BR112013013548B1 - Proteína de fusão anticancerígena - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE FUSÃO ANTICANCERÍGENA Uma proteína de fusão compreendendo o domínio (a) que é um fragmento funcional da sequência da proteína hTRAIL, tal fragmento começa com um aminoácido em uma posição não inferior a hTRAIL95, ou um homólogo do referido fragmento funcional tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, e domínio (b) que é uma sequência de um peptídeo efetor imunoestimulante, em que a sequência do domínio (b) 10 está ligada ao C-terminal ou N-terminal do domínio (a). A proteína de fusão pode ser usada para o tratamento de doenças cancerosas.

Description

A invenção refere-se ao campo das proteínas de fusão terapêuticas, em particular as proteínas de fusão recombinantes. Mais particularmente, a invenção refere-se às proteínas de fusão contendo um fragmento de uma sequência da proteína TRAIL 5 humana solúvel em combinação com uma sequência de um peptídeo imunoestimulante, as composições farmacêuticas que os contêm, a sua utilização na terapia, particularmente como agentes anticancerígenos, e sequências de polinucleotídeo que codificam as proteínas de fusão, vetores de expressão contendo as sequências de polinucleotídeo e as células hospedeiras que contêm estes vetores de expressão.

A proteína TRAIL, pertencente à família das citocinas (Ligante Indutor de Apoptose Relacionado ao Fator de Necrose Tumoral), também conhecido como Apo2L (ligante Apo2), é um ativador potente da apoptose em células tumorais e em células infectadas por vírus. TRAIL é um ligante que ocorre naturalmente no corpo. A proteína TRAIL, sua sequência de aminoácido, sequências de DNA de codificação e sistemas de expressão de proteínas foram descritos pela primeira vez na EP0835305A1.

A proteína TRAIL exerce a sua atividade anticancerígena através da ligação a receptores de superfície TRAIL pró-apoptóticos 1 e 2 (TRAIL-R1/R2) e subsequente ativação destes receptores. Estes receptores, também conhecidos como DR4 e DR5 (receptor de morte 4 e receptor de morte 5), pertencem à família de receptores de TNF e são superexpressos por diferentes tipos de células cancerosas. A ativação destes receptores pode induzir a via de sinalização externa da apoptose independente do gene p53, o qual pela ativação por caspase-8 leva à ativação de caspases de execução e, assim, a degradação dos ácidos nucleicos. A caspase-8 liberada após a ativação de TRAIL também pode causar a liberação da proteína Bid e desse modo a ativação indireta da via mitocondrial, a proteína Bid a ser translocada para a mitocôndria, onde estimula a 5 liberação do citocromo c, assim, indiretamente, amplificando o sinal da apoptose dos receptores de morte. TRAIL actua seletivamente nas células tumorais essencialmente sem induzir a apoptose em células saudáveis que são resistentes a esta proteína. Portanto, o enorme 10 potencial de TRAIL foi reconhecido como um agente anticancerígeno, que atua sobre uma vasta faixa de diferentes tipos de células tumorais, incluindo doenças malignas hematológicas e tumores sólidos, enquanto poupam as células normais e exercem efeitos colaterais 15 potencialmente relativamente pequenos.

A proteína TRAIL é uma proteína de membrana do tipo II que tem o comprimento de 281 aminoácidos, e sua região extracelular compreendendo os resíduos de aminoácidos 114 a 281 após a divagem por proteases forma a 20 molécula sTRAIL solúvel de 20 kDa de tamanho, que também é biologicamente ativa. Ambas as formas de TRAIL e sTRAIL são capazes de desencadear a apoptose através da interação com os receptores de TRAIL presentes nas células alvo. A atividade antitumoral forte e toxicidade sistêmica muito 25 baixa da parte solúvel da molécula TRAIL foi demonstrado por meio de testes de linhagens celulares.

Estudos clínicos em humanos com TRAIL solúvel humana recombinante (rhTRAIL) possuindo a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 114 a 281 da 30 hTRAIL, conhecidos sob a dulanermina INN, demonstrou também a sua boa tolerância e ausência de toxicidade limitadora de dose.

O fragmento de TRAIL mais curto do que 114 a 281 também foi descoberto por ser capaz de se ligar aos receptores de morte da membrana e induzir a apoptose através destes receptores, tal como foi recentemente 5 relatado para mutante permutado circularmente recombinante da hTRAIL 122 a 281, por exemplo na EP 1 688 498.

Os efeitos tóxicos da proteína TRAIL recombinante em células do fígado relatados até agora parecem estar associados com a presença de modificação, isto é, marcas de 10 polihistidina, enquanto que a TRAIL não marcada não mostrou nenhuma toxicidade sistêmica.

No entanto, no curso da investigação adicional e desenvolvimento pareceu que muitas células cancerosas também apresentaram resistência primária ou adquirida à 15 TRAIL (ver, por exemplo W02007/022214) . Embora o mecanismo de resistência à TRAIL não tenha sido totalmente compreendido, acredita-se que pode manifestar-se em diferentes níveis do caminho de apoptose induzida por TRAIL, variando desde o nível de receptores da superfície 20 celular para as caspases executivas da via de sinalização. Esta resistência limita a utilidade de TRAIL como um agente anticancerígeno.

Além disso, em testes clínicos em pacientes, a eficácia real de TRAIL como uma monoterapia provou ser 25 acessível. Para superar esta baixa eficiência e a resistência dos tumores à TRAIL, várias terapias de combinação com agentes radio e quimio-terapêuticos foram projetadas, o que resultou em efeito apoptótico sinérgico W02009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth 30 Factor Reviews 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001 , 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533). O uso de rhTRAIL para o tratamento do câncer em combinação com agentes quimioterapêuticos convencionais selecionados (paclitaxel, carboplatina) e anticorpos anti-VEGF monoclonais são descritos em WO2009/140469. No entanto, tal combinação implica necessariamente em deficiências bem conhecidas da quimioterapia ou radioterapia convencionais.

A proteína de fusão construída contendo seqüências de vasostatina inibidora de angiogênese e TRAIL ligada a um ligador do sítio de clivagem de metaloprotease foi descrita como apresentando o efeito indutor de apoptose nas células tumorais por A. I. Guo et al in Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930. A proteína de fusão construída contendo seqüências de Tumstatin183-230 da tumstatina inibidora de angiogênese e TRAIL114-281 foi descrita como apresentando a indução de apoptose das células cancerosas pancreáticas por N.Ren et al in Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478. A US2005/244370 e W02004/035794 correspondente descrevem o constructo de TRAIL95-281 como um domínio efetor ligado por um ligador peptídico com a parte extracelular de outro membro da família de ligantes TNF CD40 como um domínio de ligação da superfície da célula. Afirma-se que a ativação do constructo é através da ligação de sua parte CD40.

Além disso, o problema relacionado com a terapia de TRAIL provou ser a sua baixa estabilidade e rápida eliminação do corpo após administração.

O efeito vantajoso das citocinas na terapia do câncer também é conhecido. Um membro da família de citoquinas é o interferon, uma proteína que estimula o sistema imunológico. Os interferons são agentes anticancerígenos importantes ou terapêuticos anticancerígenos adjuntos (Borden e Williams, Interferons,

Cancer Medicine, 5a edição, 815-824, 2000). Demonstrou-se que um dos efeitos do interferon é a forte estimulação de vários fatores pró-apoptóticos, incluindo o ligante TRAIL.

Um representante do grupo de inteferons do tipo II é o interferon gama (IFN-y), que é uma citoquina solúvel dimérica. 0 IFN-y θ secretado por NK, NKT, Thl, Tc, e células dendríticas. O ligante IFN-y liga-se a dois tipos de receptor de IFN-y ROÍ e IFN-y Rβl e ativa a via JAK-STAT. Um dos seus efeitos é a estimulação intensa de monócitos humanos para produzir a proteína TRAIL, o que afeta significativamente a sua capacidade de eliminar células cancerosas (Griffith et al., J. Exp. Med. Chem., 189:1343- 1353, 1999).

O interferon gama ativa o receptor de IFN gama, estimulando a toxicidade dependente de anticorpo e potência o processo de ligação das células com células tumorais. Além disso, o IFN faixa ativa caspases, e induz a apoptose em células cancerosas. Além disso, demonstrou-se que, em muitas linhas de tumor que mostram resistência à apoptose estimulada por TRAIL o interferon gama atuou sinergicamente, contribuindo para a sua sensibilidade à TRAIL (Wang et al, Oncogene, 23: 928-935, 2004). No entanto, as terapias existentes, utilizando o IFN faixa não foram suficientemente eficazes para encontrar utilização no tratamento de doenças cancerosas.

Os efeitos benéficos do interferon alfa sobre a indução da superprodução de TRAIL no mieloma, linfornas e células de câncer do fígado também foram demonstrados (Chen and et al, Blood, 98: 2183-21192; Herzer et al, Cancer Res. 69 (3).: 855-862, 2009). O interferon alfa é considerado como um modulador da resposta biológica que reforça as respostas naturais do organismo às doenças. Ele afeta tanto a imunidade celular e humoral. Ele estimula a produção de anticorpos anticancerígenos, ativa a ação citotóxica dos macrófagos, células NK e linfócitos. O INF alfa aumenta também a expressão dos antígenos de histocompatibilidade de HLA em células cancerígenas, o que facilita o seu reconhecimento por células imunes. Media a desaceleração do crescimento e divisão das células cancerosas e, consequentemente, sua morte.

O interferon alfa foi usado para tratar vários tipos de cânceres, incluindo a leucemia de célula cabeluda, melanoma, câncer renal, leucemia mielocítica e mieloblástica, linfoma, sarcoma de Kaposi e outras doenças neoplásticas do sangue (Folkman J. , N. Engl. J. Med, 1995, 333: 1757-1763; Sidky YA, Borden EC. Cancer Res. 1987. 47: 5155-5161 ; Iwagak H, Hizuta A, Yoshino T, et al, Anticancer Res. 1993, 13: 13-15; Rubinger M, Plenderleith IH, Lertzman M, et al, Chest. 1995, 108:281 -282). Entretanto, na dose necessária para conseguir o efeito terapêutico nos pacientes, os efeitos tóxicos como a neutropenia, sintomas similares a gripe, indisposição, anorexia e disfunção do fígado foram observados. Por causa destes efeitos colaterais, a terapia do interferon alfa é interrompida frequentemente, o que torna esta terapia ineficaz. Além disso, a meia-vida biológica da maioria das citocinas, incluindo o interferon-alfa, é curta e dura algumas horas, devido ao que injeções frequentes são necessárias. Para várias razões, o uso frequente da droga é inconveniente para o paciente (especialmente no tratamento de longo prazo). Isto resultou na necessidade de projetar formulações de liberação prolongada do interferon-alfa.

Diversas tentativas foram feitas para melhorar as propriedades do interferon alfa. A tentativa de estender a meia vida biológica do interferon pelo fornecimento de fusões heterodiméricas com as proteínas do transportador que compreende os ligadores que permitem o dobramento apropriado das proteínas de fusão expressas é divulgada, por exemplo, na US7943733. Outras tentativas são baseadas na estrutura resolvida da forma biologicamente ativa do interferon, isto é, seus homodímeros não covalentes naturalmente formados que são formados pelo bloqueio anti- paralelo dos dois monômeros no sítio receptor de um íon de zinco (Zn2+) (R. Radhakrishnan, Structure 1996, Vol. 4 No 12, 1453-1463). Os constructos dos homodímeros do interferon alfa ligados através do ligador de glicina- serina são mencionados no pedido de patente LT2010012, mas seus dados de atividade não são fornecidos.

O IFNy é conhecido também para agir como o homodímero não covalentemente associado no qual duas cadeias de polipeptídeo idênticas são orientadas em uma maneira antiparalela para gerar uma molécula simétrica (Ealick, S. E., Science (1991) 262, 698-702). Consequentemente, existe a possibilidade de que as formas diméricas de IFNy poderiam ocupar o sítio de ligação do receptor mais eficiente, mas esta hipótese não foi confirmada clinicamente.

As tentativas de desenvolver derivados do interferon alfa que estariam livres dos efeitos colaterais acima mencionados resultaram na introdução ao tratamento de interferons alfa peguilados de longa ação. A peguilação é um dos métodos populares da administração das proteínas no corpo dos mamíferos, visando reduzir ou superar os efeitos colaterais da substância ativa. O princípio da peguilação é a criação de uma barreira protetora em torno das moléculas modificadas, resultando no tempo prolongado da concentração desejada da substância (devido à mudança das propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas). O tempo de absorção é alongado e a eliminação do corpo é mais longa.

Os valores destes parâmetros são dependentes da estrutura das moléculas de polietileno glicol (PEG): comprimento da cadeia, linearidade, grau de ramificação, tipo e número de sítios de ligação e do número das moléculas de glicol ligadas. [Delgado C, Francis GE, Fisher D., The uses e properties of PEG-linked proteins. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1992; 9 (3-4): 249-304].

A peguilação não afeta a maneira da ligação do interferon a seu receptor. Estudos pré-clínicos demonstraram que o interferon alfa peguilado se liga ao receptor de IFNa-2a e exerce a mesma ou maior atividade biológica in vitro, tal como foi confirmado nos testes na cultura de célula tumoral e em camundongos com célul-as de carcinoma renal humanas implantadas [Nieforth K, Nadeau R, 15 Patel TH, Mould D. Use of an indirect pharmacodynamic stimulation model of MX protein induction to compare in vivo activity of interferon a-2a e a polyethylene glycol - modified derivative in healthy subjects, Clin. Pharmacol. Ther. 1996; 59: 636-46; Paul G, et al. Pegylated interferon — a-2b: Pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, e preliminary efficacy data. Clin. Pharmacol. Ther. 2000; 68: 556-67].

Apesar dos dados promissores dos experimentos de modelo animal, preparações contendo o interferon peguilado 25 comercialmente disponíveis Pegintron ® e Pegasys ® (G. Pasut, FM Veronese, Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 933-961) com uma cadeia de PEG ramificada de 40 kDa e uma linear de 12 kDa ligadas ao IFNa, respectivamente, demonstraram perfil de segurança qualitativamente similar ou mesmo pior 30 a partir das moléculas de interferon não modificadas correspondentes (Bukowski R. M. et al. , Cancer, 95(2):389- 96 (2002); Bukowski R. M. et al., Journal of Clinical Oncology, 20(18):3841 -3949 (2002); Motzer, R. J. et al., J. Clin. Oncol. , 19(5): 1312-9 (2001 ); Tong M. J., Journal of Interferon e Cytokine Research, 18:81 -86 ( 1998); Yao G. B. et al., Journal of Gastroenterology e Hepatolog. , 15: 1 165-1 170 (2000); Heathcote E. J. et al, 5 N. Engl. J. Med. , 343(23): 1673-80 (2000); Tong M. J. et al. , Hepatology; 26(3):747-54 (1997)).

Os efeitos colaterais mais frequentemente observados da terapia do IFNa peguilado incluem: náusea dependente da dose, anorexia, endurecimento dos músculos.

Além disso, uma terapia mais longa revelou-se limitante da dose, tal como a fatiga severa, neurotoxicidade, mal funcionando do fígado e inibição das funções da medula óssea (Peg-lntron® em doses de 7,5 mg/kg e mais altas) (Bukowski R. M. et al., Cancer; 95(2):389-96 (2002)).

Consequentemente, apesar da existência das terapias anticancerígenas clinicamente empregadas com base em ambas a proteína TRAIL e as proteínas da família dos interferons (também modificada, em particular pela peguilação), não são suficientemente eficazes e têm muitas 20 desvantagens bem conhecidas, das quais uma da mais severa e restrição é a eficácia limitada do tratamento, falta de seletividade contra as células de câncer, efeitos colaterais e resistência preliminar ou adquirida. Há ainda uma necessidade por terapia melhorada de câncer com base 25 tanto na atividade do interferon e da proteína TRAIL, que seria tanto eficaz quanto seletiva in vivo contra as células cancerígenas. Permanece uma necessidade urgente e não atendida por novos agentes anticancerígenos que permitiriam tanto a ampliação da faixa dos agentes 30 disponíveis quanto a descoberta de agentes que são mais eficazes (citotóxicos) e seletivos. Há também uma necessidade por novos agentes seletivos com estabilidade aumentada e farmacocinética melhorada.

A presente invenção fornece uma solução deste problema por meio de novas proteínas de fusão que incorporam um domínio derivado de TRAIL e um domínio de peptídeo efetor curto que tem a atividade estimulante do sistema imune, cujo peptídeo efetor não inclui fragmentos de TRAIL, sendo que o peptídeo efetor potência ou complementa a ação de TRAIL. Além disso, foi revelado em muitos casos que as proteínas de fusão da invenção são mais potentes do que a TRAIL solúvel e suas variantes que consistem em fragmentos de sua sequência, assim como mais potentes do que os respectivos peptídeos efetores. Em muitos casos, as novas proteínas de fusão superam também a resistência à TRAIL. Além disso, a incorporação do peptídeo efetor resulta na meia vida prolongada e retenção aumentada da proteína no tumor e sua eficiência intensificada. Adicionalmente, em determinadas variantes novas proteínas de fusão podem ser capazes de se ligar ao PEG, que tem o efeito protetor contra as proteases não específicas e altera adicionalmente as propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas, particularmente com relação ao prolongamento da meia vida biológica.

Descrição das Figuras

A invenção será agora descrita em detalhe com referência às Figuras dos desenhos. FIG. 1 apresenta estruturas esquemáticas de proteínas de fusão da invenção de acordo com os Ex. 1, Ex•2, Ex. 3 e Ex. 4 . FIG. 2 apresenta estruturas esquemáticas de proteínas de fusão da invenção de acordo com os Ex. 5, Ex. 6, Ex. 7, Ex. 8, Ex. 9, Ex. 10 e Ex. 11. FIG. 3 apresenta as estruturas esquemáticas de proteínas de fusão da invenção de acordo com os Ex. 12, Ex. 13, Ex. 14 e Ex. 15. FIG. 4 apresenta estruturas esquemáticas de proteínas de fusão da invenção de acordo com os Ex. 16 e Ex. 17. FIG. 5 mostra os espectros de dicroísmo circular 5 para as rhTRAIL114-281, rhTRAIL95-281 e proteínas de fusão dos Ex. 12, Ex. 5, Ex. 3 e Ex. 14 expressas em elipticidade específica. FIG. 6 apresenta as alterações de volume tumoral (% de fase inicial) em camundongos Cri:CDl-Foxnlnu 10 sobrecarregados com câncer do cólon HCT116, tratados com as proteínas de fusão da invenção dos Ex. 3, Ex. 12 e Ex. 14 em comparação com rhTRAIL114-281. FIG. 7 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongos Cri:CD1-Foxnlnu 15 1 sobrecarregados com câncer do cólon HCT116, tratados com as proteínas de fusão da invenção dos Ex.3, Ex. 12 e Ex. 14 em comparação com rh TRAIL114-281. FIG. 8 apresenta variações no volume do tumor (% da fase inicial) no camundongo Cri:SHO-PrkdcscidHrhr 20 sobrecarregados com câncer do cólon HCT116 tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 em comparação com rhTRAIL114-281. FIG. 9 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongos Crl:SHO- 25 PrkdcscidHrhr sobrecarregados com câncer do cólon HCT116 tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 em comparação com rhTRAILl14-281. FIG. 10 apresenta as alterações de volume tumoral (% de fase inicial) em camundongos Cri:SHO-PrkdcscidHrhr 30 sobrecarregados com câncer do fígado PLC/PRF/5 tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 em comparação com rhTRAILl14-281. FIG. 11 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongos Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregados com câncer do fígado PLC/PRF/5 tratados com a proteína de fusão da invenção do 5 Ex. 14 em comparação com rhTRAIL114-281. FIG. 12 apresenta as alterações do volume tumoral (% de fase inicial) em camundongos Crl:SHO-PrkdcscidHrhr sobrecarregados com câncer do fígado com HepG2, tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 em comparação 10 com rhTRAIL114-281. FIG. 13 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongos Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregados com câncer do fígado HepG2 tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 em 15 comparação com rhTRAIL114-281.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção refere-se a uma proteína de fusão compreendendo: domínio (a), que é o fragmento funcional de uma 20 sequência de proteína hTRAIL solúvel, tal fragmento começa com um aminoácido em uma posição não inferior a hTRAIL95, ou um homólogo funcional do referido fragmento tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, e domínio (b) que é uma sequência de um peptídeo 2 5 efetor imunoestimulante, em que a sequência do domínio (b) está ligada ao C-terminal e/ou N-terminal do domínio (a).

O termo "fragmento solúvel funcional de uma sequência de hTRAIL solúvel" deve ser entendido como indicando qualquer fragmento da hTRAIL solúvel que é capaz 30 de induzir o sinal apoptótico em células de mamífero após ligação aos seus receptores na superfície das células.

Será também apreciado por uma pessoa versada na técnica que a existência de pelo menos 70% de homologia da sequência de TRAIL é conhecida na técnica.

Deve ser entendido que o domínio (b) do peptídeo efetor na proteína de fusão da invenção não é, nem a proteína hTRAIL nem uma parte ou fragmento da proteína hTRAIL.

O termo "peptídeo", de acordo com a invenção deve ser entendido como molécula construída a partir da pluralidade de aminoácidos ligados entre si por meio de uma ligação peptídica. Assim, o termo "peptídeo", de acordo com a invenção inclui polipeptídeos, oligopeptídeos e proteínas.

Na presente invenção, as sequências de aminoácidos dos peptídeos serão apresentadas de uma maneira convencional adotada na técnica, isto é, na direção do N- terminal (N-extremidade) do peptídeo para o seu C-terminal (C-extremidade) . Qualquer sequência terá, assim, o seu N- terminal no lado esquerdo e C-terminal no lado direito da sua apresentação linear.

A proteína de fusão da invenção pode incorporar um único domínio (b) do peptídeo efetor, ligado ao C- terminal ou N-terminal do domínio (a).

Em uma modalidade particular, o domínio (a) é um fragmento da sequência hTRAIL, começando com um aminoácido a partir da faixa de hTRAIL95 para hTRAIL122, inclusive, e que termina com o aminoácido hTRAIL 281.

Em particular, o domínio (a) pode ser selecionado a partir do grupo constituído por sequências correspondentes a hTRAIL95-281 , hTRAIL114-281 , hTRAILllô- 281 , hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 e hTRAIL122-281. Será evidente para as pessoas versadas na técnica que hTRAIL95- 281, hTRAILl14-281, hTRAILl16-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 e hTRAIL122-281 representam um fragmento da proteína TRAIL humana começando com o aminoácido marcado com o número 95, 114, 116, 120, 121 e 122, respectivamente, na sequência conhecida da hTRAIL publicada no GenBank sob n° de acesso P50591.

Em outra modalidade particular, o domínio (a) é um homólogo do fragmento funcional da sequência da proteína hTRAIL solúvel que começa na posição de aminoácido não inferior a hTRAIL95 e termina no aminoácido hTRAIL281, a sequência dos quais é, pelo menos em 70%, de preferência em 85%, idêntica à sequência original.

Nas variantes específicas desta modalidade o domínio (a) é um homólogo de um fragmento selecionado do grupo constituído por sequências correspondentes às hTRAIL95-281, hTRAILl14-281, hTRAIL116-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 e hTRAIL122-281.

Deve-se entender que um homólogo de um fragmento de hTRAIL é uma variação/alteração da sequência de aminoácidos deste fragmento, em que pelo menos um aminoácido é modificado, incluindo 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos , 5 aminoácidos, 6 aminoácidos e não mais do que 15% de aminoácidos, e em que um fragmento da sequência modificada preservou a funcionalidade da sequência hTRAIL, ou seja, a capacidade de ligação aos receptores de morte da superfície celular e induzindo a apoptose em células mamíferos. A modificação da sequência de aminoácido podem incluir, por exemplo, substituição, eliminação, truncamento e/ou adição de aminoácidos.

Preferencialmente, o homólogo do fragmento hTRAIL possuindo a sequência modificada mostra a afinidade modificada para os receptores de morte DR4 (TRAIL-R1) ou DR5 (TRAIL-R2), em comparaçao com o fragmento nativo de hTRAIL.

O termo "afinidade modificada" refere-se ao aumento da afinidade e/ou afinidade com a seletividade do receptor alterada.

Preferencialmente, o homólogo do fragmento possuindo a sequência de hTRAIL modificada mostra aumento da afinidade para os receptores de morte DR4 e DR5 em relação ao fragmento da hTRAIL nativa.

Particularmente de preferência, o homólogo de um fragmento possuindo a sequência de hTRAIL modificada mostra aumento da afinidade para o receptor de morte DR5, em comparação com o receptor de morte DR4, ou seja, um DR5/DR4 de seletividade aumentada.

Também de preferência, o homólogo do fragmento possuindo a sequência de hTRAIL modificada mostra uma seletividade aumentada em relação aos receptores de morte DR4 e/ou DR5 em relação à afinidade para os receptores DR1 (TRAIL-R3) e/ou DR2 (TRAIL-R4).

Modificações de hTRAIL resultantes de um aumento de afinidade e/ou seletividade em relação aos receptores de morte DR4 e DR5 são conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, por exemplo a partir da publicação Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor- related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18; 283(29): 20560-8, a qual descreve a mutação de D218H tendo seletividade aumentada para DR4, ou Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A e DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6);778-87, a qual descreve a mutação de D269H tendo uma afinidade reduzida para o DR4. Mutantes de hTRAIL resultando em um aumento da afinidade para um receptor selecionado a partir do DR4 e DR5 em comparação com receptores DR1 e DR2 e maior afinidade para o receptor de DR5 em comparação com DR4 também são descritos nas WO2009077857 e WO2009066174.

Mutações adequadas são uma ou mais mutações nas posições de hTRAL nativa selecionadas a partir do grupo consistindo em 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 e 251, em particular, as mutações que envolvem a substituição de um aminoácido com um aminoácido básico tal como lisina, arginina ou histidina, ou aminoácidos tais como ácido glutâmico ou ácido aspárgico. Particularmente, uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em G131 R, G131 K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201 H, K201 R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251 D, K251 E e K251Q, tal como descrito na WO2009066174, podem ser especificadas.

Mutações adequadas também são uma ou mais mutações nas posições de hTRAL nativa selecionadas a partir do grupo consistindo em 195, 269 e 214, em particular as mutações que envolvem a substituição de um aminoácido por um aminoácido básico tal como lisina, arginina ou histidina. Particularmente, podem ser especificadas uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em D269H, E195R, e T214R, tal como descrito, na WO2009077857.

Em uma modalidade particular, o domínio (a) que é um homólogo do fragmento de hTRAIL é selecionado a partir de mutante D218H da sequência de TRAIL nativa, tal como descrito na W02009066174, ou o mutante Y189N-R191K-Q193R- H264R-I266R-D269H da sequência de TRAIL nativa, como descrito em Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP., Apoptosis. 2009 Jun; 14(6):778-87.

O peptideo efetor imunoestimulante do domínio (b) pode ser urn peptideo de citocina que, entre outros intensamente estimula monócitos humanos para produzir a proteína TRAIL, afetando de forma significativa a capacidade de eliminar células cancerosas.

Em uma modalidade da proteína de fusão da invenção, o peptideo efetor é um peptideo com atividade imunoestimulante selecionada do grupo que consiste na SEQ. N° 17 (derivada do INF alfa 2b), SEQ. N° 18 (derivada do INF gama), SEQ N°. 19 (um pseudodímero de IFN gama), SEQ N°. 46 (um pseudodímero de interferon alfa 2b) e SEQ. N° 47 (a sequência de consenso do interferon alfa).

O peptideo efetor do grupo acima é o peptideo que estimula a superexpressão de TRAIL e, especificamente, o fragmento de 165 aminoácidos do interferon alfa subunidade beta apresentada pela SEQ N°. 17.

Acredita-se que o peptideo compreendendo a sequência de interferon alfa subunidade beta incorporada na proteína de fusão da invenção eliminará eficazmente as células cancerosas. Outro peptideo efetor é um fragmento de 124 aminoácidos de interferon gama apresentado pela SEQ N°. 18.

Acredita-se que o peptideo compreendendo a sequência de interferon gama incorporada na proteína de fusão da invenção eliminará eficazmente as células cancerosas.

O peptideo efetor do grupo acima é um peptideo de 263 aminoácidos constituindo uma fusão de duas subunidades de interferon gama humanas, formando pseudodímero de cadeia única de IFN gama, descrito por Landar' a et al. (J. Mol. Biol 299: 169-179, 2000). A variante da proteína de cadeia única resultante retém a capacidade de se ligar ao receptor apropriado e a atividade biológica esperada para o interferon-gama. Este peptídeo efetor é apresentado pela SEQ N°. 19.

Outro peptídeo efetor do grupo acima é um peptídeo de 351 aminoácidos, uma fusão de duas subunidades de interferon alfa 2b humano formando pseudodímero de cadeia única de IFN alfa-2b em que a segunda cadeia da sequência da subunidade de IFN alfa 2b é invertida em comparação com a sequência nativa (ou seja, a partir do C- terminal para N-terminal). O peptídeo efetor resultante é caracterizado por duas extremidades C-terminais "nativas" do interferon alfa 2b ligadas uma à outra. Os monômeros em dímeros de IFN alfa de formação natural estão ligados pelas suas extremidades C-terminais. As extremidades N-terminais, por sua vez, são responsáveis pela interação com o receptor e fornecem um ambiente apropriado para a coordenação do processo de dimerização do íon de zinco (resíduos de ácido glutâmico 41 e 42). A variante da proteína de cadeia única resultante retém a capacidade de se ligar ao receptor apropriado e a atividade biológica esperada para o interferon-alfa. Este peptídeo efetor é apresentado pela SEQ N° . 46.

Outro peptídeo efetor é uma sequência de consenso de 166 aminoácidos do interferon alfa apresentada pela SEQ N°. 47. Esta sequência de consenso é revelada na US 4.695.623.

Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência de consenso do interferon alfa incorporada na proteína de fusão da invenção eliminará eficazmente as células cancerosas.

Mediante a ligação aos receptores de TRAIL presentes na superfície das células cancerosas, a proteína de fusão exercerá um efeito duplo. O domínio (a), que é um fragmento funcional de TRAIL ou seu homólogo com funcionalidade preservada, vai exercer a sua atividade agonista conhecida - por exemplo, a ligação aos receptores de morte na superfície das células e a ativação da via extrínseca da apoptose. Após a internalização da proteína de fusão compreendendo o peptídeo imunoestimulante, o domínio (b) será capaz de exercer a sua ação potencialmente intracelularmente em paralelo com a atividade do domínio de TRAIL. Deste modo, a atividade anticancerígena de TRAIL pode ser potenciada pela ativação de outros elementos e mecanismos - tais como a estimulação das células B para produzir anticorpos, estimulação da expressão da caspase 7 e 8, ou a estimulação da superexpressão de TRAIL.

Em uma das modalidades da invenção, o domínio (a) e o domínio (b) são ligados por pelo menos um domínio (c) que compreende a sequência de um sítio de clivagem reconhecido pela protease presente no ambiente celular, especialmente no ambiente da célula tumoral. A ligação do domínio (a) com o domínio (b), em pelo menos um domínio (c) significa que entre os domínios (a) e (b) mais do que um domínio (c) podem estar presentes, em particular um ou dois domínios (c).

Um sítio de clivagem de protease pode ser selecionado a partir de: - uma sequência reconhecida pela metaloprotease MMP, em particular, Pro Leu Gli Leu Ala Gli (PLGLAG na convenção de uma letra) designada como a SEQ N°. 20, - uma sequência reconhecida pela uroquinase uPA, em particular Arg Vai Vai Arg (RVVR na convencão de uma letra) designada como a SEQ N°. 21, e suas combinações.

Em uma das modalidades da invenção, o sítio de clivagem da protease é uma combinação da sequência reconhecida por metaloprotease MMP e a sequência reconhecida por uroquinase uPA, localizadas uma ao lado da outra, em qualquer ordem.

Em uma modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/uPA (SEQ n° 20/Sekw. N°. 21), que é a sequência Pro Leu Gli Leu Ala Gli Arg Val Val Arg (PLGLAGRVVR na convenção de uma letra), ou uma combinação de uPA/MMP (SEQ N°. 21/SEQ N°. 20), que é a sequência Arg Val Val Arg Pro Leu Gli Leu Ala Gli (RVVRPLGLAG na convenção de uma letra). Tais combinações podem ser repetidas, de preferência duas vezes.

As proteases de metaloprotease MMP e uroquinase uPA são superexpressas no ambiente tumoral. A presença da sequência reconhecida por proteases permite a clivagem do domínio (a) a partir do domínio (b) mediante a internalização da constructo, isto é, a liberação do domínio funcional (b) e, assim, a sua ativação.

A presença do sítio de clivagem da protease, pela permissão da liberação rápida do peptídeo efetor, aumenta as possibilidades de transportar o peptídeo para o local da sua ação antes da degradação aleatória da proteína de fusão por proteases presentes na célula ocorrer.

Em outra modalidade, entre os domínios (a) e domínio (b) há adicionalmente incorporado o domínio (d) de uma sequência adequada para ligação de uma molécula de PEG (ligador PEG) à proteína de fusão da invenção.

Tal ligador de PEG é, por exemplo, uma sequência conhecida Ala Ser Gli Cis Gli Pro Glu (ASGCGPE em uma convenção de uma letra), designada como a SEQ N°. 22. O ligador PEG também pode ser escolhido entre Ala Ala Cis Ala Ala (AACAA em uma convenção de uma letra), Ser Gli Cis Gli

Gli Ser (SGGCGGS em uma convenção de uma letra) e Ser Gli Cis Gli Ser (SGCGS em uma convenção de uma letra), designado como, respectivamente, SEQ N°. 23, SEQ. N° 24 e SEQ N°. 25.

Em uma das modalidades, a proteína da invenção compreende ambos os domínio (c) e domínio (d). Em uma modalidade preferida, o domínio (d) situa- se entre os dois domínios (c), em especial entre os dois domínios (c), os quais são selecionados a partir do sítio de clivagem de protease e uma combinação dos sítios de clivagem de protease, em particular, a sequência reconhecida pelas metaloproteases MMP (SEQ N° 20), a sequência reconhecida por uroquinase uPA (SEQ N° 21), e a combinação de MMP/uPA (SEQ N° 20/SEQ N°. 21) ou uPA/MMP (SEQ n ° 21/SEQ N°. 20).

Assim, em uma modalidade da proteína de fusão da invenção, o sítio de clivagem da protease é uma combinação da sequência reconhecida por metaloprotease MMP e a sequência reconhecida por uroquinase uPA, em qualquer ordem, separadas pela sequência do ligador PEG discutida acima.

Deve ser compreendido que no caso quando a proteína de fusão tem ambos o domínio (d) do ligador PEG e os domínios (c) do sítio de clivagem entre os domínios (a) e (b), então os domínios (c) são localizados de tal forma que após a clivagem do constructo o domínio (d) é desconectado dos domínios (a) e (b). Estes dois domínios (c) podem conter ambos sítio de clivagem de protease único e combinações dos mesmos, como definido acima. Em outras palavras, se a proteína de fusão contém tanto o domínio (d) compreendendo o ligador PEG e domínios do sítio de clivagem (c), então o domínio (d) é localizado entre os domínios (c). A invenção não compreende tal variante na qual o domínio (d) poderia ser localizado entre o domínio (c) e domínio (a) ou entre o domínio (c) e domínio (b), que é a variante sendo que após a clivagem do constructo a sequência adequada para anexação à proteína de fusão da invenção de uma molécula de PEG (d) permaneceria ligada ao domínio (a) ou domínio (b).

As moléculas de PEG úteis para anexação à proteína de fusão podem ser selecionadas a partir de moléculas de PEG lineares e ramificadas. Particularmente útil é a molécula de PEG tendo um peso molecular entre 4000 e 20000.

Para além dos principais elementos funcionais da proteína de fusão, o domínio(s) do sítio de clivagem e a sequência do ligador de PEG, as proteínas de fusão da invenção podem conter uma sequência/sequências neutra de ligador de glicina-serina estérico flexível (espaçador). Estes ligadores/espaçadores são bem conhecidos e descritos na literatura. A sua incorporação na sequência da proteína de fusão destina-se a fornecer a dobramento correta das proteínas produzidas pelo processo da sua superexpressão nas células hospedeiras.

Ligador estérico flexível pode ser selecionado a partir de qualquer combinação de resíduos de glicina e serina. Em particular, o ligador flexível pode ser selecionado a partir do grupo constituído por Gli Ser Gli Gli Gli (GSGGG na convenção de uma letra), Gli Gli Gli Ser (GGGS na convenção de uma letra), Xaa Gli Gli Ser (XGGS na convenção de uma letra) em que Xaa designa qualquer aminoácido ou está ausente, e Gli Gli Ser Gli (GGSG na convenção de uma letra) designados como, respectivamente, a SEQ. N° 26, SEQ. N° 27 e SEQ N°. 28) e SEQ. N° 50.

Modalidades particulares da proteína de fusão da presente invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo imunoestimulante selecionado a partir do grupo consistindo em proteínas representadas pela SEQ. N° 1, SEQ N°. 2, SEQ. N° 3, SEQ N°. 4, e SEQ. N° 45.

Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo imunoestimulante representado pela SEQ N°. 44.

Outras modalidades específicas da proteína de fusão da invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo imunoestimulante, selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas pelas SEQ. N° 5, SEQ. N° 6, SEQ. N° 7, SEQ. N ° 8, SEQ. N° 9, SEQ. N° 10 e SEQ N°. 11.

Outras modalidades específicas da proteína de fusão da invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo imunoestimulante, selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas pelas SEQ. N° 12, SEQ N°. 13, SEQ. N° 14 e SEQ N°. 15.

Uma descrição detalhada da estrutura das proteínas de fusão representativas acima mencionadas são mostradas nas Figuras 1 a 3 e na Fig. 4, e nos Exemplos aqui apresentados abaixo.

De acordo com a presente invenção, "uma proteína de fusão" significa uma única molécula de proteína que contém duas ou mais proteínas ou seus fragmentos, ligados covalentemente através de ligações peptídicas nas respectivas cadeias peptídicas, sem ligadores químicos adicionais.

A proteína de fusão também pode ser alternativamente descrita como umo constructo de proteína ou uma proteína quimérica. De acordo com a presente invenção, os termos "constructo" ou "proteína quimérica", se utilizados, devem ser entendidos como referindo-se à proteína de fusão, tal como definido acima.

Para uma pessoa versada na técnica será evidente que a proteína de fusão assim definida pode ser sintetizada por métodos conhecidos de síntese química de peptídeos e proteínas.

A proteína de fusão pode ser sintetizada por métodos de síntese química de peptídeos, em particular utilizando as técnicas de síntese de peptídeos na fase sólida, utilizando resinas adequadas como transportadores. Tais técnicas são convencionais e conhecidas na técnica, e descritas, nomeadamente, em monografias, tais como, por exemplo, Bodanszky e Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, Nova Iorque, Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis, 2 a Edição, 1984, Pierce Chemical Company.

A proteína de fusão pode ser sintetizada pelos métodos de síntese química dos peptídeos como uma proteína contínua. Alternativamente, os fragmentos individuais (domínios) da proteína podem ser sintetizados separadamente e depois combinados em um peptídeo contínuo através de uma ligação peptídica, pela condensação do terminal amino de um fragmento de peptídeo a partir do terminal carboxila do segundo peptídeo. Tais técnicas são convencionais e bem conhecidas.

Para a verificação da estrutura do peptídeo resultantes, métodos conhecidos de análise da composição de aminoácidos dos peptídeos podem ser utilizados, tais como a técnica de espectrometria de massa de alta resolução para determinar o peso molecular do peptídeo. Para confirmar a sequência do peptídeo, sequenciadores de proteínas também podem ser usados, os quais degradam sequencialmente o peptídeo e identificam a sequência de aminoácidos.

De preferência, no entanto, a proteína de fusão da invenção é uma proteína recombinante, gerada por métodos de expressão de genes de uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão em células hospedeiras.

Um aspecto adicional da invenção é a sequência de polinucleotídeo, em particular da sequência de DNA que codifica uma proteína de fusão, tal como definido acima.

De preferência, a sequência de polinucleotídeo, em particular de DNA, de acordo com a invenção, que codifica a proteína de fusão como definido acima, é uma sequência otimizada para a expressão em E. coli.

Outro aspecto da invenção é também um vetor de expressão contendo a sequência de polinucleotídeo, em particular a sequência de DNA da invenção, como acima definida.

Outro aspecto da invenção também é uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão como definido acima. Uma célula hospedeira preferida para a expressão das proteínas de fusão da invenção é uma célula de E. coli.

Métodos para a geração de proteínas recombinantes, incluindo as proteínas de fusão, são bem conhecidos. Em resumo, esta técnica consiste na geração da molécula de polinucleotídeo, por exemplo, molécula de DNA que codifica a sequência de aminoácidos da proteína alvo e direciona a expressão da proteína alvo no hospedeiro. Em seguida, a molécula de polinucleotídeo que codifica a proteína alvo é incorporada em um vetor de expressão adequado, o que garante uma expressão eficaz do polipeptídeo. O vetor de expressão recombinante é então introduzido nas células hospedeiras para a transfecção/transformação, e, como resultado uma célula hospedeira transformada é produzida. Isto é seguido por uma cultura de células transformadas para superexpressar a proteína alvo, purificação das proteínas obtidas e, opcionalmente, o corte por clivagem das sequências marcadoras utilizadas para a expressão ou purificação da proteína. ,

As técnicas adequadas de expressão e purificação são descritas, por exemplo, na monografia Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), e A. Staron et al. , Advances Mikrobiol. 2008, 47, 2, 1983-1995.

Cosmideos, plasmídeos ou vírus modificados, podem ser usados como vetores de expressão para a introdução e replicação de sequências de DNA em células hospedeiras. Tipicamente, os plasmídeos são usados como vetores de expressão. Plasmídeos adequados são bem conhecidos e estão disponíveis comercialmente.

O vetor de expressão da invenção compreende uma molécula de polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão da presente invenção e as sequências reguladoras necessárias para a transcrição e tradução da sequência de codificação incorporada em uma célula hospedeira adequada. A seleção das sequências reguladoras é dependente do tipo de célula hospedeira e pode ser facilmente ser realizada por uma pessoa versada na técnica. Exemplos de tais sequências reguladoras são promotor e potenciador de transcrição ou sequência de ligação de polimerase de RNA, sequência de ligação de ribossoma, contendo o sinal de iniciação de transcrição, introduzido antes da sequência de codificação e uma sequência terminadora de transcrição, introduzida depois da sequência de codificação. Além disso, dependendo da célula hospedeira e o vetor utilizado, outras sequências podem ser introduzidas no vetor de expressão, tal como a origem da replicação, sítios de restrição de DNA adicionais, intensificadores, e sequências que permitem a indução de transcrição.

O vetor de expressão também compreenderá uma sequência do gene marcador, que confere o fenótipo definido para a célula transformada e permite uma seleção específica das células transformadas. Além disso, o vetor também pode conter uma segunda sequência de marcador que permite distinguir as células transformadas com plasmídeo recombinante contendo a sequência de codificação inserida da proteína alvo a partir dos que têm tido até o plasmídeo sem a inserção. Na maioria dos casos, os marcadores de resistência a antibióticos típicos são utilizados, no entanto, quaisquer outros genes repórteres conhecidos no campo podem ser utilizados, cuja presença em uma célula (in vivo) pode ser facilmente determinada utilizando técnicas de autorradiografia, espectrofotometria ou bio-e quimio- luminescência. Por exemplo, dependendo da célula hospedeira, genes repórteres tais como β-galactosidase, β- glucuronidase, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase ou a proteína fluorescente verde pode ser utilizada.

Além disso, o vetor de expressão pode conter a sequência de sinal, proteínas de transporte para o compartimento celular apropriado, por ex., periplasma, onde o dobramento é facilitado. Além disso, uma sequência que codifica um rótulo/marca, tal como HisTag ligada ao N- terminal ou GST ligada ao C-terminal, pode estar presente, o que facilita a posterior purificação da proteína produzida utilizando o princípio de afinidade, através da cromatografia de afinidade em uma coluna de níquel. Sequências adicionais que protegem a proteína contra a degradação proteolítica nas células hospedeiras, bem como sequências que aumentam a sua solubilidade também podem estar presentes.

O elemento auxiliar ligado à sequência da proteína alvo pode bloquear a sua atividade, ou ser prejudicial por outro motivo, tal como, por exemplo, devido à toxicidade. Tal elemento deve ser removido, o que pode ser conseguido pela clivagem enzimática ou química. Em particular, um marcador de seis histidinas HisTag ou outros 5 marcadores desse tipo anexado para permitir a purificação da proteína por cromatografia de afinidade deve ser removido, por causa de seu efeito descrito na toxicidade do fígado da proteína TRAIL solúvel. Sistemas de expressão heterólogos podem ser utilizados com base em várias células 10 hospedeiras bem conhecidas, incluindo as células procarióticas: infecções bacterianas, tais como Escherichia coli ou Bacillus subtilis, leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, e linhagens celulares eucarióticas (insetos, mamíferos, plantas).

De preferência, devido à facilidade de cultivo e manipulação genética, e uma grande quantidade do produto obtido, o sistema de expressão de E. coli é utilizado. Por conseguinte, a sequência de polinucleotídeo que contém a sequência alvo que codifica a proteína de fusão da invenção 20 será opimizada para a expressão em E. coli, ou seja, que irá conter os códons na sequência de codificação ideias para expressão em E. coli, selecionados a partir das possíveis variantes de sequências conhecidas no estado da técnica. Além disso, o vetor de expressão conterá os 25 elementos acima descritos adequados para E. coli associada à sequência de codificação.

Por conseguinte, em uma modalidade preferida da invenção, uma sequência polinucleotídica que compreende uma sequência que codifica uma proteína de fusão da invenção, 30 otimizada para a expressão em E. coli é selecionada a partir do grupo de sequências de polinucleotídeo constituído por: SEQ No. 29 SEQ Nθ. 30; SEQ Nθ. 31 ; SEQ N°. 32; SEQ No. 33; SEQ Nθ. 34; SEQ Nθ. 35; SEQ Nθ. 36; SEQ N°. 37; SEQ Nθ. 38; SEQ Nθ. 39; SEQ Nθ. 40; SEQ N°. 41 , SEQ Nθ. 42, SEQ N°. 43, SEQ Nθ. 48 e SEQ Nθ. 49 que codificam uma proteína de fusão possuindo uma sequência de aminoácidos correspondente às sequências de aminoácidos escolhidas a partir do grupo constituído pelas sequências de aminoácidos, respectivamente: SEQ. N° 1; SEQ N°. 2; SEQ Nθ. 3; SEQ. N° 4; SEQ. N° 5; SEQ Nθ. 6, SEQ Nθ. 7; SEQ Nθ. 8, SEQ Nθ . 9, SEQ Nθ . 10, SEQ. N° 1 1, SEQ N°. 12; SEQ Nθ . 13; SEQ. N° 14 e SEQ N°. 15. SEQ. N° 44 e SEQ. N° 45. Em uma modalidade preferida, a invenção também fornece um vetor de expressão adequado para a transformação de E. coli, compreendendo a sequência polinucleotídica selecionada do grupo de sequências de polinucleotídeo SEQ. N° 29 com a SEQ N°. 43, SEQ. N° 48 e SEQ N°. 49 indicadas acima, bem como a célula de E. coli transformada com tal vetor de expressão.

A transformação, isto é, a introdução de uma sequência de DNA em células hospedeiras bacterianas, particularmente E. coli, é normalmente realizada sobre as células competentes, preparado para levar o DNA, por exemplo, pelo tratamento com íons de cálcio a baixa temperatura (4 °C), e depois submentendo ao choque de calor (em 37 a 42 °C) ou por eletroporação.

Tais técnicas são bem conhecidas e são geralmente determinadas pelo fabricante do sistema de expressão ou estão descritas na literatura e manuais para o trabalho de laboratório, tais como Maniatis et al. , Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

O procedimento de superexpressão das proteínas de fusão da invenção em sistema de expressão de E. coli será ainda descrito abaixo.

A invenção também fornece uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão da invenção, tal como definido acima como um ingrediente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado, diluente convencional e componentes auxiliares. A composição farmacêutica conterá uma quantidade eficaz da proteína de fusão da invenção e componentes auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, dissolvidos ou dispersos em um veículo ou diluente, e de preferência estará na forma de uma composição farmacêutica formulada em uma forma de dosagem unitária ou uma formulação contendo uma pluralidade de doses. Formas e métodos para a sua formulação, bem como outros componentes farmacêuticos, veículos e diluentes são conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos na literatura. Por exemplo, eles são descritos na monografia Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, EUA.

Os termos "transportador, diluente e ingrediente auxiliar farmaceuticamente aceitáveis" incluem quaisquer solventes, meios de dispersão, agentes surfactantes, antioxidantes, estabilizantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes de isotonicidade, conhecidos na técnica. A composição farmacêutica da invenção pode conter diversos tipos de transportadores, diluentes e excipientes, dependendo da via de administração escolhida e da forma de dosagem desejada, tal como a forma líquida, sólida e em aerosol para administração oral, parentérica, por inalação, tópica, e se a forma selecionada deve ser estéril, para a via de administração, tais como por injeção. A via preferida da administração da composição farmacêutica de acordo com a invenção é parentérica, incluindo as vias de injeção, tais como administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intratumoral, ou por infusões intravenosas únicas ou contínuas.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por injeção direta no tumor. Em outra modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por via intravenosa.

Ainda em outra modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por via subcutânea ou intraperitoneal. Uma composição farmacêutica para administração parentérica pode ser uma solução ou dispersão em meio aquoso ou não aquoso farmaceuticamente aceitável, tamponado a um pH adequado e isoosmótico com os fluidos corporais, se necessário, e também pode conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e substâncias solúveis , o que torna a composição compatível com os tecidos ou sangue do receptor. Outros componentes, que podem ser incluídos na composição são, por exemplo, água, álcoois tais como etanol, polióis tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, lipídeos, tais como triglicerídeos, óleos vegetais, os lipossomas. A fluidez apropriada e o tamanho das partículas da substância podem ser fornecidos por meio de substâncias de revestimento, tais como lecitina, e agentes surfactantes, tais como polissorbatos de hidroxipropil-celulose, e semelhantes.

Agentes de isotonicidade adequados para as composições parentéricas líquidas são, por exemplo, açúcares tais como glicose e cloreto de sódio e suas combinações.

Alternativamente, a composição farmacêutica para administração por injeção ou infusão pode estar na forma de pó, tal como um pó liofilizado para reconstituição imediatamente antes da utilização, em um veículo apropriado, tal como, por exemplo, água estéril isenta de pirogênio.

A composição farmacêutica da invenção para administração parentérica também pode ter a forma da administração nasal, incluindo soluções, sprays ou aerossóis. De preferência, a forma de administração intranasal será uma solução aquosa isotônica e será tamponada para manter o pH entre cerca de 5,5 a cerca de 6,5, de modo a manter um caráter semelhante a secreções nasais. Além disso, conterá conservantes ou estabilizantes, tais como nas preparações intranasais bem conhecidas.

A composição pode conter vários antioxidantes, o que atrasa a oxidação de um ou mais componentes. Além disso, a fim de evitar a ação de microorganismos, a composição pode conter vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, por exemplo, mas não limitados a, parabenos, clorobutanol, ácido sórbico, timerosal e substâncias semelhantes conhecidos deste tipo. Em geral, a composição farmacêutica da invenção pode incluir, por exemplo, pelo menos cerca de 0,01% em peso do ingrediente ativo. Mais particularmente, a composição pode conter o ingrediente ativo na quantidade de 1% a 75% em peso da unidade de composição, ou por exemplo, de 25% a 60% em peso, mas não limitado aos valores indicados. A quantidade efetiva da dose da composição de acordo com a presente invenção administrada aos pacientes, incluindo o homem, será determinada por fatores físicos e fisiológicos, tais como o peso corporal, a gravidade da condição, tipo de doença a ser tratado, intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, o paciente e a via de administração. Uma dose unitária adequada, a dose total e a concentração de ingrediente ativo na composição devem ser determinadas pelo médico assistente.

A composição pode, por exemplo, ser administrada em uma dose de cerca de 1 micrograma/kg de peso corporal até cerca de 1000 mg/kg de peso corporal do paciente, por exemplo, na faixa de 5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg 5 de peso corporal ou na faixa de 5 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal. A proteína de fusão e as composições que as contém exibem anticancerígeno ou antitumoral e podem ser utilizadas para o tratamento de doenças cancerosas. A invenção também fornece a utilização 10 da proteína de fusão da invenção, como acima definido para o tratamento de doenças cancerosas em mamíferos, incluindo os seres humanos. A invenção também fornece um método de tratamento de doenças cancerosas em mamíferos, incluindo humanos, compreendendo a administração a um indivíduo com 15 necessidade de tal tratamento de uma quantidade eficaz da proteína de fusão anticancerígena da invenção, tal como definido acima, opcionalmente na forma de uma composição farmacêutica apropriada.

A proteína de fusão da invenção pode ser 20 utilizada para o tratamento de malignidades hematológicas, tais como leucemia, granulomatose, mieloma e outras doenças hematológicas malignas. A proteína de fusão também pode ser usada para o tratamento de tumores sólidos, como câncer de mama, câncer de pulmão, inclusive câncer de pulmão de 25 células não-pequenas, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de rim, câncer no cérebro, e semelhantes. A via apropriada de administração da proteína de fusão no tratamento do câncer será em particular a via parenteral, 30 que consiste em administrar a proteína de fusão da invenção, sob a forma de injeções ou infusões, na composição e forma adequadas para esta via de administraçao. A invenção será descrita em mais detalhe nos seguintes procedimentos gerais e exemplos de proteínas de fusão específicos. Procedimento geral para a superexpressão da proteína de fusão Preparação do plasmídeo

A sequência de aminoácidos da proteína de fusão alvo foi usada como molde para gerar uma sequência de DNA que a codifica, compreendendo códons otimizados para a expressão em Escherichia coli. Tal procedimento permite 10 aumentar a eficácia de uma etapa adicional da síntese de proteína alvo em Escherichia coli. A sequência de nucleotídeos resultante foi então sintetizada automaticamente. Além disso, os sítios de clivagem das enzimas de restrição Ndel (na extremidade 5' da fita líder) 15 e Xhol (na extremidade 3' da fita líder) foram adicionados ao gene resultante que codifica a proteína alvo. Estes foram usados para clonar o gene em um vetor pET28a (Novagen). Eles também podem ser usados para a clonagem do gene que codifica a proteína para outros vetores. A 20 proteína alvo expressa a partir deste constructo foi equipado no N-terminal com um marcador de polihistidina (seis histidinas) precedido por um sítio reconhecido pela trombina, que posteriormente serviu para a sua purificação por meio da cromatografia de afinidade. A correção do 25 constructo resultante foi confirmada primeiramente por análise de restrição dos plasmídeos isolados, utilizando as enzimas Ndel e Xhol, seguida pela sequenciação automática de todo o quadro de leitura da proteína alvo. Os iniciadores utilizados para a sequenciação foram complementares às sequências do promotor T7 (5’ — TAATACGACTCACTATAGG-3 ') e terminador T7 (5'- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') presentes no vetor. O plasmídeo resultante foi utilizado para a superexpressão da proteína de fusao alvo em uma cepa comercial de E. coli, a qual foi transformada de acordo com as recomendações do fabricante. As colônias obtidas no meio de seleção (LB agar, canamicina 50 mg/mL, glucose a 1%) foram usadas para a preparação de uma cultura durante a noite em meio líquido LB suplementado com canamicina (50 μg/ml) e 1% de glicose. Após cerca de 15 h de crescimento em incubadora de agitação, as culturas foram utilizadas para inocular a cultura apropriada. Superexpressão e purificação das proteínas de fusão - Procedimento geral A

Meio LB com canamicina (30 μg/ml) e 100 μM de sulfato de zinco foi inoculado com a cultura durante a noite. A cultura foi incubada a 37 °C até a densidade ótica (OD) a 600 nm atingir 0,60 a 0,80. Em seguida, IPTG foi adicionado até à concentração final na faixa de 0,25 a 1 mM. Após a incubação (3,5 a 2 0 h) com agitação a 2 5 °C, a cultura foi centrifugada durante 25 min a 6000 g. Péletes bacterianas foram ressuspensas em um tampão contendo 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 7,4. A suspensão foi sonicada em gelo durante 8 minutos (40% de amplitude, 15 segundos de impulsos, intervalo de 10 s). O extrato resultante foi purificado por centrifugação durante 40 minutos a 20000 g, 4 °C. A resina Ni-Sepharose (GE Healthcare) foi pré-tratada pelo equilíbrio com tampão, o qual foi utilizado para a preparação do extrato de células bacterianas. A resina foi então incubada durante a noite a 4 °C com o sobrenadante obtido após a centrifugação do extrato. Depois, foi carregada na coluna de cromatografia e lavada com 15 a 50 volumes de tampão de 50 mM de KH2PO4, NaCl a 0,5 M, 20 mM de imidazol, pH 7,4. A proteína obtida foi eluída a partir da coluna utilizando gradiente de imidazol em 50 mM de tampão de KH2PO4 com 0,5 M de NaCl, pH 7,4. As frações obtidas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações apropriadas foram combinadas e dialisadas durante a noite a 4 °C contra 50 mM do tampão Tris, pH 7,2, 150 mM de NaCl, 500 mM de L-arginina, 0,1 mM de ZnSCU, 0,01% de Tween 20, e ao mesmo tempo 10 Histag foi clivada com trombina (1:50). Após a clivagem, a trombina foi separada da proteína de fusão alvo usando resina de Benzamidina SepharoseTM. A pureza do produto foi analisada por electroforese de SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1982).

Superexpressão e purificação de proteínas de fusão - Procedimento geral B Meio LB com canamicina (30 μg/ml) e 100 μM de sulfato de zinco foi inoculado com a cultura durante a noite. As culturas foram incubadas a 37 °C até a densidade ótica (OD) a 600 nm atingir 0,60 a 0,80. Em seguida, IPTG foi adicionado até à concentração final na faixa de 0,5 -1 mM. Após 20h de incubação com agitação a 25 °C a cultura foi centrifugada durante 25 min a 6000 g. As células bacterianas foram interrompidas após a superexpressão em uma Prensa francesa em um tampão contendo 5 0 mM de KH2PO4, NaCl a 0,5 M, 10 mM de imidazol, 5 mM de beta- mercaptoetanol, 0,5 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetil- sulfonila), pH 7,8. O extrato resultante foi purificado por centrifugação durante 50 minutos a 8000 g. O sobrenadante obtido foi incubado durante a noite com resina de Ni- Sepharose. Em seguida, a resina com a proteína ligada foi embalada na coluna cromatográfica. Para lavar as frações contendo as proteínas de não-ligação, a coluna foi lavada com 15 a 50 volumes de tampão de 50 mM de KH2PO4, NaCl a 0,5 M, 10 mM de imidazol, 5 mM de beta-mercaptoetanol, 0,5 mM de PMSF (fluoreto de fenil-metilsulfonila) , pH 7,8. Em seguida, para lavar a maioria das proteínas que se ligam especificamente com o leito, a coluna foi lavada com um tampão contendo 50 mM de KH2PO4, NaCl a 0,5 M, 500 mM de imidazol, 10% de glicerol, 0,5 mM de PMSF, pH 7,5. As frações obtidas foram analisadas por SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1982). As frações contendo a proteína alvo foram combinadas e clivadas com trombina (1U por 4 mg da proteína, 8h a 16 °C) para remover o marcador de polihistidina. Em seguida, as frações foram dialisadas contra tampão de formulação (500 mM de L-arginina, 50 mM de Tris, 2,5 mM de ZnSO4, pH 7,4). Exemplo 1. A proteína de fusão da SEQ N°. 1

A proteína da SEQ. N° 1 é uma proteína de fusão possuindo um comprimento de 345 aminoácidos e a massa de 39,8 kDa, sendo que no N-terminal da sequência TRAIL122-281 uma subunidade 2b de 165 aminoácidos do interferon alfa humano (SEQ N°. 17) é anexada como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL são incorporadas sequencialmente ao lado uma da outra sequências de sítios de clivagem da protease reconhecidos por metaloproteases MMP (SEQ N° 20) e uroquinase uPA (SEQ N° 21), devido a que o peptídeo efetor vai sofrer clivagem no ambiente do tumor após internalização da proteína de fusão.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na FIG. 1 e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. N° 1 e SEQ. N° 29, como mostradas na Listagem de Sequências em anexo.

A sequência de aminoácidos SEQ N°. 1 da estrutura descrita acima foi utilizada como modelo para gerar a sua sequência de DNA de codificação SEQ N°. 29. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi efetuada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o processo geral A, usando cepas de E. coli BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS da Novagen. A proteína foi separada pela eletroforese de acordo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 2. A proteína de fusão da SEQ N°. 2

A proteína da SEQ N°. 2 é uma proteína de fusão possuindo o comprimento de 347 aminoácidos e a massa de 40 kDa, em que no C-terminal da sequência TRAIL120-281 uma subunidade de 165 aminoácidos 2b do interferon alfa humano (SEQ N°. 17) é anexada como um peptideo efetor. Entre o peptideo efetor e a sequência de TRAIL são incorporadas sequencialmente ao lado uma das outras sequências de sítios de divagem de protease reconhecidos por metaloproteases MMP (SEQ N° 20) e uroquinase de uPA (SEQ N° 21), devido a que o peptideo efetor vai sofrer divagem no ambiente do tumor após internalização da proteína de fusão.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na FIG. lea sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. N° 2 e SEQ. N° 30, como mostrado na Listagem de Sequências em anexo.

A sequência de aminoácidos SEQ N°. 2 da estrutura descrita acima foi utilizada como molde para gerar a sua sequência de codificação de DNA SEQ N°. 30. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi efetuada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o processo geral A, usando a cepa de E. coli BL21 (DE3) da Novagen. A proteína foi separada por electroforese de acordo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 3. A proteína de fusão da SEQ. N°. 3

A proteína da SEQ. N°. 3 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 352 aminoácidos e a massa de 40,4 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL122-281 uma subunidade de 165 aminoácidos 2b do interferon humano alfa (SEQ. N°. 17) é anexada como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL existem duas combinações de sequências incorporadas de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre estas duas combinações da SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão incorpora adicionalmente o ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 3 e SEQ. N°. 31 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 3 apresentada acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. No 31 apresentada acima. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral B, usando a cepa BL21 (DE3) da E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 4. A proteína de fusão da SEQ. N°. 4

A proteína da SEQ. N°. 4 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 353 aminoácidos e a massa de 40,5 kDa, na qual no C-terminal da sequência TRAIL121 -281 uma subunidade de 165 aminoácidos 2b do interferon humano alfa (SEQ. N°. 17) é anexada como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL existem duas combinações de sequências incorporadas de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre estas duas combinações da SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão incorpora adicioalmente o ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 4 e SEQ. N°. 32 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 4 apresentada acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. No 32 apresentada acima. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral B, usando a cepa BL21DE3pLysSRIL de E. coli da Stratagene e Tuner (DE3)z de E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 5. A proteína de fusão da SEQ. N°. 5

A proteína da SEQ. N°. 5 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 300 aminoácidos e a massa de 34.7 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL116-281 um fragmento do interferon gama humano (SEQ. N°. 18) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL a proteína contém sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ).

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 5 e SEQ. N°. 33 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 5 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 33. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, using a cepa Tuner (DE3) de E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 6. A proteína de fusão da SEQ. N°. 6

A proteína da SEQ. N°. 6 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 307 aminoácidos e a massa de 35,1 kDa, na qual no C-terminal da sequência TRAIL116-281 um fragmento do interferon gama humano (SEQ. N°. 18) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL a proteína contém sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível (SEQ. N°. 27) entre a sequência de TRAIL e o sítio de clivagem de metaloprotease MMP; e ligador de glicina-serina flexível (SEQ. N°. 28) entre o sítio de clivagem de uroquinase uPa e a sequência efetora.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 6 e SEQ. N°. 34 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 6 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 34. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando a cepa Tuner(DE3) de E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 7. A proteína de fusão da SEQ. N°. 7

A proteína da SEQ. N°. 7 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 310 aminoácidos e a massa de 35,5 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL116-281 um fragmento do interferon gama humano (SEQ. N°. 18) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL a proteína contém sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível da SEQ. N°. 26 entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de metaloprotease MMP; e ligador de glicina-serina flexível SEQ. N°. 26 entre o sítio de clivagem de uroquinase uPa e sequência TRAIL.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 7 e SEQ. N°. 35 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 7 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 35. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando a cepa Tuner(DE3) de E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 8. A proteína de fusão da SEQ. N°. 8

A proteína da SEQ. N°. 8 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 310 aminoácidos e a massa de 35,3 kDa, na qual no C-terminal da sequência TRAIL116-281 um fragmento do interferon gama humano (SEQ. N°. 18) é anexada como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL a proteína contém sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de metaloprotease MMP; e ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre o sítio de clivagem de uroquinase uPa e sequência TRAIL.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 8 e SEQ. N°. 36 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 8 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 36. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando a cepa Tuner(DE3) de E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 9. A proteína de fusão da SEQ. N°. 9

A proteína da SEQ. N°. 9 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 317 aminoácidos e a massa de 35,9 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL116-281 um fragmento do interferon gama humano (SEQ. N°. 18) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL é incorporada a combinação dos sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre a SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão contém adicionalmente o ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de metaloprotease MMP; e ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre o sítio de clivagem de uroquinase uPa e sequência TRAIL.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 9 e SEQ. N°. 37 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 9 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 37. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, using a cepa Rosetta (DE3) da E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 10. A proteína de fusão da SEQ. N°. 10

A proteína da SEQ. N°. 10 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 338 aminoácidos e a massa de 38,3 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL95-281 um fragmento do interferon gama humano (SEQ. N°. 18) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL a proteína de fusão contém as sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente do tumor mediante internalização da proteína de fusão. Próximo à SEQ. N°. 21 a proteína de fusão contém adicionalmente o ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de metaloprotease MMP o ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26); e entre o ligador para peguilação e sequência TRAIL o ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26).

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 10 e SEQ. N°. 38 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 10 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 38. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando as cepas BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS da E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 11. A proteína de fusão da SEQ. N°. 11

A proteína da SEQ. N°. 11 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 317 aminoácidos e a massa de 35,9 kDa, na qual no C-terminal da sequência TRAIL116-281 um fragmento do interferon gama humano (SEQ. N°. 18) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL a proteína contém sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre a SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão contém adicionalmente o ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de metaloprotease MMP; e ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre o sítio de clivagem de uroquinase uPa e sequência TRAIL.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 11 e SEQ. N°. 39 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 11 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 39. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando as cepas BL21 (DE3) de E. coli e Tuner(DE3)pLysS de E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 12. A proteína de fusão da SEQ. N°. 12

A proteína da SEQ. N°. 12 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 449 aminoácidos e a massa de 51,8 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL116-281 um pseudodímero de cadeia única do interferon gama humano (SEQ. N°. 19) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL a proteína contém sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão.

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de metaloprotease MMP; e ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre o sítio de clivagem de uroquinase uPa e sequência TRAIL.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 12 e SEQ. N°. 40 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 12 da estrutura descrita acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 40. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando as cepas BL21 (DE3) de E. coli e Tuner(DE3)pLysS de E. coli da Novagen. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 1 3. A proteína de fusão da SEQ. N°. 13

A proteína da SEQ. N°. 13 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 449 aminoácidos e a massa de 51,8 kDa, na qual no C-terminal da sequência TRAIL116-281 um pseudodímero de cadeia única do interferon gama humano (SEQ. N°. 19) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL são incorporadas sequencialmente sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente do tumor mediante internalização da proteína de fusão.

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de uroquinase uPa; e ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre o sítio de clivagem de metaloprotease MMP e sequência TRAIL.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 13 e SEQ. N°. 41 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 13 apresentada acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. No 41 apresentada acima. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral B, usando a cepa B.21 (DE3) de E. coli da Novagen e cepa L21DE3pLysSRIL de E. coli da Stratagene. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 14. A proteína de fusão da SEQ. N°. 14

A proteína da SEQ. N°. 14 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 456 aminoácidos e a massa de 52,4 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL116-281 um pseudodímero de cadeia única do interferon gama humano (SEQ. N°. 19) é anexado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL são incorporadas sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre as sequências SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão contém adicionalmente ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de uroquinase uPa; e ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre o sítio de clivagem de metaloprotease MMP e sequência TRAIL.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 14 e SEQ. N°. 42 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 14 apresentada acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 42 apresentada acima. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral B, usando a cepa B.21 (DE3) de E. coli da Novagen e cepa BL21DE3pLysSRIL de E. coli da Stratagene. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 15. A proteína de fusão da SEQ. N°. 15

A proteína da SEQ. N°. 15 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 456 aminoácidos e a massa de 52,4 kDa, na qual no C-terminal da sequência TRAIL116-281 um pseudodímero de cadeia única do interferon gama humano (SEQ. N°. 19) é anexado como um peptídeo efetor. Entre a sequência de TRAIL e o peptídeo efetor a proteína de fusão contém sequências de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre as sequências SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão contém adicionalmente o ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A proteína também compreende ligadores flexíveis: ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de uroquinase uPa; e ligador de glicina-serina flexível GSGGG (SEQ. N°. 26) entre a sequência de TRAIL e o sítio de clivagem de metaloprotease MMP.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 15 e SEQ. N°. 43 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 15 apresentada acima foi usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 43 apresentada acima. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA foi gerado e a superexpressão da proteína de fusão foi realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão foi realizada de acordo com o procedimento geral B, usando a cepa B.21 (DE3) de E. coli da Novagen e cepa L21DE3pLysSRIL de E. coli da Stratagene. A proteína foi separada por eletroforese de acodo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 16. A proteína de fusão da SEQ. N°. 44

A proteína da SEQ. N°. 44 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 538 aminoácidos e a massa de 62,4 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL122-281 um pseudodímero de cadeia única do interferon humano alfa 2b (SEQ. N°. 46) é anexado como um peptídeo efetor. Entre a sequência do peptídeo efetor e a sequência de TRAIL existem duas combinações de sequências incorporadas de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21 ) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre as duas combinações de sequências SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão contém adicionalmente ligador para peguilação (SEQ. N°. 22).

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 4 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 44 e SEQ. N°. 48 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 44 apresentada acima é usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 48 apresentada acima. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA pode ser gerado e a superexpressão da proteína de fusão realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão pode ser realizada de acordo com o procedimento geral B, usando a cepa B.21 (DE3) de E. coli da Novagen e cepa L21 DE3pLysSRIL de E. coli da Stratagene. A proteína pode ser separada por eletroforese de acordo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 17. A proteína de fusão da SEQ. N°. 45

A proteína da SEQ. N°. 45 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 384 aminoácidos e a massa de 44 kDa, na qual no N-terminal da sequência TRAIL95-281 uma sequência de consenso do interferon humano alfa (SEQ. N°. 47) é anexada como um peptídeo efetor. Entre a sequência do peptídeo efetor e a sequência de TRAIL existem duas combinações de sequências incorporadas de sítios de clivagem de protease reconhecidos por metaloprotease MMP (SEQ. N°. 20) e uroquinase uPA (SEQ. N°. 21) devido aos quais o peptídeo efetor sofrerá clivagem no ambiente tumoral mediante internalização da proteína de fusão. Entre as combinações das sequências SEQ. N°. 20 e SEQ. N°. 21 a proteína de fusão contém adicionalmente ligador para peguilação (SEQ. N°. 22). A proteína também compreende ligador de glicina-serina flexível GGSG (SEQ. N°. 50) entre a sequência de peptídeo efetor e sítio de clivagem de metaloprotease MMP.

A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 4 e sua sequência de aminoácido e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. N°. 45 e SEQ. N°. 49 como mostrados na Listagem de Sequência anexa.

A sequência de aminoácido SEQ. N°. 45 apresentada acima é usada como um modelo para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. N°. 4 9 apresentada acima. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA pode ser gerado e a superexpressão da proteína de fusão realizada de acordo com os procedimentos gerais descritos acima. A superexpressão pode ser realizada de acordo com o procedimento geral B, usando a cepa B.21 (DE3) de E. coli da Novagen e cepa L21 DE3pLysSRIL de E. coli da Stratagene. A proteína pode ser separada por eletroforese de acordo com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 18. Exame da atividade antitumoral das proteínas de fusão

O exame da atividade antitumoral das proteínas de fusão foi realizado in vitro em um ensaio de citotoxicidade nas linhagens celulares tumorais e in vivo em camundongos. Para fins de comparação, a proteína rhTRAILl14-281 e placebo foram utilizados. 1. Medição de dicroísmo circular

A qualidade das preparações das proteínas de fusão em termos da sua estrutura foi determinada pelo dicroismo circular (CD) para os Ex. 3, Ex. 5, Ex. 12 e Ex. 14 .

O dicroísmo circular é utilizado para a determinação de estruturas secundárias e conformação da proteína. O método de CD utiliza uma atividade ótica das estruturas da proteína, que se manifestam na rotação do plano de polarização da luz e aparência de polarização elíptica. O espectro de CD das proteínas no ultravioleta distante (UV) fornece dados precisos sobre a conformação da cadeia polipeptídica principal.

As amostras da proteína a ser analisada após a formulação em um tampão consistindo em 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de NaCl, 10% de glicerol, 0,1 mM de ZnC12, 80 mM de sacarose, 5 mM de DTT foram dialisadas em sacos de diálise (Sigma-Aldrich) com corte de 12 kDa. A diálise foi realizada contra o excesso de 100 vezes (v/v) do tampão em comparação com as preparações da proteína com agitação durante várias horas a 4 °C. Após a diálise ser concluída, cada preparação foi ' centrifugada (25 000 rpm, 10 min., 4 °C) e os sobrenadantes apropriados foram coletados. A concentração da proteína nas amostras assim obtidos, foi determinada pelo método de Bradford.

A medição do dicroísmo circular para as proteínas na faixa de concentração de 0,1 a 2,7 mg/ml foi realizada no espectropolarímetro Jasco J-710, em um cuvete de quartzo com via ótica de 0,2 mm ou 1 mm. A medição foi realizada sob fluxo de nitrogênio, a 7 l/min, o que permitiu a realização da medição na faixa de comprimento de onda de 195 a 250 nm. Os parâmetros de medição: resolução espectral de - 1 nm, meia largura do feixe de luz de 1 nm, sensibilidade de 20 mdeg, o tempo médio para um comprimento de onda - 8 s, velocidade de varredura de 10 nm/min.

Os resultados foram apresentados como a média das três medições. Os espectros de dicroísmo circular para rhTRAIL.114-281, rhTRAIL95-281 e as proteínas dos Ex. 12, Ex. 5, Ex. 3 e Ex. 14 são apresentadas na Fig. 5.

Os espectros obtidos foram analisados numericamente na faixa de 193 a 250 nm, utilizando o software CDPro. Pontos para os quais a tensão no fotomultiplicador excederam 700 V foram omitidos, devido à razão de sinal-ruído muito baixa nesta faixa de comprimentos de onda.

Os dados obtidos serviram para cálculos de conteúdo de estruturas secundárias particulares nas proteínas analisadas com o uso do software CDPro (Tabela D • Tabela 1. Teor das estruturas secundárias nas proteínas analisadas

* Valor obtido com base na estrutura cristalina de 1 D4V

Controles (rhTRAIL114-281 e rhTRAIL95-281) mostram característica do espectro de CD para as proteínas com estruturas predominantemente do tipo β-folha (mínima elipticidade acentuadamente delineada no comprimento de onda de 220 nm). Isto confirma o cálculo dos componentes da estrutura secundária, o que sugere um número marginal de elementos de a-hélice.

O resultado obtido é também consistente com os dados da estrutura cristalina da proteína TRAIL, em que os elementos beta constituem mais de metade da sua composição.

No caso das proteínas fundidas dos Ex. 3, Ex. 5, Ex. 12 e Ex. 14, os espectros de dicroísmo são caracterizados por dois mínimos nos comprimentos de onda 208 e 220 nm, que é característica das proteínas com a estrutura secundária mista do tipo alfa/beta. Moléculas de interferon ligadas à TRAIL nas proteínas fundidas formam estruturas predominantemente alfa-helicoidais, portanto, a natureza mista das estruturas secundárias nas proteínas quiméricas analisadas pode confirmar a presença de elementos devidamente dobrados de ambos TRAIL e interferon.

No caso das preparações de acordo com os Ex. 3. e Ex. 14, quase 100% das estruturas do tipo alfa foi encontrado. Este teor de estruturas do tipo-alfa é devido à estreita faixa de comprimentos de onda utilizada na análise, o que é uma consequência da seleção de formulações ideais para os métodos e materiais (elevada quantidade de ruído no UV distante). A ausência da faixa bruscamente delineada de 180 a 200 nm na região analisada do espectro pode fazer com que o conteúdo das estruturas de a-hélice seja superestimado. 2. Testes em linhagens celulares in vitro Linhagens celulares Tabela 2 Linhagens celulares aderentes

Tabela 3. Células nao aderentes:

Teste de citotoxicidade MTT

O teste MTT é um ensaio colorimétrico usado para medir a proliferação, viabilidade e a citotoxicidade das células. Ele consiste na decomposição de um MTT de sal de tetrazólio amarelo (brometo de 4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio) para o formazano de tintura roxa insolúvel em água pela enzima mitocondrial succinato-tetrazólio reductase 1. A redução de MTT ocorre apenas em 5 células vivas. A análise dos dados consiste em determinar a concentração de IC50 da proteína (em ng/ml), na qual a redução de 50% no número de células ocorre na população tratada em comparação com as células de controle. Os resultados foram analisados utilizando o software GraphPad Prism 5.0. 0 teste foi realizado de acordo com as descrições da literatura (Celis, JE, (1998) Cell Biology, a Laboratory Handbook, segunda edição, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004 ); Involvement fo viral anda chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183).

O meio de cultura de célula foi diluído até uma densidade definida (104-105 células por 100 μl) . Em seguida, 100 μl da suspensão de célula diluída de forma adequada foram aplicados a uma placa de 96 poços em triplicatas. Assim, as células preparadas foram incubadas durante 24 h a 37 °C em 5% ou 10% de C02, dependendo do 2 0 meio utilizado, e, em seguida, às células (em 100 μl do meio) mais 100 μl do meio contendo várias concentrações de proteínas testadas foram adicionados. Após incubação das células com proteínas testadas durante o período de 72 horas, o que é equivalente a 3 a 4 vezes ae divisão celular, o meio com a proteína de teste foi adicionado com 2 5 2 0 ml da solução de trabalho de MTT [ 5 mg/ml ], e a incubação foi continuada durante 3 h a 37 °C em 5% de CO2. Então, o meio com a solução de MTT foi removido e os cristais de formazan foram dissolvidos pela adição de 100 μl de DMSO. Após agitação, a absorbância foi medida a 570 nm (filtro de referência 690 nm). 30 Teste de citotoxicidade EZ4U

O teste de EZ4U (Biomedica) foi utilizado para testar a atividade citotóxica das proteínas em linhagens celulares não aderentes. O ensaio é uma modificação de MTT em que o formazano formado na redução do sal de tetrazólio é solúvel em água. Estudo de viabilidade da célula foi realizado após a incubação contínua de 72 horas das células com a proteína (sete concentrações de proteína, cada em triplicata). Nesta base, os valores de IC50 foram determinados (como uma média de dois experimentos independentes), utilizando o software GraphPad Prism 5.

Os resultados dos testes de citotoxicidade in vitro encontram-se resumidos na Tabela 4 e na Tabela 5, como valores de IC50 (ng/ml), o que corresponde a uma concentração de proteína em que o efeito citotóxico das proteínas de fusão é observado no nível de 50% com relação às células de controle tratadas somente com solvente. Cada experimento representa o valor médio de pelo menos duas experiências independentes realizadas em triplicatas. Como um critério de ausência de atividade das preparações de proteína o limite de IC50 de 2.000 ng/ml foi adotado. As proteínas de fusão com um valor de IC50 superior a 2000 foram consideradas inativas.

As células para este teste foram selecionadas de modo a incluir as linhagens celulares de tumor, naturalmente resistentes à proteína TRAIL (o critério da resistência natural para TRAIL: IC50 para a proteína TRAIL > 2000), linhagens celulares tumorais sensíveis à proteína TRAIL e resistentes à linhagem da doxorrubicina MES SA/DX5 como uma linhagem de câncer resistente aos medicamentos anticancerosos convencionais.

A linhagem celular HUVEC indiferenciado foi usada como uma linhagem celular de controle saudável para a avaliação do efeito/toxicidade das proteínas de fusão em células não-cancerosas.

Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de ultrapassar a resistência das linhagens celulares para TRAIL através da administração de certas proteínas de fusão da invenção para as células naturalmente resistentes a TRAIL. Quando as proteínas de fusão da invenção foram administradas para as células sensíveis à TRAIL foram administradas, em alguns casos, uma potenciação clara e forte da potência da ação foi observada, manifestando-se em valores de IC50 reduzidos da proteína de fusão em comparação com IC50 para TRAIL sozinha. Além disso, a atividade citotóxica da proteína de fusão da invenção nas células resistentes à doxorrubicina do medicamento anticancerígeno clássico foi obtida e, em alguns casos, 5 foi mais forte do que a atividade da TRAIL sozinha.

Os valores de IC50 acima de 2000 obtidos para as linhagens celulares não cancerosas mostram a ausência de efeitos tóxicos associados com a utilização das proteínas da invenção para as células saudáveis, indicando assim uma baixa toxicidade sistêmica 10 potencial da proteína.

Determinação da atividade citotóxica das preparações de proteína selecionadas contra o painel estendido das linhagens celulares tumorais A Tabela 5 apresenta os resultados dos testes de 15 atividade citotóxica in vitro para as proteínas de fusão selecionadas da invenção contra um amplo painel de células tumorais de diferentes órgãos, correspondentes à ampla faixa dos cânceres mais comuns. Os valores de IC50 obtidos confirmam elevada atividade citotóxica das proteínas de fusão e, portanto, a sua utilidade 20 potencial no tratamento do câncer. Tabela 4. Atividade citotóxica das proteínas de fusão da invenção

Tabela 5. Análise da atividade citotóxica das preparações de proteína selecionadas contra o amplo painel de linhagens celulares de tumor

2. Eficácia antitumoral das proteínas de fusao in vivo em xenoenxertos

Atividade antitumoral das preparações de proteína foi testada em um modelo de camundongo do câncer do colo humano HCT116 Células

As células HCT116 foram mantidas no meio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, EUA) misturadas na proporção de 1:1 com Opti-MEM ((Invitrogen, Cat.22600-134) suplementado com soro de cabra fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto do camundongo, as células foram separadas do suporte pela lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4 °C, 8 min., suspensas em tampão de HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25xl06 células/ml.

As células PLC/PRF/5 (CLS) foram mantidas em DMEM (HyClone, Logan, Utah, EUA) suplementadas com soro de cabra fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto do camundongo, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4 °C, 8 min., suspensas em tampão de HBSS (Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25xl06 células/ml.

As células HepG2 foram mantidas em MEM (HyClone, Logan, Utah, EUA) suplementado com soro de cabra fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto do camundongo, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4 °C, 8 min., suspensas em tampão de HBSS (Hanks médio), contadas e diluídas para a concentração de 25xl06 células/ml. Camundongos

O exame da atividade antitumoral das proteínas da invenção foi realizado em camundongos CD-nude de 7 a 9 semanas de idade (Crl:CD1-Foxnlnu 1) ou em camundongos Crl: SHO-PrkdcscldHrhr de 4 a 5 semanas de idade obtidos a partir de Charles River Germany. Os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, com livre acesso a comida e água desmineralizada (ad libitum). Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes de "Interdisciplinary Principles e Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing e Education" distribuída pela New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research e foram aprovadas the IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (N°. 71 /2009). O curso e avaliação das experiências Modelo do câncer do cólon humano Camundongos Crl: CD1-Foxnlnu 1

No dia 0 os camundongos Crl: CD1-Foxnlnu 1 foram enxertados subcutaneamente (sc) no lado direito com 5xl06 das células HCT116 suspensas em 0,2 ml do tampão de HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x2 5 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de - 50 a 140 mm3 (dia 14), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 7 0 mm3 e atribuídos aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção dos Ex. 3, Ex. 12 e Ex.14 (10 mg/kg), e rhTRAILl14-281 (10 mg/kg) como uma referência comparativa e tampão da formulação (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0, 1 mM de ZnCl2, 10% de glicerol, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) diariamente durante 10 dias nos dias 8 a 12 e 15 a 19. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de - 1000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281. Camundongos Cri; SHO-PrkdcscldHrhr

No dia 0 os camundongos Cri: SHO-PrkdcscldHrhr foram enxertados subcutaneamente (sc) no lado direito com 5xl06 de células HCT116 suspensas em 0,1 ml do tampão de HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x2 5 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de 200-700 mm3 (dia 18), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 400 mm3 e atribuídos aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção do Ex. 14 (50 mg/kg), rhTRAILl14-281 (20 mg/kg) como uma referência comparativa e tampão de formulação (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0, 1 mM de ZnCl2, 10 % de glicerol, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada segundo dia. No dia 32 da experiência, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. Modelo de câncer de fígado humano Células PLC/PRF/5

No dia 0 os camundongos Cri: SHO-PrkdcscldHrhr foram enxertados subcutaneamente (sc) no lado direito com 7xl06 de células PLC/PRF/5 suspensas em 0,1 ml de mistura de HBSS: tampão de Matrigel (3: 1) por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de 140 a 300 mm3 (dia 31), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 200 mm3 e atribuídos aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção do Ex. 14 (20 mg/kg), rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma referência comparativa, e tampão de formulação (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) quatro vezes a cada terceiro dia e posteriormente duas vezes a cada segundo dia (q3dx4 e q2dx2). No 32° dia da experiência, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. Células HepG2

No dia 0 os camundongos Cri: SHO-PrkdcscldHrhr foram enxertados subcutaneamente (sc) no lado direito, com 7xl06 células de HepG2 suspensas em 0,1 ml de mistura de HBSS:tampão de Matrigel (3: 1) por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x2 5 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de 250-390 mm3 (dia 19), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 330 mm3 e atribuídos aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção do Ex. 14 (50 mg/kg), rhTRAILl14-281 (30 mg/kg) como uma referência comparativa, e contra o tampão da formulação (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada segundo dia. No 31° dia de experiência, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal.

O tamanho do tumor foi medido utilizando um compasso de calibre eletrônico, o volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: (a2 x b)/2, em que a = diagonal mais curta do tumor 25 (mm) e b = diagonal mais longa do tumor (mm). A inibição do crescimento do tumor foi calculada utilizando a fórmula: TGI [%] (inibição do crescimento do tumor) = (WT/WC) x 100 - 100% em que WT se refere ao volume médio do tumor no grupo de tratamento, WC refere-se ao volume médio do tumor no grupo de controle.

Os resultados experimentais são apresentados como um valor médio ± desvio padrão (DP). Todos os cálculos e gráficos foram preparados utilizando o software GraphPad Prism 5.0.

Os resultados experimentais obtidos em camundongos Cri: CD1-Foxnlnu sobrecarregados com câncer do cólon HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invenção dos Ex. 3, Ex. 12 e Ex. 14 e comparativamente com rhTRAILl14-281 são mostrados na FIG. 6 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na Figura 7, que mostra a inibição do crescimento do tumor (% de TGI) como a percentagem de controle.

Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 6 e 7 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção dos Ex. 3, Ex. 12 e Ex.14 causaram a inibição do crescimento do tumor HCT116, com TGI respectivamente de 71%, 67% e 75% em relação ao controle no 28° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibidor no crescimento das células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 44%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais forte em comparação com a TRAIL sozinha.

Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscldHrhr sobrecarregados com o câncer do cólon HCT116 tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 (20 mg/kg) e comparativamente com rhTRAILl 14-281 são mostrados na FIG. 8 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na Figura 9, que mostra a inibição do crescimento do tumor (% de TGI) como a percentagem de controle.

Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 8 e 9 mostram que a administração da proteína de fusão da invenção do Ex. 14 causou a inibição do crescimento do tumor HCT116, com TGI de 22,5% em relação ao controle no dia 32 do experimento. Para rhTRAILl 14-281 utilizada como referência comparativa, um ligeiro efeito inibidor no crescimento das células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 5,6%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais forte em comparação com a TRAIL.

Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscldHrhr sobrecarregados com câncer do fígado PLC/PRF/5 tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 10 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na Figura 11, que mostra a inibição do crescimento do tumor (% de TGI) como a percentagem de controle.

Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 10 e 11 mostram que a administração da proteína de fusão da invenção do Ex. 14 causou a inibição do crescimento do tumor PLC/PRF/5, com TGI de 34% em relação ao controle no dia 49 da experiência. Para rhTRAILl14-281 utilizada como referência comparativa, um ligeiro efeito inibidor no crescimento das células tumorais foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 18%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais forte em comparação com TRAIL.

Os resultados experimentais obtidos em camundongos Cri: SHO-PrkdcscldHrhr sobrecarregados com câncer do fígado HepG2 tratados com a proteína de fusão da invenção do Ex. 14 e comparativamente com rhTRAILl14-281 são mostrados na FIG. 12 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na Figura 13, gue mostra a inibição do crescimento do tumor (% de TGI) como a percentagem de controle.

Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 12 e 13 mostram que a administração da proteína de fusão da invenção do Ex. 14 causou a inibição do crescimento do tumor HepG2, com TGI de 33,6% em relação ao controle, no dia 31 da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizada como preparação de referência, um ligeiro efeito inibidor no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 7%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais forte em comparação com TRAIL.

As proteínas de fusão testadas não causam efeitos secundários significativos manifestados por uma diminuição no peso corporal dos camundongos (isto é, menos do que 10% do peso corporal inicial). Isso mostra baixa toxicidade sistêmica da proteína.

Claims (11)

1. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende: domínio (a) que é um fragmento funcional da sequência da proteína hTRAIL de SEQ. ID No 16, em que o fragmento começa com um aminoácido em uma posição não inferior a hTRAIL95, ou um homólogo do fragmento funcional; em que o referido fragmento funcional ou seu homólogo tem a capacidade de se ligar a receptores de morte na superfície celular e induzir apoptose em células de mamíferos; e domínio (b) que é uma sequência de um peptídeo efetor imunoestimulante, selecionada a partir do grupo que consiste no pseudodímero de interferon gama da SEQ ID No. 19 e no pseudodímero de interferon alfa 2b da SEQ ID No. 46, em que a sequência de domínio (b) está ligada ao C-terminal ou N-terminal do domínio (a). em que o domínio (a) compreende o fragmento da sequência de proteína hTRAIL, que começa com um aminoácido a partir da faixa de hTRAIL95 a hTRAIL122, inclusive, e termina com o aminoácido hTRAIL281.

2. Proteína de fusão, de acordo a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio (a) é selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos de hTRAIL114-281, começando com um aminoácido na posição 95, 116, 120, 121 ou 122.

3. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que entre o domínio (a) e o domínio (b) contém pelo menos um domínio (c) que compreende um sítio de clivagem de protease selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência reconhecida pela metaloprotease MMP, sequência reconhecida por uroquinase uPA, e suas combinações; em que a sequência reconhecida pela metaloprotease MMP é a SEQ ID No. 20, e a sequência reconhecida por uroquinase uPA é SEQ ID No. 21.

4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio (c) é uma combinação da sequência reconhecida pela metaloprotease MMP e a sequência reconhecida por uroquinase uPA localizada uma ao lado da outra.

5. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizada pelo fato de que entre dois domínios (c) contém um domínio (d) de um ligante para a ligação de moléculas PEG, selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24 e SEQ ID No. 25.

6. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ligante estérico flexível de glicina-serina entre os domínios (a), (b), (c) e/ou (d).

7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o ligante de glicina-serina é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28 e SEQ ID No. 50.

8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No. 12; SEQ ID No. 13; SEQ ID No. 14; SEQ ID No. 15; e SEQ ID No. 44.

9. Sequência de polinucleotídeo caracterizada pelo fato de que codifica a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e pelo fato de é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No. 40; SEQ ID No. 41; SEQ ID No. 42; SEQ ID No. 43; e SEQ ID No. 48.

10. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo, a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de doenças cancerosas em mamíferos, incluindo os seres humanos.

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