CN103974711A - 抗癌融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

融合蛋白包含作为hTRAIL蛋白序列的功能片段的结构域(a)，所述片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸，或具有至少70％序列同一性，优选85％的同一性的所述功能片段的同源物，并终止于氨基酸hTRAIL281；和作为抑制蛋白质合成的效应子肽的序列的结构域(b)，其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端或N末端。该融合蛋白可用于治疗癌症疾病。

Description

抗癌融合蛋白
本发明涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本发明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白序列的片段和抑制蛋白合成的肽毒素的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。
TRAIL蛋白，细胞因子家族的成员(肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体)，也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。
TRAIL蛋白通过与促细胞调亡表面TRAIL受体1和2(TRAIL-R1/R2)结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5(死亡受体4和死亡受体5)，是TNF受体家族的成员并且在不同类型的癌症细胞上过表达。这些受体的激活能诱导阻抑基因p53非依赖性细胞调亡的外部信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起截短的Bid蛋白的释放，所述截短的Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。
TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞显示对该蛋白的抗性。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时极少影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。
TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是具有生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。同样，对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL(rhTRAIL)(在INN下称作dulanermin)的初步人类临床研究显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。
短于114-281的TRAIL片段也能结合膜死亡受体并通过这些受体诱导细胞调亡，如最近就122-281hTRAIL的重组循环序列改变的突变体所报道的，例如见EP1688498。
到目前为止所报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签的存在相关，而非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。
然而，在对患者的进一步临床试验中，TRAIL作为单一疗法的实际功效被证明是低的。通过很多癌症细胞显示的对于TRAIL的原发性或获得性抗性也是有问题的(见例如WO2007/022214)。抗性可因不同机制产生，并且对于癌症类型的是特异性的或是患者依赖性的(Thorburn A,Behbakht K,Ford H.TRAIL receptor-targetedtherapeutics:resistance mechanisms and strategies to avoid them.Drug Resist Updat2008；11:17-24)。该抗性限制TRAIL作为抗癌剂的有用性。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL诱导的细胞调亡途径的不同水平表现其自己，从细胞表面受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶的水平。
为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(WO2009/002947；A.Almasan and A.Ashkenazi,Cytokine GrowthFactor Reviews14(2003)337-348；RK Srivastava,Neoplasis,Vol3,No6,2001,535-546,Soria JC et al.,J.Clin.Oncology,Vol28,No9(2010),p.1527-1533)。在WO2009/140469中描述了rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡铂)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。然而，现有技术没有提及任何表明通过将TRAIL蛋白与其它蛋白质或其片段融合而获得的细胞对TRAIL的抗性的消除的任何数据。
此外，与TRAIL治疗法相关的问题表现为其低稳定性以及在施用之后迅速从身体清除。
抗癌治疗法还可针对肿瘤细胞蛋白质的抑制。通过抑制细胞内蛋白质合成来抑制肿瘤细胞增殖的有益作用是已知的。正在尝试在临床上使用抑制或调节蛋白质合成过程的物质作为癌症治疗法和癌症治疗法的补充。
抑制细胞蛋白质合成的物质是细菌、真菌或植物来源的催化肽或蛋白质毒素。仅具有催化结构域并缺乏结合结构域的单链毒素(也称为半毒素)本身以其实际上对细胞无毒的游离天然形式存在。由两条或更多条链组成的毒素(也称为全毒素)除了催化结构域外还具有结合结构域，但缺乏细胞选择性，从而在系统性施用后显示不期望的针对健康组织的毒性和广泛的副作用。
为了获得更高的特异性，将毒素或蛋白质毒素的催化结构域缀合于载体—选择性结合存在于肿瘤细胞上的标志物的配体。结构域或配体靶向蛋白的使用允许蛋白质的毒性结构域至细胞的特异性递送。免疫毒素是缀合物或融合蛋白，其中毒素连接于结合性配体，所述结合性配体为免疫系统蛋白，例如抗体、生长因子、白细胞介素和肿瘤坏死因子。它们是已知的生长因子VEGF、FGF和PDGF与来自核糖体灭活蛋白(ribosome inactivating protein)(RIP毒素)的组的毒素的缀合物、TNF与RIP毒素的缀合物、IL-2与假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素的缀合物、IL-13与假单胞菌属外毒素的缀合物，以及用于包含缀合物IL2-白喉毒素的治疗制剂其它实例是毒素例如白树毒素和相思豆毒蛋白与整联蛋白、纤连蛋白、I-CAM和颗粒蛋白酶B的缀合物，以及ebulin与转铁蛋白的缀合物(Hall,W.A.Targeted toxintherapy for malignant astrocytoma.Neurosurgery2000,46,544–551)。在WO2002/069886和US2003176331中，提及了白树毒素RIP毒素与用于靶向递送毒素的第二多肽的缀合的可能性。在许多可能的类型的这样的第二多肽当中，提及了TRAIL蛋白，然而关于该类型的嵌合物的结构和性质的任何内容未被公开。
在WO2008052322中，提及了使用结合细胞表面结构的非免疫球蛋白多肽作为RIP毒素的载体的可能性。在WO2008080218中，提出了细胞因子(包括TRAIL作为许多列出的之一)可用作修饰的毒素的载体，说明书缺乏使得能够定义包含TRAIL和毒性的治疗上有效的分子及其性质的任何信息。
U.S.6,627,197描述包含使蛋白质合成失活的毒素、被HIV蛋白酶切割的肽、作为结合细胞表面的元件的外源凝集素、靶向片段和疏水试剂的构建体，作为抗病毒试剂而施用。
在现有技术中，也已知在嵌合蛋白质中使用被特定蛋白酶识别的切割位点，使得毒素能够在肿瘤环境中释放，从而使得它们内化进入肿瘤细胞。例如，US7,252,993公开了包含通过被HIV蛋白酶识别的接头连接的蓖麻蛋白的毒性片段和靶向肽-DP178趋化因子的嵌合蛋白。然而，该说明书没有提供关于TRAIL-毒素嵌合体的结构、性质和应用的详细信息。
本发明提供了组合作为效应子肽的肽毒素的毒性性质和TRAIL蛋白的促细胞凋亡性质与特异性靶向存在于癌细胞上的结构的新的融合蛋白。本发明的融合蛋白包含来源于TRAIL的结合结构域和作为具有蛋白质合成抑制性质的效应子肽的肽毒素结构域。
由于源自hTRAIL的结构域的存在，根据本发明的蛋白选择性针对癌细胞，在那里蛋白的元件发挥它们的效应。
特别地，作为效应子肽的肽毒素抑制癌细胞的蛋白质合成过程。本发明的蛋白向肿瘤环境的递送使得针对体内的健康细胞的毒性以及副作用最小化，并且减小了施用频率。此外，通过使用本发明的蛋白的靶向治疗允许避免之前已知的由高毒性和施用高剂量的必要性引起的基于蛋白质合成抑制的非特异性治疗法的低效率问题。
在很多情况下，本发明的融合蛋白比可溶性hTRAIL及其变体、包括序列的片段更强。直至目前，用于本发明的融合蛋白中的效应子肽未被用于药物，因为例如不理想的动力学、被非特异性蛋白酶迅速降解或由于缺乏正确的激活途径次序(这对于使效应子肽在靶位点的正确作用是必须的)而在体内积累。效应子肽向融合蛋白中的掺入允许它们选择性地递送至需要它们发挥作用的位点。此外，效应子肽的连接增大了蛋白质的质量，这产生了延长的半衰期并增加了肿瘤中蛋白的保持以及其增强的效率。另外，在很多情况下，新的融合蛋白还克服了对于TRAIL的天然或诱导的抗性。
附图说明
现在将通过阅读附图详细描述本发明，其中
图1显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a、Ex.25a、Ex.37a和Ex.42a的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌Colo205的HsdCpb:NMRI-Foxn1nin小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图2显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a、Ex.25a、Ex.37a和Ex.42a的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌Colo205的HsdCpb:NMRI-Foxn1nin小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图3显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a和Ex.35a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图4显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a和Ex.35a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图5显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a和Ex.50a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图6显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a和Ex.50a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图7显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.2a、Ex.18a和Ex.44a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图8显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.2a、Ex.18a和Ex.44a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图9显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.20a、Ex.26a、Ex.43a和Ex.47a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图10显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.20a、Ex.26a、Ex.43a和Ex.47a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图11显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.20a、Ex.51a和Ex.52a的本发明的融合蛋白处理的具有胰腺癌PANC-1的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图12显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.20a、Ex.51a和Ex.52a的本发明的融合蛋白处理的具有胰腺癌PANC-1的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体生长抑制值(％TGI)；
图13显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a和Ex.44a的本发明的融合蛋白处理的具有胰腺癌PANC-1的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图14显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a和Ex.44a的本发明的融合蛋白处理的具有胰腺癌PANC-1的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图15显示了，以Ex.18a的本发明的融合蛋白处理的具有前列腺癌PC3的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图16显示了，以Ex.18a的本发明的融合蛋白处理的具有前列腺癌PC3的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图17显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.51a的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌PCL/PRF/5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图18显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.51a的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌PCL/PRF/5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图19显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b和Ex.2b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图19a显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图20显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b和Ex.2b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图20a显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图21显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b、Ex.2b和Ex.54b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌SW620的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图21a显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌SW620的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图22显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b、Ex.2b和Ex.54b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图22a显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图23显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b和Ex.51b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HT-29的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图24显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b和Ex.51b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HT-29的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图25显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌HepG2的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图26显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌HepG2的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图27显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b和Ex.2b的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图28显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b和Ex.2b的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)；
图29显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有子宫肉瘤MES-SA/Dx5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图29a显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b、Ex.2b和Ex.51b的本发明的融合蛋白处理的具有子宫肉瘤MES-SA/Dx5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(占初始阶段的百分率)；
图30显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18b的本发明的融合蛋白处理的具有子宫肉瘤MES-SA/Dx5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
图30a显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.18a、Ex.2b和Ex.51b的本发明的融合蛋白处理的具有子宫肉瘤MES-SA/Dx5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
发明详述
本发明涉及融合蛋白，其包含：
-结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸并终于氨基酸hTRAIL281；或具有至少70％序列同一性，优选85％的同一性的所述功能片段的同源物；和
-至少一个结构域(b)，其为抑制蛋白质合成的效应子肽的序列，
其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端；
并且其中融合蛋白不包含结合细胞表面上的碳水化合物受体的结构域。
术语“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”应该被理解为指可溶性hTRAIL的任何这样的片段：即能够在结合于哺乳动物细胞表面上的其受体之后在该细胞中诱导细胞调亡信号的片段。
本领域技术人员还将认识到：TRAIL序列的至少70％或85％的同源性的存在是本领域已知的。
应该理解，本发明的融合蛋白中的效应子肽结构域(b)不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分或片段。
根据本发明的术语“肽”应被理解为从通过肽键连接在一起的多个氨基酸的分子构建物。因此，根据本发明的术语“肽”包括寡肽、多肽和蛋白质。
在本发明中，肽的氨基酸序列将以本领域采纳的常规方式表示，从肽的N末端(N-端)至其C末端(C-端)。因此，任何序列的线性表示均为左侧为N末端，右侧为C末端。
前面附有数字的术语TRAIL在本说明书中用于表示在已知的hTRAIL序列中具有该数字的氨基酸。
本发明的融合蛋白在结构域(a)的C末端和/或N末端连接至少一个效应子肽结构域(b)。
在具体的实施方式中，结构域(a)是hTRAIL序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端点，结束于氨基酸hTRAIL281。
具体地，结构域(a)可选自对应于hTRAIL95-281,hTRAIL114-281、hTRAIL116-281、hTRAIL119-281、hTRAIL120-281和hTRAIL121-281的序列。本领域技术人员将认识到，hTRAIL95-281、hTRAIL114-281、hTRAIL116-281、hTRAIL119-281、hTRAIL120-281和hTRAIL121-281分别代表GenBank中登录号P50591中公布的并在本发明的序列表中显示为SEQ.No.141的hTRAIL的已知序列中的起始于编号95、114、116、119、120和121的氨基酸和终止于最后一个氨基酸281的人TRAIL蛋白的片段。
在另一个具体实施方式中，结构域(a)是起始于不低于hTRAIL95的氨基酸位置并结束于氨基酸hTRAIL281的可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段的同源物，与原始序列至少70％、优选85％同一。
在该实施方式的具体变体中，结构域(a)是选自对应于hTRAIL95-281、hTRAIL114-281、hTRAIL116-281、hTRAIL119-281、hTRAIL120-281和hTRAIL121-281的序列的片段的同源物。
应该理解，hTRAIL片段的同源物是该片段的氨基酸序列的变体/修饰，其中至少一个氨基酸被改变，包括1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸，和不超过15％的氨基酸，并且其中修饰的序列的片段具有hTRAIL序列的保留的功能，即结合细胞表面死亡受体和在哺乳动物细胞中诱导细胞凋亡的能力。氨基酸序列的修饰可以包括例如，氨基酸的置换、缺失和/或添加。
优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言，与死亡受体DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)的改变的亲和性。
术语“改变的亲和性”是指增加的亲和性和/或具有改变的受体选择性的亲和性。
优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性。
特别优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于死亡受体DR5比对于死亡受体DR4增加的亲和性，即增加的选择性DR5/DR4。
同样优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出对于死亡受体DR4和/或DR5的比对于受体DR1(TRAIL-R3)和/或DR2(TRAIL-R4)的与亲和性相关的增加的选择性。
产生对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性和/或选择性的hTRAIL的修饰对于本领域技术人员来说是已知的，例如见Tur V,van der Sloot AM,Reis CR,Szegezdi E,Cool RH,Samali A,SerranoL,Quax WJ.DR4-selective tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL)variants obtained bystructure-based design.J.Biol.Chem.2008Jul18；283(29):20560-8，其描述了D218H突变具有对于DR4的增加的选择性；或Gasparian ME,Chernyak BV,Dolgikh DA,Yagolovich AV,Popova EN,Sycheva AM,Moshkovskii SA,Kirpichnikov MP.Generation of new TRAILmutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to deathreceptor5,Apoptosis.2009Jun；14(6):778-87，其描述了D269H突变对于DR4具有降低的亲和性。产生对于选自DR4和DR5的一种受体的增加的亲和性(相对于DR1和DR2受体)和对于受体DR5的增加的亲和性(相对于DR4)的hTRAIL突变体也描述于WO2009077857和WO2009066174。
合适的突变是选自下列的天然hTRAIL位置中的一个或多个突变：氨基酸131、149、159、193、199、201、204、204、212、215、218和251，特别地，涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸，或诸如谷氨酸或天冬氨酸的氨基酸置换某氨基酸的突变。特别地可提及选自下列的一个或多个突变：G131R、G131K、R149I、R149M、R149N、R149K、S159R、Q193H、Q193K、N199H、N199R、K201H、K201R、K204E、K204D、K204L、K204Y、K212R、S215E、S215H、S215K、S215D、D218Y、D218H、K251D、K251E和K251Q，描述于WO2009066174。
合适的突变还有选自氨基酸195、269和214的天然hTRAIL位置中的一个或多个突变，特别是涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸置换某氨基酸的突变。具体地可提及选自D269H、E195R和T214R的一个或多个突变，描述于WO2009077857。
在具体的实施方式中，为hTRAIL的片段的同源物的结构域(a)选自天然TRAIL序列的D218H突变体，如WO2009066174所描述，或天然TRAIL序列的Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H突变体，如Gasparian ME等人.Generation of new TRAIL mutantsDR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor5,Apoptosis.2009Jun；14(6):778-87中所描述。
结构域(a)，即TRAIL的片段，是负责融合蛋白的构建体对细胞表面上的死亡受体的结合的结构域。此外，结构域(a)在结合后，将发挥其已知的激动活性，即细胞凋亡的外部途径的活化。
本发明的融合蛋白不包含能够结合细胞表面上碳水化合物受体的结构域的序列。对细胞表面上的碳水化合物受体的结合是非特异性结合。
具体地，本发明的融合蛋白不包含能够结合细胞表面上的糖受体的外源凝集素结构域(糖蛋白)的序列。对于“能够结合细胞表面上的碳水化合物受体的外源凝集素结构域”，应当理解为特别是蛋白质毒素的亚单位(链)A及其片段，以及未伴随具有不同功能性(包括酶促功能性)的结构域的单独存在的外源凝集素蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白，除了结构域(a)外，不包括任何其它结合细胞表面上的受体的结构域。
本发明的融合蛋白的(b)是效应子肽—抑制细胞内的蛋白质合成过程的肽毒素的结构域。
本发明的融合蛋白的结构域(b)的效应子肽可以是通过抑制细胞的蛋白质合成过程的翻译阶段而抑制蛋白质合成的毒素。
本发明的融合蛋白结构域(b)的效应子肽可以是通过抑制细胞的蛋白质合成过程的转录和RNA产生而抑制蛋白质合成的毒素。
在一个实施方案中，肽毒素是在核糖体水平上的抑制蛋白质的酶促翻译的肽。在本发明的该实施方案中，在变体之一中，肽毒素具有选自N-糖苷酶、核糖核酸酶和ADP-核糖基转移酶的活性的酶促催化活性。
应当理解，如对于本领域技术人员来说将是很显然的，肽毒素，除了其作为效应子肽的主要活性以外，可具有一个或多个可导致细胞中蛋白质合成的抑制的其它活性，如例如在W.J.Pneumans et al.,TheFASEB Journal,2001,Vol.15,str.1493-1506中描述的。
具有N-糖苷酶活性的效应子肽通过截短28S rRNA的亚单位60中的一个特定腺嘌呤残基来进行核糖体的修饰(脱嘌呤作用)。该修饰是不可逆的，并且阻止核糖体与翻译因子EF的结合，从而阻断翻译。
具有N-糖苷酶的催化活性的效应子肽可选自由1型核糖体灭活蛋白(RIP)(半毒素)、2型RIP蛋白(全毒素)的催化亚单位(链)A以及其与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的N-糖苷酶活性的修饰组成的肽毒素。
具有N-糖苷酶活性的1型RIP毒素是单链蛋白质并且仅具有催化结构域。
植物来源的下列已知毒素可被提及为来自单链1型RIP毒素的组的特定效应子肽：白树毒素(来自Gelonium multiflorum)、木鳖子苷(从苦瓜属的植物分离的蛋白质)、皂草素(来自石碱草(SaponariaOfficinalis))、dodekandrin(来自十蕊商陆(Phytolacca dodecandra))、bouganin(来自叶子花(Bougainvillea spectabilis))、来自花商陆(美国商陆)的PAP蛋白、天花粉蛋白(来自栝楼)、trichoanguin(来自蛇瓜)、agrostin(来自毒莠草)、diantrin、丝瓜素P1(来自丝瓜)、苦瓜素(来自苦瓜)和麦芽凝集素。
本实施方案中的效应子肽的示例性序列表示为SEQ.No.55(bouganin)、SEQ.No.58(PAP毒素同源物)、SEQ.No.59(皂草素的片段)、SEQ.No.60(天花粉蛋白)、SEQ.No.61(trichoanguin)、SEQ.No.65(丝瓜素P1)、SEQ.No.67(苦瓜素)和SEQ.No.78(白树毒素的催化结构域)。
本实施方案的效应子肽的其它实例是白树毒素的类似物(SEQ.No.198)和具有修饰的天然序列的天花粉蛋白的类似物(SEQ.No.199和SEQ.No.200)。
修饰的天花粉蛋白的一个实例是SEQ.No.199，其中修饰天花粉蛋白的已知序列以减小毒素的免疫原性。即，在天花粉蛋白的已知序列中，“YFF”81-83基序被“ACS”替代，类似地“KR”173-174氨基酸被“CG”残基替代(氨基酸残基编号与GenBank:AAB22585.1中公布的序列一致)(An Q,Wei S,Mu S,Zhang X,Lei Y,Zhang W,Jia N,Cheng X,Fan A,Li Z,Xu Z.J Biomed Sci.2006Sep；13(5):637-43))。
修饰的天花粉蛋白的其它实例是SEQ.No.200，其中以下列方式修饰天花粉蛋白的已知序列：即，用“ACS”替代“YFF”81-83基序以减少毒素的免疫原性，用“CG”残基替代“KR”173-174氨基酸(An Q,Wei S,Mu S,Zhang X,Lei Y,Zhang W,Jia N,Cheng X,Fan A,Li Z,Xu Z.J Biomed Sci.2006Sep；13(5):637-43)以减少VLS(血管渗漏综合征)问题，利用丙氨酸替代缬氨酸残基–2和66；和利用甘氨酸替代亮氨酸132(氨基酸残基编号与GenBank:AAB22585.1中公布的序列一致)(Baluna R,Rizo J,Gordon BE,Ghetie V,Vitetta ES..Proc NatlAcad Sci U S A.1999Mar30；96(7):3957-62))。
SEQ.No.198的具有突变V70A的白树毒素类似物是已知的并描述于文献中(Baluna et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.96,pp.3957–3962,March199)。
表示为SEQ.No.199的天花粉蛋白类似物是已知的并描述于文献中(An Q,et al.J Biomed Sci.2006Sep；13(5):637-43)。
表示为SEQ.No.200的天花粉蛋白类似物是新型的并描述于文献中。
具有N-糖苷酶活性的2型RIP毒素是双链蛋白并且具有催化结构域(亚单位A)和能够结合存在于细胞表面上的碳水化合物(糖)受体的外源凝集素结合结构域(亚单位B)。根据本发明，不存在外源凝集素结合结构域的2型RIP毒素的催化亚单位A可用作效应子肽。
作为该类型的效应子肽，可提及下列植物毒素的催化亚单位A：篦麻毒素(来自蓖麻)、相思豆毒蛋白(来自相思子)、莲根毒素(来自Adenia digitata)、榭寄生素(来自槲寄生(misletoe)白果槲寄生的毒素)、蒴莲素(来自伏氏蒴莲(Adenia volkensii))、ebulin1(来自接骨木)、链霉黑素b(来自黑叶接骨木)和细菌毒素志贺毒素(来自痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae))、或与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的N-糖苷酶活性的其修饰。
本实施方案中的效应子肽的示例性序列表示为SEQ.No.56和SEQ.No.57(篦麻毒素的亚单位A)；和篦麻毒素的变体亚单位A、SEQ.No.195(篦麻毒素的修饰亚单位A)；SEQ.No.62(槲寄生毒素的亚单位A)、SEQ.No.63(ebulin1的亚单位A)、SEQ.No.64(链霉黑素b的亚单位A),SEQ.No.66(蒴莲素的亚单位A)、SEQ.No.70(志贺毒素亚单位A的变体)和SEQ.No.82(相思豆毒蛋白的亚单位A)；SEQ.No.194(相思豆毒蛋白的修饰亚单位A，如Baluna et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.96,pp.3957–3962,March1999with mutationsV71A,G115A and S232Q中描述的，氨基酸残基编号与GenBankCAA38655.1中公布的序列一致)。
本实施方案中的效应子肽的示例性序列被表示为SEQ.No.56和SEQ.No.57(篦麻毒素的亚单位A和篦麻毒素的变体亚单位A)、SEQ.No.195(篦麻毒素的修饰亚单位A，如Baluna et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.96,pp.3957–3962,March1999中描述的，具有缺失78LDV80，氨基酸残基编号与GenBank ABG65738.1中公布的序列一致)；SEQ.No.62(槲寄生毒素的亚单位A),SEQ.No.63(ebulin1的亚单位A),SEQ.No.64(链霉黑素b的亚单位A),SEQ.No.66(蒴莲素的亚单位A),SEQ.No.70(志贺毒素亚单位A的变体)和SEQ.No.82(相思豆毒蛋白的亚单位A)；SEQ.No.194(相思豆毒蛋白的修饰亚单位A，如Baluna et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96,pp.3957–3962,March1999中描述的；具有突变V71A、G115A和S233Q，氨基酸残基编号与GenBank CAA38655.1中公布的序列一致)。
具有核糖核酸酶的催化活性的效应子肽(也称为核糖毒素)属于内切核酸酶并且切割28S rRNA中的磷酸二酯键，从而导致核糖体的抑制和终止翻译。可被提及作为该组的效应子肽为真菌毒素α-sacrin、米托洁林、来自局限曲霉的局限曲菌素和hirsutelin(来自汤氏多毛菌)。
本实施例中的效应子肽的示例性序列表示为SEQ.No.71(限曲菌素)和SEQ.No.72(hirsutellin)。
具有ADP-核糖基转移酶的催化活性的效应子肽引起ADP-核糖基化，从而灭活蛋白质合成机器的组分，主要是延伸/翻译因子EF-2，并抑制翻译。该组效应子肽属于来自白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)的白喉毒素的催化结构域、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A以及与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的ADP-核糖基转移酶活性的其修饰。
铜绿假单胞菌外毒素A和白喉毒素的催化亚基的修饰可示例性包括肽的末端片段的截短，以及催化结构域或其片段中的置换或缺失。适当的置换和缺失的一些公开于JE et al..Blood.2009Apr16；113(16):3792-800；Onda M et al..Proc Natl Acad Sci U S A.2011Apr5；108(14):5742-7中。
本实施方案中的效应子肽的示例性序列是表示为SEQ.No.69的已知的铜绿假单胞菌外毒素催化结构域A(催化结构域A的天然序列)，以及表示为SEQ.No.68；SEQ.No.83；SEQ.No.84；SEQ.No.201；SEQ.No.202；SEQ.No.203；SEQ.No.204；SEQ.No.205；SEQ.No.206；和SEQ.No.207的其突变类似物。
本实施方案中的效应子肽的示例性序列是表示为SEQ.No.68的已知的铜绿假单胞菌外毒素A，以及表示为SEQ.No.69；SEQ.No.83；SEQ.No.84；SEQ.No.201；SEQ.No.202；SEQ.No.203；SEQ.No.204；SEQ.No.205；SEQ.No.206和SEQ.No.207的其类似物。
表示为SEQ.No.69、SEQ.No.83、SEQ.No.84、SEQ.No.203和SEQ.No.206的铜绿假单胞菌外毒素A的类似物是已知的并描述于文献中。
表示为SEQ.No.201；SEQ.No.202；SEQ.No.204；SEQ.No.205和SEQ.No.207的铜绿假单胞菌外毒素A的类似物是新型的，并且未在文献中进行过描述。
已知的SEQ.No.203是Onda M et al..Proc Natl Acad Sci U S A.2011Apr5；108(14):5742-7中描述的具有8个减小免疫原性的突变的铜绿假单胞菌外毒素A的HA22-LR-8M变体。
已知的SEQ.No.206是Weldon JE et al..Blood.2009Apr16；113(16):3792-800中描述的铜绿假单胞菌外毒素A的缺失变体HA22-LR。
新型SEQ.No.201是铜绿假单胞菌外毒素A的催化结构域的类似物，其中3个点突变R318K、N441Q和R601K被引入已知的序列以减小免疫原性(氨基酸残基编号与GenBank AAB59097.1中公布的序列一致)。
新型SEQ.No.202是Weldon JE et al.,Blood.2009Apr16；113(16):3792-800中描述的铜绿假单胞菌外毒素A的催化结构域的缺失变体A2-LR，其具有引入的另外的降低免疫原性的突变(如ChoeM,Webber KO,Pastan I.Cancer Res.1994Jul1；54(13):3460-7中描述的)和其它突变(如WO2007/016150中描述的)。
新型SEQ.No.204是铜绿假单胞菌外毒素A的催化结构域的变体，其为Weldon JE et al..Blood.2009Apr16；113(16):3792-800中描述的变体HA22M3(缺失和突变C312S)与具有8个Onda M et al..Proc Natl Acad Sci U S A.2011Apr5；108(14):5742-7中描述的减小免疫原性的突变的变体HA228M的组合。
新型SEQ.No.205为铜绿假单胞菌外毒素A的催化结构域的变体，其为Weldon JE et al..Blood.2009Apr16；113(16):3792-800中描述的变体HA22M3(即具有缺失和突变C312S)、8个Onda M et al..Proc Natl Acad Sci U S A.2011Apr5；108(14):5742-7中描述的减小免疫原性的突变与存在于天然铜绿假单胞菌毒素中的被弗林蛋白酶识别的切割位点的区域的进一步缺失的组合。
新型SEQ.No.207是铜绿假单胞菌外毒素A的催化结构域的变体，其为Weldon JE et al..Blood.2009Apr16；113(16):3792-800中描述的变体HA22M3(缺失和突变C312S)、Onda M et al..Proc NatlAcad Sci U S A.2011Apr5；108(14):5742-7中描述的变体HA228M(即8个减少免疫原性的突变)与另外的突变R601K的组合。
本实施方案中的效应子肽的其它示例性序列是已知的白喉毒素的亚单位A(催化结构域)及表示为SEQ.No.79,SEQ.No.80和SEQ.No.81,SEQ.No.196的其已知的活性片段(通过引入两个突变V7A和V27A修饰的白喉毒素的亚单位A)。修饰被选择来消除因Baluna R,Rizo J,Gordon BE,Ghetie V,Vitetta ES.Proc Natl Acad Sci USA.1999Mar30；96(7):3957-62)而引起的VLS(血管渗漏综合征)，SEQ.No.197(通过引入3个氨基酸6VDS9的缺失和突变V29A修饰的白喉毒素)被选择来消除因Baluna R,Rizo J,Gordon BE,Ghetie V,Vitetta ES.ProcNatl Acad Sci USA.1999Mar30；96(7):3957-62)而引起的VLS(血管渗漏综合征)。
本发明的融合蛋白的结构域(b)的效应子肽可以是属于例如在细菌中已知的毒素-抗毒素系统的抑制蛋白质合成的肽毒素。这样的毒素可通过如下不同机制作用阻断蛋白质合成：与细胞膜结合，从而导致膜电位的快速崩溃和伴随的呼吸停止；通过结合拓扑异构酶抑制聚合酶(DNA和RNA)；或用作内切核糖核酸酶(RNA酶)。
作为具有RNA酶的毒素-抗毒素系统的组分的毒素的实例是：表示为SEQ.No.77的具有RNA酶活性的StaB蛋白(Szymanik M.,Doctoral thesis.2006.Warsaw University,Warsaw)；表示为SEQ.No.73(Kid蛋白)和SEQ.No.76(RelE蛋白)的来自伤寒沙门菌(Salmonella typhi)的Kid毒素(Bravo A,de Torrontegui G,Díaz R.Identification of components of a new stability system of plasmid R1,ParD,that is close to the origin of replication of this plasmid.Mol GenGenet.1987Nov；210(1):101-10)和来自大肠杆菌的RelE毒素(Gotfredsen M,Gerdes K.The Escherichia coli relBE genes belong to aNew toxin-antitoxin gene family.Mol Microbiol.1998Aug；29(4):1065-76)。
作为通过结合拓扑异构酶来抑制聚合酶的毒素-抗毒素系统的组分的毒素的实例是来自大肠杆菌蛋白的CcdB家族的毒素及其具有保留的降解DNA和抑制RNA聚合酶的活性的变体，例如CcdBET2毒素(E.Trovatti et al,Bioorg Med Chem Lett.2008Dec1；18(23):6161-4)。本实施方案中的效应子肽的示例性实例被表示为SEQ.No.74(CcdB蛋白)和SEQ.No.75(CcdB蛋白变体)。
作为与细胞膜结合，从而导致膜电位的快速崩溃和伴随的呼吸停止的毒素-抗毒素系统的组分的毒素的实例是小的碱性蛋白，包含插入质膜的疏水残基的长区段TisB与Hok。Hok或TisB的膜插入引起电化学电位的丢失，这解释了细胞内ATP的减少。因此，TisB和Hok可通过破坏细菌膜来杀死细胞(Unoson C,Wagner EG.A smallSOS-induced toxin is targeted against the inner membrane inEscherichia coli.Mol Microbiol.2008Oct；70(1):258-70.Epub2008Aug29)。本实施方案中的效应子肽的示例性序列被表示为SEQ.No.208。
如上所述，一些效应子肽是新型的并且之前未被描述的。
因此，本发明涉及新型肽，其选自SEQ.No.200的天花粉蛋白的突变体、SEQ.No.201的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体、SEQ.No.202的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体、SEQ.No.204的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体、SEQ.No.205的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体，和SEQ.No.207的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体。
这些新型肽特别地用作本发明的抗癌融合蛋白的结构域(b)的效应子肽。
这些新型肽被专门设计来减小亲代肽的免疫原性。
因此，这些新型肽的特定特性是低免疫原性。
有利的是选自SEQ.No.200的天花粉蛋白的突变体的肽。
还有利的是选自SEQ.No.201的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体的肽。
还有利的是选自SEQ.No.202的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体的肽。
还有利的是选自SEQ.No.204的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体、SEQ.No.205的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体和SEQ.No.207的铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体的肽。
在结合存在于癌细胞表面上的TRAIL受体后，融合蛋白将显示双重效应。结构域(a)，其为TRAIL的功能片段或具有保留的功能的其同源物，将显示出其已知的激动剂活性，即结合细胞表面上的死亡受体并激活细胞凋亡的外部途径。融合蛋白的结构域(b)的效应子肽将能够通过抑制肿瘤细胞的蛋白质合成来与TRAIL结构域的活性平行地潜在地细胞内地发挥其作用。
在融合蛋白内化至细胞中后效应子肽-功能性结构域(b)的激活可通过溶酶体酶(非特异性蛋白酶)从本发明的融合蛋白的结构域(b)切割结构域(a)来非特异性发生。
然而，选选地，融合蛋白包含被存在于环境中的细胞的蛋白酶识别的切割位点的结构域。
因此，在本发明的优选实施方案中，结构域(a)和结构域(b)通过至少一个结构域(c)连接，结构域(c)包含被存在于细胞环境、特别是肿瘤细胞环境中的蛋白酶例如金属蛋白酶、尿激酶或弗林蛋白酶识别的切割位点序列。
被蛋白酶识别的序列可选自：
-被金属蛋白酶MMP识别的序列Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP，或其片段，其与其所结合的序列的最后一个氨基酸形成被金属硫蛋白酶MMP识别的序列，
-被尿激酶uPA识别的序列Arg Val Val Arg/RVVR，或其片段，其与其所结合的序列的最后一个氨基酸形成被尿激酶识别的序列，
及其组合，或
-被弗林蛋白酶识别的序列Arg Gln Pro Arg/RQPR,Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG,Arg Lys Lys Arg/RKKR或被由M.Gordon et all.In Inf.and Immun,1995,63,No.1,p.82–87公开的弗林蛋白酶识别的其它非典型序列或被弗林蛋白酶识别的天然序列ArgHis Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu(RHRQPRGWEQL)。
在本发明的一个实施方式中，蛋白酶切割位点是以任何顺序彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列和/或被尿激酶uPA识别的序列和/或被弗林蛋白酶识别的序列的组合。
优选地，在实施方案之一中，结构域(c)是选自Arg Gln Pro Arg/RQPR、Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG、Arg Val Lys Arg/RVKR和Arg Lys Lys Arg/RKKR被弗林蛋白酶识别的的序列。
蛋白酶金属蛋白酶MMP、尿激酶uPA和弗林蛋白酶在肿瘤环境中过表达。被蛋白酶识别的序列的存在能够使结构域(a)从结构域(b)切割下来，即释放功能性结构域(b)并由此加速其激活。
蛋白酶切割位点的存在允许迅速释放效应子肽，增加融合蛋白被非特异性蛋白酶随机降解之前，肽向其作用位点转运的机会(通过在肿瘤环境中过表达的蛋白酶从hTRAIL片段切离的结果)。
在这一点上，优选效应子肽为白喉毒素和假单胞菌外毒素，其包含天然存在的被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列Arg Val Arg Arg/RVRR(白喉毒素)和Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG(假单胞菌外毒素)。
此外，转运结构域(d)可连接于本发明的融合蛋白的效应子肽的结构域(b)。
结构域(d)可以选自:
-(d1)转运通过细胞膜的源自铜绿假单胞菌的结构域,
-(d2)转运通过膜靶向内质网的结构域，和
-(d3)由6,7,8,9,10或11个(Arg/R)残基组成的转运通过细胞膜的聚精氨酸序列，
或其片段，其与其所结合的序列的最后一个氨基酸序列形成转运结构域(d1)、(d2)或(d3)的序列，
以及
-其组合。
结构域(d1)、(d2)和(d3)的组合可具体地包括(d1)/(d2)、(d1)/(d3)或(d1)/(d2)/(d3)的组合。
此外，结构域(d1)、(d2)和(d3)的组合可包括彼此相邻的并且连接于结构域(b)的一个末端和/或连接于结构域(b)的不同末端的结构域。
应当理解，在当融合蛋白具有连接于结构域(b)的转运结构域(d)和在结构域(a)和(b)之间具有切割位点的结构域(c)的情况下，结构域(c)以在切割构建体转运结构域(d)后仍然连接于结构域(b)的方式定位。换句话说，如果融合蛋白包含转运结构域(d)和切割位点结构域(c)，则结构域(d)位于结构域(b)和结构域(c)之间，或位于与结构域(d)的连接位置相对的结构域(b)的末端。
本发明还包括变体，其中结构域(d)，优选易位铜绿假单胞菌结构域，位于两个(c)结构域之间，所述变体是其中在构建体转运结构域优选易位铜绿假单胞菌结构域的切割之后，既未连接于TRAIL结构域也未连接于效应子肽结构域的变体。
本发明不包括其中结构域(d)位于结构域(c)和结构域(a)之间的这样的变体，即：在切割构建体转运结构域后仍然连接于TRAIL结构域的变体。
作为铜绿假单胞菌毒素的易位结构域或转运通过溶酶体膜的源自铜绿假单胞菌毒素的结构域的其它片段的转运结构域具有转位穿过细胞膜的能力，并且可用于将效应子肽引入肿瘤细胞的区室。铜绿假单胞菌易位结构域的序列是公知的并且被表示为SEQ.No.139。
优选地，铜绿假单胞菌易位结构域位于结构域(a)与(b)之间，并且另外地被(c)结构域间隔。
还优选地，转运至内质网的结构域(d2)连接于效应子肽的C末端，并且位于本发明的融合蛋白的C末端。
还优选地，转运通过细胞膜的聚精氨酸序列连接于效应子肽的C末端且位于效应子肽与结构域(a)之间，另外地通过结构域(c)与(d)结构域相隔。
导向内质网的序列(d2)可以是导向内质网的本领域已知的任何信号序列，例如但不限于Lys Asp Glu Leu/KDEL、His Asp Glu Leu/HDEL、Arg Asp Glu Leu/RDEL、Asp Asp Glu Leu/DDEL、Ala Asp Glu Leu/ADEL、Ser Asp Glu Leu/SDEL和Lys Glu Asp Leu/KEDL。
结构域(d2)优选选自Lys Asp Glu Leu/KDEL和Lys Glu Asp Leu/KEDL。
优选地，转运序列(d2)位于本发明的融合蛋白的C末端。
在另一个实施方案中，结构域(a)与结构域(b)之间还具有适合用于将PEG分子连接于融合蛋白的序列(PEG化接头)的结构域(e)。这样的接头可以是已知的序列Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE。PEG化接头还可选自下列序列：
Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA，
Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS，和
Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS。
优选地，PEG化接头的序列为Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE。
除了融合蛋白的主要功能元件和切割位点结构域之外，本发明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空间接头的序列。此类空间接头是本领域熟知的并且在文献中有描述。将它们掺入融合蛋白的序列中是为了使得通过在宿主细胞中过表达而产生的蛋白的正确折叠。具体地，空间接头可以是甘氨酸、甘氨酸-丝氨酸或甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸接头。
具体地，空间接头可以是甘氨酸和丝氨酸残基的组合，例如GlyGly Gly Gly Gly Ser/GGGGS，或其用作空间接头的其任何片段例如片段Gly Gly Gly Ser/GGGS、Gly Gly Gly/GGG或Gly Gly Gly Gly/GGGG。在其它实施方案中，空间接头可以是甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基的任组合，例如Ala Ser Gly Gly/ASGG或其任何片段，用作空间接头，例如AlaSerGly/ASG。还可能使用空间接头例如序列Gly Gly Gly Ser Gly/GGGGS，或用作空间接头的其任何片段例如片段Gly Gly Gly/GGG，与用作空间接头的另一个片段的组合。在这样的情况下，空间接头可以是甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基的组合，例如Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG。在另一个实施方案中，空间接头可以是丝氨酸与组氨酸残基的组合Ser His His Ser/SHHS或Ser His His Ala Ser/SHHAS。
在另一个实施方案中，空间接头可以是丙氨酸和丝氨酸残基的组合，例如CAAACAAC(Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys)、CAACAAAC(Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys)或其片段。
在另一个实施方案中，适当的空间接头通过组合上述任何类型的空间接头来形成。这样的组合的实例表示为：Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGSGGGGS)、Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys(GGGCAAACAAC)和Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys(GGGGSGGGCAAACAAC)。
在一个实施方式中，空间接头可以也选自单一氨基酸残基，例如单一半胱氨酸残基。
此外，空间接头对于以非特异性方式发生的功能性结构域(b)的激活也是有用的。以非特异性方式激活结构域(b)可通过因空间接头的pH依赖性水解而从根据本发明的融合蛋白的结构域(b)切离结构域(a)来进行。
此外，本发明的融合蛋白可包含含有结合整联蛋白的基序的接头。这样的接头提供了对细胞表面的额外结合并可减少全身性毒性。
整联蛋白是存在于许多细胞类型的表面上的α-β异二聚体。整联蛋白的配体是细胞外基质粘着蛋白例如纤连蛋白、胶原和层粘连蛋白。在纤连蛋白和一些其它配体的情况下，RGD基序负责与整联蛋白的相互作用。包含该基序的肽特异性识别整联蛋白α5β1并通过限制它们形成转移灶的能力对肿瘤细胞的侵袭性具有抑制作用(Ghelsen et al.,(1988)J.Cell Biol.106,925-930)。通过使用噬菌体展示法，从6-氨基酸肽的文库分离了包含NGR基序的序列，其特异性结合和识别整联蛋白α5β1(Koivunen et al..,J Biol Chem.1993Sep25；268(27):20205-10)。还显示了两个基序(NGR和RGD)作为拮抗剂结合参与血管生成的其它因子。RGD还与在新生血管形成的过程中特异性过量出现的整联蛋白相互作用(Friedlander et al.Definition of twoangiogenic pathways by distinctαv integrins.Science(Washington DC),270:1500-1502,1995)，然而，NGR与氨肽酶N相互作用，所述氨肽酶N是也参与癌症的侵袭、特别是强暴露于肿瘤的血管和经历强血管生成的其它细胞的蛋白(Pasqualini et al.,Aminopeptidase N is areceptor for tumor-homing peptides and a target for inhibitingangiogenesis.Cancer Res.2000Feb1；60(3):722-7)。
能够与整联蛋白结合的来自本发明的融合蛋白的接头包含基序Asn Gly Arg(NGR)、Asp Gly Arg(DGR)或Arg Gly Asp(RGD)。
在本发明的蛋白的优选实施方案中，包含与整联蛋白结合的基序的接头被表示为SEQ.No.140。
SEQ.No.140(Cys Phe Cys Asp Gly Arg Cys Asp Cys Ala/CFCDGRCDCA)包含通过半胱氨酸序列稳定的基序Asp Gly Arg(DGR)，并且是已知的，描述于Wang H,Yan Z,Shi J,Han W,Zhang Y ProteinExpr Purif.2006Jan；45(1):60-5中。
本发明的融合蛋白的特定实施方案是包含肽的融合蛋白，所述肽通过抑制翻译过程在细胞内起作用，其选自被表示为如下标识的肽：SEQ.No.55、SEQ.No.56、SEQ.No.57、SEQ.No.58、SEQ.No.59、SEQ.No.60、SEQ.No.61、SEQ.No.62、SEQ.No.63、SEQ.No.64、SEQ.No.65、SEQ.No.66、SEQ.No.67、SEQ.No.68、SEQ.No.69、SEQ.No.70、SEQ.No.71、SEQ.No.72、SEQ.No.73、SEQ.No.74、SEQ.No.75、SEQ.No.76、SEQ.No.77、SEQ.No.78、SEQ.No.79、SEQ.No.80、SEQ.No.81、SEQ.No.82、SEQ.No.83；SEQ.No.84以及SEQ.No.144、SEQ.No.145；SEQ.No.146、SEQ.No.147、SEQ.No.148、SEQ.No.149、SEQ.No.150、SEQ.No.151、SEQ.No.152、SEQ.No.153、SEQ.No.154、SEQ.No.155、SEQ.No.156、SEQ.No.157、SEQ.No.158、SEQ.No.159、SEQ.No.160、SEQ.No.161、SEQ.No.162、SEQ.No.163、SEQ.No.164；SEQ.No.165、SEQ.No.166；SEQ.No.167和SEQ.No.168。
根据本发明的融合蛋白中的TRAIL的抗癌活性可潜在地通过其它组分的激活而增加，例如28S rRNA中的腺嘌呤的脱嘌呤、因子EF2的ADP核糖基化、28S RNA中的腺嘌呤的N-糖基化、28S RNA的切割、mRNA的切割或DNA降解，从而导致蛋白质合成的抑制，从而在蛋白质组的水平上阻断细胞的反应，减少阻断细胞凋亡途径的蛋白质的过量产生，最终重建细胞凋亡途径。此外，细胞蛋白质合成过程的阻断可通过细胞周期的控制点(例如细胞周期蛋白依赖性激酶)活化内部诱导的细胞凋亡，其与因TRAIL对DR系列的功能性细胞受体的附着而产生的信号协同。
发现本发明的融合蛋白在许多情况下显示比可溶性TRAIL及其变体(包括序列的片段)更有力的活性。迄今为止，在用于本发明的融合蛋白质的已知效应子肽中，仅融合于白细胞介素-2的白喉毒素已被用于药剂用于本发明的融合蛋白的其它效应子肽因不利的动力学、被非特异性蛋白酶快速降解以及因缺乏允许效应子肽在靶位点上发挥作用所必需的活化途径的适当序列而引起的在身体中的积累，而本身未曾被用于药剂。融合蛋白的掺入使得它们能够被选择性递送至期望在其中发挥它们的作用的部位。
此外，效应子肽的连接增加了蛋白质的重量，这导致延长的半衰期，并增加了蛋白质在肿瘤中的保留，从而增强其功效。此外，在许多情况下，新的融合蛋白可能通过负责蛋白质合成的细胞机器的去稳定化来克服天然的或诱导的对TRAIL的抗性。因为癌细胞可除其它以外通过过量产生阻断细胞凋亡途径的蛋白质(Bcl-2、IAP、XIAP或cFLIP)来获得对TRAIL的细胞毒性活性的抗性，阻断蛋白质合成的细胞机器似乎可导致蛋白质组水平上的细胞反应的阻断，从而解除细胞凋亡途径的阻断。
上述代表性融合蛋白的结构的详细说明显示于下文提供的实施例中。
根据本发明，融合蛋白意思是包含2个或更多个蛋白或其片段的单一的蛋白分子，所述2个或更多个蛋白或其片段通过它们各自的肽链内的肽键共价连接而无另外的化学接头。
融合蛋白也可另外被描述为蛋白构建体或嵌合蛋白。根据本发明，术语“构建体”或“嵌合蛋白”如果被使用的话，应该被理解为是指上文定义的融合蛋白。
对于本领域技术人员，显而易见的是由此定义的融合蛋白可通过肽和蛋白的已知的化学合成方法来合成。
融合蛋白可通过化学肽合成的方法来合成，特别是使用合适的树脂作为载体，使用固相肽合成技术进行。此类技术是常规的和本领域已知的，特别描述于例如下列专论中：Bodanszky和Bodanszky,ThePractice of Peptide Synthesis,1984,Springer-Verlag,New York,Stewart等人,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Edition,1984,PierceChemical Company。
融合蛋白可通过肽的化学合成方法作为连续蛋白来合成。或者，可以单独合成蛋白的各个片段(结构域)，然后通过一个肽片段的氨基末端与另一个肽的羧基末端的缩合经由肽键而组合在一起为一个连续的肽。此类技术是常规的和本领域已知的。
然而，优选地，本发明的融合蛋白是重组蛋白，通过编码融合蛋白的多核苷酸序列在宿主细胞中的基因表达的方法来产生。
为了验证得到的肽的结构，可以使用肽的氨基酸组成的已知的分析方法，例如高分辨率质谱技术，以确定肽的分子量。为了确认肽的序列，也可以使用蛋白测序仪，其依次降解肽并鉴定氨基酸的序列。
本发明的另一方面是编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列。
优选地，根据本发明的编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列是针对在大肠杆菌中表达而优化的序列。
本发明的另一个方面也是包含多核苷酸序列、特别是如上所述的本发明的DNA序列的表达载体。
本发明的另一个方面是包含上文所述的表达载体的宿主细胞。
用于表达本发明的融合蛋白的优选宿主细胞是大肠杆菌细胞。
用于产生重组蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。简而言之，该技术为：产生编码靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指导靶蛋白的表达的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，将编码靶蛋白的多核苷酸分子掺入合适的表达载体，其确保多肽的有效表达。然后将重组表达载体导入宿主细胞以进行转染/转化，由此产生转化的宿主细胞。然后培养转化的细胞以过表达靶蛋白，纯化所获得的蛋白，任选地通过切割用于表达或纯化蛋白的标签序列而切下来。
用于表达和纯化的合适的技术描述于例如下列专著：Goeddel,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,CA(1990)和A.Staron等人,Advances Mikrobiol.,2008,47,2,1983-1995。
作为用于导入和在宿主细胞中复制DNA序列的表达载体，可以使用粘粒、质粒或修饰的病毒。通常使用质粒作为表达载体。合适的质粒是熟知的和商业上可获得。
本发明的表达载体包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于转录和翻译掺入合适的宿主细胞的编码序列的必要的调节序列。调节序列的选择取决于宿主细胞的类型，可以由本领域技术人员容易地进行。此类调节序列的实例是包含转录起始信号、插入编码序列之前的转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，和插入编码序列之后的转录终止序列。此外，取决于所用的宿主细胞和载体，可以将其它序列导入表达载体，例如复制起始子，另外的DNA限制性位点，增强子和允许诱导转录的序列。
表达载体还包含标记物基因序列，其赋予转化的细胞确定的表型并使得能够特异性选择转化的细胞。此外，载体还可以包含第二标记物序列，其允许将以包含插入的编码靶蛋白序列的重组质粒转化的细胞与摄取了无插入物的质粒的细胞区分开。通常，使用典型的抗生素抗性标记物，然而，任何其它本领域已知的报告子基因均可使用，其在细胞(在体内)中的存在可使用放射自显影技术、分光光度法或生物和化学发光法容易地确定。例如，取决于宿主细胞，可使用例如下列报告基因：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白。
此外，表达载体可包含信号序列，将蛋白转运至合适的细胞腔室，例如周质，在那里促进折叠。另外，可以存在编码标记物/标签例如连接于N末端的HisTag或连接于C末端的GST的序列，其促进后续使用亲和法、通过镍柱上的亲和层析纯化所产生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保护蛋白免于宿主细胞中的蛋白水解降解，以及增强其溶解性的序列。
连接于靶蛋白的序列的辅助元件可阻断其活性，或者由于别的原因而具有有害效应，例如由于毒性。此类元件必须被除掉，这可通过酶促或化学切割来完成。特别地，为了允许通过亲和层析而纯化蛋白而连接的6个组氨酸的标签HisTag或这种类型的其它标记物应该被除去，因为其被描述对于可溶性TRAIL蛋白的肝毒性具有影响。可以使用基于多种熟知的宿主细胞的异源表达系统，包括原核细胞：细菌，例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母；和真核细胞系(昆虫、哺乳动物、植物)。
优选地，由于培养和遗传操作的容易性和大量的获得的产物，使用大肠杆菌表达系统。因此，包含编码本发明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列将针对在大肠杆菌中的表达而进行优化，即，其将包含在大肠杆菌中表达优化的编码序列密码子，选自本领域已知的可能的序列变体。此外，表达载体将包含适合大肠杆菌的连接于编码序列的上述元件。
因此，在本发明的优选实施方式中，针对在大肠杆菌中表达而优化的包含编码本发明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列选自下组的多核苷酸序列：
SEQ.No.85；；SEQ.No.86；SEQ.No.87；SEQ.No.88；SEQ.No.89；SEQ.No.90；SEQ.No.91；SEQ.No.92；SEQ.No.93；SEQ.No.94；SEQ.No.95；SEQ.No.96；SEQ.No.97；SEQ.No.98；SEQ.No.99；SEQ.No.100；SEQ.No.101；SEQ.No.102；SEQ.No.103；SEQ.No.104；SEQ.No.105；SEQ.No.106；SEQ.No.107；SEQ.No.108；SEQ.No.109；SEQ.No.110,SEQ.No.111；SEQ.No.111；SEQ.No.113；SEQ.No.114；SEQ.No.115；SEQ.No.116；SEQ.No.117；SEQ.No.118；SEQ.No.119；SEQ.No.120；SEQ.No.121；SEQ.No.122；SEQ.No.123；SEQ.No.124；SEQ.No.125；SEQ.No.126；SEQ.No.127；SEQ.No.128；SEQ.No.129；SEQ.No.130；SEQ.No.131；SEQ.No.132；SEQ.No.133；SEQ.No.134；SEQ.No.135；SEQ.No.136；SEQ.No.137；SEQ.No.138；SEQ.No.169；SEQ.No.170；SEQ.No.171；SEQ.No.172；SEQ.No.173；SEQ.No.174；SEQ.No.175；SEQ.No.176；SEQ.No.177；SEQ.No.178；SEQ.No.179；SEQ.No.180；SEQ.No.181；SEQ.No.182；SEQ.No.183；SEQ.No.184；SEQ.No.185；SEQ.No.186；SEQ.No.187；SEQ.No.188；SEQ.No.189；SEQ.No.190；SEQ.No.191；SEQ.No.192和SEQ.No.193；
其分别编码具有对应于选自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白：
SEQ.No.1；SEQ.No.2；SEQ.No.3；SEQ.No.4；SEQ.No.5；SEQ.No.6；SEQ.No.7；SEQ.No.8；SEQ.No.9；SEQ.No.10；SEQ.No.11；SEQ.No.12；SEQ.No.13；SEQ.No.14；SEQ.No.15；SEQ.No.16；SEQ.No.17；SEQ.No.18；SEQ.No.19；SEQ.No.20；SEQ.No.21；SEQ.No.22；SEQ.No.23；SEQ.No.24；SEQ.No.25；SEQ.No.26,SEQ.No.27；SEQ.No.28；SEQ.No.29；SEQ.No.30；SEQ.No.31；SEQ.No.32；SEQ.No.33；SEQ.No.34；SEQ.No.35；SEQ.No.36；SEQ.No.37；SEQ.No.38；SEQ.No.39；SEQ.No.40；SEQ.No.41；SEQ.No.42；SEQ.No.43；SEQ.No.44；SEQ.No.45；SEQ.No.46；SEQ.No.47；SEQ.No.48；SEQ.No.49；SEQ.No.50；SEQ.No.51；SEQ.No.52；SEQ.No.53,SEQ.No.54144；SEQ.No.145；SEQ.No.146；SEQ.No.147；SEQ.No.148；SEQ.No.149；SEQ.No.150；SEQ.No.151；SEQ.No.152；SEQ.No.153；SEQ.No.154；SEQ.No.155；SEQ.No.156；SEQ.No.157；SEQ.No.158；SEQ.No.159；SEQ.No.160；SEQ.No.161；SEQ.No.162；SEQ.No.163；SEQ.No.164；SEQ.No.165；SEQ.No.166；SEQ.No.167和SEQ.No.168。
在优选实施方式中，本发明还提供了适合于转化大肠杆菌的表达载体，其包含上述选自SEQ.NO.85至SEQ.NO.138和SEQ.NO.169至SEQ.NO.193的多核苷酸序列，以及以此类表达载体转化的大肠杆菌细胞。
转化，即将DNA序列导入细菌宿主细胞特别是大肠杆菌，通常在准备好摄取DNA的感受态细胞上进行，例如通过以钙离子在低温(4℃)处理，然后进行热击(37-42℃)或通过电穿孔进行。此类技术是熟知的并且通常由表达系统的生产商确定，或描述于文献和实验室工作手册中，例如Maniatis等人,Molecular Cloning.Cold Spring Harbor,N.Y.,1982)。
在大肠杆菌表达系统中过表达本发明的融合蛋白的程序将在下文详述。
本发明还提供了包含如上文所述的本发明的融合蛋白作为活性成分以及合适的药学上可接受的载体、稀释剂和常规辅助性成分的药物组合物。药物组合物将包含有效量的本发明的融合蛋白和药学上可接受的溶解或分散于载体或稀释剂中的辅助性成分，优选是配制为单元剂型或包含多剂的制剂的药物制剂的形式。药物形式和其配制方法以及其它成分、载体和稀释剂是本领域技术人员已知的并且在文献中有描述。例如，描述于下列专著：Remington's Pharmaceutical Sciences,ed.20,2000,Mack Publishing Company,Easton,USA。
术语“药学上可接受的载体、稀释剂和辅助性成分”包含本领域已知的任何溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂。本发明的药物组合物可包含多种类型的载体、稀释剂和赋形剂，这取决于所选的施用途径和需要的剂型，例如液体、固体和气雾剂形式，用于口服、胃肠外、吸入、表面，以及所选的形式对于施用途径(例如注射)是否必须是无菌的。本发明的药物组合物的优选施用途径是胃肠外，包括注射途径，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、肿瘤内或通过单次或连续静脉内输注。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以通过直接注射至肿瘤来施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可通过静脉内施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可皮下或腹膜内施用。用于胃肠外施用的药物组合物可以是药学上可接受的水性或非水性介质中的溶液或分散体，所述介质缓冲至合适的pH和与体液等渗(如果必要)，并且还可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和可溶性物质，其使得组合物与受体的组织或血液相容。可包含于组合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液体聚乙二醇，脂质例如甘油三酯，植物油，脂质体。合适的流动性和物质粒度可通过涂覆性物质例如卵磷脂和表面活性剂例如羟丙基纤维素、聚山梨酸酯等来提供。
用于液体胃肠外组合物的合适的等渗剂是例如糖，例如葡萄糖，和氯化钠，及其组合。
或者，用于通过注射或输注施用的药物组合物可以是粉末形式，例如冻干的粉末，用于在临使用前以合适的载体例如无菌无热源水进行重构。
用于胃肠外施用的本发明的药物组合物也可具有经鼻施用的形式，包括溶液、喷雾剂或气雾剂。优选地，用于经鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等渗的或缓冲至保持从大约5.5至大约6.5的pH，以维持类似于鼻分泌物的性质。此外，其将包含防腐剂或稳定剂，例如熟知的鼻内制剂中包含的那些。
组合物可包含多种抗氧化剂，其延迟一种或多种成分的氧化。此外，为了防止微生物的作用，组合物可包含多种抗细菌和抗真菌试剂，包括例如，但不限于，尼铂金酯类，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和这种类型的类似的已知物质。一般地，本发明的药物组合物可以包含例如至少大约0.01wt％的活性成分。更具体地，组合物可包含1％至75％重量的活性成分，或例如25％至60％重量，但不限于这些数值。施用于患者包括人类的根据本发明的组合物的实际剂量将由物理和生理因素决定，例如体重、病况的严重性、被治疗的疾病的类型，之前或同时的治疗性干预，患者和施用途径。合适的单元剂量，总剂量和组合物中的活性成分的浓度将由主治医生决定。
组合物可例如以下列剂量施用：大约1μg/kg体重至大约1000mg/kg患者体重，例如5mg/kg体重至100mg/kg体重，或5mg/kg体重至500mg/kg体重。融合蛋白和包含它的组合物显示出抗癌或抗肿瘤活性，可用于治疗癌症疾病。本发明还提供了如上所述的本发明的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人类中的癌症疾病的用途。本发明还提供了治疗哺乳动物包括人类中的肿瘤/癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用抗肿瘤/抗癌有效量的如上所述的本发明的融合蛋白，任选为合适的药物组合物的形式。
本发明的融合蛋白可用于治疗血液恶性肿瘤，例如白血病，肉芽肿病，骨髓瘤和其它血液恶性肿瘤。融合蛋白也可用于治疗实体瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，肾癌，脑癌等。用于治疗癌症的融合蛋白的合适的施用途径特别为胃肠外途径：以注射或输注的形式、在组合物中和以适合于该施用途径的形式施用本发明的融合蛋白。本发明将以下列一般性程序和具体融合蛋白的实例进行更详细的描述。
用于过表达融合蛋白的一般性程序
质粒的制备
靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以产生编码它的DNA序列，包含针对在大肠杆菌中的表达优化了的密码子。此程序允许增大在大肠杆菌中进行靶蛋白合成的后续步骤的效率。然后自动化合成得到的核苷酸序列。另外，将限制性酶Ndel(在引导链的5’末端)和Xhol(在引导链的3’末端)的切割位点添加到得到的编码靶蛋白的基因中。它们用于将基因克隆进入载体pET28a(Novagen)。它们也可用于将编码蛋白的基因克隆进入其它载体。从该构建体表达而来的靶蛋白在N末端可以任选地具有多聚组氨酸标签(6个组氨酸)，其之前是凝血酶识别的位点，该位点用于后续通过亲和层析进行纯化。一些靶在不使用任何标签的情况下表达，特别是不使用组氨酸标签，随后在SP琼脂糖上纯化。首先通过使用酶Ndel和Xhol对分离的质粒进行限制性分析、然后通过靶蛋白的整个阅读框的自动化测序来确认得到的构建体的正确性。用于测序的引物互补于存在于载体中的T7启动子的序列(5'-TAATACGACTCACTATAGG-3')和T7终止子的序列(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')。得到的质粒用于在商业化大肠杆菌菌株中过表达靶融合蛋白，其根据生产商的推荐进行转化。在选择性培养基(LB琼脂，卡那霉素50μg/ml，1％葡萄糖)上获得的菌落用于制备LB液体培养基(补充了50μg/ml的卡那霉素和1％葡萄糖)中的过夜培养物。在摇动的温育箱中生长大约15小时之后，培养物用于接种合适的培养物。
融合蛋白的过表达和纯化——一般程序A
以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.25-1mM。在25℃摇动温育后(3.5-20h)，将培养物在6,000g离心25分钟。将细菌沉淀物重悬于含有50mM KH2PO4,0.5M NaCl,10mM咪唑,pH7.4的缓冲液中。将悬浮液在冰上超声8分钟(40％振幅，15秒脉冲，10秒间隔)。通过在20000g、4℃离心40分钟而使得到的提取物澄清。以用于制备细菌细胞提取物的缓冲液平衡来预处理Ni-Sepharose树脂(GEHealthcare)。然后使用离心提取物后获得的上清液将树脂在4℃过夜温育。然后将其载入色谱柱并以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4,0.5M NaCl,20mM咪唑,pH7.4洗涤。使用含有0.5M NaCl pH7.4的50mM KH2PO4缓冲液中的咪唑梯度从柱洗脱获得的蛋白。通过SDS-PAGE分析获得的级份。将合适的级份组合并针对50mM Tris缓冲液,pH7.2,150mM NaCl,500mM L-精氨酸,0.1mM ZnSO4,0.01％Tween20在4℃过夜透析，同时，以凝血酶(1:50)切割Histag(如果存在的话)。切割之后，通过使用Benzamidine SepharoseTM树脂纯化而从与His标签一起表达的靶融合蛋白分离凝血酶。在SP琼脂糖上进行不与His标签一起表达的靶融合蛋白的纯化。通过SDS-PAGE电泳分析产物的纯度(Maniatis等人,Molecular Cloning.Cold SpringHarbor,NY,1982)。
融合蛋白的过表达和纯化——一般程序B
以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.5-1mM。在25℃摇动温育20h后，将培养物在6000g离心25分钟。将过表达后的细菌细胞在弗氏细胞压碎器中在含有50mM KH2PO4,0.5M NaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mM PMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8的缓冲液中破碎。通过在8000g离心50分钟使得到的提取物澄清。使用获得的上清液过夜温育Ni-Sepharose树脂。然后将结合了蛋白的树脂载入色谱柱。为了洗掉含有非结合性蛋白的级份，以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4,0.5M NaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mMPMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8洗涤柱。然后，为了洗掉大部分的特异性与床结合的蛋白，以含有50mM KH2PO4,0.5M NaCl,500mM咪唑,10％甘油,0.5mM PMSF,pH7.5的缓冲液洗涤柱。通过SDS-PAGE分析获得的级份(Maniatis等人,Molecular Cloning.ColdSpring Harbor,NY,1982)。将含有靶蛋白的级份组合(如果蛋白是与组氨酸标签一起表达)，以凝血酶切割(1U/4mg蛋白，16℃，8小时)以除掉多聚组氨酸标签。然后将级份针对配制缓冲液(500mM L-精氨酸,50mM Tris,2.5mM ZnSO4,pH7.4)透析。
在本说明书中，最初经表达具有组氨酸标签、组氨酸标签随后被除去的蛋白质在实施例编号中加以上标a)来表示。最初经表达不具有组氨酸标签的蛋白质在实施例编号之中利用上标b)来表示。
通过2-D电泳表征融合蛋白
为了进一步表征获得的蛋白质和精确地选择色谱条件，测定蛋白质的等电点。为此目的，根据下列方案在两个阶段使用二维电泳(2-D)。
步骤1。将蛋白质在pH梯度和变性条件下等电聚焦。
通过以1:1的比率与含有10％三氯醋酸和丙酮中的0.07％的β-巯基乙醇的沉淀溶液混合来沉淀浓度为1-2mg/ml的蛋白质制剂。将混合物在-20℃温育30min，随后在15,000g和4℃离心25min。除去上清液，用具有0.07％的β-巯基乙醇的冷丙酮洗涤沉淀2次。随后将丙酮的残留物蒸发直至无可检测的气味。取决于随后使用的条，将蛋白质沉淀悬浮于250 ml的具有pH 3-11或6-11的再水化缓冲液8M尿素、1％CHAPS、15mM DTT、0.5％两性电解质(GE Healthcare)。将蛋白质溶液置于陶瓷小室中以进行等电聚焦，随后置于具有适当pH(3-11或6-11)的13cm DryStrip (GE Healthcare)。整个表面覆盖一层矿物油。将小室置于Ettan IPGphor III装置中，在所述装置中根据按照胶条尺寸和pH赋予的下列参数进行等电聚焦：
在20℃脱水16h。
在固定的pH梯度下在电场中聚焦
时间 电压
1h 500V
1h 梯度500–1000V
2h30min 梯度1000–8000V
30min 8000V
随后，将包含聚焦的蛋白质的条在去离子水中洗涤1min，用考马斯亮染色，随后脱色，将其作为图像归档以标记蛋白质的位置。将脱色的条用具有下列组成的缓冲液平衡2x15min：50mM Tris-HClpH8.8、6M尿素、1％DTT、2％SDS、30％甘油。
步骤2.利用SDS-PAGE在第二方向上进行分离。
将条置于12.5％的包含每标准尺寸单个孔的聚丙烯酰胺凝胶上方，随后在用于SDS-PAGE的装置中，以200V的电压进行3小时。用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，随后与应用的范围一起归档。通过基于尺寸的标准测定其重量来鉴定蛋白质，随后针对基于由制造商(GEHealthcare)提供的曲线(pH对条离标记为正极的末端的长度的百分比的比率)的6-11的范围或基于通过等电聚集校准试剂盒(GEHealthcare)实验地测定的曲线的3-11的范围读取其IPI。
实施例
本发明的融合蛋白的代表性实例示于下列实施例中。
使用氨基酸序列组分的下列名称：
接头1:空间接头序列(Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS)
接头2:空间接头序列(Gly Gly Gly Gly/GGGG)
接头3:空间接头序列(Ala Ser Gly Gly/ASGG)
接头4:空间接头序列(Gly Gly Gly Ser/GGGS)
接头5:空间接头序列(Ser His Ala Ser/SHAS)
FURIN:被弗林蛋白酶切割的序列(Arg Lys Lys Arg/RKKR)
UROKIN:被尿激酶切割的序列(Arg Val Val Arg/RVVR)
PEG:PEG化接头序列(Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE)
TRANS1:转运序列(Lys Asp Glu Leu/KDEL)
TRANS2:转运序列(ArgArg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR)
TRANS3:(Lys Glu Asp Leu/KEDL)
接头6:(Cys Ala Ala Ala Cys AlaAla Cys/CAAACAAC)
接头7:(Gly Gly Gly/GGG)
MMP:(Pro Leu Gly Leu Ala Gly/PLGLAG)
FURIN.NAT:(Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu GlnLeu/RHRQPRGWEQL)
实施例1.SEQ.No.1的融合蛋白
SEQ ID NO:1的蛋白是具有430个氨基酸的长度和48.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为248个氨基酸的boguanin结构域A(SEQ.No.55)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间，连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.55)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:85。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:1用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:85。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例2.SEQ.No.2的融合蛋白
SEQ ID NO:2的蛋白是具有267个氨基酸的长度和50.8kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为篦麻毒素A的267个氨基酸的结构域(SEQ.No.56)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间相隔以空间接头序列(GGGGS)、PEG化序列(ASGCGPE)和被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-接头1-(SEQ.No.56)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:86。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:2用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:86。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.2a)和不具有组氨酸标签(Ex.2b)。
实施例3.SEQ.No.3的融合蛋白
SEQ ID NO:3的蛋白是具有378个氨基酸的长度和42kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为篦麻毒素A结构域的267个氨基酸的变体(SEQ.No.57)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间相隔以空间接头序列(GGGGS)、PEG化序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)和空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-接头1-(SEQ.No.57)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:87。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:3用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:87。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例4.SEQ.No.4的融合蛋白
SEQ ID NO:4的蛋白是具有473个氨基酸的长度和53.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为PAP毒素的290个氨基酸的类似物(SEQ.No.58)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间相隔以空间接头序列(GGGGS)、PEG化序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列(KDEL)，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-接头1-(SEQ.No.58)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:88。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:4用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:88。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例5.SEQ.No.5的融合蛋白
SEQ ID NO:5的蛋白是具有430个氨基酸的长度和48.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为皂草素的252个氨基酸的片段(SEQ.No.59)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间顺序地相隔以空间接头序列(GGGGS)、PEG化序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-接头1-(SEQ.No.59)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:89。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:5用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:89。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例6.SEQ.No.6的融合蛋白
SEQ ID NO:6的蛋白是具有442个氨基酸的长度和49.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为皂草素的252个氨基酸的片段(SEQ.No.59)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、两个空间接头的序列(GGGGS)和被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-PEG-接头1-接头1-furin-(SEQ.No.59)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:90。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:6用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:90。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例7.SEQ.No.7的融合蛋白
SEQ ID NO:7的蛋白是具有429个氨基酸的长度和47.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为247个氨基酸的肽天花粉蛋白(SEQ.No.60)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.60)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:91。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:7用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:91。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例8.SEQ.No.8的融合蛋白
SEQ ID NO:8的蛋白是具有427个氨基酸的长度和47.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为247个氨基酸的肽trichoanguin(SEQ.No.61)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(b)与结构域(a)之间，连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.61)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:92。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:8用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:92。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例9.SEQ.No.9的融合蛋白
SEQ ID NO:9的蛋白是具有427个氨基酸的长度和47.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为槲寄生凝集素A的249个氨基酸的链(SEQ.No.62)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(b)与结构域(a)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.62)-接头1-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:93。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:9用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:93。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例10.SEQ.No.10的融合蛋白
SEQ ID NO:10的蛋白是具有462个氨基酸的长度和51.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为ebulin的273个氨基酸的亚单位A(SEQ.No.63)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(b)与结构域(a)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(GGGG)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.63)-接头1-PEG-furin-LINK2-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:94。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:10用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:94。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例11.SEQ.No.11的融合蛋白
SEQ ID NO:11的蛋白是具有454个氨基酸的长度和50.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为链霉黑素的272个氨基酸的亚单位A(SEQ.No.64)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(b)与结构域(a)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.64)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:95。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:11用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:95。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例12.SEQ.No.12的融合蛋白
SEQ ID NO:12的蛋白是具有221个氨基酸的长度和25.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为47个氨基酸的丝瓜素P1肽(SEQ.No.65)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)和被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-furin-(SEQ.No.65)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:96。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:12用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:96。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例13.SEQ.No.13的融合蛋白
SEQ ID NO:13的蛋白是具有221个氨基酸的长度和26kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为篦麻毒素A的47个氨基酸的丝瓜素P1肽(SEQ.No.65)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(ASGG)和(GGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(ASGG)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头4-PEG-furin-接头3-(SEQ.No.65)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:97。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:13用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:97。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例14.SEQ.No.14的融合蛋白
SEQ ID NO:14的蛋白是具有254个氨基酸的长度和29.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为95-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为47个氨基酸的丝瓜素P1肽(SEQ.No.65)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列(KDEL)，其将效应子肽靶向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL95-281)-接头1-PEG-furin-(SEQ.No.65)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:98。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:14用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:98。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.14a)和不具有组氨酸标签(Ex.14b)。
实施例15.SEQ.No.15的融合蛋白
SEQ ID NO:15的蛋白是具有438个氨基酸的长度和49kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为蒴莲素的244个氨基酸的亚单位A(SEQ.No.66)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.66)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:99。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:15用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:99。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.15a)和不具有组氨酸标签(Ex.15b)。
实施例16.SEQ.No.16的融合蛋白
SEQ ID NO:16的蛋白是具有431个氨基酸的长度和48.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为蒴莲素的244个氨基酸的亚单位A(SEQ.No.66)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-接头1-(SEQ.No.66)-TRANS1
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:16用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:100。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例17.SEQ.No.17的融合蛋白
SEQ ID NO:17的蛋白是具有428个氨基酸的长度和47.8kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为蒴莲素的246个氨基酸的亚单位A(SEQ.No.67)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(b)与结构域(a)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.67)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:101。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:17用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:101。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例18.SEQ.No.18的融合蛋白
SEQ ID NO:18的蛋白是具有515个氨基酸的长度和55.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为铜绿假单胞菌外毒素的修饰序列的片段的342个氨基酸的同源物(SEQ.No.68)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和空间接头序列(ASGG)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列(KDEL)，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头4-接头3-(SEQ.No.68)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:102。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:18用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:102。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.18a)和不具有组氨酸标签(Ex.18b)。
实施例19.SEQ.No.19的融合蛋白
SEQ ID NO:19的蛋白是具有526个氨基酸的长度和57.1kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL119-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为修饰铜绿假单胞菌外毒素序列的片段的342个氨基酸的同源物(SEQ.No.68)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(ASGG)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列(KDEL)，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL119-281)-接头4-PEG-furin-接头3-(SEQ.No.68)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:103。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:19用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:103。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例20.SEQ.No.20的融合蛋白
SEQ ID NO:20的蛋白是具有526个氨基酸的长度和57.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为修饰铜绿假单胞菌外毒素序列的片段的354个氨基酸的同源物(SEQ.No.84)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(ASGG)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头4-PEG-furin-接头3-(SEQ.No.84)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:104。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:20用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:104。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.20a)和不具有组氨酸标签(Ex.20b)。
实施例21.SEQ.No.21的融合蛋白
SEQ ID NO:21的蛋白是具有534个氨基酸的长度和58.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的片段的354个氨基酸的同源物(SEQ.No.69)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(ASGG)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头4-PEG-furin-接头3-(SEQ.No.69)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:105。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:21用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:105。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例22.SEQ.No.22的融合蛋白
SEQ ID NO:22的蛋白是具有534个氨基酸的长度和56.1kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的342个氨基酸的片段(SEQ.No.83)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间插入了空间接头序列(GGGS)。因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头4-(SEQ.No.83)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:106。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:22用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:106。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例23.SEQ.No.23的融合蛋白
SEQ ID NO:23的蛋白是具有526个氨基酸的长度和57.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL119-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的342个氨基酸片段(SEQ.No.83)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(ASGG)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整构建体的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL119-281)-接头4-PEG-furin-接头3-(SEQ.No.
83)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:107。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:23用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:107。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例24.SEQ.No.24的融合蛋白
SEQ ID NO:24的蛋白是具有526个氨基酸的长度和57.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的342个氨基酸的片段(SEQ.No.83)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(ASGG)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL119-281)-接头4-PEG-furin-接头3-(SEQ.No.
83)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:108。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:24用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:108。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例25.SEQ.No.25的融合蛋白
SEQ ID NO:25的蛋白是具有423个氨基酸的长度和47.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为志贺毒素stx的239个氨基酸的变体(SEQ.No.70)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(SHHAS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.70)-接头5-furin-接头1-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:109。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:25用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:109。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例26.SEQ.No.26的融合蛋白
SEQ ID NO:26的蛋白是具有432个氨基酸的长度和47.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL120-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为志贺毒素stx的239个氨基酸的变体(SEQ.No.70)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(GGGS)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL120-281)-接头4-PEG-furin-接头4-(SEQ.No.70)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:110。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:26用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:110。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.26a)和不具有组氨酸标签(Ex.26b)。
实施例27.SEQ.No.27的融合蛋白
SEQ ID NO:27的蛋白是具有526个氨基酸的长度和38kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为149个氨基酸的局限曲菌素肽(SEQ.No.71)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和PEG化接头序列(ASGCGPE)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.71)-接头1-接头1-furin-PEG-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:111。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:27用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:111。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.27a)和不具有组氨酸标签(Ex.27b)。
实施例28.SEQ.No.28的融合蛋白
SEQ ID NO:28的蛋白是具有335个氨基酸的长度和37.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为149个氨基酸的局限曲菌素肽(SEQ.No.71)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-接头1-(SEQ.No.71)-TR2
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:112。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:28用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:112。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.28a)和不具有组氨酸标签(Ex.28b)。
实施例29.SEQ.No.29的融合蛋白
SEQ ID NO:29的蛋白是具有319个氨基酸的长度和35.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为130个氨基酸的hirsutellin肽(SEQ.No.72)，并且连接于结构域(a)的N端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和PEG化接头序列(ASGCGPE)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.72)-接头1-接头1-furin-PEG-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:113。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:29用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:113。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.29a)和不具有组氨酸标签(Ex.29b)。
实施例30.SEQ.No.30的融合蛋白
SEQ ID NO:30的蛋白是具有290个氨基酸的长度和32.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为109个氨基酸的Kid蛋白(SEQ.No.73)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-(SEQ.No.73)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:114。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:30用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:114。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例31.SEQ.No.31的融合蛋白
SEQ ID NO:31的蛋白是具有277个氨基酸的长度和31.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为100个氨基酸的CcdB蛋白(SEQ.No.74)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-(SEQ.No.74)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:115。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:31用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:115。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例32.SEQ.No.32的融合蛋白
SEQ ID NO:32的蛋白是具有228个氨基酸的长度和25.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为CcdB蛋白的47个氨基酸的变体(SEQ.No.75)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-(SEQ.No.75)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:116。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:32用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:116。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.32a)和不具有组氨酸标签(Ex.32b)。
实施例33.SEQ.No.33的融合蛋白
SEQ ID NO:33的蛋白是具有275个氨基酸的长度和31.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为94个氨基酸的RelE蛋白(SEQ.No.76)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-(SEQ.No.76)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:117。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:33用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:117。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例34.SEQ.No.34的融合蛋白
SEQ ID NO:34的蛋白是具有271个氨基酸的长度和30.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为90个氨基酸的StaB蛋白(SEQ.No.77)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-(SEQ.No.77)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:118。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:34用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:118。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例35.SEQ.No.35的融合蛋白
SEQ ID NO:35的蛋白是具有429个氨基酸的长度和48.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的白树毒素肽(SEQ.No.78)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.78)-接头1-接头1-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:119。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:35用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:119。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例36.SEQ.No.36的融合蛋白
SEQ ID NO:36的蛋白是具有434个氨基酸的长度和48.6kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL120-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为为251个氨基酸的白树毒素肽(SEQ.No.78)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.78)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL120-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:120。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:36用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:120。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例37.SEQ.No.37的融合蛋白
SEQ ID NO:37的蛋白是具有427个氨基酸的长度和48kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的白树毒素肽(SEQ.No.78)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-PEG-接头1-(SEQ.No.78)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:121。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:37用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:121。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例38.SEQ.No.38的融合蛋白
SEQ ID NO:38的蛋白是具有433个氨基酸的长度和48.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的白树毒素肽(SEQ.No.78)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.78)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:122。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:38用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:122。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例39.SEQ.No.39的融合蛋白
SEQ ID NO:39的蛋白是具有558个氨基酸的长度和61.4kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为白喉毒素的387个氨基酸的亚单位A(SEQ.No.79)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.79)-接头1-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:123。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:39用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:123。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例40.SEQ.No.40的融合蛋白
SEQ ID NO:40的蛋白是具有481个氨基酸的长度和53.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为白喉毒素的193个氨基酸的催化结构域(SEQ.No.80)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、来源于假单胞菌属毒素的转运结构域的序列(SEQ.No.139)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-furin-(SEQ.No.139)-接头1-(SEQ.No.80)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:124。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:40用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:124。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.40a)和不具有组氨酸标签(Ex.40b)。
实施例41.SEQ.No.41的融合蛋白
SEQ ID NO:41的蛋白是具有481个氨基酸的长度和53.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为白喉毒素的189个氨基酸的催化结构域(SEQ.No.81)，并且连接于结构域(a)的N末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)、空间接头序列(GGGGS)、来源于假单胞菌属毒素的转运结构域的序列(SEQ.No.139)、被弗林蛋白酶切割的序列(RKKR)和两个空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.81)-furin-接头1-(SEQ.No.139)-furin-接头1-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:41和SEQ IDNO:125。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:41用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:125。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例42.SEQ.No.42的融合蛋白
SEQ ID NO:42的蛋白是具有432个氨基酸的长度和48.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了两个空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.82)-接头1-接头1-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:42和SEQ IDNO:126。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:42用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:126。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.42a)和不具有组氨酸标签(Ex.42b)。
实施例43.SEQ.No.43的融合蛋白
SEQ ID NO:43的蛋白是具有443个氨基酸的长度和49.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、整联蛋白配体的序列(SEQ.No.140)、被尿激酶切割的序列(RVVR)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.82)-接头1-(SEQ.No.140)-尿激酶-接头1-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:43和SEQ IDNO:127。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:43用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:127。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.43a)和不具有组氨酸标签(Ex.43b)。
实施例44.SEQ.No.44的融合蛋白
SEQ ID NO:44的蛋白是具有433个氨基酸的长度和48.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了两个空间接头序列(GGGGS)和被尿激酶切割的序列(RVVR)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.82)-接头1-接头1-尿激酶-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:44和SEQ IDNO:128。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:44用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:128。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.44a)和不具有组氨酸标签(Ex.44b)。
实施例45.SEQ.No.45的融合蛋白
SEQ ID NO:45的蛋白是具有441个氨基酸的长度和50kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了8个精氨酸残基的转运序列(RRRRRRRR)、被尿激酶切割的序列(RVVR)和连续地两个空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.82)-TRANS2-尿激酶-接头1-接头1-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:129。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:45用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:129。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例46.SEQ.No.46的融合蛋白
SEQ ID NO:46的蛋白是具有550个氨基酸的长度和61.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被尿激酶切割的序列(RVVR)、来源于假单胞菌属的转运结构域序列(SEQ.No.139)、空间接头序列(GGGGS)和被尿激酶切割的序列(RVVR)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL114-281)-接头1-尿激酶-(SEQ.No.139)-接头1-尿激酶-(SEQ.No.82)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:130。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:46用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:130。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.46a)和不具有组氨酸标签(Ex.46b)。
实施例47.SEQ.No.47的融合蛋白
SEQ ID NO:47的蛋白是具有459个氨基酸的长度和51.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL95-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了两个空间接头序列(GGGGS)、被尿激酶切割的序列(RVVR)和PEG化接头序列(ASGCGPE)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.82)-接头1-接头1-尿激酶-PEG-(TRAIL95-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:47和SEQ IDNO:131。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:47用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:131。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.47a)和不具有组氨酸标签(Ex.47b)。
实施例48.SEQ.No.48的融合蛋白
SEQ ID NO:48的蛋白是具有443个氨基酸的长度和49.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被尿激酶切割的序列(RVVR)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-尿激酶-接头1-(SEQ.No.82)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:48和SEQ IDNO:132。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:48用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:132。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例49.SEQ.No.49的融合蛋白
SEQ ID NO:49的蛋白是具有447个氨基酸的长度和50.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被尿激酶切割的序列(RVVR)和空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-尿激酶-接头1-(SEQ.No.82)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:133。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:49用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:133。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.49a)和不具有组氨酸标签(Ex.49b)。
实施例50.SEQ.No.50的融合蛋白
SEQ ID NO:50的蛋白是具有441个氨基酸的长度和49.4kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为251个氨基酸的相思豆毒蛋白的结构域A(SEQ.No.82)，并且连接于结构域(a)的N末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了两个空间接头序列(GGGGS)、被尿激酶切割的序列(RVVR)和PEG化接头序列(ASGCGPE)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.82)-接头1-接头1-尿激酶-PEG-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:50和SEQ IDNO:134。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:50用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:134。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.50a)和不具有组氨酸标签(Ex.50b)。
实施例51.SEQ.No.51的融合蛋白
SEQ ID NO:51的蛋白是具有515个氨基酸的长度和55.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含D218H突变的TRAIL121-281(SEQ.No.142)，并且效应子肽的结构域(b)为342个氨基酸的修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的片段的同源物(SEQ.No.68)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和(ASGG)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.142)-接头4-接头3-(SEQ.No.68)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:51和SEQ IDNO:135。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:51用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:135。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.51a)和不具有组氨酸标签(Ex.51b)。
实施例52.SEQ.No.52的融合蛋白
SEQ ID NO:52的蛋白是具有515个氨基酸的长度和55.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269H突变的TRAIL121-281(SEQ.No.143)，并且效应子肽的结构域(b)为342个氨基酸的修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的片段的同源物(SEQ.No.68)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和(ASGG)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.143)-接头4-接头3-(SEQ.No.68)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:52和SEQ IDNO:136。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:52用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:136。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例53.SEQ.No.53的融合蛋白
SEQ ID NO:53的蛋白是具有515个氨基酸的长度和55.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含突变D218H的TRAIL121-281(SEQ.No.142)，并且效应子肽的结构域(b)为342个氨基酸的修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的片段的同源物(SEQ.No.83)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和PEG化接头序列(ASGCGPE)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.142)-接头4-PEG-(SEQ.No.83)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:53和SEQ IDNO:137。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:53用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:137。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序A，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例54.SEQ.No.54的融合蛋白
SEQ ID NO:54的蛋白是具有515个氨基酸的长度和55.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含突变Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269H的TRAIL121-281(SEQ.No.143)，并且效应子肽的结构域(b)为342个氨基酸的修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的片段的同源物(SEQ.No.83)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和(ASGG)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.143)-接头4-接头3-(SEQ.No.83)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:54和SEQ IDNO:138。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:54用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:138。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.54a)和不具有组氨酸标签(Ex.54b)。
实施例55.SEQ.No.144的融合蛋白
SEQ ID NO:144的蛋白是具有433个氨基酸的长度和48.8kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL114-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的N末端，并且为251个氨基酸的相思豆毒蛋白A结构域的变体(SEQ.No.194)。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了两个空间接头序列(GGGGS)和被弗林蛋白酶识别的切割位点(RKKR)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.194)-接头1-接头1-furin-(TRAIL114-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:144和SEQID NO:169。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:144用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:169。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例56.SEQ.No.145的融合蛋白
SEQ ID NO:145的蛋白是具有450个氨基酸的长度和50.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的C末端，并且为264个氨基酸的篦麻毒素A结构域的缺失变体(SEQ.No.195)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、PEG化接头序列(ASGCGPE)、被弗林蛋白酶识别的序列和空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-接头1-(SEQ.No.195)-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:145和SEQID NO:170。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:145用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:170。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例57.SEQ.No.146的融合蛋白
SEQ ID NO:146的蛋白是具有481个氨基酸的长度和53kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的N末端，并且为189个氨基酸的白喉毒素的突变的活性结构域(SEQ.No.196)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了被弗林蛋白酶识别的切割位点序列(RKKR)、空间接头序列(GGGGS)、来源于假单胞菌属毒素的转运结构域的序列(SEQ.No.139)、另一个被弗林蛋白酶识别的切割位点序列(RKKR)和随后两个空间接头的序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.196)-furin-接头1-SEQ.No.139-furin-接头1-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:146和SEQID NO:171。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:146用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:171。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例58.SEQ.No.147的融合蛋白
SEQ ID NO:147的蛋白是具有478个氨基酸的长度和52.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的N末端，并且为186个氨基酸的白喉毒素的突变的活性结构域(SEQ.No.197)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了被弗林蛋白酶识别的切割位点序列(RKKR)、空间接头序列(GGGGS)、来源于假单胞菌属毒素的转运结构域的序列(SEQ.No.139)、另一个被弗林蛋白酶识别的切割位点序列(RKKR)和随后两个空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.197)-furin-接头1-SEQ.No.139-furin-接头1-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:147和SEQID NO:172。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:147用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:172。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例59.SEQ.No.148的融合蛋白
SEQ ID NO:148的蛋白是具有433个氨基酸的长度和48.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的N末端，并且为251个氨基酸的白树毒素的突变体(SEQ.No.198)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、被弗林蛋白酶识别的切割位点序列(RKKR)、PEG化接头序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No198)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:148和SEQID NO:173。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:148用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:173。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.59a)和不具有组氨酸标签(Ex.59b)。
实施例60.SEQ.No.149的融合蛋白
SEQ ID NO:149的蛋白是具有258个氨基酸的长度和29.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL95-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的C末端，并且为47个氨基酸的P1丝瓜素白肽(SEQ.No.65)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)、(GGG)和(CAAACAAC)，随后被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL95-281)-接头1-接头7-接头6-furin-(SEQ.No.65)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:149和SEQID NO:174。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:149用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:174。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例61.SEQ.No.150的融合蛋白
SEQ ID NO:150的蛋白是具有253个氨基酸的长度和29.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL95-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的N末端，并且为47个氨基酸的P1丝瓜素白肽(SEQ.No.65)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)和空间接头序列(GGG)和(CAAACAAC)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.65)-TRANS1-furin-接头7-接头6-(TRAIL95-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:150和SEQID NO:175。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:150用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:175。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例62.SEQ.No.151的融合蛋白
SEQ ID NO:151的蛋白是具有539个氨基酸的长度和59.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的N末端，并且为247个氨基酸的天花粉蛋白的突变的突变体(SEQ.No.199)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)和空间接头序列(GGGGS)，随后来源于假单胞菌属毒素的转运结构域的序列(SEQ.No.139)、另一个被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)和两个空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.199)-furin-接头1-SEQ.No.139-furin-接头1-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:151和SEQID NO:176。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:151用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:176。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例63.SEQ.No.152的融合蛋白
SEQ ID NO:152的蛋白是具有429个氨基酸的长度和47.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，效应子肽的结构域(b)连接于结构域(a)的N末端，并且为247个氨基酸的天花粉蛋白的突变的突变体(SEQ.No.200)。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)和被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)，随后PEG化序列(ASGCGPE)和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.200)-接头1-furin-PEG-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:152和SEQID NO:177。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:152用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:177。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例64.SEQ.No.153的融合蛋白
SEQ ID NO:153的蛋白是具有515个氨基酸的长度和55.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为342个氨基酸的具有点突变R318K、N441Q和R601K的修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列(SEQ.No.201)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和(ASGG)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头4-接头3-SEQ.No.201-(TRANS1)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:153和SEQID NO:178。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:153用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:178。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例65.SEQ.No.154的融合蛋白
SEQ ID NO:154的蛋白是具有402个氨基酸的长度和43.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为225个氨基酸的修饰的铜绿假单胞菌外毒素序列的缺失变体(SEQ.No.202)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和(GGGG)以及被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头4-接头2-furin-(SEQ.No.202)-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:154和SEQID NO:179。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:154用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:179。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.65a)和不具有组氨酸标签(Ex.65b)。
实施例66.SEQ.No.155的融合蛋白
SEQ ID NO:155的蛋白是具有403个氨基酸的长度和44.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为226个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的缺失变体(SEQ.No.203)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)和(GGGG)以及被弗林蛋白酶识别的切割位点的序列(RKKR)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
TRAIL121-281-接头1-接头2-furin-SEQ.No.203-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:155和SEQID NO:180。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:155用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:180。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.66a)和不具有组氨酸标签(Ex.66b)。
实施例67.SEQ.No.156的融合蛋白
SEQ ID NO:156的蛋白是具有470个氨基酸的长度和51.5kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的缺失变体(SEQ.No.204)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)和(ASGCGPE)，随后被弗林蛋白酶识别的序列(RKKR)和被弗林蛋白酶识别的切割位点的天然序列(RHRQPRGWEQL)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-PEG-furin-FURIN.NAT-(SEQ.No.204)-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:156和SEQID NO:181。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:156用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:181。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.67a)和不具有组氨酸标签(Ex.67b)。
实施例68.SEQ.No.157的融合蛋白
SEQ ID NO:157的蛋白是具有478个氨基酸的长度和51.8kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的缺失变体(SEQ.No.205)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的切割位点(RKKR)，被弗林蛋白酶识别的切割位点的天然序列(RHRQPRGWEQL)和重复的空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-接头1-furin-FURIN.NAT-接头1-接头1-(SEQ.No.205)-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:157和SEQID NO:182。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:157用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:182。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.68a)和不具有组氨酸标签(Ex.68b)。
实施例69.SEQ.No.158的融合蛋白
SEQ ID NO:158的蛋白是具有402个氨基酸的长度和44.7kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为214个氨基酸的铜绿假单胞菌外毒素序列的突变的缺失变体(SEQ.No.206)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后空间接头序列(GGGG)，被弗林蛋白酶识别的切割位点(RKKR)和被弗林蛋白酶识别的切割位点的天然序列(RHRQPRGWEQL)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-接头2-furin-FURIN.NAT-(SEQ.No.206)-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:158和SEQID NO:183。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:158用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:183。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例70.SEQ.No.159的融合蛋白
SEQ ID NO:159的蛋白是具有467个氨基酸的长度和50.4kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的突变的缺失变体(SEQ.No.205)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的切割位点(RKKR)和另一个重复的空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-接头1-furin-接头1-接头1-(SEQ.No.205)-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:159和SEQID NO:184。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:159用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:184。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例71.SEQ.No.160的融合蛋白
SEQ ID NO:160的蛋白是具有474个氨基酸的长度和51.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的突变的缺失变体(SEQ.No.205)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGG)，随后被弗林蛋白酶识别的切割位点的天然序列(RHRQPRGWEQL)和另一个重复的空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
TRAIL121-281-接头1-接头1-FURIN.NAT-接头1-接头1-SEQ.No.205-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:160和SEQID NO:185。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:160用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:185。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.71a)和不具有组氨酸标签(Ex.71b)。
实施例72.SEQ.No.161的融合蛋白
SEQ ID NO:161的蛋白是具有474个氨基酸的长度和51.3kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的突变的缺失变体(SEQ.No.205)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的天然切割位点序列(RHRQPRGWEQL)和另一个重复的空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-接头1-FURIN.NAT-接头1-接头1-(SEQ.No.205)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:161和SEQID NO:186。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:161用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:186。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例73.SEQ.No.162的融合蛋白
SEQ ID NO:162的蛋白是具有474个氨基酸的长度和51.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的缺失变体(SEQ.No.207)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的天然切割位点序列(RHRQPRGWEQL)和另一个重复的空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-接头1-FURIN.NAT-接头1-接头1-(SEQ.No.207)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:162和SEQID NO:187。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:162用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:187。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例74.SEQ.No.163的融合蛋白
SEQ ID NO:163的蛋白是具有515个氨基酸的长度和55.9kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含突变D218H的TRAIL121-281(SEQ.No.142)，并且效应子肽的结构域(b)为342个氨基酸的具有3个点突变R318K、N441Q和R601K的修饰铜绿假单胞菌外毒素序列(SEQ.No.201)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)和(ASGG)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.142)-接头4-接头3-(SEQ.No.201)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:163和SEQID NO:188。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:163用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:188。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例75.SEQ.No.164的融合蛋白
SEQ ID NO:164的蛋白是具有475个氨基酸的长度和51.4kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含突变D218H的TRAIL121-281(SEQ.No.142)，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的突变的缺失变体(SEQ.No.205)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的天然切割位点序列(RHRQPRGWEQL)和另一个重复的空间接头序列(GGGGS)。此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.142)-接头1-接头1-FURIN.NAT-接头1-接头1-(SEQ.No.205)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:164和SEQID NO:189。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:164用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:189。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例76.SEQ.No.165的融合蛋白
SEQ ID NO:165的蛋白是具有463个氨基酸的长度和50.6kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含突变D218H的TRAIL121-281(SEQ.No.142)，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的缺失变体(SEQ.No.204)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的切割位点的天然序列(RHRQPRGWEQL)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.142)–接头4-接头4-FURIN.NAT-(SEQ.No.204)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:165和SEQID NO:190。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:165用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:190。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例77.SEQ.No.166的融合蛋白
SEQ ID NO:166的蛋白是具有475个氨基酸的长度和51.4kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为包含突变Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269H的TRAIL121-281(SEQ.No.143)，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有几个点突变的铜绿假单胞菌外毒素序列的突变的缺失变体(SEQ.No.205)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的切割位点的天然序列(RHRQPRGWEQL)和两个空间接头序列(GGGGS)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.143)-接头1-接头1-FURIN.NAT-接头1-接头1-(SEQ.No.205)-TRANS1
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:166和SEQID NO:191。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:166用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:191。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签。
实施例78.SEQ.No.167的融合蛋白
SEQ ID NO:167的蛋白是具有474个氨基酸的长度和51.24kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为279个氨基酸的具有突变的铜绿假单胞菌外毒素A序列的缺失变体(SEQ.No.207)，并且连接于结构域(a)的C末端。此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被弗林蛋白酶识别的切割位点的天然序列(RHRQPRGWEQL)和两个空间接头序列(GGGGS)。
此外，在结构域(b)的C末端连接有转运序列KDEL，其将效应子肽导向内质网，从而形成完整融合蛋白的C末端片段。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(TRAIL121-281)-接头1-接头1-FURIN.NAT-接头1-接头1-(SEQ.No.207)-TRANS3
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:167和SEQID NO:192。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:167用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:192。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
蛋白质经表达具有组氨酸标签(Ex.78a)和不具有组氨酸标签(Ex.78b)。
实施例79.SEQ.No.168的融合蛋白
SEQ ID NO:168的蛋白是具有232个氨基酸的长度和26.2kDa的质量的融合蛋白，其中结构域(a)为TRAIL121-281的序列，并且效应子肽的结构域(b)为51个氨基酸的Hok蛋白序列(SEQ.No.208)，并且连接于结构域(a)的C末端。
此外，在结构域(a)与结构域(b)之间连续地插入了空间接头序列(GGGGS)，随后被尿激酶(RVVR)和金属蛋白酶MMP(PLGLAG)识别的切割位点的序列和空间接头序列(GGGGS)。
因此，本发明的融合蛋白的结构如下：
(SEQ.No.208)-接头1-尿激酶-MMP-接头1-(TRAIL121-281)
氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别为所附序列表中所示的SEQ ID NO:168和SEQID NO:193。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:168用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:193。产生包含DNA的编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据上述一般程序B，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或Tuner(DE3)菌株进行过表达。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例80.融合蛋白的抗肿瘤活性的测定
在体外在肿瘤细胞系中在细胞毒性测定中以及在体内在小鼠中进行了融合蛋白的抗肿瘤活性的测定。为了比较目的，使用了rhTRAIL114-281蛋白和安慰剂。
1.圆二色性(circular dichroism)测定:获得的蛋白质的二级结构组成的测定
通过Ex.2a、Ex.11a、Ex.12a、Ex.13a、Ex.14a、Ex.15a、Ex.18a、Ex.20a、Ex.26a、Ex.29a、Ex.42a、Ex.43a、Ex.44a、Ex.50a、Ex.51a和Ex.52a的融合蛋白的圆二色性测定融合蛋白的制备物的质量(就它们的结构而言)。圆二色性用于测定蛋白质的二级结构和构象。CD方法使用蛋白结构的光学活性，表现为使光偏振平面旋转和椭圆偏振的出现。远紫外(UV)中的蛋白的CD光谱提供了关于主要多肽链的构象的精确数据。
将待分析的蛋白的样品在配制于由50mM Tris-HCl pH8,0,100mM NaCl,10％甘油,0.1mM ZnCl2,80mM蔗糖,5mM DTT组成的缓冲液后于具有12kDa截留值的透析袋(Sigma-Aldrich)中透析。针对相对于蛋白制剂100倍过量(v/v)的缓冲液进行透析，同时搅拌，在4℃持续数个小时。透析完成之后，将每个制剂离心(25000rpm,10min,4℃)，收集上清液。
通过Bradford法测定由此获得的样品中的蛋白浓度。
在Jasco J-710分光偏振计中，在具有0.2mm或1mm光程的石英杯中进行浓度范围为0.1-2.7mg/ml的蛋白的圆二色性测定。在7l/min的氮气流下进行该测定，这允许在195至250nm波长范围内进行测定。测量参数：光谱分辨率-1nm；光束的半宽1nm；灵敏性20mdeg,一个波长的平均时间-8s,扫描速度10nm/min。
使用CDPro软件在193-250nm范围内对获得的光谱进行数值分析。忽略掉光电倍增管中的电压超过700V的点，因为该波长范围内的信噪比太低。
获得的数据用于计算所分析的蛋白质中的特定二级结构含量，使用CDPro软件(表1)。
表1：所分析的蛋白质中的二级结构的含量
*基于晶体结构1D4V获得的值
**基于晶体结构1IKQ、1R4Q、1ABR、3PX8获得的值
对照分子(rhTRAIL114-281)显示出蛋白的特征性CD光谱，主要类型为β-片层结构(在220nm的波长处锐利刻画出最小椭圆率)。这确认了二级结构成分的计算，表明有少量的α-螺旋元件。
获得的结果与来自hTRAIL蛋白的晶体结构和本发明的融合蛋白(Ex.12a、Ex.13a、Ex.14a和Ex.29a)的特征的数据也是一致的，其中β元件构成32-44％的其结构。在所有实施例的情况下，二色性光谱的特征在于220nm波长处的一个最小值。由于连接于TRAIL的小的肽构成蛋白的小部分，无需产生确定的二级结构，所以分析的蛋白质应该不与初始蛋白质有显著不同。在Ex.2a、Ex.11a、Ex.15a、Ex.20a、Ex.26a、Ex.42a、Ex.43a、Ex.44a、Ex.50a、Ex.51a和Ex.52a的构建体的情况下，观察到二级结构α/β的混合含量，其与基于效应子肽结构域的已知晶体结构的预期一致。在这些大的结构域的情况下50％的水平的α结构的含量对融合蛋白的结构具有显著的影响。
仅Ex.18a的蛋白具有超过70％的α-螺旋含量和低β结构的含量。
2.在体外在细胞系中的测试
细胞系
细胞系获自ATCC和CLS，随后进行增殖，并保藏在Laboratoryof Biology Adamed’s Cell Line Bank。在实验过程中，使用试剂盒GeM Mycoplasma PCR Detection Kit(Minerva Biolabs,Berlin,Germany)通过PCR技术常规地检查细胞的支原体的存在。在标准条件：37℃,5％CO2(在DMEM的情况下10％CO2)和85％相对湿度下维持培养物。将特定细胞系培养在由ATCC推荐的适当的培养基中。
表2.粘附性细胞系
表3：非粘附性细胞：
MTT细胞毒性测试
MTT测试法是用于测定细胞增殖、存活性和细胞毒性的比色测定法。其在于黄色的四唑盐MTT(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)通过线粒体酶琥珀酸盐-四唑还原酶1分解为不溶于水的紫色染料甲瓒。MTT还原仅在活细胞中发生。数据分析：测定蛋白质的IC50浓度(ng/ml)，即相对于对照细胞，经处理的群体中的细胞数目减少50％时的蛋白浓度。使用GraphPad Prism5.0软件分析结果。根据文献中的描述进行测试(Celis,JE,(1998).Cell Biology,a LaboratoryHandbook,second edition,Academic Press,San Diego；Yang,Y.,Koh,LW,Tsai,JH.,(2004)；Involvement of viral and chemical factors withoral cancer in Taiwan,Jpn J Clin Oncol,34(4),176-183)。
将细胞培养基稀释至确定的密度(104-105个细胞/100μl)。然后将100μl适当稀释的细胞悬浮液加至96孔板中，一式三份。将所制备的细胞在37℃在5％或10％CO2(取决于所用的培养基)中温育24小时，然后向细胞(在100μl培养基中)中再加入100μl含有各种浓度的测试蛋白的培养基。将细胞与测试蛋白温育72小时，相当于3-4次细胞分裂，然后向含有测试蛋白的培养基中加入20ml MTT工作溶液[5mg/ml]，并在37℃在5％CO2中温育3小时。然后除去含有MTT溶液的培养基，通过加入100μl DMSO溶解甲瓒晶体。搅拌之后，在570nm(参考滤波器690nm)测定吸收值。
EZ4U细胞毒性测试
EZ4U(Biomedica)测试用于测定非粘附性细胞系中的蛋白质的细胞毒性活性。该测试是MTT法的改进形式，其中还原四唑盐而形成的甲瓒是可溶于水的。将细胞与蛋白(7个蛋白浓度，每个一式三份)连续温育72小时之后进行细胞存活性研究。基于此，使用GraphPadPrism5软件测定IC50值(两次独立实验的平均值)。对照细胞仅用溶剂温育。
体外细胞毒性测试的结果以IC50值(ng/ml)总结，IC50值对应于：相对于仅以溶剂温育的对照细胞，在50％水平观察到融合蛋白的细胞毒性效应时的蛋白浓度。每个实验代表以一式三份进行的至少2次独立实验的平均值。作为缺乏蛋白质制剂活性的标准，采用了2000ng/ml的IC50限值。具有大于2000的IC50值的融合蛋白被认为是无活性的。
被选择用于此测试的细胞包括对于TRAIL蛋白具有天然抗性的细胞系(对于TRAIL的天然抗性的标准：对于TRAIL蛋白的IC50>2000)，以及对于TRAIL蛋白敏感的肿瘤细胞系，对于多柔比星有抗性的细胞系MES-SA/DX5作为对于常规抗癌药物有抗性的癌细胞系。
未分化的HUVEC细胞系用作健康对照细胞系，用于估量融合蛋白对于非癌细胞的影响/毒性。
获得的结果确认了通过向对于TRAIL具有天然抗性的细胞施用本发明的某些融合蛋白而克服细胞系对于TRAIL的抗性的可能性。当将本发明的融合蛋白施用于对于TRAIL敏感的细胞时，在一些情况下观察到作用效力的明显的、强烈的加强，这表现为融合蛋白的IC50值相对于单独的TRAIL的IC50降低。此外，在对于常规抗癌药多柔比星有抗性的细胞中获得了本发明的融合蛋白的细胞毒性活性，在一些情况下其比单独的TRAIL的活性更强。
对于非癌细胞系所获得的大于2000的IC50值显示：对于健康细胞使用本发明的蛋白，不存在毒性效应，这表明这些蛋白的潜在的低系统性毒性。
选择的蛋白质制剂对于扩展的肿瘤细胞系小组的细胞毒性活性的 测定
表4显示了选择的本发明的融合蛋白针对来自不同器官的一大组肿瘤细胞(对应于宽范围的多数常见癌症)的体外细胞毒性活性测试结果。
实验结果表示为平均值±标准差(SD)。使用GraphPad Prism5.0软件产生所有计算和图表。
获得的IC50值确认了融合蛋白的高细胞毒性活性，由此确认了它们对于治疗癌症的潜在有用性。
3.融合蛋白在体内对异种移植物的抗肿瘤有效性
在人结肠癌Colo205和HCT-116、SW620、人肺癌A549、人前列腺癌PC-3、人胰腺癌Panc-1、人肝癌PCL/PRF/5、HT-29、HepG2和人子宫肉瘤MES-SA.Dx5的小鼠模型中测试蛋白质制剂的抗肿瘤活性。
细胞
将人结肠癌Colo205的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)(任选地以1:1比例与Opto-MEM(Invitrogen,Cat.22600-134)混合)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
将人肺癌A549的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
将人前列腺癌PC3的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
人胰腺癌PANC-1的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
将人肝癌/PRF/5(CLS)和人结肠癌SW-620的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
将人结肠癌HCT-116和HT-29的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的McCoy’s培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
将人肝癌HepG2的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的MEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
将多重耐药的人子宫肉瘤MES-SA.Dx5的细胞维持于补充了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺以及1μM盐酸多柔比星(Sigma,Cat.No.D1515-10MG)的McCoy’s培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植前3天，将细胞培养在无多柔比星的培养基中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4℃离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中。
小鼠
在获自Centrum Medycynyin的7-9周龄CD-裸鼠(Crl:CD1-Foxn1nu1)、获自Harlan UK的7-8周龄Hsd:无胸腺-裸-Foxn1nu(雌性)、获自Harlan UK的8-10周龄HsdCpb:NMRI-Foxn1nu小鼠、获自Centrum Medycynyin的8-10周龄雌性Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠和获自Charles River Germany的4-5周龄雌性Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中进行本发明的蛋白的抗肿瘤活性测定。将小鼠保持于特定的无病原体条件下，自由获取食物和去矿物水(随意)。所有的动物实验根据下列指引进行："Interdisciplinary Principlesand Guidelines for the Use of Animals in Research,Marketing andEducation"，由New York Academy of Sciences'Ad Hoc Committee onAnimal Research颁布并由IV Local Ethics Committee on AnimalExperimentation in Warsaw(No.71/2009)批准。
实验进程和评价
使用电子卡尺测定肿瘤大小，使用公式(a2x b)/2计算肿瘤体积，其中a＝肿瘤的较短的对角线(mm)，b＝肿瘤的较长的对角线(mm)。使用下列公式计算肿瘤生长的抑制：
TGI[％](肿瘤生长抑制)＝(WT/WC)x100-100％
其中WT是指处理组中的平均肿瘤体积，WC是指对照组中的平均肿瘤体积。
实验结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用GraphPad Prism5.0软件进行所有计算和作图。
人结肠癌模型
A.Colo205
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.15ml RPMI1640中的5x106个Colo205细胞。在实验的第10天，将小鼠随机化以获得～100mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18a(3mg/kg)、Ex.25a(3mg/kg)、Ex.37a(5mg/kg)和Ex.42a(10mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(10mg/kg)作为对比和以注射用水作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次，每2天一次。在实验的第27天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图1和图2中，作为肿瘤体积的变化的图(图1)，作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)的图(图2)。
图1和图2中显示的实验结果显示：施用Ex.18a、Ex.25a、Ex.37a和Ex.42a的本发明的融合蛋白引起肿瘤Colo205生长抑制，在实验的第27天相对于对照的TGI分别是30.5％、37％、29％和60.2％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为12％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
B.HCT-116
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml的HBSS缓冲液:基质胶的3:1混合物中的5x106个HCT116细胞。当肿瘤达到71-432mm3的大小(第13天)时，将小鼠随机化以获得～180mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18b(3mg/kg)、Ex.2b(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(65mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用rhTRAIL114-281和Ex.2b6次，在实验的第13、15、21、24天静脉内(i.v.)施用Ex.18b。对照组接受配制缓冲液。在实验的第24天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图19中作为肿瘤体积的变化图，和示于图20中，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图1和2中显示的实验结果显示：施用Ex.18b和Ex.2b的本发明的融合蛋白引起肿瘤HCT116生长抑制，在实验的第24天相对于对照的TGI分别是81％和67％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为38％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
B1.HCT116
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml的HBSS缓冲液:基质胶的3:1混合物中的5x106个HCT116细胞。当肿瘤达到63-370mm3(第17天)时，将小鼠随机化以获得～190mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18b(3mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(70mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用rhTRAIL114-281六次，每4天静脉内(i.v.)施用Ex.18b六次。对照组接受配制缓冲液。在实验的第47天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图19a中作为肿瘤体积的变化图，和示于图20a中，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图19a和20a中显示的实验结果显示：施用Ex.18b的本发明的融合蛋白引起肿瘤HCT116生长抑制，在实验的第47天相对于对照的TGI分别是85％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为37％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
C.SW620TAZD
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml的HBSS缓冲液:基质胶的3:1混合物中的5x106个SW620细胞。当肿瘤达到92-348mm3(第13天)时，将小鼠随机化以获得～207mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.2b(5mg/kg)、Ex.18b(3mg/kg)和Ex.51b(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(50mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mMNaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂六次，对照组接受配制缓冲液[f25]。
在实验的第26天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图21中作为肿瘤体积的变化图，和示于图22中，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图21和22中显示的实验结果显示：施用Ex.18b、Ex.51b和Ex.2b的本发明的融合蛋白引起SW620肿瘤生长抑制，在实验的第34天相对于对照的TGI分别是62.6％、39％和54％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为23％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
C1SW620
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml的HBSS缓冲液:基质胶的3:1混合物中的5x106个SW620细胞。当肿瘤达到126-300mm3(第11天)时，将小鼠随机化以获得～210mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18b(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(50mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每3天静脉内(i.v.)施用制剂5次，对照组接受配制缓冲液[f25]。
在实验的第31天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图21a中作为肿瘤体积的变化图，和示于图22a中，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图21a和22a中显示的实验结果显示：施用Ex.18b的本发明的融合蛋白引起SW620肿瘤生长抑制，在实验的第31天相对于对照的TGI是73％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为27.6％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
D.HT-29
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml的HBSS缓冲液:基质胶的3:1混合物中的5x106个HT-29细胞。当肿瘤达到80-348mm3(第12天)时，将小鼠随机化以获得～188mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18b(4个剂量为3mg/kg，其余2个剂量为6mg/kg)、Ex.51b(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(50mg/kg)作为对比，配制缓冲液作为对照[f25]。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次，对照组接受配制缓冲液(50mMTrizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。在实验的第26天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图23中作为肿瘤体积的变化图，和示于图24中，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图23和24中显示的实验结果显示：施用Ex.18b和Ex.51b的本发明的融合蛋白引起HT-29肿瘤生长抑制，在实验的第26天相对于对照的TGI分别是53％和67％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为17.5％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
肺癌模型
A.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.15ml的HBSS培养基中的5x106个A549细胞。在实验的第20天，将小鼠随机化以获得～45mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18a(5mg/kg)和Ex.35a(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(15mg/kg)作为对比，注射用水作为对照。如下静脉内(i.v.)施用制剂：施用(第1天)，暂停1天，在第3、4、5天每天施用，暂停1天，施用(第7天)，暂停1天，施用(第9天)。在实验的第38天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图3和图4中，作为肿瘤体积的变化(图3)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图4)的图。
图3和4中显示的实验结果显示：施用Ex.18a和Ex.35a的本发明的融合蛋白引起A549肿瘤生长抑制，在实验的第38天相对于对照的TGI分别是73.3％和20.7％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为16％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
B.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.10ml的HBSS培养基与基质胶的混合物(4:1)中的5x106个A549细胞。在实验的第19天，将小鼠随机化以获得～75mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18a(5mg/kg)和Ex.50a(20mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(15mg/kg)作为对比，注射用水作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第35天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图5和图6中，作为肿瘤体积的变化(图5)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图6)的图。
实验结果显示：施用Ex.18a和Ex.50a的本发明的融合蛋白引起A549肿瘤生长抑制，在实验的第35天相对于对照的TGI分别是26％和45％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照未获得对于肿瘤细胞生长的抑制效应，TGI水平为0％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
C.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.10ml的HBSS培养基与基质胶的混合物(3:1)中的5x106个A549细胞。在实验的第17天，将小鼠随机化以获得～100-120mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.2a(5mg/kg)、Ex.18a(3mg/kg)和Ex.44a(20mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(19mM NaH2PO4,81mM Na2HPO4,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,pH7.4)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第34天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图7和图8中，作为肿瘤体积的变化(图7)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图8)的图。
实验结果显示：施用Ex.2a、Ex.18a和Ex.44a的本发明的融合蛋白引起A549肿瘤生长抑制，在实验的第34天相对于对照的TGI分别是83.5％、80％和47％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为21.8％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
D.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.10ml的HBSS培养基与基质胶的混合物(3:1)中的7x106个A549细胞。在实验的第21天，将小鼠随机化以获得～160-180mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.20a(15mg/kg)、Ex.26a(6mg/kg)、Ex.43a(10mg/kg)和Ex.47a(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(40mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH7.4)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第35天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图9和图10中，作为肿瘤体积的变化(图9)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图10)的图。
实验结果显示：施用Ex.20a、Ex.26a、Ex.43a和Ex.47a的本发明的融合蛋白引起A549肿瘤生长抑制，在实验的第35天相对于对照的TGI分别是49.5％、64％、40.2％和49.5％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为15％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
E.A549-肿瘤的再生长
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml的HBSS缓冲液:基质胶的3:1混合物中的7x106个A549细胞。当肿瘤达到85-302mm3的大小(第17天)时，将小鼠随机化以获得～177mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.2b(5mg/kg)、Ex.18b(3mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(90mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用rhTRAIL114-281十二次，每2天静脉内(i.v.)施用Ex.2b七次以及在实验的第17、20、25和29天天静脉内(i.v.)施用Ex.18b。对照组接受配制缓冲液。在实验的第45天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图27中作为肿瘤体积的变化图，和示于图28中，其显示作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图27和28中显示的实验结果显示：施用Ex.18b和Ex.2b的本发明的融合蛋白引起A549肿瘤生长抑制，在实验的第45天相对于对照的TGI分别是71％和44％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为10.6％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
胰腺癌模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.10ml HBSS培养基与基质胶的混合物(3:1)中的7x106个PANC-1细胞。在实验的第27天时，将小鼠随机化以获得～95mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.20a(5mg/kg)、Ex.51a(10mg/kg)和Ex.52a(10mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH7,4)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第40天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图11和图12中，作为肿瘤体积的变化(图11)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图12)的图。
实验结果显示：施用Ex.20a、Ex.51a和Ex.52a的本发明的融合蛋白引起PANC-1肿瘤生长抑制，在实验的第40天相对于对照的TGI分别是19％、38％和34％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为12％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
B.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.10ml HBSS培养基与基质胶的混合物(3:1)中的5x106个PANC-1细胞。在实验的第31天时，将小鼠随机化以获得～110mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18a(3mg/kg)和Ex.44a(20mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(19mM NaH2PO4,81mM Na2HPO4,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,pH7.4)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第42天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图13和图14中，作为肿瘤体积的变化(图13)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图14)的图。
实验结果显示：施用Ex.18a和Ex.44a的本发明的融合蛋白引起PANC-1肿瘤生长抑制，在实验的第42天相对于对照的TGI分别是56％和43％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为27.5％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
前列腺癌模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.20ml HBSS培养基与基质胶的混合物(9:1)中的5x106个PC3细胞。在实验的第29天时，将小鼠随机化以获得～90mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18a(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以注射用水作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第60天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图15和图16中，作为肿瘤体积的变化(图15)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图16)的图。
实验结果显示：施用Ex.18a的本发明的融合蛋白引起PC3肿瘤生长抑制，在实验的第60天相对于对照的TGI分别是30.8％。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
肝癌模型
A.PCL/PRF/5
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.10ml HBSS培养基与基质胶的混合物(3:1)中的7x106个PCL/PRF/5细胞。在实验的第31天时，将小鼠随机化以获得～200mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.51a(10mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(30mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mMNaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mMZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH7.4)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第49天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图17和图18中，作为肿瘤体积的变化(图17)和作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)(图18)的图。
实验结果显示：施用Ex.51a的本发明的融合蛋白引起PCL/PRF/5肿瘤生长抑制，在实验的第49天相对于对照的TGI分别是88.5％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为18％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
B.HepG2
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml HBSS培养基与基质胶的3:1混合物中的7x106个HepG2细胞。当肿瘤达到64-530mm3的大小(第25天)时，将小鼠随机化以获得～228mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18b(5mg/kg，补充有10mg/kg HSA)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(50mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照，以5FU(20mg/kg)作为参考化合物。每2天静脉内(i.v.)施用rhTRAIL114-281六次，在实验的第25、27、29、37和42天静脉内(i.v.)施用Ex.18b。每2天腹膜内(i.p.)施用5FU(20mg/kg)6次。对照组接受配制缓冲液。在实验的第49天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图25中作为肿瘤体积的变化图，和示于图26中，其显示作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图25和26中显示的实验结果显示：施用Ex.18b的本发明的融合蛋白引起HepG2肿瘤生长抑制，在实验的第49天相对于对照的TGI是82.5％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281和5FU，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平分别为31％和-4.7％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL和标准化学疗法显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10％的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
多重耐药子宫肉瘤模型
MES-SA.Dx5
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml HBSS培养基与基质胶的3:1混合物中的7x106个MES-SA.Dx5细胞。当肿瘤达到64-323mm3的大小(第13天)时，将小鼠随机化以获得～180mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.18b(5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(50mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照，以CPT-11(camptothecin,Pfeizer)(30mg/kg)作为参考化合物。每2天静脉内(i.v.)施用rhTRAIL114-281和Ex.18b六次。每2天腹膜内(i.p.)施用CPT-11六次。对照组接受配制缓冲液。在实验的第34天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图29中作为肿瘤体积的变化图，和示于图30中，其显示作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图29和30中显示的实验结果显示：施用Ex.18b的本发明的融合蛋白引起MES-SA/Dx5肿瘤生长抑制，在实验的第34天相对于对照的TGI是85％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281和CPT-11，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平分别为51％和57％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL和标准化学疗法显示出强得多的效应。
.MES-SA.Dx5
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(s.c.)移植悬于0.1ml HBSS培养基与基质胶的3:1混合物中的7x106个MES-SA.Dx5细胞。当肿瘤达到26-611mm3的大小(第19天)时，将小鼠随机化以获得～180mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分配至处理组。处理组施以Ex.2b(3mg/kg)、Ex.18b(3mg/kg)、Ex.51b(7,5mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(60mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma碱,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10％甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用rhTRAIL114-281、Ex.2b和Ex.51b六次。每2天静脉内(i.v.)施用Ex.18b四次。对照组接受配制缓冲液。
在实验的第33天，通过破坏脊髓杀死小鼠。
实验结果示于图29a中作为肿瘤体积的变化图，和示于图30a中，其显示作为对照的百分率的肿瘤生长抑制(％TGI)。
图29a和30a中显示的实验结果显示：施用Ex.2b、Ex.18b和Ex.51b的本发明的融合蛋白引起MES-SA/Dx5肿瘤生长抑制，在实验的第33天相对于对照的TGI分别是84％、67.5％和58.6％。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为25.8％。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。

Claims (41)

1.一种融合蛋白，其包含：
-结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸并终止于氨基酸hTRAIL281，或具有至少70％序列同一性，优选85％的同一性的所述功能片段的同源物；和
-至少一个结构域(b)，其为抑制蛋白质合成的效应子肽的序列，其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端,
并且其中所述融合蛋白不包含结合细胞表面上的碳水化合物受体的结构域。
2.权利要求的1融合蛋白，其中结构域(a)包含可溶性hTRAIL蛋白序列的片段，该片段起始于从hTRAIL95至hTRAIL121的范围内的氨基酸，含端点，终止于氨基酸281。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中结构域(a)选自hTRAIL95-281、hTRAIL114-281、hTRAIL116-281、hTRAIL119-281、hTRAIL120-281和hTRAIL121-281。
4.权利要求1至3的融合蛋白，其中结构域(a)为具有改变的对DR4和/或DR5受体的亲和力的hTRAIL的所述功能片段的同源物。
5.权利要求的融合蛋白4，其中所述同源物选自SEQ.No.142和SEQ.No.143。
6.权利要求1至5的融合蛋白，其中结构域(b)的效应子肽是在核糖体水平上抑制酶促蛋白质翻译的肽。
7.权利要求6的融合蛋白，其中所述效应子是具有N-糖苷酶的酶促活性的肽。
8.权利要求7的融合蛋白，其中所述效应子肽选自灭活核糖体RIP1型的蛋白毒素和灭活核糖体RIP2型的蛋白毒素的催化亚单位A，或与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的N-糖苷酶活性的其修饰。
9.权利要求8的融合蛋白，其中所述效应子肽选自RIP1型毒素，包括白树毒素(来自Gelonium multiflorum)、突变的白树毒素、木鳖子苷、皂草素、briodin I、dodekandrin、bouganin(来自Bougainvillea spectabilis)、PAP蛋白美洲商陆(Phytolacca Americana)或选自RIP2型毒素的催化亚单位A，包括下列毒素的亚单位A：篦麻毒素、突变的篦麻毒素变体、相思豆毒蛋白(来自AbbrusPrecatrius)、突变的相思豆毒蛋白变体、蒴莲根毒素(来自Adeniadigitata)、viscumin(来自槲寄生的毒素MLI)、蒴莲素(来自伏氏蒴莲)、志贺毒素(来自痢疾志贺菌)、天花粉蛋白、突变的天花粉蛋白变体或与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的N-糖苷酶活性的其修饰。
10.权利要求7至9的融合蛋白，其中所述效应子肽选自SEQ.No.55、SEQ.No.56、SEQ.No.57、SEQ.No.58、SEQ.No.59、SEQ.No.60、SEQ.No.61、SEQ.No.62、SEQ.No.63、SEQ.No.64、SEQ.No.65、SEQ.No.66、SEQ.No.67、SEQ.No.70、SEQ.No.78、SEQ.No.82、SEQ.No.194、SEQ.No.195、SEQ.No.198、SEQ.No.199和SEQ.No.200。
11.权利要求6的融合蛋白，其中所述效应子肽为具有核糖核酸酶酶促活性的肽。
12.权利要求11的融合蛋白，其中所述效应子肽选自蛋白毒素α-sacrin、米托洁林、hirsutellin(来自汤氏多毛菌)、局限曲菌素(来自局限曲霉)以及与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的核糖核酸酶活性的其修饰。
13.权利要求12的融合蛋白，其中所述效应子肽选自SEQ.No.71和SEQ.No.72。
14.权利要求6的融合蛋白，其中所述效应子肽具有ADP-核糖基转移酶的酶促活性。
15.权利要求14的融合蛋白，其中所述效应子肽选自铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A或铜绿假单胞菌毒素和白喉棒状杆菌的白喉毒素或白喉棒状杆菌的突变的白喉毒素的突变的催化亚单位A，以及与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的ADP核糖基转移酶活性的其修饰。
16.权利要求15的融合蛋白，其中所述效应子肽选自SEQ.No.79、SEQ.No.80、SEQ.No.81、SEQ.No.83、SEQ.No.84、SEQ.No.196、SEQ.No.197、SEQ.No.201、SEQ.No.202、SEQ.No.203、SEQ.No.204、SEQ.No.205、SEQ.No.206和SEQ.No.207。
17.权利要求1至5的融合蛋白，其中结构域(b)的效应子肽为抑制蛋白质合成的毒素，其属于毒素-抗毒素系统。
18.权利要求17的融合蛋白，其中所述效应子肽为具有拓扑异构酶活性、mRNA酶活性或与细胞膜结合的肽。
19.权利要求18的融合蛋白，其中所述效应子肽选自SEQ.No.74的CcdB蛋白、SEQ.No.75的CcdB蛋白、SEQ.No.73的Kid蛋白、SEQ.No.76的RelE蛋白、SEQ.No.77的StaB蛋白和SEQ.No.208的Hok蛋白以及与原始序列具有至少85％的序列同一性的具有保留的拓扑异构酶活性、mRNA酶活性或与细胞膜结合的活性的其修饰。
20.权利要求1至19的任一项的融合蛋白，其在结构域(a)与结构域(b)之间或结构域(b)之间包含含有蛋白酶切割位点的结构域(c)。
21.权利要求20的融合蛋白，其中结构域(c)包含被存在于肿瘤环境中的蛋白酶识别的蛋白酶切割位点。
22.前述权利要求的任一项的融合蛋白，其中结构域(b)的效应子肽另外地连接有转运结构域(d)，其选自：
-(d1)SEQ ID NO:139的转运通过细胞膜的结构域，其源自铜绿假单胞菌；
-(d2)转运通过膜靶向内质网的结构域，其选自Lys Asp Glu Leu/KDEL、His Asp Glu Leu/HDEL、Arg Asp Glu Leu/RDEL、Asp Asp Glu Leu/DDEL、Ala Asp Glu Leu/ADEL、Ser Asp Glu Leu/SDEL和Glu Asp Leu/KEDL；
-(d3)由6,7,8,9,10或11个Arg残基组成的转运通过细胞膜的聚精氨酸序列，
及其组合，其中转运结构域(d)位于效应子结构域(b)的C末端和/或N末端。
23.权利要求22的融合蛋白，其中转运结构域(d)位于结构域(b)与结构域(c)之间，或结构域(a)与结构域(c)之间，或两个结构域(c)之间。
24.权利要求22的融合蛋白，其中序列(d)位于融合蛋白的C末端。
25.权利要求20至24的任一项的融合蛋白，其额外地在(a)、(b)、(c)和/或(d)之间包含柔性空间接头。
26.权利要求25的融合蛋白，其中所述空间接头选自Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS、Gly Gly Gly Ser/GGGS或Gly Gly Gly/GGG、Gly Gly Gly Gly/GGGG、Ala Ser Gly Gly/ASGG、Ala Ser Gly/ASG、Gly Gly Gly Ser Gly/GGGSG、Gly Gly Gly/GGG、Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG、Ser His HisSer/SHHS、CAAACAAC(Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys)、CAACAAAC(Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys)及其组合。
27.权利要求20至26的任一项的融合蛋白，其在结构域(a)、(b)和/或(c)之间包含结构域(e)，所述结构域(e)为用于连接PEG分子的接头，其选自Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE、Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA、Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS或Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS。
28.权利要求20至27的任一项的融合蛋白，其在结构域(b)与结构域(c)之间另外地包含与整联蛋白结合的基序，其选自Asn Gly Arg/NGR、Asp Gly Arg/DGR或Arg Gly Asp/RGD。
29.权利要求1的融合蛋白，其具有选自SEQ.No.1；SEQ.No.2；SEQ.No.3；SEQ.No.4；SEQ.No.5；SEQ.No.6；SEQ.No.7；SEQ.No.8；SEQ.No.9；SEQ.No.10；SEQ.No.11；SEQ.No.12；SEQ.No.13；SEQ.No.14；SEQ.No.15；SEQ.No.16；SEQ.No.17；SEQ.No.18；SEQ.No.19；SEQ.No.20；SEQ.No.21；SEQ.No.22；SEQ.No.23；SEQ.No.24；SEQ.No.25；SEQ.No.26、SEQ.No.27；SEQ.No.28；SEQ.No.29；SEQ.No.30；SEQ.No.31；SEQ.No.32；SEQ.No.33；SEQ.No.34；SEQ.No.35；SEQ.No.36；SEQ.No.37；SEQ.No.38；SEQ.No.39；SEQ.No.40；SEQ.No.41；SEQ.No.42；SEQ.No.43；SEQ.No.44；SEQ.No.45；SEQ.No.46；SEQ.No.47；SEQ.No.48；SEQ.No.49；SEQ.No.50；SEQ.No.51；SEQ.No.52；SEQ.No.53.SEQ.No.54；SEQ.No.144、SEQ.No.145；SEQ.No.146、SEQ.No.147、SEQ.No.148、SEQ.No.149、SEQ.No.150、SEQ.No.151、SEQ.No.152、SEQ.No.153、SEQ.No.154、SEQ.No.155、SEQ.No.156、SEQ.No.157、SEQ.No.158、SEQ.No.159、SEQ.No.160、SEQ.No.161、SEQ.No.162、SEQ.No.163、SEQ.No.164；SEQ.No.165、SEQ.No.166；SEQ.No.167和SEQ.No.168的氨基酸序列。
30.前述权利要求的任一项的融合蛋白，其为重组蛋白。
31.多核苷酸序列，其编码权利要求1至29的任一项中定义的融合蛋白。
32.权利要求31的多核苷酸序列，其针对在大肠杆菌中的基因表达进行了优化。
33.权利要求32的序列，其选自SEQ.No.85；SEQ.No.86；SEQ.No.87；SEQ.No.88；SEQ.No.89；SEQ.No.90；SEQ.No.91；SEQ.No.92；SEQ.No.93；SEQ.No.94；SEQ.No.95；SEQ.No.96；SEQ.No.97；SEQ.No.98；SEQ.No.99；SEQ.No.100；SEQ.No.101；SEQ.No.102；SEQ.No.103；SEQ.No.104；SEQ.No.105；SEQ.No.106；SEQ.No.107；SEQ.No.108；SEQ.No.109；SEQ.No.110、SEQ.No.111；SEQ.No.111；SEQ.No.113；SEQ.No.114；SEQ.No.115；SEQ.No.116；SEQ.No.117；SEQ.No.118；SEQ.No.119；SEQ.No.120；SEQ.No.121；SEQ.No.122；SEQ.No.123；SEQ.No.124；SEQ.No.125；SEQ.No.126；SEQ.No.127；SEQ.No.128；SEQ.No.129；SEQ.No.130；SEQ.No.131；SEQ.No.132；SEQ.No.133；SEQ.No.134；SEQ.No.135；SEQ.No.136；SEQ.No.137；SEQ.No.138；SEQ.No.169；SEQ.No.170；SEQ.No.171；SEQ.No.172；SEQ.No.173；SEQ.No.174；SEQ.No.175；SEQ.No.176；SEQ.No.177；SEQ.No.178；SEQ.No.179；SEQ.No.180；SEQ.No.181；SEQ.No.182；SEQ.No.183；SEQ.No.184；SEQ.No.185；SEQ.No.186；SEQ.No.187；SEQ.No.188；SEQ.No.189；SEQ.No.190；SEQ.No.191；SEQ.No.192和SEQ.No.193。
34.一种表达载体，其包含权利要求31至33的任一项的多核苷酸序列。
35.一种宿主细胞，其包含权利要求34中定义的表达载体。
36.权利要求35的宿主细胞，其为大肠杆菌细胞。
37.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体组合的权利要求1至30的任一项中定义的作为活性成分的融合蛋白。
38.权利要求37的药物组合物，其以用于胃肠外施用的形式存在。
39.权利要求1至30的任一项中定义的融合蛋白，其用于治疗哺乳动物包括人的肿瘤疾病。
40.一种治疗哺乳动物包括人的癌症疾病的方法，其包括给有此需要的受试者施用抗肿瘤有效量的权利要求1至30中定义的融合蛋白，或权利要求37或38中定义的药物组合物。
41.一种肽，其选自SEQ.No.200的天花粉蛋白的突变体、SEQ.No.201的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体、SEQ.No.202的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体、SEQ.No.204的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体、SEQ.No.205的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体和SEQ.No.207的铜绿假单胞菌毒素的催化亚单位A的突变体。
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