQ.No.25和SEQ.No.26。

上述代表性融合蛋白的详细描述显示于图1-5和9-13，以及如下文的实施例所描述。

根据本发明，融合蛋白意思是包含2个或更多个蛋白或其片段的单一的蛋白分子，所述2个或更多个蛋白或其片段通过它们各自的肽链内的肽键共价连接而无另外的化学连接子。

融合的蛋白也可另外被描述为蛋白构建体或嵌合蛋白。根据本发明，术语“构建体”或“嵌合蛋白”如果被使用的话，应该被理解为是指上文定义的融合蛋白。

对于本领域技术人员，显而易见的是由此定义的融合蛋白可通过肽和蛋白的已知的化学合成方法来合成。

融合蛋白可通过化学肽合成的方法来合成，特别是使用合适的树脂作为载体，使用固相肽合成技术进行。此类技术是常规的和本领域已知的，特别描述于例如下列专论中：Bodanszky和Bodanszky,ThePractice of Peptide Synthesis,1984,Springer-Verlag,New York,Stewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Edition,1984,PierceChemical Company。

融合蛋白可通过肽的化学合成方法作为连续蛋白来合成。或者，可以单独合成蛋白的各个片段（结构域），然后通过一个肽片段的氨基末端与另一个肽的羧基末端的缩合经由肽键而组合在一起。此类技术是常规的和本领域已知的。

为了验证得到的肽的结构，可以使用肽的氨基酸组成的已知的分析方法，例如高分辨率质谱技术，以确定肽的分子量。为了确认肽的序列，也可以使用蛋白测序仪，其依次降解肽并鉴定氨基酸的序列。

然而，优选地，本发明的融合蛋白是重组蛋白，通过编码融合蛋白的多核苷酸序列在宿主细胞中的基因表达的方法来产生。

本发明的另一方面是编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列。

优选地，根据本发明的编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列是针对在大肠杆菌中表达而优化的序列。

本发明的另一个方面是包含多核苷酸序列、特别是如上所述的本发明的DNA序列的表达载体。

本发明的另一个方面是包含上文所述的表达载体的宿主细胞。

用于表达本发明的融合蛋白的优选宿主细胞是大肠杆菌细胞。

用于产生重组蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。简而言之，该技术为：产生编码靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指导靶蛋白的表达的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，将编码靶蛋白的多核苷酸分子掺入合适的表达载体，其确保多肽的有效表达。然后将重组表达载体导入宿主细胞以进行转染/转化，由此产生转化的宿主细胞。然后培养转化的细胞以过表达靶蛋白，纯化所获得的蛋白，任选地通过切割用于表达或纯化蛋白的标签序列而切下来。

用于表达和纯化的合适的技术描述于例如下列专著：Goeddel,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,CA(1990)和A.Staron et al.,Advances Mikrobiol.,2008,47,2,1983-1995。

作为用于导入和在宿主细胞中复制DNA序列的表达载体，可以使用粘粒、质粒或修饰的病毒。通常使用质粒作为表达载体。合适的质粒是熟知的和商业上可获得。

本发明的表达载体包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于转录和翻译掺入合适的宿主细胞的编码序列的必要的调节序列。调节序列的选择取决于宿主细胞的类型，可以由本领域技术人员容易地进行。此类调节序列的实例是包含转录起始信号的、插入编码序列之前的转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，和插入编码序列之后的转录终止序列。此外，取决于所用的宿主细胞和载体，可以将其它序列导入表达载体，例如复制起始子，另外的DNA限制性位点，增强子和允许诱导转录的序列。

表达载体还包含标记物基因序列，其赋予转化的细胞确定的表型并使得能够特异性选择转化的细胞。此外，载体还可以包含第二标记物序列，其允许将以包含插入的编码靶蛋白序列的重组质粒转化的细胞与摄取了无插入物的质粒的细胞区分开。通常，使用典型的抗生素抗性标记物，然而，任何其它本领域已知的报告子基因均可使用，其在细胞（在体内）中的存在可使用放射自显影技术、分光光度法或生物和化学发光法容易地确定。例如，取决于宿主细胞，可使用例如下列报告基因：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白。

此外，表达载体可包含信号序列，将蛋白转运至合适的细胞腔室，例如周质，在那里促进折叠。另外，可以存在编码标记物/标签例如连接于N末端的HisTag或连接于C末端的GST的序列，其促进后续使用亲和法、通过镍柱上的亲和层析纯化所产生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保护蛋白免于宿主细胞中的蛋白水解降解，以及增强其溶解性的序列。

连接于靶蛋白的序列的辅助元件可能阻断其活性，或者由于别的原因而具有有害效应，例如由于毒性。此类元件必须被除掉，这可通过酶促或化学切割来完成。

特别地，为了允许通过亲和层析而纯化蛋白而连接的6个组氨酸的标签HisTag或这种类型的其它标记物应该被除去，因为其被描述对于可溶性TRAIL蛋白的肝毒性具有影响。

可以使用基于多种熟知的宿主细胞的异源表达系统，包括原核细胞：细菌，例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母；和真核细胞系（昆虫、哺乳动物、植物）。

优选地，由于培养和遗传操作的容易性和大量的获得的产物，使用大肠杆菌表达系统。因此，包含编码本发明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列将针对在大肠杆菌中的表达而进行优化，即，其将包含在大肠杆菌中表达优化的编码序列密码子，选自本领域已知的可能的序列变体。此外，表达载体将包含适合大肠杆菌的连接于编码序列的上述元件。

因此，在本发明的优选实施方式中，针对在大肠杆菌中表达而优化的包含编码本发明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列选自下组的多核苷酸序列：

SEQ.No.67,SEQ.No.68,SEQ.No.69,SEQ.No.70,SEQ.No.71,SEQ.No.72,SEQ.No.73,SEQ.No.74,SEQ.No.75,SEQ.No.76,SEQ.No.77,SEQ.No.78,SEQ.No.79,SEQ.No.80,SEQ.No.81,SEQ.No.82,SEQ.No.83,SEQ.No.84,SEQ.No.85,SEQ.No.86,SEQ.No.87,SEQ.No.88),SEQ.No.89,SEQ.No.90,SEQ.No.91,SEQ.No.92,SEQ.No.122,SEQ.No.123,SEQ.No.124,SEQ.No.125,SEQ.No.126,SEQ.No.127,SEQ.No.128,SEQ.No.129,SEQ.No.130,SEQ.No.131,SEQ.No.132,SEQ.No.133,SEQ.No.134,SEQ.No.135,SEQ.No.136,SEQ.No.137,SEQ.No.138,SEQ.No.139,SEQ.No.140,SEQ.No.141,SEQ.No.142,SEQ.No.143),SEQ.No.144,SEQ.No.145,SEQ.No.146,SEQ.No.147;SEQ.No.148,SEQ.No.149,和SEQ.No.150；

其分别编码具有对应于选自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白：

SEQ.No.1,SEQ.No.2,SEQ.No.3,SEQ.No.4,SEQ.No.5,SEQ.No.6,SEQ.No.7,SEQ.No.8,SEQ.No.9,SEQ.No.10,SEQ.No.11,SEQ.No.12,SEQ.No.13,SEQ.No.14,SEQ.No.15,SEQ.No.16,SEQ.No.17,SEQ.No.18,SEQ.No.19,SEQ.No.20,SEQ.No.21,SEQ.No.22),SEQ.No.23,SEQ.No.24,SEQ.No.25,SEQ.No.26,SEQ No.93,SEQ.No.94,SEQ.No.95,SEQ.No.96,SEQ.No.97,SEQ.No.98,SEQ.No.99,SEQ.No.100,SEQ.No.101,SEQ.No.102,SEQ.No.103,SEQ.No.104,SEQ.No.105,SEQ.No.106,SEQ.No.107,SEQ.No.108,SEQ.No.109,SEQ.No.110,SEQ.No.111,SEQ.No.112,SEQ.No.113,SEQ.No.114,SEQ.No.115,SEQ.No.116,SEQ.No.117和SEQ.No.118,SEQ.No.119,SEQ.No.120和SEQ.No.121。

在优选实施方式中，本发明还提供了适合于转化大肠杆菌的表达载体，其包含上述选自SEQ.NO.67至SEQ.NO.92和SEQ.NO.122至SEQ.NO.150的多核苷酸序列，以及以此类表达载体转化的大肠杆菌细胞。

转化，即将DNA序列导入细菌宿主细胞特别是大肠杆菌，通常在准备好摄取DNA的感受态细胞上进行，例如通过以钙离子在低温(4°C)处理，然后进行热击(37-42°C)或通过电穿孔进行。此类技术是熟知的并且通常由表达系统的生产商确定。

在大肠杆菌表达系统中过表达本发明的融合蛋白的程序将在下文详述。

本发明还提供了包含如上文所述的本发明的融合蛋白作为活性成分以及合适的药学上可接受的载体、稀释剂和常规辅助性成分的药物组合物。

药物组合物将包含有效量的本发明的融合蛋白和药学上可接受的溶解或分散于载体或稀释剂中的辅助性成分，优选是配制为单元剂型或包含多剂的制剂的药物制剂的形式。

药物形式和其配制方法以及其它成分、载体和稀释剂是本领域技术人员已知的并且在文献中有描述。例如，描述于下列专著：Remington's Pharmaceutical Sciences,ed.20,2000,Mack PublishingCompany,Easton,USA。

术语“药学上可接受的载体、稀释剂和辅助性成分”包含本领域已知的任何溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂（例如抗细菌剂、抗真菌剂）等渗剂。本发明的药学上可接受的载体可包含多种类型的载体、稀释剂和赋形剂，这取决于所选的施用途径和需要的剂型，例如液体、固体和气雾剂形式，用于口服、胃肠外、吸入、表面，以及所选的形式对于施用途径(例如注射)是否必须是无菌的。

本发明的药物组合物的优选施用途径是胃肠外，包括注射途径，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、肿瘤内或通过单次或连续静脉内输注。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以通过直接注射至肿瘤来施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可通过静脉内施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可皮下或腹膜内施用。

用于胃肠外施用的药物组合物可以是药学上可接受的水性或非水性介质中的溶液或分散体，所述介质缓冲至合适的pH和与体液等渗（如果必要），并且还可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和可溶性物质，其使得组合物与受体的组织或血液相容。可包含于组合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液体乙二醇，脂质例如甘油三酯，植物油，脂质体。合适的流动性和物质粒度可通过涂覆性物质例如卵磷脂和表面活性剂例如羟丙基纤维素、聚山梨酸酯等来提供。用于液体胃肠外组合物的合适的等渗剂是例如糖，例如葡萄糖，和氯化钠，及其组合。

或者，用于通过注射或输注施用的药物组合物可以是粉末形式，例如冻干的粉末，用于在临使用前以合适的载体例如无菌无热源水进行重构。

用于胃肠外施用的本发明的药物组合物也可具有经鼻施用的形式，包括溶液、喷雾剂或气雾剂。优选地，用于经鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等渗的或缓冲至保持从大约5.5至大约6.5的pH，以维持类似于鼻分泌物的性质。此外，其将包含防腐剂或稳定剂，例如熟知的鼻内制剂中包含的那些。

组合物可包含多种抗氧化剂，其延迟一种或多种成分的氧化。此外，为了防止微生物的作用，组合物可包含多种抗细菌和抗真菌试剂，包括例如，但不限于，尼铂金酯类，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和这种类型的类似的已知物质。

一般地，本发明的药物组合物可以包含例如至少大约0.01wt%的活性成分。更具体地，组合物可包含1%至75%重量的活性成分，或例如25%至60%重量，但不限于这些数值。

施用于患者包括人类的根据本发明的组合物的实际剂量将由物理和生理因素决定，例如体重、病况的严重性、被治疗的疾病的类型，之前或同时的治疗性干预，患者和施用途径。合适的单元剂量，总剂量和组合物中的活性成分的浓度将由主治医生决定。

组合物可例如以下列剂量施用：大约1μg/kg体重至大约1000mg/kg患者体重，例如5mg/kg体重至100mg/kg体重，或5mg/kg体重至500mg/kg体重。

融合蛋白和包含它的组合物显示出抗癌或抗肿瘤活性，可用于治疗癌症疾病。

本发明还提供了如上所述的本发明的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人类中的癌症疾病的用途。

本发明还提供了治疗哺乳动物包括人类中的癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用抗癌有效量的如上所述的本发明的融合蛋白，任选为合适的药物组合物的形式。

本发明的融合蛋白可用于治疗血液恶性肿瘤，例如白血病，肉芽肿病，骨髓瘤和其它血液恶性肿瘤。融合蛋白也可用于治疗实体瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，肾癌，脑癌等。

用于治疗癌症的融合蛋白的合适的施用途径特别为胃肠外途径：以注射或输注的形式、在组合物中和以适合于该施用途径的形式施用本发明的融合蛋白。

本发明将以下列一般性程序和具体融合蛋白的实例进行更详细的描述。

用于过表达融合蛋白的一般性程序

质粒的制备

靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以产生编码它的DNA序列，包含针对在大肠杆菌中的表达优化的密码子。此程序允许增大在大肠杆菌中进行靶蛋白合成的后续步骤的效率。然后自动化合成得到的核苷酸序列。另外，将限制性酶Ndel(在引导链的5’末端)和Xhol(在引导链的3’末端)的切割位点添加到得到的编码靶蛋白的基因中。它们用于将基因克隆进入载体pET28a(Novagen)。它们也可用于将编码蛋白的基因克隆进入其它载体。从该构建体表达而来的靶蛋白在N末端具有多聚组氨酸标签（6个组氨酸），其之前是凝血酶识别的位点，该位点用于后续通过亲和层析进行纯化。首先通过使用酶Ndel和Xhol对分离的质粒进行限制性分析、然后通过靶蛋白的整个阅读框的自动化测序来确认得到的构建体的正确性。用于测序的引物互补于存在于载体中的T7启动子的序列(5'-TAATACGACTCACTATAGG-3')和T7终止子的序列(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')。

得到的质粒用于在商业化大肠杆菌菌株中过表达靶融合蛋白，其根据生产商的推荐进行转化。在选择性培养基(LB琼脂，卡那霉素50μg/ml，1%葡萄糖)上获得的菌落用于制备LB液体培养基(补充了50μg/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的过夜培养物。在摇动的温育箱中生长大约15小时之后，培养物用于接种合适的培养物。

融合蛋白的过表达和纯化——一般程序A

以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.25-1mM。在25℃摇动温育后(3.5-20h)，将培养物在6,000g离心25分钟。

将细菌沉淀物重悬于含有50mM KH₂PO₄,0.5M NaCl,10mM咪唑,pH7.4的缓冲液中。将悬浮液在冰上超声8分钟(40%振幅，15秒脉冲，10秒间隔)。通过在20,000g、4℃离心40分钟而使得到的提取物澄清。以用于制备细菌细胞提取物的缓冲液平衡预处理Ni-Sepharose树脂(GE Healthcare)。然后使用离心提取物后获得的上清液将树脂在4℃过夜温育。然后将其载入色谱柱并以15-50倍体积的缓冲液50mM KH₂PO₄,0.5M NaCl,20mM咪唑,pH7.4洗涤。使用含有0.5M NaCl pH7.4的50mM KH₂PO₄缓冲液中的咪唑梯度从柱洗脱获得的蛋白。通过SDS-PAGE分析获得的级份。将合适的级份组合并以50mM Tris缓冲液,pH7.2,150mM NaCl,500mM L-精氨酸,0.1mM ZnSO₄,0.01%Tween20在4℃过夜透析，同时，以凝血酶切割Histag(1:50)。切割之后，使用Benzamidine Sepharose^TM树脂从靶融合蛋白分离凝血酶。通过SDS-PAGE电泳分析产物的纯度(Maniatis et al,Molecular Cloning.Cold Spring Harbor,NY,1982)。

融合蛋白的过表达和纯化——一般程序B

以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.5-1mM。在25℃摇动温育20h后，将培养物在6,000g离心25分钟。

将过表达后的细菌细胞在弗氏细胞压碎器中在含有50mMKH₂PO₄,0.5M NaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mM PMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8的缓冲液中破碎。通过在8,000g离心50分钟使得到的提取物澄清。使用获得的上清液过夜温育Ni-Sepharose树脂。然后将结合了蛋白的树脂载入色谱柱。为了洗掉含有非结合性蛋白的级份，以15-50倍体积的缓冲液50mM KH₂PO₄,0.5M NaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mM PMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8洗涤柱。然后，为了洗掉大部分的特异性与床结合的蛋白，以含有50mM KH₂PO₄,0.5M NaCl,500mM咪唑,10%甘油,0.5mM PMSF,pH7.5的缓冲液洗涤柱。通过SDS-PAGE分析获得的级份(Maniatis et al,Molecular Cloning.Cold Spring Harbor,NY,1982)。将含有靶蛋白的级份组合并以凝血酶切割(1U/4mg蛋白，16℃，8小时)以除掉多聚组氨酸标签。然后将级份以配制缓冲液(500mM L-精氨酸,50mM Tris,2,5mM ZnSO₄,pH7.4)透析。

使用2-D电泳表征融合蛋白

为了进一步表征获得的蛋白并精确选择色谱条件，测定了蛋白质的等电点。为此，使用了2维电泳(2-D)方法，根据下列程序以2步进行。

步骤1：在pH梯度和变性条件下进行蛋白的等电聚焦

通过与含有10%三氯乙酸和0.07%β-巯基乙醇/丙酮的沉淀溶液按照1:1的比例混合而沉淀浓度为1-2mg/ml的蛋白制剂。将混合物在-20℃温育30分钟，然后在15,000g、4℃离心25分钟。除去上清液并以冷的丙酮(含有0.07%β-巯基乙醇)洗涤沉淀物两次。然后蒸发残余的丙酮直至无可检测的气味。将蛋白沉淀物悬于250ml的复水缓冲液8M尿素,1%CHAPS,15mM DTT,0.5%两性电解质(GEHealthcare)，pH为pH3-11或6-11，取决于后续使用的条带。将蛋白溶液置于陶瓷室中进行等电聚焦，然后置于具有合适的pH值(3-11或6-11)的13cm DryStrip(GE Healthcare)中。使用矿物油层覆盖全部。将室置于Ettan IPGphor III装置中，根据下列程序(根据条带的尺寸和pH值分配)进行等电聚焦。

在20℃脱水16小时。

在固定的pH梯度在电场中聚焦

时间	电压
		1小时	500V
1小时	梯度500–1000V
		2小时30分钟	梯度1000–8000V
30分钟	8000V

然后，将含有聚焦的蛋白的条带在去离子水中洗涤1分钟，以考马斯亮蓝染色，然后脱色并存档为图像以标记蛋白的位置。以下列成分的缓冲液平衡脱色的条带2次各15分钟：50mM Tris-HCl pH8.8,6M尿素,1%DTT,2%SDS,30%甘油。

步骤2：通过SDS-PAGE在第二维上分离

将条带置于含有单一的孔/大小标准物中的12.5%的聚丙烯酰胺凝胶上，然后在200V的电压下进行SDS-PAGE3小时以进行分离。以考马斯亮蓝染色凝胶，然后使用适当的比例保存。通过基于大小标准物测定蛋白的分子量来鉴定蛋白，基于生产商(GE Healthcare)提供的曲线以6-11的标度(pH与从标记为阳极的末端条带的长度的%之比)，或基于通过等电聚焦校正试剂盒(GE Healthcare)通过实验测定的曲线以3-11的标度读取其IPI。

以下描述本发明的融合蛋白的代表性实例。

实施例1：SEQ.NO.1的融合蛋白

SEQ.No.1的蛋白是具有194个氨基酸的长度和22.7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了源自Bax蛋白的BH3结构域的16个氨基酸的肽(SEQ.NO.30)作为效应子肽。在效应子肽的16个氨基酸的序列的C末端连接了7个Arg/R残基的多聚精氨酸序列。多聚精氨酸序列辅助穿透细胞膜和将融合蛋白转运进入细胞。在多聚精氨酸序列和TRAIL结构域之间掺入了彼此相邻的被尿激酶uPA识别的序列(SEQ.NO.52)和被金属蛋白酶MMP识别的序列(SEQ.NO.51)，由此在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中被切割。

融合蛋白的结构示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.1和SEQ.NO.67，如下所示：

氨基酸序列:SEO·NO·1

1 KKLSECLKRI GDELDSRRRR RRRRVVRPLG LAGRVAAHIT GTRGRSNTLS

51 SPNSKNEKAL GRKINSWESS RSGHSFLSNL HLRNGELVIH EKGFYYIYSQ

101 TYFRFQEEIK ENTKNDKQMV QYIYKYTSYP DPILLMKSAR NSCWSKDAEY

151 GLYSIYQGGI FELKENDRIF VSVTNEHLID MDHEASFFGA FLVG

DNA序列:SEQ·N0·67

上述结构的氨基酸序列用作模板以产生其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序A，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS(二者都来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例2：SEQ.NO.2的融合蛋白

SEQ.No.2的融合蛋白是具有193个氨基酸的长度和22.5kDa的分子量的蛋白，其中在121-281TRAIL序列的N末端连接了源自Bid蛋白的16个氨基酸的肽(SEQ.NO.31)作为效应子肽。另外，在效应子肽的C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。多聚精氨酸序列辅助穿透细胞膜和将融合蛋白转运进入细胞。在多聚精氨酸序列和TRAIL序列之间掺入了彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列(SEQ.NO.51)和被尿激酶uPA识别的序列(SEQ.NO.52)，由此在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中被切割。

融合蛋白的结构示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.2和SEQ.NO.68，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.2

1 RNIARHLAQV GDSMDRRRRR RRRVVRPLGL AGRVAAHITG TRGRSNTLSS

51 PNSKNEKALG RKINSWESSR SGHSFLSNLH LRNGELVIHE KGFYYIYSQT

101 YFRFQEEIKE NTKNDKQMVQYIYKYTSYPD PILLMKSARN SCWSKDAEYG

151 LYSIYQGGIF ELKENDRIFV SVTNEHLIDM DHEASFFGAF LVG

DNA序列：SEQ.NO.68

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序A，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例3：SEQ.NO.3的融合蛋白

SEQ.No.3的融合蛋白是具有303个氨基酸的长度和34.2kDa的分子量的蛋白，其中在121-281TRAIL序列的C末端连接了核糖核酸酶RNase A的同源物(SEQ.NO.32)作为效应子肽。在多聚精氨酸序列和TRAIL序列之间掺入了彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列(SEQ.NO.51)和被尿激酶uPA识别的序列(SEQ.NO.52)，由此在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中被切割。

该蛋白还在TRAIL结构域序列与切割位点之间包含柔性的甘氨酸-丝氨酸连接子GGSG(SEQ.NO.57)。此外，在效应子肽的C末端，该蛋白包含靶向内质网的序列KEDL(SEQ.NO.56)，其也是整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.3和SEQ.NO.69，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.3

DNA序列：SEQ.NO.69

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序B，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例4：SEQ.NO.4的融合蛋白

SEQ.No.4的融合蛋白是具有293个氨基酸的长度和33.2kDa的分子量的蛋白，其中在121-281TRAIL序列的C末端连接了核糖核酸酶RNase A的同源物(SEQ.NO.32)作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间是柔性的甘氨酸-丝氨酸连接子GGGSGGGS(SEQ.NO.63)。

融合蛋白的结构示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.4和SEQ.NO.70，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.4

DNA序列：SEQ.NO.70

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序B，使用大肠杆菌菌株BL21DE3pLysSRIL(来自Stratagene)和Tuner(DE3)(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例5：SEQ.NO.5的融合蛋白

SEQ.No.5的融合蛋白是具有283个氨基酸的长度和31kDa的分子量的蛋白，其中在121-281TRAIL序列的C末端连接了细胞色素C(SEQ.NO.33)作为效应子肽。在TRAIL结构域与效应子蛋白的序列之间掺入了彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列(SEQ.NO.51)和被尿激酶uPA识别的序列(SEQ.NO.52)，由此在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中被切割。该蛋白还在TRAIL结构域序列与切割位点之间包含柔性的甘氨酸-丝氨酸连接子GGSG(SEQ.NO.57)。此外，在效应子肽的C末端，该蛋白包含靶向内质网的序列KEDL(SEQ.NO.56)，其也是整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.5和SEQ.NO.71，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.5

DNA序列：SEQ.NO.71

实施例6：SEQ.NO.6的融合蛋白

SEQ.No.6的融合蛋白是具有407个氨基酸的长度和45.2kDa的分子量的蛋白，其中在121-281TRAIL序列的C末端连接了细胞色素C(SEQ.NO.33)作为效应子肽。在TRAIL结构域与效应子蛋白的序列之间是被弗林蛋白酶识别的序列(SEQ.NO.53)和来自铜绿假单胞菌的转位结构域(SEQ.NO.54)。该蛋白还在TRAIL结构域序列与弗林蛋白酶识别的切割位点序列之间包含柔性连接子：柔性的甘氨酸-丝氨酸连接子GGGS(SEQ.NO.58)，在弗林蛋白酶识别的切割位点序列与来自铜绿假单胞菌的转位结构域之间是柔性的甘氨酸-丝氨酸连接子ASGG(SEQ.No.65)，在转位结构域序列和细胞色素C序列之间是柔性的甘氨酸-丝氨酸连接子GGGSGGG(SEQ.No.62)。此外，在效应子肽结构域的C末端，该蛋白包含靶向内质网的序列KEDL(SEQ.NO.56)，其也是整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.6和SEQ.NO.72，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.6

DNA序列：SEQ.NO.72

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序A，使用大肠杆菌菌株Tuner(DE3)(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例7：SEQ.NO.7的融合蛋白

SEQ.No.7的融合蛋白是具有409个氨基酸的长度和46.1kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL114-281序列的N末端连接了粒酶B(SEQ.NO.34)作为效应子肽。在TRAIL结构域与效应子肽粒酶B的序列之间是被弗林蛋白酶识别的序列(SEQ.NO.53)，另外两翼是柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGGS(SEQ.NO.59)。

融合蛋白的结构示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.7和SEQ.NO.73，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.7

DNA序列：SEQ.NO.73

实施例8：SEQ.NO.8的融合蛋白

SEQ.No.8的融合蛋白是具有405个氨基酸的长度和45.7kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了粒酶B(SEQ.NO.34)作为效应子肽。在TRAIL结构域与效应子肽的序列之间是被弗林蛋白酶识别的序列(SEQ.NO.53)，另外柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGS(SEQ.NO.58)和GGGGS(SEQ.NO.59)间隔粒酶B和TRAIL的序列。此外，在效应子肽的C末端是靶向内质网的序列KDEL，其是整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.8和SEQ.NO.74，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.8

DNA序列：SEQ.NO.74

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序A，使用大肠杆菌菌株Tuner(DE3)pLysS(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例9：SEQ.NO.9的融合蛋白

SEQ.No.9的融合蛋白是具有187个氨基酸的长度和21.9kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了源自Nur77蛋白的9个氨基酸的肽(SEQ.NO.35)作为效应子肽。在效应子肽的C末端另外连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。在效应子肽与TRAIL序列之间是金属蛋白酶MMP的切割位点(SEQ.NO.51)和尿激酶uPA的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.9和SEQ.NO.75，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.9

DNA序列：SEQ.NO.75

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序A，使用大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例10：SEQ.NO.10的融合蛋白

SEQ.No.10的融合蛋白是具有193个氨基酸的长度和22.4kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了含有Bak蛋白的BH3结构域的16个氨基的的肽(SEQ.NO.36)作为效应子肽。在效应子肽的C末端另外连接了由7个Arg残基组成的穿过膜的多聚精氨酸序列。在效应子肽与TRAIL序列之间是金属蛋白酶MMP的切割位点(SEQ.NO.51)和尿激酶uPA的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.10和SEQ.NO.76，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.10

DNA序列：SEQ.NO.76

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序A，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例11：SEQ.NO.11的融合蛋白

SEQ.No.11的融合蛋白是具有204个氨基酸的长度和24.3kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了PUMA/BBC3分子的BH3结构域(SEQ.NO.37)作为效应子肽。在效应子肽的C末端另外连接了由9个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。在效应子肽与TRAIL序列之间构建体还包含蛋白酶uPA的切割位点(SEQ.NO.52)和MMP的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.11和SEQ.NO.77，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.11

DNA序列：SEQ.NO.77

实施例12：SEQ.NO.12的融合蛋白

SEQ.No.12的融合蛋白是具有372个氨基酸的长度和41kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了PUMA蛋白(SEQ.NO.38)作为效应子肽。TRAIL序列和效应子序列之间是金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)，其另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSGG(SEQ.No.60)与TRAIL序列间隔开。此外，在效应子肽的C末端包含靶向内质网的KEDL序列(SEQ.NO.56)，其构成整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.12和SEQ.NO.78，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.12

DNA序列：SEQ.NO.78

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序B，使用大肠杆菌菌株B.21(DE3)(来自Novagen)和BL21DE3pLysSRIL(来自Stratagene)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例13：SEQ.NO.13的融合蛋白

SEQ.No.13的融合蛋白是具有493个氨基酸的长度和53.4kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了PUMA蛋白(SEQ.NO.38)作为效应子肽。此外，在TRAIL序列和PUMA蛋白序列之间是来自铜绿假单胞菌的转位结构域的序列(SEQ.NO.54)，其与TRAIL序列被连续的下列序列间隔开：柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGGS(SEQ.No.59)，弗林蛋白酶切割位点(SEQ.NO.53)和柔性丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸连接子ASGG(SEQ.NO.65)；其与PUMA蛋白被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSGG(SEQ.NO.60)间隔开。此外，在效应子肽的C末端包含靶向内质网的KEDL序列(SEQ.NO.56)，其构成整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.13和SEQ.NO.79，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.13

DNA序列：SEQ.NO.79

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序B，使用大肠杆菌菌株BL.21(DE3)(来自Novagen)和BL21DE3pLysSRIL(来自Stratagene)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例14：SEQ.NO.14的融合蛋白

SEQ.No.14的融合蛋白是具有186个氨基酸的长度和21.5kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了蛋白SMAC/Diablo的8个氨基酸的片段(SEQ.NO.39)作为效应子肽，在效应子肽的C末端另外连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。此外，在多聚精氨酸序列与TRAIL序列之间，该蛋白包含蛋白酶uPA的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.14和SEQ.NO.80，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.14

1 AVPIAQKPRR RRRRRRVVRP LGLAGRVAAH ITGTRGRSNT LSSPNSKNEK

51 ALGRKINSWE SSRSGHSFLS NLHLRNGELV IHEKGFYYIY SQTYFRFQEE

101 IKENTKNDKQ MVQYIYKYTS YPDPILLMKS ARNSCWSKDA EYGLYSIYQG

151 GIFELKENDR IFVSVTNEHL IDMDHEASFF GAFLVG

DNA序列：SEQ.NO.80

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序B，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)或Tuner(DE3)(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例15：SEQ.NO.15的融合蛋白

SEQ.No.15的融合蛋白是具有191个氨基酸的长度和22.2kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了buforinIIb(SEQ.NO.40)作为效应子肽。此外，在效应子肽与TRAIL序列之间，该蛋白包含蛋白酶uPA的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.15和SEQ.NO.81，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.15

1 RAGLQFPVGR LLRRLLRRLL RVVRPLGLAG RVAAHITGTR GRSNTLSSPN

51 SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR NGELVIHEKG FYYIYSQTYF

101 RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI LLMKSARNSC WSKDAEYGLY

151 SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH EASFFGAFLV G

DNA序列：SEQ.NO.81

实施例16：SEQ.NO.16的融合蛋白

SEQ.No.16的融合蛋白是具有279个氨基酸的长度和31.7kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了蛋白豹蛙酶(SEQ.NO.41)作为效应子肽。在TRAIL序列与效应子肽序列之间是MMP的切割位点序列(SEQ.NO.51)和蛋白酶uPA的切割位点序列(SEQ.NO.52)，与TRAIL序列之间另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGS(SEQ.NO.58)间隔开。

融合蛋白的结构示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.16和SEQ.NO.82，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.16

DNA序列：SEQ.NO.82

实施例17：SEQ.NO.17的融合蛋白

SEQ.No.17的融合蛋白是具有274个氨基酸的长度和31kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了蛋白豹蛙酶(SEQ.NO.41)作为效应子肽，效应子肽与TRAIL序列之间另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGGSGGGGS(SEQ.No.64)间隔开。

融合蛋白的结构示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.17和SEQ.NO.83，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.17

DNA序列：SEQ.NO.83

实施例18：SEQ.NO.18的融合蛋白

SEQ.No.18的融合蛋白是具有197个氨基酸的长度和23.2kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了包含蛋白p14ARF的N末端结构域的20个氨基酸的肽(SEQ.NO.42)作为效应子肽，在效应子肽的C末端另外连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。此外，在多聚精氨酸序列与TRAIL序列之间是蛋白酶uPA的切割位点(SEQ.NO.52)和MMP的切割位点(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.18和SEQ.NO.84，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.18

1 VRRFLVTLRI RRACGPPRVR RRRRRRRVVR PLGLAGRVAA HITGTRGRSN

51 TLSSPNSKNE KALGRKINSW ESSRSGHSFL SNLHLRNGEL VIHEKGFYYI

1Ol YSQTYFRFQE EIKENTKNDK QMVQYIYKYT SYPDPILLMK SARNSCWSKD

15l AEYGLYSIYQ GGIFELKEND RIFVSVTNEH LIDMDHEASF FGAFLVG

DNA序列：SEQ.NO.84

实施例19：SEQ.NO.19的融合蛋白

SEQ.No.19的融合蛋白是具有189个氨基酸的长度和22.3kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了结合Mdm2的11个氨基酸的肽(SEQ.NO.43)作为效应子肽，在效应子肽的C末端另外连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。此外，在多聚精氨酸序列与TRAIL序列之间是蛋白酶uPA的切割位点(SEQ.NO.52)和MMP的切割位点(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.19和SEQ.NO.85，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.19

1 PRFMDTWEGL NRRRRRRRRV VRPLGLAGRV AAHITGTRGR SNTLSSPNSK

51 NEKALGRKIN SWESSRSGHS FLSNLHLRNG ELVIHEKGFY YIYSQTYFRF

101 QEEIKENTKN DKQMVQYIYK YTSYPDPILL MKSARNSCWS KDAEYGLYSI

151 YQGGIFELKE NDRIFVSVTN EHLIDMDHEA SFFGAFLVGDNA序列：SEQ.NO.85

实施例20：SEQ.NO.20的融合蛋白

SEQ.No.20的融合蛋白是具有195个氨基酸的长度和22.9kDa的分子量的蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了源自lunasin的肽(SEQ.NO.44)作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间是由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列和蛋白酶uPA的切割位点(SEQ.NO.52)和MMP的切割位点(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.20和SEQ.NO.86，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.20

1 CEKHIMEKIQ GRGDDDDRRR RRRRRVVRPL GLAGRVAAHI TGTRGRSNTL

51 SSPNSKNEKA LGRKINSWES SRSGHSFLSN LHLRNGELVI HEKGFYYIYS

101 QTYFRFQEEI KENTKNDKQM VQYIYKYTSY PDPILLMKSA RNSCWSKDAE

15l YGLYSIYQGG IFELKENDRI FVSVTNEHLI DMDHEASFFG AFLVG

DNA序列：SEQ.NO.86

实施例21：SEQ.NO.21的融合蛋白

SEQ.No.21的蛋白是具有218个氨基酸的长度和25.5kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了蛋白Smac/Diablo的8个氨基酸的片段(SEQ.NO.39)作为效应子肽，其C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。此外，在TRAIL121-281序列的C末端连接了包含Bik蛋白的BH3结构域的肽(SEQ.NO.45)作为第二效应子肽，所述第二效应子肽在其N末端具有由7个Arg残基组成的多聚精氨酸序列。在TRAIL序列和具有多聚精氨酸序列的两个效应子肽之间是被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.21和SEQ.NO.87，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.21

DNA序列：SEQ.NO.87

实施例22：SEQ.NO.22的融合蛋白

SEQ.No.22的蛋白是具有199个氨基酸的长度和22.3kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了由Gly、Ala重复序列组成的合成肽序列(SEQ.NO.46)作为效应子肽，其C末端还连接了由8个Arg残基组成的多聚精氨酸序列，后者也构成整个构建体的C末端部分。此外，在效应子肽和TRAIL序列之间是被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.22和SEQ.NO.88，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.22

1 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR

51 NGELVIHEKG FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI

101 LLMKSARNSC WSKDAEYGLY SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH

151 EASFFGAFLV GRVVRPLGLA GAGAGGGAGG AGAGGGAGGA GRRRRRRRR

DNA序列：SEQ.NO.88

实施例23：SEQ.NO.23的融合蛋白

SEQ.No.23的蛋白是具有289个氨基酸的长度和32.6kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了含有UIM基序的蛋白酶体成分S5a的C末端结构域(SEQ.NO.47)作为效应子肽。此外，在效应子肽和TRAIL序列之间是弗林蛋白酶切割位点序列(SEQ.NO.53)，其与TRAIL序列另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGSGG(SEQ.No.61)间隔开，在效应子肽的C末端是靶向内质网的KEDL序列(SEQ.NO.56)，后者是整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.23和SEQ.NO.89，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.23

DNA序列：SEQ.NO.89

上述氨基酸序列用作模板以产生上述的其编码DNA序列。产生了包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行了融合蛋白的过表达。根据一般程序B，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)or Tuner(DE3)(来自Novagen)进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白质。

实施例24：SEQ.NO.24的融合蛋白(比较性)

SEQ.No.24的蛋白是具有183个氨基酸的长度和21kDa的分子量的融合蛋白，其中在119-281TRAIL序列的N末端连接了源自TNF配体的十肽(SEQ.NO.48)作为效应子肽。此外，在效应子肽和TRAIL序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.24和SEQ.NO.90，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.24

1 VANPQAEGQL RVVRPLGLAG PQRVAAHITG TRGRSNTLSS PNSKNEKALG

51 RKINSWESSR SGHSFLSNLH LRNGELVIHE KGFYYIYSQT YFRFQEEIKE

101 NTKNDKQMVQ YIYKYTSYPD PILLMKSARN SCWSKDAEYG LYSIYQGGIF

151 ELKENDRIFV SVTNEHLIDM DHEASFFGAF LVG

DNA序列：SEQ.NO.90

实施例25：SEQ.NO.25的融合蛋白(比较性)

SEQ.No.25的蛋白是具有179个氨基酸的长度和20.7kDa的分子量的融合蛋白，其中在119-281TRAIL序列的N末端连接了源自TNF配体的6个氨基酸的肽(SEQ.NO.49)作为效应子肽。此外，在效应子肽和TRAIL序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.25和SEQ.NO.91，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.25

1 LANGVERVVR PLGLAGPQRV AAHITGTRGR SNTLSSPNSK NEKALGRKIN

51 SWESSRSGHS FLSNLHLRNG ELVIHEKGFY YIYSQTYFRF QEEIKENTKN'

101 DKQMVQYIYK YTSYPDPILL MKSARNSCWS KDAEYGLYSI YQGGIFELKE

151 NDRIFVSVTN EHLIDMDHEA SFFGAFLVG

DNA序列：SEQ.NO.91

实施例26：SEQ.NO.26的融合蛋白(比较性)

SEQ.No.26的蛋白是具有180个氨基酸的长度和20.8kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL119-281序列的N末端连接了TNF细胞因子的5个氨基酸的片段(SEQ.NO.50)作为效应子肽，在其C末端和N末端还有1个Cys残基。此外，在效应子肽和TRAIL序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.26和SEQ.NO.92，如下所示：

氨基酸序列：SEQ.NO.26

1 CPSEGLCRVV RPLGLAGPQR VAAHITGTRG RSNTLSSPNS KNEKALGRKI

51 NSWESSRSGH SFLSNLHLRN GELVIHEKGF YYIYSQTYFR FQEEIKENTK

101 NDKQMVQYIY KYTSYPDPIL LMKSARNSCW SKDAEYGLYS IYQGGIFELK

151 ENDRIFVSVT NEHLIDMDHE ASFFGAFLVG

DNA序列：SEQ.NO.92

实施例27：SEQ.NO.93的融合蛋白

SEQ.No.93的蛋白是具有459个氨基酸的长度和50.4kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的C末端连接了全长人RNAse A(SEQ.NO.32)作为效应子肽，在其C末端是靶向内质网的序列(KDEL)，在其N末端是柔性甘氨酸-丝氨酸连接子(SEQ.NO.175)。另外，为了稳定其三聚体结构，TRAIL的序列在其N末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.179)，其N末端是甘氨酸残基。此外，在TRAIL的序列和效应子肽的序列之间是给定顺序的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子(SEQ.NO.59)、用于聚乙二醇化的连接子(SEQ.NO.170)、弗林蛋白酶识别的切割位点序列(SEQ.NO.53)、柔性的甘氨酸-丝氨酸连接子(SEQ.NO.65)和修饰的铜绿假单胞菌转位结构域(螺旋F删除)(SEQ.NO.176)。

融合蛋白的结构示于图6，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.93和SEQ.NO.122。

实施例28：SEQ.NO.94的融合蛋白

SEQ.No.94的蛋白是具有213个氨基酸的长度和24.7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的N末端连接了Nur77衍生的肽(SEQ.NO.35)作为效应子肽。效应子肽的序列的N末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。在效应子肽的序列与TRAIL序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

实施例29：SEQ.NO.95的融合蛋白

SEQ.No.95的蛋白是具有204个氨基酸的长度和23.1kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL116-281序列的N末端连接了azurin衍生的肽(SEQ.NO.151)作为效应子肽。在效应子肽的序列与TRAIL序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图6，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.95和SEQ.NO.124。

实施例30：SEQ.NO.96的融合蛋白

SEQ.No.96的蛋白是具有205个氨基酸的长度和23.3kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL120-281序列的C末端连接了azurin衍生的肽(SEQ.NO.151)作为效应子肽。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是弗林蛋白酶蛋白酶识别的切割位点序列(SEQ.NO.172)，其与TRAIL序列之间另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGS(SEQ.NO.58)间隔开。效应子肽的C末端是靶向内质网的序列KEDL(SEQ.NO.56)，其构成整个构建体的C末端部分。

融合蛋白的结构示于图6，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.96和SEQ.NO.125。

实施例31：SEQ.NO.97的融合蛋白

SEQ.No.97的蛋白是具有207个氨基酸的长度和23.1kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL120-281序列的C末端连接了azurin衍生的肽(SEQ.NO.151)作为效应子肽。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)，与TRAIL的序列另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGSGGG(SEQ.No.62)间隔开。

融合蛋白的结构示于图6，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.97和SEQ.NO.126。

实施例32：SEQ.NO.98的融合蛋白

SEQ.No.97的蛋白是具有327个氨基酸的长度和36.2kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL120-281序列的C末端连接了全长azurin肽(SEQ.NO.152)作为效应子肽。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)，与TRAIL的序列另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGSGGG(SEQ.No.62)间隔开。

融合蛋白的结构示于图7，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.98和SEQ.NO.127。

实施例33：SEQ.NO.99的融合蛋白

SEQ.No.99的蛋白是具有199个氨基酸的长度和22.9kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL114-281序列的N末端连接了Smac/DIABLO衍生的八肽(SEQ.NO.39)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图7，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.99和SEQ.NO.128。

实施例34：SEQ.NO.100的融合蛋白

SEQ.No.100的蛋白是具有221个氨基酸的长度和25.2kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的N末端连接了Smac/DIABLO衍生的八肽(SEQ.NO.39)作为效应子肽。TRAIL的序列在其N末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.177)用于稳定其三聚体结构。效应子肽的序列在其C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，在效应子肽与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图7，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.100和SEQ.NO.129。

实施例35：SEQ.NO.101的融合蛋白

SEQ.No.101的蛋白是具有212个氨基酸的长度和24.5kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的N末端连接了Smac/DIABLO衍生的八肽(SEQ.NO.39)作为效应子肽。效应子肽在其C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图7，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.101和SEQ.NO.130。

实施例36：SEQ.NO.102的融合蛋白

SEQ.No.102的蛋白是具有212个氨基酸的长度和24.5kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了从app蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽(SEQ.NO.153)作为效应子肽。效应子肽在其C末端连接了由6个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图7，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.102和SEQ.NO.131。

实施例37：SEQ.NO.103的融合蛋白

SEQ.No.103的蛋白是具有247个氨基酸的长度和28.1kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的N末端连接了从app蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽(SEQ.NO.153)作为效应子肽。效应子肽在其C末端连接了由6个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。TRAIL的序列在其N末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.177)以稳定化其三聚体结构。此外，在效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图8，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.103和SEQ.NO.132。

实施例38：SEQ.NO.104的融合蛋白

SEQ.No.104的蛋白是具有212个氨基酸的长度和24.4kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL114-281序列的C末端连接了从app蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽(SEQ.NO.153)作为效应子肽。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图8，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.104和SEQ.NO.133。

实施例39：SEQ.NO.105的融合蛋白

SEQ.No.105的蛋白是具有221个氨基酸的长度和24.8kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL120-281序列的N末端连接了Reticulon RTN1-C衍生的肽(SEQ.NO.155)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了细胞核定位序列SEQ.NO.168。另外，为了稳定其三聚体结构，TRAIL的序列在其N末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.179)，其N末端和C末端分别是2个和3个甘氨酸残基。此外，在效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图8，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.105和SEQ.NO.134。

实施例40：SEQ.NO.106的融合蛋白

SEQ.No.106的蛋白是具有435个氨基酸的长度和48kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL119-281序列的N末端连接了ReticulonRTN1-C衍生的肽(SEQ.NO.156)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了由8个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。另外，为了稳定其三聚体结构，TRAIL的序列在其N末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.178)。此外，在效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)，该切割位点序列在其N和C末端分别侧接连接子序列GGSGG(SEQ.NO.60)。

融合蛋白的结构示于图8，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.106和SEQ.NO.135。

实施例41：SEQ.NO.107的融合蛋白

SEQ.No.107的蛋白是具有580个氨基酸的长度和65kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了组成型活性的胱天蛋白酶-3(单链)(SEQ.NO.157)作为效应子肽。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是源自假单胞菌的转运结构域(SEQ.NO.176)。转运结构域与效应子肽的序列通过柔性连接子GGGSGGG(SEQ.No.62)连接。转运结构域与TRAIL的序列通过弗林蛋白酶识别的切割位点序列(SEQ.NO.53)被间隔开，该切割位点序列在其N和C末端分别侧接2个连接子序列GGGGS(SEQ.No.59)和ASGG(SEQ.No.65)。

融合蛋白的结构示于图8，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.107和SEQ.NO.136。

实施例42：SEQ.NO.108的融合蛋白

SEQ.No.108的蛋白是具有247个氨基酸的长度和28.5kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL119-281序列的N末端连接了来自Par-4的SAC结构域(SEQ.NO.158)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。另外，TRAIL的序列在其N末端连接了柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSGG(SEQ.No.60)。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.173)。

融合蛋白的结构示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.108和SEQ.NO.137。

实施例43：SEQ.NO.109的融合蛋白

SEQ.No.109的蛋白是具有247个氨基酸的长度和28.5kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL119-281序列的N末端连接了来自Par-4的SAC结构域(SEQ.NO.158)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域，在其N末端连接了来自Oct6转录因子的NLS(细胞核定位信号)(SEQ.NO.168)。TRAIL的序列在其N末端连接了柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSGG(SEQ.No.60)。此外，在效应子肽与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.173)。

融合蛋白的结构示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.109和SEQ.NO.138。

实施例44：SEQ.NO.110的融合蛋白

SEQ.No.110的蛋白是具有270个氨基酸的长度和30.8kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的C末端连接了Noxa蛋白(SEQ.NO.159)作为效应子肽。效应子肽的序列在其N末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。另外，为了稳定其三聚体结构，TRAIL的序列在其C末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.No.177)，与TRAIL的序列被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSG(SEQ.No.57)间隔开。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.110和SEQ.NO.139。

实施例45：SEQ.NO.111的融合蛋白

SEQ.No.111的蛋白是具有207个氨基酸的长度和23.7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL114-281序列的C末端连接了源自Noxa蛋白的MTD/CKP肽(SEQ.NO.160)作为效应子肽。效应子肽的序列在其N末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。为了稳定其三聚体结构，TRAIL的序列在其C末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.No.177)，该连接子与TRAIL的序列被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSG(SEQ.NO.57)间隔开。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.111和SEQ.NO.140。

实施例46：SEQ.NO.112的融合蛋白

SEQ.No.112的蛋白是具有311个氨基酸的长度和35kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的N末端连接了豹蛙酶（onconase）(SEQ.NO.41)作为效应子肽。此外，在效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)，与TRAIL的序列另外被两个柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGGS(SEQ.No.59)间隔开。

融合蛋白的结构示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.112和SEQ.NO.141。

实施例47：SEQ.NO.113的融合蛋白

SEQ.No.113的蛋白是具有230个氨基酸的长度和27kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的N末端连接了来自PUMA蛋白的BH3结构域(SEQ.NO.37)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了由9个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图10，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.113和SEQ.NO.142。

实施例48：SEQ.NO.114的融合蛋白

SEQ.No.114的蛋白是具有225个氨基酸的长度和25.7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的C末端连接了源自Bid蛋白的短肽(SEQ.NO.31)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了转运结构域KPRRPY(SEQ.No.167)。为了稳定其三聚体结构，TRAIL的序列在其C末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.177)。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。

融合蛋白的结构示于图10，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.114和SEQ.NO.143。

实施例49：SEQ.NO.115的融合蛋白

SEQ.No.115的蛋白是具有234个氨基酸的长度和26.7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的C末端连接了杂合肽Antp-TPR(SEQ.NO.161)作为效应子肽。此外，在TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)，与TRAIL序列另外被多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.177)间隔开以稳定其三聚体结构，后跟2个甘氨酸残基。

融合蛋白的结构示于图10，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.115和SEQ.NO.144。

实施例50：SEQ.NO.116的融合蛋白

SEQ.No.116的蛋白是具有216个氨基酸的长度和24.3kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL120-281序列的N末端连接了Stat3蛋白的SH2结构域的抑制剂(SEQ.NO.162)作为效应子肽。另外，为了稳定其三聚体结构，在TRAIL的序列的N末端连接了多聚半胱氨酸连接子(SEQ.NO.179)，该连接子在其N和C末端分别侧接3个甘氨酸残基和GSG基序。此外，效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图10，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.116和SEQ.NO.145。

实施例51：SEQ.NO.117的融合蛋白

SEQ.No.117的蛋白是具有194个氨基酸的长度和22.8kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了源自Bak蛋白的BH3结构域的肽(SEQ.NO.163)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。

融合蛋白的结构示于图10，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.117和SEQ.NO.146。

实施例52：SEQ.NO.118的融合蛋白

SEQ.No.118的蛋白是具有257个氨基酸的长度和30kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端连接了源自Bad蛋白的BH3结构域的肽(SEQ.NO.164)作为效应子肽。效应子肽的序列在其C末端连接了由8个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)。在TRAIL121-281的序列的C末端是柔性连接子GGSHG(SEQ.No.182)，后跟凝血酶识别的切割位点序列(SEQ.NO.174)，以及作为整个构建体的C末端部分的TRAIL95-121的序列。

融合蛋白的结构示于图11，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.118和SEQ.NO.147。

实施例53：SEQ.NO.119的融合蛋白

SEQ.No.119的蛋白是具有236个氨基酸的长度和27.5kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL95-281序列的C末端连接了源自Bad蛋白的BH3结构域的肽(SEQ.NO.164)作为效应子肽。效应子肽的序列在其N末端连接了由7个Arg残基组成的多聚精氨酸转运结构域。此外，TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)。在TRAIL95-281的序列的C末端与切割位点序列另外被由GGS残基组成的连接子间隔开。

融合蛋白的结构示于图11，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.119和SEQ.NO.148。

实施例54：SEQ.NO.120的融合蛋白

SEQ.No.120的蛋白是具有216个氨基酸的长度和24.7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了来自Bfl1蛋白的ATAP肽(SEQ.NO.165)作为效应子肽。效应子肽的序列在其N末端连接了膜转运结构域KPRRPYR(SEQ.No.181)。此外，TRAIL的序列与效应子肽的序列之间是蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)和uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)，与TRAIL的序列另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGGGSGGGG(SEQ.No.180)间隔开。

融合蛋白的结构示于图11，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.120和SEQ.NO.149。

实施例55：SEQ.NO.121的融合蛋白

SEQ.No.120的蛋白是具有237个氨基酸的长度和27kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的C末端连接了来自Bfl1蛋白的ATAP肽(SEQ.NO.165)作为效应子肽。效应子肽的序列在其N末端连接了线粒体靶向序列(SEQ.No.166)。此外，效应子肽的序列与TRAIL的序列之间是蛋白酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.NO.52)和MMP识别的切割位点序列(SEQ.NO.51)，与TRAIL的序列另外被柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSGG(SEQ.No.60)间隔开。

融合蛋白的结构示于图11，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别是SEQ.NO.121和SEQ.NO.150。

融合蛋白的抗肿瘤活性的测定

通过细胞毒性测定法在肿瘤细胞系中体外进行并在小鼠中体内进行融合蛋白的抗肿瘤活性的测定。为了比较目的，使用了hTRAIL114-281蛋白(下文也简单称作TRAIL)。

1.在体外在细胞系中测定

细胞系

人结肠直肠癌Colo205(ATCC#CCL-222)、小细胞肺癌A549(ATCC#CCL-185)、胰腺癌BxPC3(ATCC#CRL-1687)、前列腺癌DU145(ATCC#HTB-81)和PC3(ATCC#CRL-1435)以及人大细胞肺癌NCI-H460-Luc2(Caliper#124316)维持在补充了10%胎牛血清的RPMI1640培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)中。人卵巢癌细胞OVCAR-3(ATCC#HTB-161)维持于补充了20%胎牛血清和0.01mg/ml胰岛素的RPMI1640培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)中。膀胱癌细胞UM-UC-3(ATCC#CRL-1749)、肺癌细胞SK-MES-1(ATCC#HTB-58)、乳腺癌细胞MCF-7(ATCC#HTB-22)、HT1080结缔组织癌细胞(ATCC#CCL-121)、肝细胞癌HepG2细胞(ATCC#HB-8065)维持于补充了10%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT,USA)的MEM培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)中。结缔组织肿瘤细胞HT1080在实验中也维持于条件化培养基中，从正常培养2天的这些细胞收获。人结肠直肠癌HCT-116(ATCC#CCL-247)和HT-29(HTB-38)、卵巢癌SK-OV-3(ATCC#HTB-77)、子宫癌MES-SA(ATCC#CRL-1976)及其对于阿霉素有抗性的克隆MES-SA/Dx5(ATCC#CRL-1977)维持于补充了10%胎牛血清的McCoy's培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)中。膀胱癌细胞SW780(ATCC#CRL-2169)、乳腺癌细胞MDA-MB-231(ATCC#HTB-26)和人胰腺癌上皮样细胞系PANC-1,CLS(Cell Lines Service#300228)维持于补充了10%胎牛血清的DMEM(Hyclone,Logan,UT,USA)中。来自脐带静脉的HUVEC细胞(ATCC#CRL-1730)维持于补充了20%胎牛血清、生长因子0.02mg/ml ECGS(Sigma),0.1mg/ml肝素(Sigma)的M199培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)中。这些细胞生长于涂覆了0.1%明胶的培养基中。MCF10A乳腺细胞(ATCC#CRL-10317)维持于补充了5%马血清、0.5mg/ml氢化可的松、10μg/ml胰岛素、20ng/ml生长因子EGF(全部为Sigma,USA)的DMEM:F12(1:1)(Sigma,USA)中。所有的培养基另外补充2mM L-谷氨酰胺和抗生素(100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素(Hyclone,Logan,UT,USA))。在RPMI,MEM,McCoy和DMEM:F12培养基的情况下，细胞于37°C维持于5%CO₂/空气中；在DMEM的情况下，细胞维持于10%CO₂/空气中。使用试剂盒Venor

GeM Mycoplasma PCR Detection Kit(Minerva Biolabs,Berlin,Germany)，通过PCR技术常规检查细胞是否存在支原体。

MTT细胞毒性测试

MTT测试法是用于测定细胞增殖、存活性和细胞毒性的比色测定法。黄色的四唑盐MTT(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)通过存在于线粒体中的酶琥珀酸盐-四唑还原酶分解为不溶于水的紫色染料甲瓒。MTT还原仅在活细胞中发生。数据分析：测定蛋白的IC₅₀浓度(ng/ml)，即相对于对照细胞，经处理的群体中的细胞数目减少50%时的蛋白浓度。使用GraphPad Prism5.0分析结果。

根据文献中的描述进行测试(Celis,JE,(1998).Cell Biology,aLaboratory Handbook,second edition,Academic Press,San Diego;Yang,Y.,Koh,LW,Tsai,JH.,(2004);Involvment of viral and chemi-cal factors with oral cancer in Taiwan,Jpn J Clin Oncol,34(4),176-183)。

将细胞培养基稀释至确定的密度(10⁴-10⁵个细胞/100μl)。然后将100μl适当稀释的细胞悬浮液加至96孔板中，一式三份。将这样制备的细胞在37°C在5%或10%CO₂(取决于所用的培养基)中温育24小时，然后向细胞(在100μl培养基中)中再加入100μl含有多种浓度的测试蛋白的培养基中。将细胞与测试蛋白温育72小时，相当于3-4次细胞分裂，然后向含有测试蛋白的培养基中加入20ml MTT工作溶液[5mg/ml]，并在37°C在5%CO₂中温育3小时。然后除去含有MTT溶液的培养基，通过加入100μl DMSO溶解甲瓒晶体。混合之后，在570nm(参考滤波器690nm)测定吸收值。

体外细胞毒性测试的结果以IC₅₀值(ng/ml)总结于表1、1a、1b和表2中，IC₅₀值对应于：相对于仅以溶剂温育的对照细胞，在50%水平观察到融合蛋白的细胞毒性效应时的蛋白浓度。每个实验代表按照一式三份进行的至少2次独立实验的平均值。作为缺乏蛋白制剂活性的标准，采用了2000ng/ml的IC₅₀限值。具有大于2000的IC₅₀值的融合蛋白被认为是无活性的。

选择用于此测试的细胞使得包括对于TRAIL蛋白具有天然抗性的肿瘤细胞系(对于TRAIL的天然抗性的标准：对于TRAIL蛋白IC₅₀>2000)，对于TRAIL蛋白敏感的肿瘤细胞系，对于阿霉素抗性的细胞系MES-SA/DX5作为对于常规抗癌药物有抗性的癌细胞系。

未分化的HUVEC细胞系用作健康对照细胞系，用于测定融合蛋白对于非癌细胞的影响/毒性。

获得的结果确认了通过向对于TRAIL具有天然抗性的细胞施用本发明的某些融合蛋白而克服细胞系对于TRAIL的抗性的可能性。当将本发明的融合蛋白施用于对于TRAIL敏感的细胞时，在一些情况下观察到TRAIL作用效力的明显的、强烈的加强，表现为融合蛋白的IC₅₀值相对于单独的TRAIL的IC₅₀降低。此外，在对于常规抗癌药物阿霉素有抗性的细胞中获得了本发明的融合蛋白的细胞毒性活性，在一些情况下比TRAIL的活性更强。

对于非癌细胞系所获得的大于2000的IC₅₀值显示：对于健康细胞使用本发明的蛋白，不存在毒性效应，这表明这些蛋白的潜在的低系统性毒性。

2.选择的蛋白制剂对于延伸的肿瘤细胞系组的细胞毒性活性的分析

表2显示了选择的本发明的融合蛋白针对来自不同器官的一大组肿瘤细胞(对应于宽范围的多数常见癌症)的体外细胞毒性活性结果。获得的IC₅₀值确认了融合蛋白的高细胞毒性活性，由此确认了它们对于治疗癌症的潜在有用性。

表2：选择的蛋白制剂针对一大组肿瘤细胞系的细胞毒性活性的分析

3.融合蛋白在体内对于异种移植物的抗肿瘤有效性

在人结肠癌Colo205、人大细胞肺癌NCI-H460-Luc2、人肺癌A549和人胰腺癌PANC-1的小鼠模型中测试了蛋白制剂的抗肿瘤活性。

细胞

Colo205细胞(ATCC#CCL-222)维持于以1:1比例混合的补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)和Opti-MEM((Invitrogen,Cat.22600-134)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至28.57x10⁶个细胞/ml的浓度。然后向细胞中加入Matrigel(BD Biocsciences,Cat.354248)至25x10⁶细胞/ml的最终细胞浓度。

H460-Luc2细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至50x10⁶个细胞/ml的浓度。

A549细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。

人胰腺癌PANC-1细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。

小鼠

在获自Harlan UK Ltd.,Shaws Farm,Bicester,UK的7-9周龄的NOD SCID小鼠中进行本发明的蛋白的抗肿瘤活性测定。在A549,NCI-H460-Luc2和PANC-1细胞的情况下，在获自Charles RiverGermany的4-5周龄Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr小鼠中进行本发明的蛋白的抗肿瘤活性的测定。将小鼠保持于特定的无病原体条件下，自由获取食物和去矿物水(随意)。所有的动物实验根据下列指引进行："Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals inResearch,Marketing and Education"，由New York Academy ofSciences'Ad Hoc Committee on Animal Research颁布并由IV LocalEthics Committee on Animal Experimentation in Warsaw(No.71/2009)批准。

实验进程和评价

在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(sc)移植悬于0.15ml HBSS缓冲液和0.05ml Matrigel中的5x10⁶个Colo205细胞。当肿瘤达到～90-140mm³(第11天)时，将小鼠随机化以获得～115mm³的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以本发明的融合蛋白制剂，以TRAIL114-281作为对比。在第11-20天每日腹膜内(ip)施用制剂，持续10天(qdx10)。当治疗组达到～2000mm³的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受TRAIL114-281。

在H460的情况下，在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(sc)移植悬于0.1ml HBSS缓冲液中的5x10⁶个NCI-H460-Luc2细胞。当肿瘤达到～100-120mm³(第11天)时，将小鼠随机化并分为不同的处理组。处理组施以本发明的融合蛋白制剂，以TRAIL114-281作为对比。隔日静脉内(i.v.)施用制剂，每日6次。在实验的第29天，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受TRAIL114-281。

在A549的情况下，在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(sc)移植悬于0.1ml HBSS缓冲液和Matrigel混合物(3:1)中的7x10⁶个A549细胞。当肿瘤达到～100-120mm³(第17天)时，将小鼠随机化并分为不同的处理组。处理组施以本发明的融合蛋白制剂，以TRAIL114-281作为对比。隔日静脉内(i.v.)施用制剂，每日6次。在实验的第34天，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受TRAIL114-281。

在PANC-1的情况下，在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(sc)移植悬于0.1ml HBSS缓冲液和Matrigel混合物(3:1)中的7x10⁶个PANC-1细胞。当肿瘤达到～95mm³(第27天)时，将小鼠随机化并分为不同的处理组。处理组施以本发明的融合蛋白制剂，以TRAIL114-281作为对比。隔日静脉内(i.v.)施用制剂，每日6次。在实验的第43天，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受TRAIL114-281。

使用电子卡尺测定肿瘤大小，使用公式(a²x b)/2计算肿瘤体积，其中a=肿瘤的较短的对角线(mm)，b=肿瘤的较长的对角线(mm)。使用下列公式计算肿瘤生长的抑制：

TGI[%](肿瘤生长抑制)=(WT/WC)x100-100%

其中WT是指处理组中的平均肿瘤体积，WC是指对照组中的平均肿瘤体积。

实验结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用程序GraphPadPrism5.0进行所有计算和作图。

实验结果显示于图12和13，显示为以本发明的融合蛋白和用于比较的TRAIL114-281处理的负载了Colo205结肠癌的SCID/NOD小鼠中的肿瘤体积的变化图。图12和13的图形中显示的实验结果表明：施用实施例1和14的本发明的融合蛋白引起肿瘤Colo205生长抑制，在实验的第29天相对于对照TGI分别为39%和32%。对于用作参考制剂的TRAIL114-281，观察到对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应(相对于对照)，TGI水平是9%。因此，本发明的融合蛋白相对于TRAIL显示出强得多的效应。

所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10%的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。

图14和15的图形中显示的实验结果显示了以本发明的融合蛋白和作为比较的TRAIL114-281处理的负载了NCI-H460人大细胞肺癌的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积的变化图。可以看出：通过施用实施例14和实施例2的本发明的融合蛋白，获得了NCI-H460肿瘤生长的抑制，在实验的第29天相对于对照TGI分别为82%和81%。对于用作参考制剂的TRAIL114-281，观察到对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应(相对于对照)，TGI水平是75%。因此，本发明的融合蛋白相对于TRAIL显示出对于这种癌细胞强得多的效应。

图16和17的图形中显示的实验结果显示了以本发明的融合蛋白和作为比较的TRAIL114-281处理的负载了A549人肺癌的Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr小鼠中的肿瘤体积的变化图。可以看出：通过施用实施例14和实施例2的本发明的融合蛋白，获得了A549肿瘤生长的抑制，在实验的第29天相对于对照TGI分别为48%和45.5%。对于用作参考制剂的TRAIL114-281，观察到对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应(相对于对照)，TGI水平是20.7%。因此，本发明的融合蛋白相对于TRAIL显示出强得多的效应。

图18和19的图形中显示的实验结果显示了以本发明的融合蛋白和作为比较的TRAIL114-281处理的负载了PANC-1人胰腺癌上皮细胞样细胞的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积的变化图。可以看出：通过施用实施例14和实施例2的本发明的融合蛋白，获得了PANC-1肿瘤生长的抑制，在实验的第43天相对于对照TGI分别为41.5%和49.8%。对于用作参考制剂的TRAIL114-281，获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应(相对于对照)，TGI水平是32%。因此，本发明的融合蛋白相对于TRAIL显示出强得多的效应。

圆二色性-本发明的融合蛋白制剂中的二级结构含量的测定

通过使用圆二色性(CD)分析二级结构测定了融合蛋白制剂的结构的质量。CD方法使用蛋白结构的光学活性，表现为使光偏振平面旋转和椭圆偏振的出现。远紫外(UV)中的蛋白的CD光谱提供了关于主要多肽链的构象的精确数据。

Ex.1,Ex.2,Ex.14,Ex.24,Ex.51和Ex.42中制备的蛋白的样品配制于由50mM Tris-HCl pH8,0,100mM NaCl,10%甘油,0.1mMZnCl₂,80mM蔗糖,5mM DTT组成的缓冲液中，然后在具有12kD截留值的透析袋(Sigma-Aldrich)中透析。在透析的同时以相对于蛋白制剂100倍过量(v/v)的缓冲液进行搅拌，在4°C持续数个小时。透析完成之后，将每个制剂离心(25000rpm,10min,4°C)，收集适当的上清液。通过Bradford法测定所获得的样品中的蛋白浓度。

在Jasco J-710分光偏振计中，在具有0.2mm或1mm光程的石英杯中进行浓度范围为0.1-2.7mg/ml的蛋白的圆二色性测定。在7l/min的氮气流下进行该测定，这允许在195至250nm波长范围内进行测定。

测量参数：光谱分辨率-1nm；光束的半宽1nm;灵敏性20mdeg,一个波长的平均时间-8s,扫描速度10nm/min。

结果显示为3次测量的平均值。根据Ex.1,Ex.2,Ex.14,Ex.24,Ex.51和Ex.42的蛋白的圆二色性光谱显示于图20。

使用CDPro pack在193-250nm范围内对获得的光谱进行数值分析。忽略掉光电倍增管中的电压超过700V的点，因为该波长范围内的信噪比太低。获得的数据用于计算所分析的蛋白中的特定二级结构含量，使用CDPro程序包(表4)。

表4：所分析的蛋白中的二级结构的含量

^*基于晶体结构1D4V获得的值

对照(rhTRAIL114-281)显示出蛋白的特征性CD光谱，主要类型为β-层结构(在波长220nm处锐利刻画出最小椭圆率)。这确认了二级结构成分的计算，其提示有少量的α-螺旋元件。获得的结果与来自TRAIL蛋白的晶体结构的数据也是一致的，其中β元件构成一半以上的其组分。在Ex.1和Ex.42的杂合蛋白的情况下，二色性光谱的特征是在波长208和220nm处有2个最小值，其是具有α/β类型的混合的二级结构的蛋白的特征。这可能是由于结构域(例如来自Bax的BH3)连接至TRAIL，其构成α-螺旋结构，所以所分析的嵌合蛋白中的二级结构的混合性质能够确认它们的存在(对于Ex.42，由于光谱质量差，所以其不那么明显)。

对于Ex.2,Ex.51,Ex.14和Ex.24的制剂以及TRAIL蛋白，发现有显著含量的β-类型结构。这可能是由于下列事实：连接的短肽最初具有β结构或者是非结构化的，因此不显著影响它们的组成。在Ex.2的蛋白的情况下，还观察到α结构的含量稍有增加。与Ex.1的蛋白类似，这可能是由于存在BH3结构域，其产生了类似的形式，或者由于波长的窄范围(远UV中的大量的噪声排除了读数)。所分析的光谱区域中锐利刻画的180-200nm范围的缺失可引起α-螺旋结构的过量。

Claims

1.融合蛋白，其包含：

结构域（a），其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少70%同源性的序列；和

2.权利要求1的融合蛋白，其中结构域（a）是可溶性hTRAIL蛋白序列的片段，该片段始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端点，终于氨基酸hTRAIL281。

3.权利要求1或2的融合蛋白，其中结构域（a）选自：hTRAIL114-281 (SEQ. No. 27), hTRAIL119-281 (SEQ. No. 28),hTRAIL121-281 (SEQ. No. 29), hTRAIL116-281和hTRAIL120-281。

4.权利要求1的融合蛋白，其中结构域（a）是序列hTRAIL95-281。

5.权利要求1-4任一项的融合蛋白，其中结构域（b）选自：

SEQ. NO. 30的Bax蛋白的BH3结构域的片段；

SEQ. NO. 31的Bid蛋白的片段；

SEQ. NO. 32的核糖核酸酶A；

SEQ. NO. 33的细胞色素C；

SEQ. NO. 34的粒酶B；

SEQ. NO. 35的Nur77蛋白的片段；

SEQ. NO. 36的Bak蛋白的BH3结构域；

SEQ. NO. 37的PUMA/BBC3蛋白的BH3结构域；

SEQ. NO. 38的PUMA/BBC3蛋白；

SEQ. NO. 39的SMAC/Diablo蛋白的片段；

SEQ. NO. 40的buforin A；

SEQ. NO. 41的豹蛙酶；

SEQ. NO. 42的Mdm2蛋白的片段；

SEQ. NO. 43的与Mdm2结合的肽；

SEQ. NO. 44的lunasin的片段；

SEQ. NO. 45的Bik蛋白的BH3结构域；

SEQ. NO. 46的蛋白酶体的肽抑制剂；

SEQ. NO. 47的包含蛋白酶体结合性UIM基序的结构域；

SEQ. NO. 151的azurin衍生的肽；

SEQ. NO. 152的全长azurine肽；

SEQ. NO. 153的从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽；

SEQ. NO. 154的从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽；

SEQ. NO. 155的Reticulon RTN1-C衍生的肽；

SEQ. NO. 156的全长人Reticulon 3；

SEQ. NO. 157的修饰的组成型活性胱天蛋白酶-3；

SEQ. NO. 158的来自Par-4蛋白的SAC结构域；

SEQ. NO. 159的Noxa蛋白；

SEQ. NO. 160的Noxa蛋白的MTD/CKP片段；

SEQ. NO. 161的短的杂合肽Antp-TPR；

SEQ. NO. 162的Stat3蛋白的SH2结构域的肽抑制剂；

SEQ. NO. 163的Bak蛋白的BH3结构域衍生的肽；

SEQ. NO. 164的Bad蛋白的BH3结构域衍生的肽；和

SEQ. NO. 165的来自Bfl1蛋白的肽ATAP。

6.权利要求1-5任一项的融合蛋白，其在结构域（a）和结构域（b）之间包含结构域（c），所述结构域（c）包含被存在于肿瘤细胞环境中的蛋白酶识别的蛋白酶切割位点，其选自金属蛋白酶MMP识别的序列，尿激酶uPA识别的序列，弗林蛋白酶识别的序列，及其组合。

7.权利要求6的融合蛋白，其中金属蛋白酶MMP识别的序列是SEQ. No. 51, SEQ. No. 171或SEQ. No. 173，尿激酶uPA识别的序列是SEQ. No. 52，弗林蛋白酶识别的序列是SEQ. No. 53或Seq. No.172。

8.权利要求6或7的融合蛋白，其中结构域（c）是彼此相邻的金属蛋白酶MMP识别的序列与尿激酶uPA识别的序列的组合。

9.权利要求6或7的融合蛋白，其中结构域（c）是弗林蛋白酶识别的序列。

10.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中结构域（b）另外与转运结构域（d）相连，所述转运结构域（d）选自：

（d1）靶向内质网的序列；

（d3）选自SEQ. NO. 54或SEQ. NO. 176的铜绿假单胞菌转位结构域；

（d4）膜转运结构域；

（d5）细胞核定位结构域；和

（d6）线粒体靶向结构域；

及其组合。

11.权利要求10的融合蛋白，其中靶向内质网的序列(d1)是KEDL (SEQ. No. 55)或KDEL (SEQ. No. 56)。

12.权利要求10或11的融合蛋白，其中靶向内质网的序列(d1)位于融合蛋白的C末端。

13.权利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸序列(d2)位于融合蛋白的C末端。

14.权利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸(d2)位于结构域（b）和（c）之间。

15.权利要求10的融合蛋白，其中铜绿假单胞菌转位结构域(d3)位于位于结构域（a）和（c）之间。

16.前述权利要求任一项的融合蛋白，其在结构域(a), (b), (c)和/或 (d)之间另外包含甘氨酸-丝氨酸柔性空间连接子的结构域（e）。

17.权利要求16的融合蛋白，其中所述甘氨酸-丝氨酸连接子选自GGSG (SEQ. No. 57), GGGS (SEQ. No. 58), GGGGS (SEQ. No. 59),GGSGG (SEQ. No. 60), GGGSGG (SEQ. No. 61), GGGSGGG (SEQ.No. 62), GGGSGGGS (SEQ. No. 63), GGGSGGGGS (SEQ. No. 64),ASGG (SEQ. No. 65), GGGSASGG (SEQ. No. 66), GGSHG (SEQ. No.182), SGCGS (SEQ. No. 169), GGGGSGGGG (SEQ. No. 180),SGGCGGS(SEQ. No. 183)和AACAA (SEQ. No. 184)。

18.权利要求1的融合蛋白，其具有选自下列的氨基酸序列：SEQ.No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6;SEQ. No. 7; SEQ. No. 8 ; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11; SEQ.No. 12; SEQ. No. 13; SEQ. No. 14; SEQ. No. 15; SEQ. No. 16; SEQ.No. 17; SEQ. No. 18; SEQ. No. 19; SEQ. No. 20; SEQ. No. 21; SEQ.No. 22); SEQ. No. 23; SEQ. No. 24; SEQ. No. 25, SEQ. No. 26, SEQ.No. 93, SEQ. No. 94, SEQ. No. 95, SEQ. No. 96, SEQ., No. 97, SEQ. No.98, SEQ. No. 99, SEQ. No. 100, SEQ. No. 101, SEQ. No. 102, SEQ. No.103, SEQ. No. 104, SEQ. No. 105, SEQ. No. 106, SEQ. No. 107, SEQ.No. 108, SEQ. No. 109, SEQ. No. 110, SEQ. No. 111, SEQ. No. 112,SEQ. No. 113, SEQ. No. 114, SEQ. No 115, SEQ. No. 116, SEQ. No.117, SEQ. No. 118, SEQ. No. 119, SEQ. No. 120和SEQ. No. 121。

19.前述权利要求任一项的融合蛋白，其是重组蛋白。

20.前述权利要求任一项的融合蛋白，其另外包含序列hTRAIL95-121作为其C末端部分，在该序列之前是蛋白酶切割位点的序列，从而允许其从构建体上被切割下来。

21.编码权利要求1-20任一项中定义的融合蛋白的多核苷酸序列。

22.权利要求21的多核苷酸序列，针对在大肠杆菌中的遗传表达进行了优化。

23.权利要求22的多核苷酸序列，选自：SEQ. No. 67; SEQ. No. 68;SEQ. No. 69; SEQ. No. 70; SEQ. No. 71; SEQ. No. 72; SEQ. No. 73;SEQ. No. 74 ; SEQ. No. 75; SEQ. No. 76; SEQ. No. 77; SEQ. No. 78;SEQ. No. 79; SEQ. No. 80; SEQ. No. 81; SEQ. No. 82 ; SEQ. No. 83;SEQ. No. 84; SEQ. No. 85; SEQ. No. 86; SEQ. No. 87; SEQ. No. 88);SEQ. No. 89; SEQ. No. 122; SEQ. No. 123; SEQ. No. 124; SEQ. No.125; SEQ. No. 126; SEQ. No. 127; SEQ. No. 128; SEQ. No. 129; SEQ.No. 130; SEQ. No. 131; SEQ. No. 132; SEQ. No. 133; SEQ. No. 134;SEQ. No. 135; SEQ. No. 136; SEQ. No. 137; SEQ. No. 138; SEQ. No.139; SEQ. No. 140; SEQ. No. 141; SEQ. No. 142; SEQ. No. 143; SEQ.No. 144; SEQ. No. 145; SEQ. No. 146; SEQ. No. 147; SEQ. No. 148;SEQ; No. 149; 和SEQ. No. 150。

24.表达载体，其包含权利要求21-23任一项的多核苷酸序列。

25.宿主细胞，其包含权利要求24的表达载体。

26.权利要求25 的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞。

27.药物组合物，其包含权利要求1-19任一项的融合蛋白作为活性成分，与药学上可接受的载体组合。

28.权利要求1-19任一项的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人中的癌症疾病的用途。

29.治疗哺乳动物包括人中的癌症疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用抗癌有效量的权利要求1-19任一项的融合蛋白或权利要求27的药物组合物。