CN103237808B - 抗癌融合蛋白 - Google Patents
抗癌融合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103237808B CN103237808B CN201180057053.1A CN201180057053A CN103237808B CN 103237808 B CN103237808 B CN 103237808B CN 201180057053 A CN201180057053 A CN 201180057053A CN 103237808 B CN103237808 B CN 103237808B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seqidno
- sequence
- fusion rotein
- structural domain
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title description 13
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 title description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 220
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 41
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 51
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 43
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 38
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 13
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 11
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 7
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 68
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 123
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 116
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 89
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 89
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 89
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 76
- 230000008569 process Effects 0.000 description 76
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 57
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 47
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 24
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 23
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 22
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 22
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000009471 action Effects 0.000 description 20
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 20
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 19
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 18
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 17
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 14
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 14
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 description 13
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 13
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 13
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 10
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 10
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 9
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 9
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 9
- 230000034994 death Effects 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 8
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 8
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 7
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 6
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 4
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 3
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 3
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 3
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N (2r)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrobromide Chemical compound Br.OC(=O)[C@H](N)CCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCC(O)=O JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N 0.000 description 2
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 208000000857 Hepatic Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 2
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 108010044804 gamma-glutamyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BLSQLHNBWJLIBQ-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-terconazole Chemical compound C1CN(C(C)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2N=CN=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 BLSQLHNBWJLIBQ-OZXSUGGESA-N 0.000 description 1
- VNBFUGOVQMFIRN-UHFFFAOYSA-N 1-chlorobutan-2-ol Chemical compound CCC(O)CCl VNBFUGOVQMFIRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055105 BH3 Interacting Domain Death Agonist Human genes 0.000 description 1
- 108700000712 BH3 Interacting Domain Death Agonist Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004041 Caspase 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100031186 Chromogranin-A Human genes 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001001496 Homo sapiens Interferon gamma receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 description 1
- 101000610609 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 102100036157 Interferon gamma receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 208000002740 Muscle Rigidity Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091007178 TNFRSF10A Proteins 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 1
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 1
- 102000018594 Tumour necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007852 Tumour necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102400000731 Tumstatin Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000031709 bromination Effects 0.000 description 1
- 238000005893 bromination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- OQUUTERJWTYTHP-UHFFFAOYSA-N butanedioate;1h-tetrazol-1-ium Chemical compound [NH2+]1C=NN=N1.[NH2+]1C=NN=N1.[O-]C(=O)CCC([O-])=O OQUUTERJWTYTHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012829 chemotherapy agent Substances 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229950000317 dulanermin Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229940089256 fungistat Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 102000044949 human TNFSF10 Human genes 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- HYWYRSMBCFDLJT-UHFFFAOYSA-N nimesulide Chemical compound CS(=O)(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1OC1=CC=CC=C1 HYWYRSMBCFDLJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000001047 purple dye Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011125 single therapy Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 108010012374 type IV collagen alpha3 chain Proteins 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010060757 vasostatin Proteins 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N zorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(\C)=N\NC(=O)C=1C=CC=CC=1)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N 0.000 description 1
- 229960000641 zorubicin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/217—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/212—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
融合蛋白，其包含：结构域（a），其为hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸，或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和结构域（b），其为免疫刺激效应子肽的序列，其中结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端或N末端。所述融合蛋白可用于治疗癌症疾病。
Description
本发明涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本发明涉及包含可溶性人TRAIL5蛋白的序列片段和免疫刺激肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。
TRAIL蛋白属于细胞因子家族（肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体），也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。
TRAIL蛋白通过与促细胞调亡TRAIL表面受体1和2（TRAIL-R1/R2）结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5（死亡受体4和死亡受体5），属于TNF受体家族并且在不同类型的癌症细胞上过表达。这些受体的激活能诱导独立于阻抑基因p53的细胞调亡的外部信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起Bid蛋白的释放，从而间接激活线粒体途径，Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。
TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞对该蛋白是抗性的。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时极少影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。
TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是有生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。
对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL（rhTRAIL）（在INN下称作dulanermin）的人类临床研究也显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。
还发现短于114-281的TRAIL片段能结合膜死亡受体并通过这些受体诱导细胞调亡，如最近就122-281hTRAIL的重组循环序列改变的突变体所报道的，例如见EP1688498。
到目前为止所报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签相关，而非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。
然而，在进一步研究和开发的过程中，很多癌症细胞似乎也显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性（见例如WO2007/022214）。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL诱导的细胞调亡途径的不同水平表现其自己，从细胞表面受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶。这种抗性限制了TRAIL作为抗癌试剂的有用性。
此外，在对患者进行的临床试验中证明，TRAIL作为单一治疗的实际有效性是低下的。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(WO2009/002947;A.AlmasanandA.Ashkenazi,CytokineGrowthFactorReviews14(2003)337-348;RKSrivastava,Neoplasis,Vol3,No6,2001,535-546,SoriaJCetal.,J.Clin.Oncology,Vol28,No9(2010),p.1527-1533)。在WO2009/140469中描述了rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡铂)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。
包含通过金属蛋白酶切割位点连接子连接的血管生成抑制剂血管抑制素(vasostatin)和TRAIL的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示出诱导细胞调亡的效应，见A.I.Guoetal,ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology2008,vol.24(10),925-930。包含血管生成抑制剂肿瘤抑素(tumstatin)的Tumstatin183-230和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为显示出诱导胰腺癌细胞的细胞调亡，见N.Renetal,AcademicJournalofSecondMilitaryMedicalUniversity2008,vol.28(5),676-478。
US2005/244370和对应的WO2004/035794公开了TRAIL95-281的构建体，其作为效应子结构域，通过肽连接子与作为细胞表面结合结构域的TNF家族配体的另一成员CD40的细胞外部分连接。其指出该构建体的激活是通过其CD40部分的结合。
此外，已经证明与TRAIL治疗相关的问题是其低稳定性以及在施用之后迅速从体内被清除。
细胞因子在癌症治疗中的有利效应也是已知的。细胞因子家族的一个成员是干扰素，其是刺激免疫系统的蛋白。干扰素是重要的抗癌试剂或辅助性抗癌治疗剂(BordenandWilliams,Interferons,CancerMedicine,5thedition,815-824,2000)。已经表明干扰素的效应之一是对于多种促细胞凋亡因子包括TRAIL配体的强烈的刺激。
II型干扰素组的一个代表是干扰素γ(IFN-γ)，其实二聚体的可溶性细胞因子。IFN-γ由NK,NKT,Th1,Tc和树突细胞分泌。IFN-γ配体结合两种类型的IFN-γ受体Rα和IFN-γRβ1，并激活JAK-STAT途径。其效应之一是对于人单核细胞的强烈刺激以产生TRAIL蛋白，这显著影响它们的清除癌细胞的能力(Griffithetal,J.Exp.Med.,189:1343-1353,1999)。
干扰素γ激活IFNγ受体，刺激抗体依赖性毒性并加强细胞与肿瘤细胞连接的过程。另外，IFNγ激活胱天蛋白酶，从而诱导癌细胞中的细胞凋亡。另外，已经表明在很多显示出对于TRAIL刺激的细胞凋亡有抗性的肿瘤细胞系中，干扰素γ协同作用，对于它们对TRAIL的敏感性作出贡献(Wangetal,Oncogene,23:928-935,2004)。然而，已有的使用IFNγ的治疗不足以有效地用于治疗癌症疾病。
还已经证明了干扰素α对于诱导黑素瘤、淋巴瘤和肝癌细胞中TRAIL的过表达的有益效应(Chenandetal,Blood,98:2183-21192;Herzeretal,CancerRes.69(3):855-862,2009)。干扰素α被认为是生物应答调节剂，其加强生物对于疾病的天然应答。其影响细胞和体液免疫力。其刺激抗癌抗体的产生，激活巨噬细胞、NK细胞和淋巴细胞的细胞毒性作用。IFNα还增加癌细胞上HLA组织相容性抗原的表达，这促进了它们被免疫细胞识别。其介导癌细胞的生长和分裂的减慢，从而介导它们的死亡。
干扰素α已被用于治疗多种类型的癌症，包括毛发细胞白血病、黑素瘤、肾癌、成髓细胞和髓细胞白血病、淋巴瘤、卡波氏肉瘤和血液的其它肿瘤性疾病(FolkmanJ.,N.Engl.J.Med.1995,333:1757-1763;SidkyYA,BordenEC.CancerRes.1987.47:5155-5161;IwagakH,HizutaA,YoshinoT,etal,AnticancerRes.1993,13:13-15;RubingerM,PlenderleithIH,LertzmanM,etal,Chest.1995,108:281-282)。然而，在于患者中达到治疗效应所需的剂量时，观察到毒性效应，例如嗜中性白血球减少症、流感样症状、不适、厌食和肝功能失调。由于这些副作用，干扰素α治疗通常被打断，这使得该治疗是无效的。此外，大部分细胞因子、包括干扰素α的生物半衰期是短的，持续至多几个小时，因此需要频繁注射。由于种种原因，频繁使用药物对于患者是不方便的（尤其是在长期治疗中）。这导致需要设计干扰素α的延释制剂。
已经进行了数项关于改善干扰素α性质的尝试。通过提供与载体蛋白的二聚体融合物（包含连接子，使得表达的融合蛋白能够正确折叠）而延长干扰素的生物半衰期的尝试公开于例如US7943733。其它尝试是基于干扰素的生物活性形式（即其天然形成的非共价同二聚体，通过在受体位点锌离子(Zn2+)处两个单体的反平行互锁而形成）的结构的解析(R.Radhakrishnan,Structure1996,Vol.4No12,1453-1463)。通过甘氨酸-丝氨酸连接子连接的干扰素α的同二聚体描述于专利申请LT2010012中，但是其中没有提供它们的活性数据。
还已知IFNy以非共价缔和的同二聚体发挥作用，其中2个相同的多肽链以反平行方式排列，以产生对称分子(Ealick,S.E.,Science(1991)262,698-702)。因此，存在下列可能性：IFNy二聚体形式能够更有效地占据受体结合位点，但是该假设未经临床证实。
对于不具有上述副作用的干扰素α的衍生物的开发尝试产生了对于长效聚乙二醇化干扰素α的处理的介绍。聚乙二醇化是向哺乳动物动物体内施用蛋白的流行方法之一，旨在减少或克服活性物质的副作用。聚乙二醇化的原理是在被修饰的分子周围产生保护性屏障，这导致需要的物质浓度的延长的时间（由于药代动力学和药效学的变化）。吸收时间被延长了，并且从体内清除的时间更长了。
这些参数的数值取决于聚乙二醇（PEG）分子的结构：链长度，线性，分支程度，结合位点的类型和数目，以及所连接的二醇分子的数目[DelgadoC,FrancisGE,FisherD.,TheusesandpropertiesofPEG-linkedproteins.Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.1992;9(3-4):249-304]。
聚乙二醇化不影响干扰素与其受体的结合方式。临床前研究已经证明聚乙二醇化的干扰素α结合IFNα-2a受体并在体外显示出相同或更高的生物活性，如通过在肿瘤细胞培养物和在移植了人肾癌细胞的小鼠上进行的测试所证实[NieforthK,NadeauR,PatelIH,MouldD.UseofanindirectpharmacodynamicstimulationmodelofMXproteininductiontocompareinvivoactivityofinterferonα-2aandapolyethyleneglycol-modifiedderivativeinhealthysubjects,Clin.Pharmacol.Ther.1996;59:636-46;PaulG,etal.Pegylatedinterferon-α-2b:Pharmacokinetics,pharmacodynamics,safety,andpreliminaryefficacydata.Clin.Pharmacol.Ther.2000;68:556-67]。
虽然存在来自动物模型试验的有前景的数据，商业上可获得的含聚乙二醇化的干扰素的制剂和(G.Pasut,F.M.Veronese,Prog.Polym.Sci.32(2007)933-961)(分别具有40kDa分支的和12kDa线性的连接于IFNα的PEG链)显示出与对应的未修饰的干扰素分子定量的相似或甚至更差的安全性谱(BukowskiR.M.etal.,Cancer,95(2):389-96(2002);BukowskiR.M.etal.,JournalofClinicalOncology,20(18):3841-3949(2002);Motzer,R.J.etal.,J.Clin.Oncol.,19(5):1312-9(2001);TongM.J.,JournalofInterferonandCytokineResearch,18:81-86(1998);YaoG.B.etal.,JournalofGastroenterologyandHepatolog.,15:1165-1170(2000);HeathcoteE.J.etal,N.Engl.J.Med.,343(23):1673-80(2000);TongM.J.etal.,Hepatology;26(3):747-54(1997))。
聚乙二醇化的IFNα治疗的最常见到的副作用包括：剂量依赖性恶心、厌食、肌肉僵硬。另外，较长的治疗显示出剂量限制性，例如严重疲劳、神经毒性、肝功能障碍和骨髓功能的抑制(剂量为7.5μg/kg或更高剂量的(BukowskiR.M.etal.,Cancer;95(2):389-96(2002))。
因此，虽然存在临床上应用的基于TRAIL蛋白和干扰素家族蛋白（也是修饰的，特别是通过聚乙二醇化）二者的抗癌治疗，但是它们不足以是有效的且具有很多熟知的缺点，其中最严重和局限性的缺点之一是治疗的有限的有效性，缺乏针对癌细胞的选择性，副作用和原发或获得性抗性。仍然需要基于干扰素和TRAIL蛋白二者活性的改善的、既有效又在体内具有针对癌细胞的选择性的癌症治疗。仍然存在对于允许拓宽可利用的试剂的范围并发现更有效（细胞毒性）和选择性的试剂的新的抗癌试剂的迫切需要和未满足的需要。还需要具有增加的稳定性和改善的药代动力学的新的选择性试剂。
本发明通过提供新的融合蛋白而提供了该问题的解决方法，所述融合蛋白中引入了源自TRAIL的结构域和具有免疫系统刺激活性的短的效应子肽，所述效应子肽不包括TRAIL片段，其中所述效应子肽加强或补充TRAIL的作用。此外，在很多情况下，本发明的融合蛋白相对于可溶性TRAIL以及由其序列的片段组成的其变体而言效力更强，并且比对应的效应子肽也是效力更强。在很多情况下，新的融合蛋白还克服了对于TRAIL的抗性。此外，效应子肽的引入导致产生了延长的半衰期和在肿瘤中增加的蛋白质保留以及其增强的功效。另外，在一些变体中，新的融合蛋白能够连接PEG，其对于非特异性蛋白酶具有保护性效应，并且还改变了药代动力学和药效学性质，特别是就生物半衰期的延长而言。
附图说明
现在将通过阅读附图详细描述本发明。
图1显示了根据Ex.1、Ex.2、Ex.3和Ex.4的本发明的融合蛋白的示意性结构。
图2显示了根据Ex.5、Ex.6、Ex.7、Ex.8、Ex.9、Ex.10和Ex.11的本发明的融合蛋白的示意性结构。
图3显示了根据Ex.12、Ex.13、Ex.14和Ex.15的本发明的融合蛋白的示意性结构。
图4显示了根据Ex.16和Ex.17的本发明的融合蛋白的示意性结构。
图5显示了以比椭圆率(specificellipticity)表示的rhTRAIL114-281，rhTRAIL95-281和Ex.12,Ex.5,Ex.3和Ex.14的融合蛋白的圆二色性光谱。
图6显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.3,Ex.12和Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:CD1-Foxn1nu小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图7显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.3,Ex.12和Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:CD1-Foxn1nu1小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图8显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图9显示了显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图10显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌PLC/PRF/5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图11显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌PLC/PRF/5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图12显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌HepG2的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图13显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.14的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌HepG2的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
发明详述
本发明涉及融合蛋白，其包含：
-结构域（a），其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和
-结构域（b），其为免疫刺激效应子肽的序列，
其中结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端和/或N末端。
术语“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”应该被理解为指可溶性hTRAIL的任何能够在结合于哺乳动物细胞表面上的其受体之后在该细胞中诱导细胞调亡信号的片段。
本领域技术人员还将认识到：TRAIL序列的70%的同源性的存在是本领域已知的。
应该理解，本发明的融合蛋白中的效应子肽的结构域（b）不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分或片段。
根据本发明的术语“肽”应被理解为从通过肽键连接在一起的多个氨基酸的分子构建物。因此，根据本发明的术语“肽”包括寡肽、多肽和蛋白质。
在本发明中，肽的氨基酸序列将以本领域采纳的常规方式表示，即从肽的N末端（N-端）至其C末端（C-端）。因此，任何序列均为左侧为N末端，右侧为C末端。
本发明的融合蛋白在结构域（a）的C末端或N末端连接单一的效应子肽的结构域（b）。
在具体的实施方式中，结构域（a）是hTRAIL序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL122的氨基酸，含端点，结束于氨基酸hTRAIL281。
具体地，结构域（a）可选自对应于hTRAIL95-281,hTRAIL114-281,hTRAIL116-281,hTRAIL120-281,hTRAIL121-281和,hTRAIL122-281的序列。本领域技术人员将认识到，hTRAIL95-281,hTRAIL114-281,hTRAIL116-281,hTRAIL120-281,hTRAIL121-281和hTRAIL122-281分别代表GenBank中登记号P50591的hTRAIL的已知序列中的起始于编号95,114,116,120,121和122的氨基酸的人TRAIL蛋白的片段。
在另一个具体实施方式中，结构域（a）是起始于不低于hTRAIL95的氨基酸位置并结束于氨基酸hTRAIL281的可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段的同源物，该序列与原始序列至少70%、优选85%同一。
在该实施方式的具体变体中，结构域（a）是选自对应于hTRAIL95-281,hTRAIL114-281,hTRAIL116-281,hTRAIL120-281,hTRAIL121-281和hTRAIL122-281的序列的片段的同源物。
应该理解，hTRAIL片段的同源物是该片段的氨基酸序列的变体/修饰，其中至少一个氨基酸被改变，包括1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸，和不超过15%的氨基酸，并且其中修饰的序列的片段具有hTRAIL序列的保留的功能，即结合细胞表面死亡受体和在哺乳动物细胞中诱导细胞凋亡的能力。氨基酸序列的修饰可以包括例如，置换、缺失、截短和/或添加氨基酸。
优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言，与死亡受体DR4（TRAIL-R1）或DR5（TRAIL-R2）的改变的亲和性。
术语“改变的亲和性”是指增加的亲和性和/或具有改变的受体选择性的亲和性。
优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性。
特别优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于死亡受体DR5比对于死亡受体DR4增加的亲和性，即增加的选择性DR5/DR4。
同样优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出对于死亡受体DR4和/或DR5的比对于受体DR1（TRAIL-R3）和/或DR2（TRAIL-R4）的亲和性增加的选择性。
产生对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性和/或选择性的hTRAIL的修饰是本领域已知的，例如见TurV,vanderSlootAM,ReisCR,SzegezdiE,CoolRH,SamaliA,SerranoL,QuaxWJ.DR4-selectivetumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL)variantsobtainedbystructure-baseddesign.J.Biol.Chem.2008Jul18;283(29):20560-8，其描述了D218H突变具有对于DR4的增加的选择性；或GasparianME,ChernyakBV,DolgikhDA,YagolovichAV,PopovaEN,SychevaAM,MoshkovskiiSA,KirpichnikovMP.GenerationofnewTRAILmutantsDR5-AandDR5-Bwithimprovedselectivitytodeathreceptor5,Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87，其描述了D269H突变对于DR4具有降低的亲和性。产生对于选自DR4和DR5的一种受体的增加的亲和性（相对于DR1和DR2受体）和对于受体DR5的增加的亲和性（相对于DR4）的hTRAIL突变体也描述于WO2009077857和WO2009066174。
合适的突变是选自下列的天然hTRAIL位置中的一个或多个突变：131,149,159,193,199,201,204,204,212,215,218和251，特别地，涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸，或诸如谷氨酸或天冬氨酸的氨基酸置换某氨基酸的突变。特别地可提及选自下列的一个或多个突变：G131R,G131K,R149I,R149M,R149N,R149K,S159R,Q193H,Q193K,N199H,N199R,K201H,K201R,K204E,K204D,K204L,K204Y,K212R,S215E,S215H,S215K,S215D,D218Y,D218H,K251D,K251E和K251Q，描述于WO2009066174。
合适的突变还有选自195、269和214的天然hTRAIL位置中的一个或多个突变，特别是涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸置换某氨基酸的突变。具体地可提及选自D269H,E195R和T214R的一个或多个突变，描述于WO2009077857。
在具体的实施方式中，为hTRAIL的片段的同源物的结构域（a）选自天然TRAIL序列的D218H突变体，如WO2009066174所描述，或天然TRAIL序列的Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H突变体，如GasparianME,ChernyakBV,DolgikhDA,YagolovichAV,PopovaEN,SychevaAM,MoshkovskiiSA,KirpichnikovMP.,Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87中所描述。
结构域（b）的免疫刺激效应子肽可以是细胞因子肽，其特别地强烈刺激人单核细胞以产生TRAIL蛋白，由此显著影响清除癌细胞的能力。
在本发明的融合蛋白的一个实施方式中，效应子肽是选自下列的具有免疫刺激活性的肽：SEQ.No.17(源自IFNα2b),SEQ.No.18(源自IFNγ),SEQ.No.19(IFNγ的假二聚体),SEQ.No.46(干扰素α2b的假二聚体)和SEQ.No.47(干扰素α的共有序列)。
上述组的效应子肽是刺激TRAIL过表达的肽，特别地是，SEQIDNO:17所示的干扰素α-亚基β的165个氨基酸的片段。
据信引入到本发明的融合蛋白中的包含干扰素αβ亚基的序列的肽将有效清除癌细胞。
另一个效应子肽是SEQIDNO:18所示的干扰素γ的124个氨基酸的片段。
据信引入到本发明的融合蛋白中的包含干扰素γ的序列的肽将有效清除癌细胞。
上述组的效应子肽是263个氨基酸的肽，其构成2个人干扰素γ亚基的融合物，形成IFNγ的单链假二聚体，如Landar’aetal.(J.Mol.Biol.299:169-179,2000)所描述。得到的单链蛋白变体保留结合合适的受体的能力和干扰素γ的生物学活性。该效应子肽如SEQIDNO:19所示。
上述组的另一个效应子肽是351个氨基酸的肽，其为2个人干扰素α2b亚基的融合物，形成IFNα2b的单链假二聚体，其中IFNα2b亚基序列的第二个链相对于天然序列是反的（即从C末端至N末端）。得到的效应子肽的特征在于彼此连接的干扰素α2b的2个“天然”C末端。天然存在的IFNα二聚体中的单体是通过它们的C末端连接的。N末端则负责与受体相互作用并为锌离子（谷氨酸残基41和42）的二聚化过程的协调提供正确的环境。得到的单链蛋白变体保留结合合适的受体的能力和干扰素α的生物学活性。该效应子肽如SEQIDNO:46所示。
另一个效应子肽是如SEQIDNO:47所示的干扰素α的166个氨基酸的共有序列。该共有序列公开于US4,695,623。
据信引入到本发明的融合蛋白中的包含干扰素α的共有序列的肽将有效清除癌细胞。
在与存在于癌细胞表面上的TRAIL受体结合之后，融合蛋白将显示出双重效应。结构域（a），其为TRAIL的功能片段或其具有保留的功能的同源物，将显示出已知的激动剂活性，即结合细胞表面上的死亡受体并激活细胞凋亡的外部途径。包含免疫刺激肽的融合蛋白内化之后，结构域（b）将能够与TRAIL结构域平行地潜在地细胞内地发挥其作用。通过这种方式，TRAIL的抗癌活性可通过其它元件和机制的激活而被加强，例如刺激B细胞以产生抗体，刺激胱天蛋白酶7和8的表达，或刺激TRAIL的过表达。
在另一实施方式中，结构域（a）和结构域（b）通过至少一个结构域（c）连接，结构域（c）包含被存在于细胞环境、特别是肿瘤细胞环境中的蛋白酶识别的蛋白酶切割位点序列。结构域（a）和结构域（b）通过至少一个结构域（c）连接意思是在结构域（a）和（b）之间可以存在不止一个结构域（c），特别是1个或2个结构域（c）。
蛋白酶切割位点可以选自：
-被金属蛋白酶MMP识别的序列，特别是表示为SEQIDNO:20的ProLeuGlyLeuAlaGly(以单字符表示为PLGLAG)；
-被尿激酶uPA识别的序列，特别是表示为SEQIDNO:21的ArgValValArg(以单字符表示为RVVR)；
以及它们的组合。
在本发明的一个实施方式中，蛋白酶切割位点是被金属蛋白酶MMP识别的序列与被尿激酶uPA识别的序列的组合，以任何顺序彼此相邻。
在一个实施方式中，结构域（c）是MMP/uPA的组合（SEQIDNO:20/SEQIDNO:21），即序列
ProLeuGlyLeuAlaGlyArgValValArg(以单字符表示为
PLGLAGRVVR)，或uPA/MMP的组合(SEQ.No21/SEQ.No.20),即序列ArgValValArgProLeuGlyLeuAlaGly(以单字符表示为RVVRPLGLAG)。此组合可以重复，优选重复2次。
蛋白酶金属蛋白酶MMP和尿激酶uPA在肿瘤环境中过表达。被蛋白酶识别的序列的存在使得能够在构建体内化之后从结构域（b）切割下来结构域（a），即释放功能性结构域（b），从而激活它。
蛋白酶切割位点的存在允许迅速释放效应子肽，由此增加了融合蛋白被存在于细胞中的蛋白酶随机降解之前肽向其作用位点转运的机会。
在另一实施方式中，在结构域（a）与（b）之间还引入了适合于将PEG分子（PEG连接子）连接至本发明的融合蛋白的结构域（d）。
这样的PEG连接子是例如已知的序列AlaSerGlyCysGlyProGlu(以单字符表示为ASGCGPE),如SEQIDNO:22所示。PEG连接子也可以选自AlaAlaCysAlaAla(以单字符表示为AACAA)，SerGlyGlyCysGlyGlySer(以单字符表示为SGGCGGS)和SerGlyCysGlySer(以单字符表示为SGCGS),分别如SEQ.No.23,SEQ.No.24和SEQ.No.25所示。
在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含结构域（c）和（d）二者。
在优选实施方式中，结构域（d）位于2个结构域（c）之间，特别是这样的2个结构域（c）之间：选自蛋白酶切割位点和蛋白酶切割位点的组合。特别是被金属蛋白酶MMP识别的序列（SEQIDNO:20），被尿激酶uPA识别的序列（SEQIDNO:21），MMP/uPA的组合（SEQIDNO:20/SEQIDNO:21）或uPA/MMP的组合（SEQIDNO:21/SEQIDNO:20）。
因此，在本发明的融合蛋白的一个实施方式中，蛋白酶切割位点是被蛋白酶MMP识别的序列与被尿激酶uPA识别的序列的以任何顺序的组合，其被上述PEG连接子间隔开。
应该理解，在融合蛋白在结构域（a）和（b）之间具有PEG连接子结构域（d）和切割位点结构域（c）二者时，则结构域（c）的定位是：在构建体被切割之后，结构域（d）与结构域（a）和（b）不相连。这2个结构域（c）可包含单一蛋白酶切割位点中的两个及其组合，如上文定义。换言之，如果融合蛋白包含含有PEG连接子的结构域（d）和切割位点结构域（c），则结构域（d）位于结构域（c）之间。本发明不包括这样的变体：其中结构域（d）将位于结构域（c）与结构域（a）之间或位于结构域（c）与结构域（b）之间，即这样的变体：在构建体被切割后，适合连接于本发明的融合蛋白的PEG分子（d）的序列将仍然保持与结构域（a）或结构域（b）连接。
用于与融合蛋白连接的PEG分子可以选自线性和分支的PEG分子。特别有用的是具有4000-20000的分子量的线性PEG分子。
除了融合蛋白的主要功能元件切割位点结构域和PEG连接子序列之外，本发明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空间甘氨酸-丝氨酸连接子（间隔子）的序列。此类连接子/间隔子是本领域熟知的并且在文献中有描述。将它们掺入融合蛋白的序列中是为了为通过在宿主细胞中过表达而产生的蛋白提供正确折叠。
柔性空间连接子可以选自甘氨酸和丝氨酸残基的任意组合。特别地，柔性连接子可以选自GlySerGlyGlyGly(以单字符表示为GSGGG),GlyGlyGlySer(以单字符表示为GGGS),XaaGlyGlySer(以单字符表示为XGGS)，其中Xaa代表任何氨基酸或不存在，以及选自GlyGlySerGly(以单字符表示为GGSG)，分别如SEQ.No.26,SEQ.No.27，SEQ.No.28和SEQ.No.50所示。
本发明的融合蛋白的具体实施方式是包含选自SEQ.No.1,SEQ.No.2,SEQ.No.3,SEQ.No.4和SEQ.No.45所示的蛋白的免疫刺激肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含如SEQIDNO:44所示的免疫刺激肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含选自SEQ.No.5,SEQ.No.6,SEQ.No.7,SEQ.No.8,SEQ.No.9,SEQ.No.10和SEQ.No.11的蛋白的免疫刺激肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含选自SEQ.No.12,SEQ.No.13,SEQ.No.14和SEQ.No.15的蛋白的免疫刺激肽的融合蛋白。
上述代表性融合蛋白的详细描述显示于图1-3和图4，以及如下文的实施例所描述。
根据本发明，融合蛋白意思是包含2个或更多个蛋白或其片段的单一的蛋白分子，所述2个或更多个蛋白或其片段通过它们各自的肽链内的肽键共价连接而无另外的化学连接子。
融合的蛋白也可另外被描述为蛋白构建体或嵌合蛋白。根据本发明，术语“构建体”或“嵌合蛋白”如果被使用的话，应该被理解为是指上文定义的融合蛋白。
对于本领域技术人员，显而易见的是由此定义的融合蛋白可通过肽和蛋白的已知的化学合成方法来合成。
融合蛋白可通过化学肽合成的方法来合成，特别是使用合适的树脂作为载体，使用固相肽合成技术进行。此类技术是常规的和本领域已知的，特别描述于例如下列专论中：Bodanszky和Bodanszky,ThePracticeofPeptideSynthesis,1984,Springer-Verlag,NewYork,Stewartetal.,SolidPhasePeptideSynthesis,2ndEdition,1984,PierceChemicalCompany。
融合蛋白可通过肽的化学合成方法作为连续蛋白来合成。或者，可以单独合成蛋白的各个片段（结构域），然后通过一个肽片段的氨基末端与另一个肽的羧基末端的缩合经由肽键而组合在一起。此类技术是常规的和本领域已知的。
为了验证得到的肽的结构，可以使用肽的氨基酸组成的已知的分析方法，例如高分辨率质谱技术，以确定肽的分子量。为了确认肽的序列，也可以使用蛋白测序仪，其依次降解肽并鉴定氨基酸的序列。
然而，优选地，本发明的融合蛋白是重组蛋白，通过编码融合蛋白的多核苷酸序列在宿主细胞中的基因表达的方法来产生。
本发明的另一方面是编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列。
优选地，根据本发明的编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列是针对在大肠杆菌中表达而优化的序列。
本发明的另一个方面是包含多核苷酸序列、特别是如上所述的本发明的DNA序列的表达载体。
本发明的另一个方面是包含上文所述的表达载体的宿主细胞。
用于表达本发明的融合蛋白的优选宿主细胞是大肠杆菌细胞。
用于产生重组蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。简而言之，该技术为：产生编码靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指导靶蛋白的表达的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，将编码靶蛋白的多核苷酸分子掺入合适的表达载体，其确保多肽的有效表达。然后将重组表达载体导入宿主细胞以进行转染/转化，由此产生转化的宿主细胞。然后培养转化的细胞以过表达靶蛋白，纯化所获得的蛋白，任选地通过切割用于表达或纯化蛋白的标签序列而切下来。
用于表达和纯化的合适的技术描述于例如下列专著：Goeddel,GeneExpressionTechnology,MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)和A.Staronetal.,AdvancesMikrobiol.,2008,47,2,1983-1995。
作为用于导入和在宿主细胞中复制DNA序列的表达载体，可以使用粘粒、质粒或修饰的病毒。通常使用质粒作为表达载体。合适的质粒是熟知的和商业上可获得。
本发明的表达载体包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于转录和翻译掺入合适的宿主细胞的编码序列的必要的调节序列。调节序列的选择取决于宿主细胞的类型，可以由本领域技术人员容易地进行。此类调节序列的实例是包含转录起始信号的、插入编码序列之前的转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，和插入编码序列之后的转录终止序列。此外，取决于所用的宿主细胞和载体，可以将其它序列导入表达载体，例如复制起始子，另外的DNA限制性位点，增强子和允许诱导转录的序列。
表达载体还包含标记物基因序列，其赋予转化的细胞确定的表型并使得能够特异性选择转化的细胞。此外，载体还可以包含第二标记物序列，其允许将以包含插入的编码靶蛋白序列的重组质粒转化的细胞与摄取了无插入物的质粒的细胞区分开。通常，使用典型的抗生素抗性标记物，然而，任何其它本领域已知的报告子基因均可使用，其在细胞（在体内）中的存在可使用放射自显影技术、分光光度法或生物和化学发光法容易地确定。例如，取决于宿主细胞，可使用例如下列报告基因：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白。
此外，表达载体可包含信号序列，将蛋白转运至合适的细胞腔室，例如周质，在那里促进折叠。另外，可以存在编码标记物/标签例如连接于N末端的HisTag或连接于C末端的GST的序列，其促进后续使用亲和法、通过镍柱上的亲和层析纯化所产生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保护蛋白免于宿主细胞中的蛋白水解降解，以及增强其溶解性的序列。
连接于靶蛋白的序列的辅助元件可能阻断其活性，或者由于别的原因而具有有害效应，例如由于毒性。此类元件必须被除掉，这可通过酶促或化学切割来完成。特别地，为了允许通过亲和层析而纯化蛋白而连接的6个组氨酸的标签HisTag或这种类型的其它标记物应该被除去，因为其被描述对于可溶性TRAIL蛋白的肝毒性具有影响。可以使用基于多种熟知的宿主细胞的异源表达系统，包括原核细胞：细菌，例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母；和真核细胞系（昆虫、哺乳动物、植物）。
优选地，由于培养和遗传操作的容易性和大量的获得的产物，使用大肠杆菌表达系统。因此，包含编码本发明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列将针对在大肠杆菌中的表达而进行优化，即，其将包含在大肠杆菌中表达优化的编码序列密码子，选自本领域已知的可能的序列变体。此外，表达载体将包含适合大肠杆菌的连接于编码序列的上述元件。
因此，在本发明的优选实施方式中，针对在大肠杆菌中表达而优化的包含编码本发明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列选自下组的多核苷酸序列：
SEQ.No.29;SEQ.No.31;SEQ.No.32;SEQ.No.33,SEQ.No.34;SEQ.No.35;SEQ.No.36;SEQ.No.37;SEQ.No.38;SEQ.No.39;SEQ.No.40;SEQ.No.41,SEQ.No.42;SEQ.No.43;SEQ.No.48;SEQ.No.49；
其分别编码具有对应于选自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白：
SEQ.No.1;SEQ.No.2;SEQ.No.3;SEQ.No.4;SEQ.No.5;SEQ.No.6;SEQ.No.7;SEQ.No.8;SEQ.No.9;SEQ.No.10;SEQ.No.11,SEQ.No.12,SEQ.No.13;SEQ.No.14SEQ.No.15,SEQ.No.44;SEQ.No.45。
在优选实施方式中，本发明还提供了适合于转化大肠杆菌的表达载体，其包含上述选自SEQ.NO.29至SEQ.NO.43，SEQ.NO.48和SEQ.NO.49的多核苷酸序列，以及以此类表达载体转化的大肠杆菌细胞。
转化，即将DNA序列导入细菌宿主细胞特别是大肠杆菌，通常在准备好摄取DNA的感受态细胞上进行，例如通过以钙离子在低温(4°C)处理，然后进行热击(37-42°C)或通过电穿孔进行。此类技术是熟知的并且通常由表达系统的生产商确定，或描述于文献和实验室工作手册中，例如Maniatisetal.,MolecularCloning.ColdSpringHarbor,N.Y.,1982)。
在大肠杆菌表达系统中过表达本发明的融合蛋白的程序将在下文详述。
本发明还提供了包含如上文所述的本发明的融合蛋白作为活性成分以及合适的药学上可接受的载体、稀释剂和常规辅助性成分的药物组合物。药物组合物将包含有效量的本发明的融合蛋白和药学上可接受的溶解或分散于载体或稀释剂中的辅助性成分，优选是配制为单元剂型或包含多剂的制剂的药物制剂的形式。药物形式和其配制方法以及其它成分、载体和稀释剂是本领域技术人员已知的并且在文献中有描述。例如，描述于下列专著：Remington'sPharmaceuticalSciences,ed.20,2000,MackPublishingCompany,Easton,USA。
术语“药学上可接受的载体、稀释剂和辅助性成分”包含本领域已知的任何溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂（例如抗细菌剂、抗真菌剂）、等渗剂。本发明的药学上可接受的载体可包含多种类型的载体、稀释剂和赋形剂，这取决于所选的施用途径和需要的剂型，例如液体、固体和气雾剂形式，用于口服、胃肠外、吸入、表面，以及所选的形式对于施用途径(例如注射)是否必须是无菌的。本发明的药物组合物的优选施用途径是胃肠外，包括注射途径，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、肿瘤内或通过单次或连续静脉内输注。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以通过直接注射至肿瘤来施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可通过静脉内施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可皮下或腹膜内施用。用于胃肠外施用的药物组合物可以是药学上可接受的水性或非水性介质中的溶液或分散体，所述介质缓冲至合适的pH和与体液等渗（如果必要），并且还可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和可溶性物质，其使得组合物与受体的组织或血液相容。可包含于组合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液体乙二醇，脂质例如甘油三酯，植物油，脂质体。合适的流动性和物质粒度可通过涂覆性物质例如卵磷脂和表面活性剂例如羟丙基纤维素、聚山梨酸酯等来提供。用于液体胃肠外组合物的合适的等渗剂是例如糖，例如葡萄糖，和氯化钠，及其组合。
或者，用于通过注射或输注施用的药物组合物可以是粉末形式，例如冻干的粉末，用于在临使用前以合适的载体例如无菌无热源水进行重构。
用于胃肠外施用的本发明的药物组合物也可具有经鼻施用的形式，包括溶液、喷雾剂或气雾剂。优选地，用于经鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等渗的或缓冲至保持从大约5.5至大约6.5的pH，以维持类似于鼻分泌物的性质。此外，其将包含防腐剂或稳定剂，例如熟知的鼻内制剂中包含的那些。
组合物可包含多种抗氧化剂，其延迟一种或多种成分的氧化。此外，为了防止微生物的作用，组合物可包含多种抗细菌和抗真菌试剂，包括例如，但不限于，尼铂金酯类，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和这种类型的类似的已知物质。一般地，本发明的药物组合物可以包含例如至少大约0.01wt%的活性成分。更具体地，组合物可包含1%至75%重量的活性成分，或例如25%至60%重量，但不限于这些数值。施用于患者包括人类的根据本发明的组合物的实际剂量将由物理和生理因素决定，例如体重、病况的严重性、被治疗的疾病的类型，之前或同时的治疗性干预，患者和施用途径。合适的单元剂量，总剂量和组合物中的活性成分的浓度将由主治医生决定。
组合物可例如以下列剂量施用：大约1μg/kg体重至大约1000mg/kg患者体重，例如5mg/kg体重至100mg/kg体重，或5mg/kg体重至500mg/kg体重。融合蛋白和包含它的组合物显示出抗癌或抗肿瘤活性，可用于治疗癌症疾病。本发明还提供了如上所述的本发明的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人类中的癌症疾病的用途。本发明还提供了治疗哺乳动物包括人类中的癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用抗癌有效量的如上所述的本发明的融合蛋白，任选为合适的药物组合物的形式。
本发明的融合蛋白可用于治疗血液恶性肿瘤，例如白血病，肉芽肿病，骨髓瘤和其它血液恶性肿瘤。融合蛋白也可用于治疗实体瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，肾癌，脑癌等。用于治疗癌症的融合蛋白的合适的施用途径特别为胃肠外途径：以注射或输注的形式、在组合物中和以适合于该施用途径的形式施用本发明的融合蛋白。本发明将以下列一般性程序和具体融合蛋白的实例进行更详细的描述。
用于过表达融合蛋白的一般性程序
质粒的制备
靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以产生编码它的DNA序列，包含针对在大肠杆菌中的表达优化的密码子。此程序允许增大在大肠杆菌中进行靶蛋白合成的后续步骤的效率。然后自动化合成得到的核苷酸序列。另外，将限制性酶Ndel(在引导链的5’末端)和Xhol(在引导链的3’末端)的切割位点添加到得到的编码靶蛋白的基因中。它们用于将基因克隆进入载体pET28a(Novagen)。它们也可用于将编码蛋白的基因克隆进入其它载体。从该构建体表达而来的靶蛋白在N末端具有多聚组氨酸标签（6个组氨酸），其之前是凝血酶识别的位点，该位点用于后续通过亲和层析进行纯化。首先通过使用酶Ndel和Xhol对分离的质粒进行限制性分析、然后通过靶蛋白的整个阅读框的自动化测序来确认得到的构建体的正确性。用于测序的引物互补于存在于载体中的T7启动子的序列(5'-TAATACGACTCACTATAGG-3')和T7终止子的序列(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')。得到的质粒用于在商业化大肠杆菌菌株中过表达靶融合蛋白，其根据生产商的推荐进行转化。在选择性培养基(LB琼脂，卡那霉素50μg/ml，1%葡萄糖)上获得的菌落用于制备LB液体培养基(补充了50μg/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的过夜培养物。在摇动的温育箱中生长大约15小时之后，培养物用于接种合适的培养物。
融合蛋白的过表达和纯化——一般程序A
以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.25-1mM。在25℃摇动温育后(3.5-20h)，将培养物在6,000g离心25分钟。将细菌沉淀物重悬于含有50mMKH2PO4,0.5MNaCl,10mM咪唑,pH7.4的缓冲液中。将悬浮液在冰上超声8分钟(40%振幅，15秒脉冲，10秒间隔)。通过在20000g、4℃离心40分钟而使得到的提取物澄清。以用于制备细菌细胞提取物的缓冲液平衡预处理Ni-Sepharose树脂(GEHealthcare)。然后使用离心提取物后获得的上清液将树脂在4℃过夜温育。然后将其载入色谱柱并以15-50倍体积的缓冲液50mMKH2PO4,0.5MNaCl,20mM咪唑,pH7.4洗涤。使用含有0.5MNaClpH7.4的50mMKH2PO4缓冲液中的咪唑梯度从柱洗脱获得的蛋白。通过SDS-PAGE分析获得的级份。将合适的级份组合并针对50mMTris缓冲液,pH7.2,150mMNaCl,500mML-精氨酸,0.1mMZnSO4,0.01%Tween20在4℃过夜透析，同时，以凝血酶(1:50)切割10Histag。切割之后，通过使用BenzamidineSepharoseTM树脂从靶融合蛋白分离凝血酶。通过SDS-PAGE电泳分析产物的纯度(Maniatisetal,MolecularCloning.ColdSpringHarbor,NY,1982)。
融合蛋白的过表达和纯化——一般程序B
以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.5-1mM。在25℃摇动温育20h后，将培养物在6000g离心25分钟。将过表达后的细菌细胞在弗氏细胞压碎器中在含有50mMKH2PO4,0.5MNaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mMPMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8的缓冲液中破碎。通过在8000g离心50分钟使得到的提取物澄清。使用Ni-琼脂糖树脂过夜温育获得的上清液。然后将结合了蛋白的树脂载入色谱柱。为了洗掉含有非结合性蛋白的级份，以15-50倍体积的缓冲液50mMKH2PO4,0.5MNaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mMPMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8洗涤柱。然后，为了洗掉大部分的特异性与床结合的蛋白，以含有50mMKH2PO4,0.5MNaCl,500mM咪唑,10%甘油,0.5mMPMSF,pH7.5的缓冲液洗涤柱。通过SDS-PAGE分析获得的级份(Maniatisetal,MolecularCloning.ColdSpringHarbor,NY,1982)。将含有靶蛋白的级份组合，以凝血酶切割(1U/4mg蛋白，16°C，8小时)以除掉多聚组氨酸标签。然后将级份针对配制缓冲液(500mML-精氨酸,50mMTris,2.5mMZnSO4,pH7.4)透析。
实施例1：SEQIDNO:1的融合蛋白
SEQIDNO:1的蛋白是具有345个氨基酸的长度和39.8kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素α的165个氨基酸的亚基2b（SEQIDNO:17）连接于序列TRAIL122-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间依次插入了彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:29。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:1用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:29。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例2：SEQIDNO:2的融合蛋白
SEQIDNO:2的蛋白是具有347个氨基酸的长度和40kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素α的165个氨基酸的亚基2b（SEQIDNO:17）连接于序列TRAIL120-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间依次插入了彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:2和SEQIDNO:30。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:2用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:30。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例3：SEQIDNO:3的融合蛋白
SEQIDNO:3的蛋白是具有352个氨基酸的长度和40.4kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素α的165个氨基酸的亚基2b（SEQIDNO:17）连接于序列TRAIL122-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）的2个组合，由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的2个组合之间，融合蛋白另外引入了用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:3和SEQIDNO:31。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:3用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:31。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例4：SEQIDNO:4的融合蛋白
SEQIDNO:4的蛋白是具有353个氨基酸的长度和40.5kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素α的165个氨基酸的亚基2b（SEQIDNO:17）连接于序列TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）的2个组合，由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的2个组合之间，融合蛋白另外引入了用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:4和SEQIDNO:32。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:4用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:32。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Stratagene的大肠杆菌BL21DE3pLysSRIL菌株和来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)z菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例5：SEQIDNO:5的融合蛋白
SEQIDNO:5的蛋白是具有300个氨基酸的长度和34.7kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的片段（SEQIDNO:18）连接于序列TRAIL116-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:5和SEQIDNO:33。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:5用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:33。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例6：SEQIDNO:6的融合蛋白
SEQIDNO:6的蛋白是具有307个氨基酸的长度和35.1kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的片段（SEQIDNO:18）连接于序列TRAIL116-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）。
该蛋白还包含柔性连接子：在TRAIL的序列与金属蛋白酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子（SEQIDNO:27）；以及在尿激酶uPA切割位点和效应子序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子（SEQIDNO:28）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:6和SEQIDNO:34。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:6用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:34。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例7：SEQIDNO:7的融合蛋白
SEQIDNO:7的蛋白是具有310个氨基酸的长度和35.5kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的片段（SEQIDNO:18）连接于序列TRAIL116-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与金属蛋白酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子SEQIDNO:26；以及在尿激酶uPA切割位点和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子SEQIDNO:26。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:7和SEQIDNO:35。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:7用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:35。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例8：SEQIDNO:8的融合蛋白
SEQIDNO:8的蛋白是具有310个氨基酸的长度和35.3kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的片段（SEQIDNO:18）连接于序列TRAIL116-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与金属蛋白酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及在尿激酶uPA切割位点和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:8和SEQIDNO:36。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:8用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:36。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例9：SEQIDNO:9的融合蛋白
SEQIDNO:9的蛋白是具有317个氨基酸的长度和35.9kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的片段（SEQIDNO:18）连接于序列TRAIL116-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）的组合，由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的之间，融合蛋白另外包含用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与金属蛋白酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及在尿激酶uPA切割位点和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:9和SEQIDNO:37。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:9用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:37。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例10：SEQIDNO:10的融合蛋白
SEQIDNO:10的蛋白是具有338个氨基酸的长度和38.3kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的片段（SEQIDNO:18）连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，融合蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在SEQIDNO:21之后，融合蛋白另外包含用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与金属蛋白酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及在用于聚乙二醇化的连接子和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:10和SEQIDNO:38。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:10用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:38。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例11：SEQIDNO:11的融合蛋白
SEQIDNO:11的蛋白是具有317个氨基酸的长度和35.9kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的片段（SEQIDNO:18）连接于序列TRAIL116-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在SEQIDNO:20和SEQIDNO:21之间，融合蛋白另外包含用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与金属蛋白酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及尿激酶uPA切割位点和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:11和SEQIDNO:39。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:11用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:39。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例12：SEQIDNO:12的融合蛋白
SEQIDNO:12的蛋白是具有449个氨基酸的长度和51.8kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的单链假二聚体（SEQIDNO:19）连接于序列TRAIL116-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与金属蛋白酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及尿激酶uPA切割位点和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:12和SEQIDNO:40。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:12用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:40。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例13：SEQIDNO:13的融合蛋白
SEQIDNO:13的蛋白是具有449个氨基酸的长度和51.8kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的单链假二聚体（SEQIDNO:19）连接于序列TRAIL116-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，引入了被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与尿激酶uPA切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及金属蛋白酶酶MMP切割位点和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:13和SEQIDNO:41。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:13用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:41。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21(DE3)和来自Stratagene的大肠杆菌L21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例14：SEQIDNO:14的融合蛋白
SEQIDNO:14的蛋白是具有456个氨基酸的长度和52.4kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的单链假二聚体（SEQIDNO:19）连接于序列TRAIL116-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，引入了被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在序列SEQIDNO:20和SEQIDNO:21之间，融合蛋白还包含用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与尿激酶uPA切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及金属蛋白酶酶MMP切割位点和TRAIL序列之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:14和SEQIDNO:42。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:14用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:42。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21(DE3)和来自Stratagene的大肠杆菌BL21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例15：SEQIDNO:15的融合蛋白
SEQIDNO:15的蛋白是具有456个氨基酸的长度和52.4kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素γ的单链假二聚体（SEQIDNO:19）连接于序列TRAIL116-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，融合蛋白包含被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21），由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在序列SEQIDNO:20和SEQIDNO:21之间，融合蛋白还包含用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与尿激酶uPA切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）；以及TRAIL序列和金属蛋白酶酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GSGGG（SEQIDNO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:15和SEQIDNO:43。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:15用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:43。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21(DE3)和来自Stratagene的大肠杆菌L21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例16：SEQIDNO:44的融合蛋白
SEQIDNO:44的蛋白是具有538个氨基酸的长度和62.4kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素α2b的单链假二聚体（SEQIDNO:46）连接于序列TRAIL122-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，引入了被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）的2个组合，由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在序列SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的2个组合之间，融合蛋白还包含用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。
该融合蛋白的结构显示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:44和SEQIDNO:48。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:44用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:48。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21(DE3)和来自Stratagene的大肠杆菌L21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例17：SEQIDNO:45的融合蛋白
SEQIDNO:45的蛋白是具有384个氨基酸的长度和44kDa的质量的融合蛋白，其中人干扰素α的共有序列（SEQIDNO:47）连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，引入了被金属蛋白酶MMP识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:20）和被尿激酶uPA识别的蛋白酶切割位点的序列（SEQIDNO:21）的2个组合，由于它们的存在，在融合蛋白内化之后效应子肽将在肿瘤环境中经历切割。在序列SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的2个组合之间，融合蛋白还包含用于聚乙二醇化的连接子（SEQIDNO:22）。该蛋白还包含柔性连接子：在效应子肽序列与金属蛋白酶酶MMP切割位点之间的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子GGSG（SEQIDNO:50）。
该融合蛋白的结构显示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQIDNO:45和SEQIDNO:49。
上述结构的氨基酸序列SEQIDNO:45用作模板以产生其编码DNA序列DNASEQIDNO:49。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21(DE3)和来自Stratagene的大肠杆菌L21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例18：融合蛋白的抗肿瘤活性的检测
在体外在肿瘤细胞系中在细胞毒性测定中以及在体内在小鼠中进行融合蛋白的抗肿瘤活性的测定。为了比较目的，使用了rhTRAIL114-281蛋白和安慰剂。
1.圆二色性测定
通过Ex.3,Ex.5,Ex.12和Ex.14的圆二色性（CD）测定融合蛋白的制备物的质量（就它们的结构而言）。
圆二色性用于测定蛋白质的二级结构和构象。CD方法使用蛋白结构的光学活性，表现为使光偏振平面旋转和椭圆偏振的出现。远紫外(UV)中的蛋白的CD光谱提供了关于主要多肽链的构象的精确数据。
待分析的蛋白的样品配制于由50mMTris-HClpH8,0,100mMNaCl,10%甘油,0.1mMZnCl2,80mM蔗糖,5mMDTT中之后，在具有12kDa截留值的透析袋(Sigma-Aldrich)中透析。针对相对于蛋白制剂100倍过量(v/v)的缓冲液进行透析，同时搅拌，在4°C持续数个小时。透析完成之后，将每个制剂离心(25000rpm,10min,4°C)，收集适当的上清液。通过Bradford法测定所获得的样品中的蛋白浓度。
在JascoJ-710分光偏振计中，在具有0.2mm或1mm光程的石英杯中进行浓度范围为0.1-2.7mg/ml的蛋白的圆二色性测定。在7l/min的氮气流下进行该测定，这允许在195至250nm波长范围内进行测定。测量参数：光谱分辨率-1nm；光束的半宽1nm;灵敏性20mdeg,一个波长的平均时间-8s,扫描速度10nm/min。
结果显示为3次测量的平均值。rhTRAIL114-281，rhTRAIL95-281和Ex.12,Ex.5,Ex.3和Ex.14的蛋白的圆二色性光谱显示于图5。
使用CDPro软件在193-250nm范围内对获得的光谱进行数值分析。忽略掉光电倍增管中的电压超过700V的点，因为该波长范围内的信噪比太低。
获得的数据用于计算所分析的蛋白中的特定二级结构含量，使用CDPro软件(表1)。
表1：所分析的蛋白中的二级结构的含量
*基于晶体结构1D4V获得的值
对照(rhTRAIL114-281和rhTRAIL95-281)显示出蛋白的特征性CD光谱，主要类型为β-层结构(在波长220nm处锐利刻画出最小椭圆率)。这确认了二级结构成分的计算，其表明有少量的α-螺旋元件。
获得的结果与来自TRAIL蛋白的晶体结构的数据也是一致的，其中β元件构成一半以上的其成分。
在Ex.3,Ex.5,Ex.12和Ex.14的融合蛋白的情况下，二色性光谱的特征在于208和220nm波长处的两个最小值，其是具有α/β类型的混合二级结构的蛋白的特征。
在融合蛋白中连接于TRAIL的干扰素主要构成α螺旋结构，因此，所分析的嵌合蛋白中的二级结构的混合性质能够确认存在TRAIL和干扰素的正确折叠的元件。
在Ex.3和Ex.14的制剂的情况下，发现几乎100%的α类型的结构。这样的α类型结构的含量是由于分析中使用的波长的窄范围，其为对于方法和材料优化的制剂选择的结果（在远-UV中大量的噪声）。光谱的所分析的区域中锐利刻画的180-200nm范围的缺失可导致α螺旋结构的含量被过量估计。
2.体外细胞系测试
细胞系
表2.粘附性细胞系
表3：非粘附性细胞
MTT细胞毒性测试
MTT测试法是用于测定细胞增殖、存活性和细胞毒性的比色测定法。黄色的四唑盐MTT(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)通过线粒体酶琥珀酸盐-四唑还原酶1分解为不溶于水的紫色染料甲瓒。MTT还原仅在活细胞中发生。数据分析：测定蛋白的IC50浓度(ng/ml)，即相对于对照细胞，经处理的群体中的细胞数目减少50%时的蛋白浓度。使用GraphPadPrism5.0软件分析结果。根据文献中的描述进行测试(Celis,JE,(1998)。CellBiology,aLaboratoryHandbook,secondedition,AcademicPress,SanDiego;Yang,Y.,Koh,LW,Tsai,JH.,(2004);InvolvmentofviralandchemicalfactorswithoralcancerinTaiwan,JpnJClinOncol,34(4),176-183)。
将细胞培养基稀释至确定的密度(104-105个细胞/100μl)。然后将100μl适当稀释的细胞悬浮液加至96孔板中，一式三份。将这样制备的细胞在37°C在5%或10%CO2(取决于所用的培养基)中温育24小时，然后向细胞(在100μl培养基中)中再加入100μl含有各种浓度的测试蛋白的培养基中。将细胞与测试蛋白温育72小时，相当于3-4次细胞分裂，然后向含有测试蛋白的培养基中加入20mlMTT工作溶液[5mg/ml]，并在37°C在5%CO2中温育3小时。然后除去含有MTT溶液的培养基，通过加入100μlDMSO溶解甲瓒晶体。搅拌之后，在570nm(参考滤波器690nm)测定吸收值。
EZ4U细胞毒性测试
EZ4U(Biomedica)测试用于测定非粘附性细胞系中的蛋白的细胞毒性活性。该测试是MTT的修改，其中还原四唑盐而形成的甲瓒是可溶于水的。将细胞与蛋白（7个蛋白浓度，每个一式三份）连续温育72小时之后进行细胞存活性研究。基于此，使用GraphPadPrism5软件测定IC50值。
体外细胞毒性测试的结果以IC50值(ng/ml)总结于表4和表5，IC50值对应于：相对于仅以溶剂温育的对照细胞，在50%水平观察到融合蛋白的细胞毒性效应时的蛋白浓度。每个实验代表以一式三份进行的至少2次独立实验的平均值。作为缺乏蛋白制剂活性的标准，采用了2000ng/ml的IC50限值。具有大于2000的IC50值的融合蛋白被认为是无活性的。
将用于此测试的细胞选择为：使得包括对于TRAIL蛋白具有天然抗性的肿瘤细胞系(对于TRAIL的天然抗性的标准：对于TRAIL蛋白IC50>2000)，对于TRAIL蛋白敏感的肿瘤细胞系，对于阿霉素抗性的细胞系MES-SA/DX5作为对于常规抗癌药物有抗性的癌细胞系。
未分化的HUVEC细胞系用作健康对照细胞系，用于测定融合蛋白对于非癌细胞的影响/毒性。
获得的结果确认了通过向对于TRAIL具有天然抗性的细胞施用本发明的某些融合蛋白而克服细胞系对于TRAIL的抗性的可能性。当将本发明的融合蛋白施用于对于TRAIL敏感的细胞时，在一些情况下观察到作用效力的明显的、强烈的加强，表现为融合蛋白的IC50值相对于单独的TRAIL的IC50降低。此外，在对于常规抗癌药物阿霉素有抗性的细胞中获得了本发明的融合蛋白的细胞毒性活性，在一些情况下比单独的TRAIL的活性更强。
对于非癌细胞系所获得的大于2000的IC50值显示：对于健康细胞使用本发明的蛋白，不存在毒性效应，这表明这些蛋白的潜在的低系统性毒性。
选择的蛋白制剂对于延伸的肿瘤细胞系组的细胞毒性活性的测定
表5显示了选择的本发明的融合蛋白针对来自不同器官的一大组肿瘤细胞(对应于宽范围的多数常见癌症)的体外细胞毒性活性结果。获得的IC50值确认了融合蛋白的高细胞毒性，从而确认了它们在癌症治疗中的潜在应用。
2.融合蛋白在体内对于异种移植物的抗肿瘤有效性
在人结肠癌HCT116的小鼠模型中测试了蛋白制剂的抗肿瘤活性。
细胞
HCT116细胞维持于以1:1比例混合的补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)和Opti-MEM((Invitrogen,Cat.22600-134)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
PLC/PRF/5(CLS)细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
HepG2细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的MEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
小鼠
在获自CharlesRiverGermany的7-9周龄CD-裸鼠(Crl:CD1-Foxn1nu1)或4-5周龄Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠上进行本发明的蛋白的抗肿瘤活性测定。将小鼠保持于特定的无病原体条件下，自由获取食物和去矿物水(随意)。所有的动物实验根据下列指引进行："InterdisciplinaryPrinciplesandGuidelinesfortheUseofAnimalsinResearch,MarketingandEducation"，由NewYorkAcademyofSciences'AdHocCommitteeonAnimalResearch颁布并由IVLocalEthicsCommitteeonAnimalExperimentationinWarsaw(No.71/2009)批准。
实验进程和评价
人结肠癌模型
小鼠Crl:CD1-Foxn1
nu
1
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:CD1-Foxn1nu1的右侧皮下(sc)移植悬于0.2mlHBSS缓冲液中的5x106个HCT116细胞。当肿瘤达到～50-140mm3(第14天)时，将小鼠随机化以获得～70mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.3,Ex.12和Ex.14(10mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(10mg/kg)作为比较参考，配制缓冲液(5mMNaH2PO4,95mMNa2HPO4,200mMNaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mMZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8,0)作为对照。在第8-12天和第15-19天持续10天每日静脉内(i.v.)施用制剂。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
小鼠Crl:SHO-Prkdc
scid
Hr
hr
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.1mlHBSS缓冲液中的5x106个HCT116细胞。当肿瘤达到200-700mm3(第18天)时，将小鼠随机化以获得～400mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.14(50mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为比较参考，配制缓冲液(5mMNaH2PO4,95mMNa2HPO4,200mMNaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mMZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第32天通过破坏脊髓杀死小鼠。
人肝癌模型
PLC/PRF/5细胞
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.1mlHBSS缓冲液:Matrigel(3:1)中的7x106个PLC/PRF/5细胞。当肿瘤达到140-300mm3(第31天)时，将小鼠随机化以获得～200mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.14(20mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(30mg/kg)作为比较参考，配制缓冲液(5mMNaH2PO4,95mMNa2HPO4,200mMNaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mMZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每3天4次、然后每2天2次静脉内(i.v.)施用制剂(q3dx4和q2dx2)。在实验的第32天通过破坏脊髓杀死小鼠。
HepG2细胞
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.1mlHBSS缓冲液:Matrigel(3:1)中的7x106个HepG2细胞。当肿瘤达到250-390mm3(第19天)时，将小鼠随机化以获得～330mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.14(50mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(30mg/kg)作为比较参考，配制缓冲液(5mMNaH2PO4,95mMNa2HPO4,200mMNaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mMZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。在实验的第31天通过破坏脊髓杀死小鼠。
使用电子卡尺测定肿瘤大小，使用公式(a2xb)/2计算肿瘤体积，其中a=肿瘤的较短的对角线(mm)，b=肿瘤的较长的对角线(mm)。使用下列公式计算肿瘤生长的抑制：
TGI[%](肿瘤生长抑制)=(WT/WC)x100-100%
其中WT是指处理组中的平均肿瘤体积，WC是指对照组中的平均肿瘤体积。
实验结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用GraphPadPrism5.0软件进行所有计算和作图。
在以Ex.3,Ex.12和Ex.14的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有HCT116结肠癌的小鼠Crl:CD1-Foxn1nu中获得的实验结果显示于图6，作为肿瘤体积的变化图；和图7，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图6和7中的图显示的实验结果显示：施用Ex.3,Ex.12和Ex.14的本发明的融合蛋白引起肿瘤HCT116生长抑制，在实验的第28天相对于对照的TGI分别是71%，67%和75%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为44%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
在以Ex.14(20mg/kg)的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有HCT116结肠癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图8，作为肿瘤体积的变化图；和图9，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图8和9中的图显示的实验结果显示：施用Ex.14的本发明的融合蛋白引起肿瘤HCT116生长抑制，在实验的第32天相对于对照的TGI是22.5%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为5.6%。因此，本发明的融合蛋白相对于TRAIL显示出强得多的效应。
在以Ex.14的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有PLC/PRF/5肝癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图10，作为肿瘤体积的变化图；和图11，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图10和11中的图显示的实验结果显示：施用Ex.14的本发明的融合蛋白引起肿瘤PLC/PRF/5生长抑制，在实验的第49天相对于对照的TGI是34%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为18%。因此，本发明的融合蛋白相对于TRAIL显示出强得多的效应。
在以Ex.14的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有HepG2肝癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图12，作为肿瘤体积的变化图；和图13，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图12和13中的图显示的实验结果显示：施用Ex.14的本发明的融合蛋白引起肿瘤HepG2生长抑制，在实验的第31天相对于对照的TGI是33.6%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为7%。因此，本发明的融合蛋白相对于TRAIL显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10%的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
Claims (15)
1.融合蛋白，其包含：
结构域(a)，其为序列为SEQIDNO:16的hTRAIL蛋白的功能片段，该片段起始于hTRAIL95至hTRAIL122的氨基酸，含端点，结束于氨基酸hTRAIL281；和
结构域(b)，其是免疫刺激效应子肽的序列并选自SEQIDNO:19所示的干扰素γ的假二聚体和SEQIDNO:46所示的干扰素α2b的假二聚体，
其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端或N末端。
2.权利要求1的融合蛋白，其中结构域(a)选自序列为SEQIDNO:16的hTRAIL的片段，其起始于位置95,116,120,121或122的氨基酸。
3.权利要求2的融合蛋白，其中在结构域(a)与结构域(b)之间包含至少一个结构域(c)，结构域(c)包含选自被金属蛋白酶MMP识别的序列、被尿激酶uPA识别的序列，及其组合的蛋白酶切割位点。
4.权利要求3的融合蛋白，其中被金属蛋白酶MMP识别的序列是SEQIDNO:20，被尿激酶uPA识别的序列是SEQIDNO:21。
5.权利要求3的融合蛋白，其中结构域(c)是彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列和被尿激酶uPA识别的序列的组合。
6.权利要求5的融合蛋白，其中结构域(c)是彼此相邻的SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的组合。
7.权利要求4或5或6的融合蛋白，其中在两个结构域(c)之间包含用于连接PEG分子的连接子结构域(d)，其选自SEQIDNO:22，SEQIDNO:23，SEQIDNO:24和SEQIDNO:25。
8.权利要求4或5或6的融合蛋白，其在结构域(a)，(b)，(c)和/或(d)之间还包含甘氨酸-丝氨酸柔性空间连接子。
9.权利要求8的融合蛋白，其中甘氨酸-丝氨酸连接子选自SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28和SEQIDNO:50。
10.权利要求1的融合蛋白，其氨基酸序列选自SEQ.No.12；SEQ.No.13；SEQ.No.14；SEQ.No.15；和SEQ.No.44。
11.权利要求1的融合蛋白，其为重组蛋白。
12.药物组合物，其包含与任何药学上可接受的载体组合的作为活性成分的权利要求1或10中定义的融合蛋白。
13.根据权利要求12的药物组合物，其为用于胃肠外施用的形式。
14.权利要求1或10中定义的融合蛋白在制备用于治疗哺乳动物中的癌症疾病的药物中的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述哺乳动物是人。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL393146A PL393146A1 (pl) | 2010-12-03 | 2010-12-03 | Przeciwnowotworowe białko fuzyjne |
| PLP.393146 | 2010-12-03 | ||
| PLP.394597 | 2011-04-18 | ||
| PL39459711 | 2011-04-18 | ||
| PCT/EP2011/071719 WO2012072815A1 (en) | 2010-12-03 | 2011-12-05 | Anticancer fusion protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103237808A CN103237808A (zh) | 2013-08-07 |
| CN103237808B true CN103237808B (zh) | 2016-02-24 |
Family
ID=45065918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201180057053.1A Active CN103237808B (zh) | 2010-12-03 | 2011-12-05 | 抗癌融合蛋白 |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9161991B2 (zh) |
| EP (1) | EP2646464B1 (zh) |
| JP (1) | JP5759557B2 (zh) |
| KR (1) | KR101952460B1 (zh) |
| CN (1) | CN103237808B (zh) |
| AU (1) | AU2011334868B2 (zh) |
| BR (1) | BR112013013548B8 (zh) |
| CA (1) | CA2814595C (zh) |
| CY (1) | CY1116646T1 (zh) |
| DK (1) | DK2646464T3 (zh) |
| EA (1) | EA024452B1 (zh) |
| ES (1) | ES2545895T3 (zh) |
| HK (1) | HK1186192A1 (zh) |
| HR (1) | HRP20150664T1 (zh) |
| HU (1) | HUE027068T2 (zh) |
| IL (1) | IL226207A (zh) |
| ME (1) | ME02224B (zh) |
| MX (1) | MX337436B (zh) |
| NZ (1) | NZ609216A (zh) |
| PL (1) | PL2646464T3 (zh) |
| PT (1) | PT2646464E (zh) |
| RS (1) | RS54057B1 (zh) |
| SG (2) | SG10201509676UA (zh) |
| SI (1) | SI2646464T1 (zh) |
| SM (1) | SMT201500203B (zh) |
| WO (1) | WO2012072815A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201303449B (zh) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL219845B1 (pl) * | 2011-01-05 | 2015-07-31 | Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością | Przeciwnowotworowe białko fuzyjne |
| EP2670426B1 (en) | 2011-01-31 | 2017-05-10 | The General Hospital Corporation | Multimodal trail molecules and uses in cellular therapies |
| EP3473708B1 (en) | 2012-07-24 | 2021-01-27 | The General Hospital Corporation | Oncolytic virus therapy for resistant tumors |
| WO2014035474A1 (en) | 2012-08-30 | 2014-03-06 | The General Hospital Corporation | Compositions and methods for treating cancer |
| WO2014057436A2 (en) | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer conjugate |
| WO2014141094A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer conjugate |
| WO2016127346A1 (zh) * | 2015-02-11 | 2016-08-18 | 四川大学华西医院 | 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 |
| CN106632682A (zh) * | 2015-08-04 | 2017-05-10 | 清华大学 | 融合蛋白ifn-elp及其应用 |
| US11136353B2 (en) | 2019-04-15 | 2021-10-05 | Qwixel Therapeutics Llc | Fusion protein composition(s) comprising masked type I interferons (IFNA and IFNB) for use in the treatment of cancer and methods thereof |
| BR112022020440A2 (pt) | 2020-04-10 | 2022-12-27 | Cytomx Therapeutics Inc | Construtos de citocinas ativáveis e composições e métodos relacionados |
| BR112023018735A2 (pt) | 2021-03-16 | 2023-11-28 | Cytomx Therapeutics Inc | Construtos de citocinas ativáveis mascarados e composições e métodos relacionados |
| KR20230169700A (ko) | 2022-06-09 | 2023-12-18 | 제주대학교 산학협력단 | Trail을 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 |
| KR20240068191A (ko) | 2022-11-10 | 2024-05-17 | 제주대학교 산학협력단 | 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 |
| KR20240072614A (ko) | 2022-11-17 | 2024-05-24 | 제주대학교 산학협력단 | 감귤 무봉 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모증상의 예방 개선 또는 치료용 조성물 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| DE69635480T2 (de) | 1995-06-29 | 2006-08-17 | Immunex Corp., Thousand Oaks | Apoptosis induzierendes cytokin |
| CA2411967A1 (en) * | 2000-06-09 | 2001-12-20 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary Of The Departent Of Health And Human Services | Pegylation of linkers improves antitumor activity and reduces toxicity of immunoconjugates |
| DE60141992D1 (zh) * | 2000-09-05 | 2010-06-10 | Biosight Ltd | |
| DE10247755B4 (de) | 2002-10-14 | 2006-01-19 | Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. | Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine |
| US7666989B2 (en) | 2003-11-03 | 2010-02-23 | Beijing Sunbio Biotech Co., Ltd. | Recombinant protein having an anti-cancer effect, its encoding gene and uses thereof |
| ZA200800974B (en) | 2005-08-16 | 2009-11-25 | Genentech Inc | Apoptosis sensitivity to Apo2L/TRAIL by testing for 'GalNac-T14 expression in cells/tissues |
| WO2009002947A2 (en) | 2007-06-22 | 2008-12-31 | Affymax, Inc. | Compounds and peptides that bind the trail receptor |
| EP3072903B1 (en) * | 2007-07-10 | 2017-10-25 | Apogenix AG | Tnf superfamily collectin fusion proteins |
| CA3128656A1 (en) * | 2007-08-22 | 2009-02-26 | The Regents Of The University Of California | Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof |
| GB0723059D0 (en) | 2007-11-23 | 2008-01-02 | Nat Univ Ireland | Improved cytokine design |
| GB0724532D0 (en) | 2007-12-17 | 2008-01-30 | Nat Univ Ireland | Trail variants for treating cancer |
| WO2009086132A2 (en) | 2007-12-20 | 2009-07-09 | University Of Southern California | Design of spacers to increase the expression of recombinant fusion proteins |
| TW200950778A (en) | 2008-05-14 | 2009-12-16 | Genentech Inc | Methods of using Apo2L/TRAIL to treat cancer |
| LT2010012A (lt) | 2010-02-10 | 2011-08-25 | Uab Profarma, , | Granulocitus stimuliuojančio baltymo linijiniai oligomerai su prailginta in vivo gyvavimo trukme |
-
2011
- 2011-12-05 CN CN201180057053.1A patent/CN103237808B/zh active Active
- 2011-12-05 WO PCT/EP2011/071719 patent/WO2012072815A1/en active Application Filing
- 2011-12-05 US US13/989,969 patent/US9161991B2/en active Active
- 2011-12-05 KR KR1020137017194A patent/KR101952460B1/ko active IP Right Grant
- 2011-12-05 HU HUE11790636A patent/HUE027068T2/en unknown
- 2011-12-05 CA CA2814595A patent/CA2814595C/en active Active
- 2011-12-05 MX MX2013006213A patent/MX337436B/es active IP Right Grant
- 2011-12-05 AU AU2011334868A patent/AU2011334868B2/en active Active
- 2011-12-05 SG SG10201509676UA patent/SG10201509676UA/en unknown
- 2011-12-05 JP JP2013541381A patent/JP5759557B2/ja active Active
- 2011-12-05 NZ NZ609216A patent/NZ609216A/en unknown
- 2011-12-05 EA EA201390820A patent/EA024452B1/ru unknown
- 2011-12-05 PL PL11790636T patent/PL2646464T3/pl unknown
- 2011-12-05 DK DK11790636.2T patent/DK2646464T3/en active
- 2011-12-05 ES ES11790636.2T patent/ES2545895T3/es active Active
- 2011-12-05 PT PT117906362T patent/PT2646464E/pt unknown
- 2011-12-05 EP EP11790636.2A patent/EP2646464B1/en active Active
- 2011-12-05 ME MEP-2015-89A patent/ME02224B/me unknown
- 2011-12-05 SI SI201130524T patent/SI2646464T1/sl unknown
- 2011-12-05 RS RS20150407A patent/RS54057B1/en unknown
- 2011-12-05 BR BR112013013548A patent/BR112013013548B8/pt active IP Right Grant
- 2011-12-05 SG SG2013027479A patent/SG189370A1/en unknown
-
2013
- 2013-05-07 IL IL226207A patent/IL226207A/en active IP Right Grant
- 2013-05-13 ZA ZA2013/03449A patent/ZA201303449B/en unknown
- 2013-12-06 HK HK13113599.3A patent/HK1186192A1/zh unknown
-
2015
- 2015-06-18 HR HRP20150664TT patent/HRP20150664T1/hr unknown
- 2015-08-25 CY CY20151100743T patent/CY1116646T1/el unknown
- 2015-08-25 SM SM201500203T patent/SMT201500203B/xx unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Generation of a novel proform of tumor necrosis factor-related apoptosis-inuducing ligand (TRAIL) protein that can be reactivated by matrix metalloproteinase;Shin J N等;《Experimental cell research》;20060815;第312卷(第19期);第3892-3898页 * |
| TRAIL and interferon-alpha act synergistically to induce renal cell carcinoma apoptosis;Clark PE等;《Journal of urology》;20100901;第184卷(第3期);第1166-1174页 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103237808B (zh) | 抗癌融合蛋白 | |
| CN102958940B (zh) | 抗癌融合蛋白 | |
| CN103228788B (zh) | 抗癌融合蛋白 | |
| CN103920139B (zh) | 活化素‑actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途 | |
| CN103974711A (zh) | 抗癌融合蛋白 | |
| CN103987728B (zh) | 抗癌融合蛋白 | |
| CN112543767A (zh) | Pd1-4-1bbl变体融合蛋白及其使用方法 | |
| US9757473B2 (en) | Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same | |
| CN108137671A (zh) | 高亲和力的可溶性pdl-1分子 | |
| TWI579299B (zh) | 去整合蛋白變異體及其醫藥用途 | |
| CN103562220A (zh) | 抗癌融合蛋白 | |
| CN100393356C (zh) | 用于癌症治疗的经修饰的细胞因子 | |
| US20170252435A1 (en) | Combination | |
| CN115703840A (zh) | 抗Her-2抗体-粒细胞调节因子融合蛋白及其制法和应用 | |
| CN106046170A (zh) | 一种新型trail融合蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220715 Address after: PIVA, Poland Patentee after: Adamed pharmaceutical Co. Address before: warsaw Patentee before: ADAMED SP.Z.O.O |