KR20240068191A

KR20240068191A - 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240068191A
Application number: KR1020220149330A
Authority: KR
Inventors: 강희경; 강정일; 최윤경
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2024-05-17

Abstract

본 발명은 리모닌(Limonin)을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 용도{Composition for preventing, improving or treating hair loss symptoms, including limonin, and use thereof}

본 발명은 리모닌(Limonin)을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 몇 십 년 동안 탈모 치료를 위한 많은 연구가 진행되고 있지만, 아직도 탈모의 원인이 무엇인지는 정확히 알려져 있지 않다. 지금까지 밝혀진 탈모요인에 대한 내용을 살펴보면, 모발 주기 조절과 관련된 모유두(Dermal papilla)의 증식억제 또는 기능저하, 남성호르몬의 작용에 의한 모발주기의 비정상화, 두피로 공급되는 혈류량 저하로 인한 모발주기의 비정상적 변화, 항암제, 정신적 스트레스, 물리적 자극 및 환경오염 등이 거론되고 있다.

현재 미국식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)으로부터 승인받은 모발성장 촉진물질로는 미녹시딜(Minoxidil)과 피나스테리드(Finasteride)가 잘 알려져 있다.

미녹시딜은 처음에 고혈압 치료를 위한 혈관확장제로 개발되었으나, 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모제로 개발되었다. 미녹시딜의 발모효과에 대한 작용기전은 현재까지 명확히 밝혀지지 않았지만, 혈관확장을 통한 영양공급 증가, potassium channel opening 효과 및 모유두 진피 세포(Dermal papilla cells)의 아포토시스(Apoptosis) 억제 효능 등이 모발성장을 유도하는 것으로 판단하고 있다.

또한, 머크(Merck)사에서 개발한 피나스테리드는 남성호르몬 대사에 작용하는 효소인 5α-환원효소(5α-reductase)의 활성을 억제시키는 물질로서 전립선 비대증 치료제로 개발되었으나, 모발의 성장을 촉진시키는 것이 알려지면서 발모제로 개발되었다.

이외에도 다양한 연구기관에서 육모 및 탈모 기전에 관여하는 많은 조절 인자들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 성장기, 퇴행기, 휴지기의 모발주기에 관련된 여러 인자들과 그들의 수용체에 의한 신호전달에 의해 육모효과가 조절됨이 계속적으로 보고되고 있다. 예를 들어, 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈관내피세포성장인자 수용체(Vascular endothelial Growth factor receptor, VEGFR), 전환성장인자-β(Transforming growth factor-β, TGF-β) 및 전환성장인자-βR(TGF-βR) 등의 성장인자들이 모유두의 활성을 조절하여 모발주기에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 또한, bulge region에 있는 모낭 줄기세포의 증식 또는 분화에 윈트 신호전달(Wnt pathway) 및 골형성 단백질 신호전달(Bmp signaling)이 결정적으로 작용함이 밝혀지고 있다.

한편, 풋귤은 미성숙과로 hesperidin과 같은 flavonoid, pectin, carotenoid, vitamin 등 다양한 성분이 함유되어 있다. Kim 등에 따르면 미성숙 감귤은 성숙과에 비해 고기능성분인 flavonoid 함량이 높고, 항염(Choi), 항산화(Yu), 미백(Lee) 활성 등이 더 높은 것으로 알려져 있다. 반면에 탈모 활성에 대한 효능 평가는 전무한 상황이다.

본 발명자들은 풋귤의 과피로부터 추출할 수 있는 리모닌이 육모에 미치는 영향을 규명하고 그 기전을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1952460호(2019.02.27. 공고)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

일 양태에서 본 발명은 리모닌(Limonin)을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 약학 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있다.

본 발명의 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물은 모유두 세포 증식을 나타낼 수 있다.

다른 양태에서 본 발명은 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방 또는 개선용 기능성식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 기능성식품 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있다.

본 발명은 모유두 세포의 증식을 촉진하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 3D 배양된 모유두 세포의 증식 효과를 나타낸 결과이다.
도 2는 리모닌의 PI3K/Akt 신호전달 경로를 통한 3D 배양 모유두 세포의 증식 효능을 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 실시형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시형태에 한정되지 않는다. 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 동일한 도면 부호를 붙였다.

또한, 본 발명에서 수치와 관련하여 용어 “약(about)”, “대략(approximately)” 또는, 적어도(at least)와 같은 유사한 표현이 사용되는 경우, 해당 수치를 기준으로 ±10%, ±7%, ±5%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%의 이론적, 실험적, 통계적, 또는 경험칙상의 오차가 허용되는 것으로 의도된다.

본 발명자는, 예의 연구 결과, 리모닌이 모유두 세포의 증식을 촉진하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. 이에 따라 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용으로 적용할 수 있는 약학, 기능성식품 및 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "리모닌(limonin)"은 감귤류의 쓴맛 성분인 리모노이드(limonoid)의 주요성분의 하나로 1960년 Arigoni 등에 의해 구조식이 결정되었으며, 분자식은 C₂₃H₃O₆이며, 분자량은 417인 화합물을 의미한다. 리모닌과 관련된 연구로는 뇌신경 보호 효과, 항바이러스 효과 및 직장암세포의 성장을 억제하는 항암효과 등이 알려져 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 양태에서, 본 발명은 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 약학 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3~5㎍/㎖의 리모닌, 더욱 바람직하게는 4.7㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있다.

본 발명에서 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학 조성물은 세포증식의 주요 조절자인 Akt의 인산화를 증가시켜 모유두 세포 증식을 나타낼 수 있으며, 이로부터 탈모를 방지하고, 모발 성장을 촉진할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '모유두 세포"는 모낭의 기저에 위치한 중배엽유래의 섬유아세포로서, 모낭의 모기질 세포와 상호작용을 통해 모발의 성장에서 중요한 역할을 한다.

본 발명에서 약학 조성물은 유효성분 이외의 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에서 약학 조성물은 약학으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에서 약학 조성물은 개별로 투여하거나 다른 약물과 병용하여 투여될 수 있고, 병용 투여시 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001~1,000mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05~200mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1~100mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3~5㎍/㎖의 리모닌, 더욱 바람직하게는 4.7㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있다.

본 명세서의 탈모 증상의 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어컨디셔너, 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 모발영양화장수, 헤어에센스, 헤어스프레이, 헤어팩, 바디샴푸, 화장수, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일, 클렌징 폼, 및 비누로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상으로 제형화될 수 있으며, 바람직하게는 헤어샴푸일 수 있다.

또한, 전술한 제형의 탈모 증상의 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 각종 제형에 따라, 또는 최종 목적에 적합하게 통상의 화장료 조성물에 배합되는 각종 성분들을 더 포함할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 통상적인 화장료 조성물에 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 본 발명에서 탈모 증상의 예방 또는 개선용 화장료 조성물이 헤어 샴푸의 제형인 경우, 본 발명에서 탈모 증상의 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 음이온성 계면활성제, 양성(兩性) 계면활성제, 점증제, 방부제, pH조절제, 향료, 안료, 기타 컨디셔닝 성분을 더 포함할 수 있다.

음이온성 계면활성제로는 통상적인 화장료 조성물에 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 알킬 설페이트, 에톡실화 알킬 설페이트, 알킬 에톡시 카르복실레이트, 알킬 글리세릴 에테르 설포네이트, 에톡시에테르 설포네이트, 메틸 아실 타우레이트, 알킬 설포숙시네이트, 알킬 에톡시설포숙시네이트, 알파-설포네이트화 지방산, 이들의 염 및/또는 이들의 에스테르, 알킬 포스페이트 에스테르, 에톡실화 알킬포스페이트 에스테르, 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트, 파라핀 설포네이트, 알파 올레핀 설포네이트 및 알킬 알콕시설페이트로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 화합물일 수 있다.

음이온성 계면활성제의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 50중량%일 수 있다. 음이온성 계면활성제의 함량이 1중량% 미만인 경우에는 계면활성제 자체의 효과를 발휘할 수 없고, 50중량% 초과인 경우에는 인체에 대한 자극을 유발할 수 있다.

양이온성 계면활성제로는 통상적인 화장료 조성물에 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 이미다졸린계 양성 계면활성제(2-운데실-N,N,N-(히드록시에틸카르복시메틸)-2-이미다졸린나트륨, 2-코코일-2-이미다졸리늄히드록사이드-1-카르복시에틸옥시2나트륨염 등); 베타인계 계면활성제(2-헵타데실-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄베타인, 라우릴디메틸아미노아세트산베타인, 알킬 베타인, 아미드베타인, 설포베타인 등)등을 사용할 수 있다.

점증제로 양이온 폴리머를 더 포함할 수 있으며, 양이온 폴리머는 통상적인 화장료 조성물에 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 히드록시에틸 셀룰로오즈의 폴리머릭 쿼터너리 암모늄염류 및 구아히드록시피르필트리암모늄 클로라이드류 등을 사용할 수 있다. 양이온 폴리머는 화장료 조성물에서 헤어의 컨디셔닝 효과, 머리카락 표면을 부드럽게 해주는 효과, 기포력 향상, 거품의 탄력성 등 목적하는 효과를 부여하기 위해 적당한 것을 선택하거나 조합하여 사용할 수 있다. 양이온 폴리머의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~1.0중량%, 바람직하게는 0.1~0.5중량%일 수 있다. 양이온 폴리머의 함량이 0.01중량% 미만이면 효과를 기대할 수 없고, 1.0중량%를 초과하면 점도를 제어하기 어려워 피부 또는 모발에 과도하게 부착되어 사용감이 현저히 감소할 수 있다.

방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산 나트륨, 메틸클로로이소치아졸리논, 메틸이소치아졸리논 및 소듐벤조에이트로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

pH 조절제로는 인산나트륨, 인산이나트륨, 구연산 및 구연산나트륨으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

기타 컨디셔닝 성분으로는 통상적인 화장료 조성물에 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 사이클로 메치콘, 디메치콘(디메칠 폴리실록산), 디메치콘코폴리올, 알킬디메치콘코폴리올, 실리콘에스터, 플루오로디메치콘, 알킬디메치콘, 디메치콘 코폴리올아민, 카르복시실리콘, 아모디메치콘 및 실리콘 쿼츠를 포함하는 실리콘 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 컨디셔닝 성분의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5.0중량%일 수 있으며, 컨디셔닝 성분의 함량이 0.01중량% 미만이면 컨디셔닝 효과를 기대하기 어렵고, 5.0중량%를 초과하면 제형의 불안정화로 인한 품질 저하가 우려될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선용 기능성식품 조성물을 제공한다.

상기 기능성식품 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3~5㎍/㎖의 리모닌, 더욱 바람직하게는 4.7㎍/㎖의 리모닌을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “기능성식품”은 기능성식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명에서 기능성식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

“식품 첨가물 공전”에 수록된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등일 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 기능성식품 조성물은 본 발명의 리모닌을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한, 정제 형태의 기능성식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

본 발명에서 기능성식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제, 과립제 또는 액제 형태로 제조될 수 있으며, 예로 음료류, 육류, 초콜릿, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등의 형태로 사용할 수 있고, 통상적인 의미에서의 기능성식품 조성물을 모두 포함한다.

본 발명에서 캡슐 형태의 기능성식품 조성물 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명의 리모닌을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 사간 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에서 환 형태의 기능성식품 조성물은 리모닌과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

본 발명에서 과립 형태의 기능성식품 조성물은 리모닌과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 재료의 준비

리모닌은 Sigma(MO, USA)사로부터 입수하였다.

100 units/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin 및 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)은 Gibco Inc(NY, USA)에서 구입하였고, DMEM은 Hyclone Inc(USA)로부터 입수하였다.

양성 대조군인 minoxidil은 Sigma(MO, USA)사로부터, wortmannin은 Invitrogen(CA, USA)로부터 입수하였다. WST dye는 Daeil Lab Service(Seoul, Korea)로부터 입수하였다.

VERSAmax microplate reader로 Molecular Devices(CA, USA)를 사용하였다.

PVDF (polyvinylidene fluoride) membranes는 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)로부터 입수하였으며, ECL 기질은 Intron(Seoul, Korea)로부터 입수하였으며, X-ray film은 AGFA(Mortsel, Belgium)로부터 입수하였다.

2. 시료의 준비

리모닌은 DMSO에 투입하고 완전히 용해될 때까지 교반하여 조성물 1㎖ 당 리모닌의 농도가 0.47, 4.7 및 9.4㎍인 시료를 각각 제조하였다.

풋귤과피 추출물은 건조된 과피를 70중량% 에탄올로 추출하고 농축한 후 동결건조하였다. 이후 DMSO에 투입하고 완전히 용해될 때까지 교반하여 조성물 1㎖ 당 리모닌의 농도가 0.47, 4.7 및 9.4㎍인 시료를 각각 제조하였다.

양성대조군인 minoxidil은 0.12 mM HCl로 녹여 10 μM의 농도로 제조하였다.

3. 모유두 세포의 배양

흰쥐 수염에서 분리한 불멸화된 모유두 세포(Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell, Filsell W, et al., 1994)를 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)과 100 unit/ml 페니실린-100 μg/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 2-3일에 한 번씩 계대배양 하였다.

4. 통계처리

모든 측정 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 검증은 student's t-test로 검증하였으며, p-value가 0.05 이하인 경우 유의성을 인정하였다. 통계처리는 Sigma Stat software (Jandel Scientific Software, USA)를 사용하였다.

시험예 1: 3D 배양 모유두세포의 증식 효능 분석

모유두세포의 증식은 WST assay를 이용하여 측정하였다.

모유두세포(3.0×10³ cells/well)를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 3D 배양용 96 well plate에 투입한 다음 48시간 배양 후 0.47, 4.7 및 9.4㎍/㎖ 농도의 풋귤과피 70중량% 에탄올 추출물과 리모닌을 각각 처리하였으며, 양성 대조군인 minoxidil은 0.12mM HCl로 녹여 10μM의 농도로 처리하였다.

또한, PI3K 억제제인 wortmannin 대한 리모닌의 효과를 확인하기 위하여 PI3K 억제제인 wortmannin(10nM)을 2시간 전처리하고 리모닌(10μM)을 처리하였다. 72시간 동안 배양한 후 10㎕의 WST dye을 첨가하고 3시간 동안 반응시킨 다음 VERSAmax microplate reader를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식 정도를 평가하였다.

도 1을 참조하면, 풋귤과피 70중량% EtOH 추출물을 0.47, 4.7 및 9.4 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 103.0±6.5%, 103.0±5.8% 및 100.3±6.6%의 증식률을 확인할 수 있으며, 리모닌을 0.47, 4.7 및 9.4 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 107.7±6.3%, 118.9±4.3% (p<0.001) 및 99.9±4.5%의 증식률을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히, 리모닌 4.7㎍/㎖(약 10 μM)에서 대조군(100.0±3.3%)에 비하여 3D 배양된 모유두세포의 성장을 유의하게 증가시켰으며, 양성대조군인 minoxidil(10 μM)의 118.7±10.1% (p<0.05)과 비슷한 모유두세포 증식 효과를 나타내었다. 즉, 본 발명의 리모닌을 유효성분으로 포함하는 조성물이 모유두세포 증식 작용으로 육모를 촉진하는 효과를 나타내는 것은 물론, 풋귤과피 추출물보다 우수하고, minoxidil과 유사한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

시험예 2: PI3K/Akt 신호전달 경로를 통한 3D 배양 모유두세포의 증식 효능 분석

모유두 세포에서 리모닌의 Akt 인산화/활성화를 통해 세포사멸 저해 및 세포 증식 증가 효과를 확인하였다.

모유두세포(3.0×10³ cells/well)를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 3D 배양용 96 well plate에 투입하고 48시간 배양한 다음 리모닌(4.7μg/mL)을 처리하여 0~6 시간 동안 배양하였다. PI3K 억제제인 wortmannin 대한 리모닌의 효과를 확인하기 위하여 PI3K 억제제인 wortmannin (10 nM)을 2시간 전처리하고 리모닌(4.7μg/mL)을 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 3D 배양된 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척한 후 100 μl의 lysis buffer[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₃, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 25 μg/mL aprotinin, 25 μg/mL leupeptin and 1% NP-40]를 첨가한 다음, 4℃에서 30분 동안 lysis하였다. Cell lysate는 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고 실험에 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다.20-30μg의 lysate를 8-12% mini gel SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 변성분리하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) membranes으로 200mA에서 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% non-fat dried milk가 함유된 Tween-20-TBS(T-TBS) (50 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액에서 2시간 동안 실시하였다.

Membrane은 여러 단백질의 발현을 조사하기 위해 phospho-Akt(1:1000), Cyclin D1(1:1000) 그리고 β-Actin(1:5000)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 실시하였다. Secondary antibody는 HRP(Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG 를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 진행하였다. 그 다음 T-TBS로 membrane을 3회 세척한 후, ECL 기질로 1분 동안 반응시킨 다음 X-ray film에 감광하였다.

도 2를 참조하면, 리모닌은 6시간에서 세포증식의 주요 조절자인 Akt의 인산화를 증가시키는 것을 확인할 수 있다(도 2A). 또한, 리모닌의 모유두세포 증식 증가 효과가 PI3K/Akt 신호전달 경로를 통해 조절되는지 확인하기 위해, 3D 배양 모유두세포에 wortmannin(10 nM)을 2 시간 전처리 후 리모닌(5, 10 μM)을 처리하여 72 시간 동안 배양하였다. 그 결과, 10 μM 농도에서 리모닌에 의한 3D 배양 모유두세포 증식 증가가 wortmannin 전처리에 의하여 저해되는 것을 확인할 수 있다(도 2B)

PI3K/Akt 신호전달의 활성화에 의해 세포주기 단백질의 발현 변화가 일어나는지 알아보기 위해, 3D 배양 모유두세포에 wortmannin(10 nM)을 2 시간 전처리하고 리모닌(10 μM)을 처리하여 24 시간 동안 배양하여 세포주기 조절 단백질의 하나인 cyclin D1의 발현 변화를 분석하였으며, 그 결과 리모닌에 의한 cyclin D1 단백질 발현 증가가 wortmannin에 의해 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 2C).

이러한 결과는 리모닌이 모발 성장의 주요 조절자로 알려진 모유두세포에서 PI3K/Akt 신호전달의 활성화를 통해 3D 배양 모유두세포의 증식 증가 효능을 나타냄을 시사한다.

Claims

리모닌(Limonin)을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물
제1항에 있어서,
모유두 세포 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방, 개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
리모닌을 유효성분으로 포함하는 탈모 증상의 예방 또는 개선용 기능성식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 기능성식품 조성물은 0.1~7.0㎍/㎖의 리모닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성식품 조성물.