KR102073337B1 - 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 후피향(Ternstroemia kwangtungensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 후피향 추출물이 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진에 유의적인 효과를 확인함으로써, 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진에 유용한 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물 용도에 적용할 수 있다.
본 발명의 후피향 추출물이 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진에 유의적인 효과를 확인함으로써, 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진에 유용한 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물 용도에 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 후피향(Ternstroemia kwangtungensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 후피향 추출물이 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진에 효과를 가지므로, 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진에 유용한 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물 용도에 관한 것이다.
최근 급속한 경제성장과 생활수준의 향상으로 사람들의 삶의 질은 향상되었으나 이에 따른 공해와 환경오염의 발생으로 인해 현대인들은 외부의 자극과 각종 질병에 노출되어 있다.
특히, 모발과 관련해 국소감염, 유전적 소인, 내분비 장애 등에 의해 탈모증이 발병된다고 밝혀졌으나, 최근의 연구에서는 스트레스, 환경오염에 의한 부작용, 화학적 제품에 의한 부작용 등 탈모에 관련한 다양한 요인들이 작용하는 것으로 보고되고 있다.
탈모의 유발 기전 중에서도 스트레스 등 환경에 의해 면역세포와 호중구가 활성화되어 염증반응을 일으키게 되고 모낭 조직을 파괴하여 모발세포의 세포사를 유발하여 탈모가 진행되게 된다.
현재 모발성장 촉진제제로서 FDA에서 승인한 미녹시딜(minoxidil, 경피도포제)과 피나스테리드(finasteride, 경구복용제) 두 종류가 있다.
미녹시딜은 항고혈압용 경구약제로 사용되었으나 이 약제를 복용한 환자에서 다모증이 나타나는 것이 관찰되어 현재 두피 도포용으로 남성형 탈모증에 사용되고 있다.
이러한 미녹시딜은 피리미딘(pyrimidine) 유도체로 두피의 혈관을 확장시켜 국소적으로 혈류를 증가시키고 모모세포를 활성화시켜 탈모진행을 더디게 하여, 솜털을 자라나게 하는 효과가 있어 현재 탈모치료제로 널리 사용되고 있다.
또한, 피나스테리드는 타입 Ⅱ 5α-환원효소(reductase)를 억제함으로써 탈모를 예방하고 모발의 성장을 증진시키는 남성형 안드로겐성 탈모증 치료에 대한 최초의 경구치료제로서 1997년 FDA 승인 후 현재 전 세계 약260만 명이 사용하고 있다.
그러나 여러 임상연구보고에 따르면, 미녹시딜은 50% 이하의 환자에서만 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 탈모효과는 있으나 사용을 중단할 경우에는 다시 탈모가 진행되는 문제가 있다.
이외에도 미녹시딜은 체중증가, 부종, 심장박동 증가, 협심증, 피부염, 가려움증 등의 부작용이 있고, 피나스테리드의 경우 역시 남성 성기능 장애, 기형아 출산 등의 심각한 부작용이 임상사례로 보고된바 있다.
이러한 이유로, 상기 발모촉진제의 경우 사용이 제한적이거나 환자들 스스로가 약물에 대한 거부감을 나타내는 문제점이 있다.
따라서 인체에 무해한 천연소재로부터 탈모 예방물질에 대한 소비자들의 관심이 점차 높아짐에 따라, 천연식물소재나 한약재성분으로부터 추출된 추출물이 부작용이 거의 없으면서 탈모 방지, 발모 촉진 및 두피 개선 목적으로 일례로 꾸준히 보고되고 있다[특허문헌 1 내지 3].
이에, 본 발명자들은 종래 발모촉진제의 부작용을 최소화하기 위한 노력의 일환으로서, 천연식물군을 탐색하던 중 후피향 추출물이 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진 효과가 있음을 규명하고, 후피향 추출물을 유효성분으로 함유한 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물의 용도를 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 후피향 추출물을 유효성분으로 함유한 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 후피향 추출물을 유효성분으로 함유한 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 후피향 추출물을 유효성분으로 함유한 탈모방지 또는 발모 촉진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 후피향 추출물이 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진에 효과가 있음을 규명함으로써, 이를 유효성분으로 함유한 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제1실시형태로서, 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물에 있어서, 바람직하게는 후피향 추출물은 0.01 내지 30μM 농도로 함유되는 것이다.
상기 약학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된 제형으로 적용될 수 있다.
본 발명의 제2실시형태로는, 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 조성물에 있어서, 후피향 추출물은 0.01 내지 30μM 농도로 함유되는 것이다.
상기 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 제형에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 제3실시형태는 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료에서 선택된 어느 하나의 형태로 가공될 수 있다.
본 발명에 따른 후피향 추출물을 유효성분으로 함유한 조성물은 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진에 효과를 제공한다.
따라서, 본 발명의 후피향 추출물을 함유하는 조성물은 약학, 화장품, 식품 및 미용 등의 분야에서 다양하게 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 후피향 추출물의 농도별에 따른 인간 모낭의 모두유 세포에서의 세포 성장 결과이고,
도 2는 본 발명의 후피향 추출물의 농도별에 따른 TCF-루시퍼라제 활성평가 결과이고,
도 3은 본 발명의 후피향 추출물에 의한 인간 모낭의 모두유 세포에서의 mRNA 발현 결과를 도시한 것이고,
도 4는 본 발명의 후피향 추출물에 의한 세포의 주요 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과이고,
도 5는 본 발명의 후피향 추출물에 의한 모낭형성의 대비사진이다.
도 2는 본 발명의 후피향 추출물의 농도별에 따른 TCF-루시퍼라제 활성평가 결과이고,
도 3은 본 발명의 후피향 추출물에 의한 인간 모낭의 모두유 세포에서의 mRNA 발현 결과를 도시한 것이고,
도 4는 본 발명의 후피향 추출물에 의한 세포의 주요 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과이고,
도 5는 본 발명의 후피향 추출물에 의한 모낭형성의 대비사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 후피향(Ternstroemia kwangtungensis) 추출물이 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진 효과를 규명함으로써, 탈모 방지 및 발모 촉진을 위한 천연식물로부터 유래된 소재의 신규한 용도를 제공한다.
본 발명의 후피향 나무는 우리나라 남해안 제주도, 중국, 일본, 필리핀, 베트남 등에 자생하는 상록 활엽수로, 붉은 열매가 아름답고 잎이 윤택이 나며 온도나 채광에 따라 붉게 물들기도 하여 주로 정원수나 관상용 나무로 사용되어 왔다.
후피향은 급체 및 치질에 대한 약용으로 사용되어 왔으며, 후피향 잎에 항산화 성분이 포함된 것으로 알려져 있다.
또한, 본 출원인은 최근 베트남 후피향 식물의 줄기 또는 잎 추출물에 대한 산화적 스트레스를 감소시키는 ARE(antioxidant response element) 유도 및 Nrf2 유전자 발현 증가 효과를 발견하고 아토피 예방, 개선 및 치료용 조성물을 출원 진행한 바 있다[특허출원번호 제2018-0021280호].
다만, 본 발명의 실시예에서는 후피향 잎 추출물에 한정하여 설명하고 있으나, 줄기 부위도 포함될 수 있을 것이며, 본 발명의 후피향 추출물은 추출용매 및 추출시간에 특별한 제한없이 통상의 추출방법으로 수득할 수 있다.
도 1은 본 발명의 후피향 추출물의 농도별에 따른 인간 모낭의 모두유 세포에서의 세포 성장 결과로서, 인간 모낭의 모두유 세포(HHDFP)가 농도의존적으로 성장함을 확인할 수 있다.
도 2는 본 발명의 후피향 추출물의 농도별에 따른 TCF-루시퍼라제 활성평가를 나타낸 결과로서, 농도의존적으로 TCF-루시퍼라제 활성 증가를 확인함으로써, 본 발명의 후피향 추출물이 인산화에 의한 β-카테틴(catenin)의 분해를 억제하며 또한, β-카테틴(catenin)을 활성화하여 모두유 세포 성장을 촉진하는데 관여함을 뒷받침한다.
도 3은 본 발명의 후피향 추출물에 의한 인간 모낭의 모두유 세포에서의 mRNA 발현 결과를 도시한 것으로서, 모두유 세포 성장조절 mRNA의 발현이 증가되었고, 도 4의 후피향 추출물에 의한 세포의 주요 단백질 발현 결과에서, 후피향 추출물에 의해 β-카테틴(catenin) 단백질 발현이 증가하면서 인산화 β- 카테틴(catenin)의 발현 감소와 세포 성장에 주요 단백질인 ERk 활성 증가를 제시하고 있다.
또한, 도 5는 본 발명의 후피향 추출물에 의한 모낭형성 결과로부터, 후피향 추출물 3.0uM 처리시, 모낭 형성능이 증가를 확인할 수 있다.
이상으로부터, 본 발명은 후피향 추출물은 모유두 세포 증가 및 세포성장 촉진에 효과가 가지므로, 이를 유효성분으로 함유한 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물로서 약학, 화장품, 식품 및 미용 등의 분야에서 유용할 것이다.
구체적으로, 본 발명의 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제1실시형태로는 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 본 발명의 실시예에서 후피향 추출물의 농도별 실험결과를 토대로 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물에 있어서, 후피향 추출물은 0.01 내지 30μM 농도로 함유되는 것이 바람직하다.
상기 농도범위는 인간 모낭의 모두유 세포에서의 세포 성장 결과를 근거하여 설정되며, 더욱 바람직하게는 1 내지 30μM, 가장 바람직하게는 1 내지 10μM로 함유하는 것이다.
이때, 약학적 조성물로서의 적용제형은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택되는 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다.
본 발명의 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제2실시형태로서, 본 발명은 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물은 후피향 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
이때, 상기 후피향 추출물 성분은 0.01 내지 30μM 농도로 함유되는 것이고, 상기 0.01μM 미만의 농도라면, 탈모방지 또는 발모 촉진 효과가 미흡하고, 30μM 를 초과하면, 기대하는 효과보다 피부 자극을 초래할 수 있고, 제형 상의 문제점이 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 당 업계에서 적용되는 제형에 적용될 수 있을 것이다. 그 일례로는 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 헤어토닉, 모발 영양화장수, 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어린스, 헤어샴푸 및 헤어로션으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물의 제3실시형태로서, 본 발명은 후피향 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물에는 후피향 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 일례로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스 등의 디사카라이드; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드를 포함하는 통상의 당 성분, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜이다.
또한, 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강 보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 후피향 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 후피향 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 탈모 방지, 발모 촉진 및 두피 개선을 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 탈모 방지, 발모 촉진 및 두피 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있는 건강기능식품을 포함한다.
본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 상기 후피향 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 상기 후피향 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 후피향 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 상기 후피향 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 상기 후피향 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 후피향 잎 추출물 제조 1
후피향(Ternstroemia kwangtungensis) 잎에 중량 기준으로 15 배의 50% 에탄올을 첨가하고, 50℃에서 3시간 동안 추출한 후, 0.3㎛ 필터로 여과하여 60℃에서 농축한 고형분을 얻었다. 상기 농축 고형분 0.5중량%에 30중량%의 1,3-부티렌 글리콜로 희석하여 0.22㎛ 필터로 여과하여 후피향 잎 추출물을 제조하였다.
<실시예 2> 후피향 잎 추출물 제조 2
추출용매로서 50% 에탄올 대신에 정제수룰 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 후피향 잎 추출물을 제조하였다.
<실험예 1>
단계1: 세포 배양
본 발명에 사용된 인간 모낭의 모두유 세포(Human hair dermal follicle papilloma cells, 이하 HHDFP 라 함)는 제품(abm, Richmond, BC, Canada)을 사용하고, 3T3-WNT 세포주는 제품(Enzo life science, Lausen, switzerland)을 구입 사용하였다. 상기 세포들은 질소 탱크에 보관 전에 세포유전학적으로 시험하고 입증하였다.
상기 HHDFP 세포는 페니실린과 스트렙토마이신(100 units/㎖) 및 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 유지되었다. 또한, 3T3-WNT 세포주는 퓨로마이신(puromycin; 3ug/㎖), 스트렙토마이신(100 units/㎖) 및 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 유지되었다.
단계 2: 세포 성장 분석
HHDFP 세포는 96-웰 플레이트(1×104 cells/well)에 접종하였다. 72시간 후, 세포들은 적절한 농도의 후피향 추출물로 표시된 시간 동안 처리하였고(DMSO를 대조군으로 사용), 세포 성장은 키트(CellTiter Glo® luminescent cell viability kit)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 상기 방법은 세포 내 루시퍼라제 반응을 통한 ATP 측정을 기반으로 하고 있는데, 상기 산물은 생존 세포의 수와 비례한다. 이때, 세포 증식 억제율은 하기 식에 의해 산출되었다.
수학식 1
세포 증식 억제율 = (실험군의 상대 발광 정도/대조군의 상대 발광 정도)×100
세포 생존능을 간접적으로 반영하는 발광 정도는 LuBi luminometer (Berthold TEC GmbH & Co., Oak Ridge, TN, USA)로 측정하였다. 모든 실험은 적어도 3번 이상 반복하였고, 평균값은 표준편차와 함께 표시하였다.
도 1은 본 발명의 후피향 추출물의 농도별에 따른 인간 모낭의 모두유 세포에서의 세포 성장 분석결과로서, 모발(Hair) 세포에서 후피향 추출물의 모발 성장에 미치는 영향을 보기 위해 세포의 ATP를 측정하는 CellTiter Glo® luminescent cell viability kit를 사용한 결과, 후피향 추출물을 농도별로 72시간 처리했을 때 대조군(DMSO 사용) 대비, HHDFP 세포의 성장이 유의성있게 농도의존적으로 성장함을 확인하였다.
<실험예 2> 루시퍼라제(luciferase) 활성 측정
TCF-루시퍼라제 구조체로 형질 감염된 3T3-WNT 세포는 96-웰 플레이트에 2×104 세포수로 접종하였고, 퓨로마이신(puromycin; 3ug/㎖) 및 5% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 유지되었다. 그 후, 3T3-WNT 세포는 WNT3a 단독 또는 후피향 추출물과 혼합하여 24시간 동안 노출시켰다. 세포 용해 후, 최종 루시퍼라제 활성은 루미노미터(luminometer)를 통해 측정하였다. 모든 실험은 적어도 3번 이상 반복하였고, 평균값은 표준편차와 함께 표시하였다.
도 2는 본 발명의 후피향 추출물의 농도별에 따른 TCF-루시퍼라제 활성평가결과를 나타낸다.
모발 발생과정에는 여러 가지 물질이 관여하는데, 모낭 발생의 첫 번째 신호는 진피 쪽에서 온다고 알려져 있으며 β-카테틴(catenin)이 가장 중요한 물질로 추정된다. 또한 LEF/TCF, WNT 신호도 첫 번째 신호에 관여한다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 후피향 추출물이 WNT 신호 전달(signaling) 활성을 통해 β-카테틴(catenin)을 증가시켜 전사인자인 TCF의 활성을 유도하는지를 평가하기 위하여, TCF-루시퍼라제 유전자가 안정적으로 발현되게 만들어진 3T3-WNT 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 후피향 추출물은 농도의존적으로 TCF-루시퍼라제 활성이 증가하였다. 특히, 후피향 추출물 10uM에서 대조군에 비해 약 2.4배 증가된 결과를 보였다.
본 결과로부터 후피향 추출물은 인산화에 의한 β-카테틴(catenin)의 분해를 억제하며 또한 β-카테틴(catenin)을 활성화하여 모두유 세포 성장을 촉진하는데 관여함을 뒷받침한다.
<실험예 3> RNA 분리 및 실시간 정량 PCR
HHDFP 세포(5×105 cells/well)를 6-웰 플레이트에 접종하였고, WNT3a 단독 또는 후피향 추출물(10μM)과 혼합하여 72시간 동안 노출시켰다. 그 후, 키트(Aurum total RNA mini kit, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다.
1μg의 총 RNA를 이용하여 MMLV-RTase(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 유전자증폭기(GeneAmp PCR 9700 thermocycler, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 β-카테틴(catenin), GSK-3b, Lef/TCF, BCL-2, BAX, SOP-9 및 GAPDH PCR 프라이머로 증폭시켰다.
PCR 산물은 1X TAE buffer을 이용하여 1% 아가로스 젤을 통해 분석하였다. 상대적 mRNA 수준은 분석기기(myECL imager analysis software, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 정량하였다.
사이토카인들의 정량적 유전자 발현 수준은 CFX96 Touch PCR system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 상에서 SYBR Green reagents (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 측정하였다. 상대적 표적 유전자 발현은 GAPDH 수준으로 표준화한 후에 측정하였다. 각각의 실험에 있어서, 2번의 독립적인 실험을 3번 반복하여 결과를 계산하였다. RT-PCR을 위한 프라이머쌍은 다음과 같다.
GAPDH forward 5'-TGGCAAATTCCATGGCAC-3', reverse 5'-CCATGGTGGTGAAGACGC-3'; b-catenin forward 5'-CCCACTAATGTCCAGCGTTT-3', reverse 5'-AACCAAGCATTTTCACCAGG-3'; GSK-3b forward 5'-AACTGCCCGACTAACAACAC-3', reverse 5'-ATTGGTCTGTCCACGGTCTC-3'; Lef/TCF forward 5'-AATCATCCCGGCCAGCA-3', reverse 5'-TGTCGTGGTAGGGCTCCTC-3'; BCL-2 forward 5'-AGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGAC-3', reverse 5'-AGATAGGCACCCAGGGTGATGCAAGCT-3'; BAX forward 5'-AAGCTGAGCGAGTGTCTCAAGCGC-3', reverse 5'-TCCCGCCACAAAGATGGTCACG-3'; SOX9 forward 5'- AGACCTTTGGGCTGCCTTAT-3', reverse 5'-TAGCCTCCCTCACTCCAAGA -3'.
<실험예 4> 웨스턴 블랏 분석
적절한 처리 후, 세포들은 세포 용해 완충액(20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM b-glycerophosphate, 1 mM sodium vanadate, 1 mg/ml leupeptin 및 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF))으로 얼음에서 30분 동안 파괴하였다. 20,817g로 15분 동안 원심 분리한 후, 상등액을 얻었고, 단백질 농도를 측정하였다. 전체 세포 단백질 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분리되었고, 150mM 글리신(glycine) 및 20% (v/v) 메탄올이 함유된 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)에서 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF) 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인은 0.05% 트윈 20이 함유된 1x TBS (TBS-T buffer)에 녹인 5% 비지방 건조 밀크로 차단하였고, 적절한 항체들로 반응시켰다. 블랏들은 1x TBS-T buffer로 3번 씻어낸 후, 적절한 HRP-linked IgG로 반응시켰다. 혼성화된 단백질들은 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시스템을 이용하여 가시화하였다.
도 3은 본 발명의 후피향 추출물에 의한 인간 모낭의 모두유 세포에서의 mRNA 발현 결과를 도시한 것이다.
모두유 세포 성장을 억제하는 TGF-β 및 성장을 촉진하는 WNT3a를 대조군으로 하고, 본 발명의 후피향 추출물에 의한 주요 성장 및 억제 조절 mRNA 발현을 관찰하였다.
그 결과, TGF-β에 의해 β-카테틴(catenin)의 분해를 유도하며, 특히 BAX 발현이 높고 BCL-2 발현이 낮아지는 결과를 보였다.
그러나 TGF-β에 WNT3a을 처리시 β-카테틴(catenin)의 발현과 동시에 TCF와 BCL-2 발현이 증가됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 후피향 추출물은 모두유 세포 성장조절 mRNA의 발현이 증가됨으로써 성장을 촉진함을 알 수가 있었다.
도 4는 본 발명의 후피향 추출물에 의한 세포의 주요 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3의 mRNA 발현과 같이 단백질 발현 양상을 관찰한 결과, 후피향 추출물에 의해 β-카테틴(catenin) 단백질 발현이 증가하면서 인산화 β-카테틴(catenin)의 발현은 감소하였고, 세포 성장에 주요 단백질인 ERk 활성이 높아짐을 확인하였다.
<실험예 5> 동물 실험
생쥐의 피부로부터 진피층(dermal)과 상피층(epidermal)을 분리하여 각각으로부터 세포를 분리한 후, 95% O2, 5% CO2와 37℃의 조건하에서 각 세포의 선택배지(DMEM과 EpiLife 배지)에서 유지하였다. 분리한 진피세포에 후피향 추출물을 농도별로 처치하고 48시간 배양하였다. 분리한 상피세포와 혼합하여 누드마우스의 등쪽 피부에 주사기로 주입하고 2주 후, 형성된 모낭을 현미경으로 관찰하여 사진촬영을 한 후, 형성된 모낭 개수를 측정하여 모낭형성능 증대 여부를 평가하였다.
도 5는 본 발명의 후피향 추출물에 의한 모낭형성의 대비사진이고, 하기 표 1은 진피세포에 후피향 추출물을 각각 0.3μM 또는 3μM 농도별로 처리하여 모낭 형성능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
그 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 평균 128개의 모낭이 형성되는 반면, 후피향 추출물 0.3μM 농도로 처리한 군에서는 평균 101개, 후피향 추출물을 3.0μM 농도로 처리했을 경우에는 평균 206개로 확인되었다. 따라서, 후피향 추출물을 고농도로 처리했을 때 모낭 형성능이 증가함을 확인하였다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
Claims (9)
- 후피향(Ternstroemia kwangtungensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 후피향 추출물이 모유두 세포 증가 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 후피향 추출물이 조성물에 0.01 내지 30μM 농도로 함유된 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물.
- 후피향(Ternstroemia kwangtungensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 후피향 추출물이 조성물에 0.01 내지 30μM 농도로 함유된 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 후피향(Ternstroemia kwangtungensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 식품 조성물이 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료에서 선택된 어느 하나의 형태로 가공된 탈모 방지 또는 육모 촉진용 식품 조성물.
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