KR20120041980A - 페길레이션된 인터페론 알파 동종체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람 인터페론 알파의 특정 부위에 아미노산 서열의 변형을 유전자 조작에 의해 실시하고, 아미노산 변형이 이루어진 부위에 적정한 크기의 PEG를 결합시킴으로써 사람 인터페론의 비활성 증대와 지속성을 갖도록 제작함에 있다.
Description
본 발명은 사람 인터페론 알파 유전자에 대해 유전자 조작 방법을 사용하여 시스테인을 포함하는 아미노산 서열을 첨가하고, 이 유전자가 도입된 균주의 배양액으로부터 인터페론 알파 동종체를 정제하여 시스테인에 특이적으로 결합하는 적정한 크기의 PEG와 결합시킴으로써 인터페론 알파 단백질의 체내 지속성은 물론 인터페론 알파 단백질의 비활성(specific activity)이 증대된 PEG-인터페론 알파를 제작하는 것이다.
인터페론 알파는 제1형 인터페론에 속하며, 제1형 인터페론에는 그외에도 인터페론 베타, 오메가가 존재하며 그들 사이의 아미노산 서열은 매우 유사하다.
인터페론은 항바이러스, 세포 증식 억제효과, 면역학적 수정 효과 (immunomodulatory) 등의 생물학적 활성을 갖는다(Stark 등, 1998). 이러한 특성 때문에 인터페론 알파-2는 1980년대 후반부터 암치료제와 바이러스 질환의 치료를 위해 사용되어 왔다. 특히 만성 B형과 C형 간염 치료제에서는 주요 의약품으로 사용되어 왔다. (Zeuzem et.al.,2000; Heathcote et.al.,2000; R.J. Wills. 1990; Barouki et.al.,1987: Craxi A. and Licata A. 2003; Choueiri et.al.,2003; Perry M.C. and Jarvis B.,1998))
간염 바이러스의 감염 인구가 전 세계적으로 B형 간염의 경우 3억 5천만 명이, C형 간염의 경우는 1억 7천만 명의 환자로 추정되고 있다. B형 간염의 경우는 한국, 일본 및 중국에 주로 분포하고 있다.
많은 종류의 자연적인 또는 유전자 재조합으로 생산된 단백질은 약리학적인 효능이 있지만, 치료제로서 주사하였을 경우에 항원성을 유발할 수도 있고, 수용성이 낮아서 주사제로서의 어려움이 있을 수 있으며, 또한 체내 잔류 기간이 짧아서 약리효과가 좋지 않을 수도 있다.
이러한 어려움을 극복하기 위해서 단백질과 PEG를 결합시키는 방법이 이용되어 왔으며, 이는 US Pat 4,179,337에서 처음 발표되었다. 이 특허에 의하면 PEG와 결합한 단백질 및 효소 등을 치료제로 사용할 경우, PEG가 갖는 장점인 항원성의 감소, 수용성의 증가, 체내 잔류 기간의 증가 등에서 효과를 나타낸다고 보고 하였다. PEG는 HO-(-CH2-CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로서, 친수성이 강하여 단백질과 결합해서 용해도를 증가시키기도 한다. 단백질에 결합할 때의 PEG 분자량의 사용 범위가 1,000-100,000 Da 정도의 크기로서, 이 범위에 속하는 PEG의 독성은 매우 낮은 것으로 알려져 있다. US Pat 4,766,106과 US Pat 4,917,888에서는 단백질에 PEG를 포함한 중합체를 결합시켜 단백질의 수용성을 증가시켰다고 밝혔다. US Pat 4,902,502에서는 PEG나 다른 중합체들을 재조합 단백질에 결합시켜 항원성을 줄이고 체내 잔존기간을 증가시켰다고 보고하고 있다.
1990년대 초부터 인터페론 투여 빈도를 줄이기 위해 반감기를 증가시키는 연구가 집중적으로 이루어졌다. 이들은 주로 인터페론 내에 존재하는 amine기와 반응할 수 있는 PEG를 사용하여 인터페론 알파-2의 혈액 내에서 반감기를 증대시킬 수 있음을 보여주었다. Amine-reactive PEG의 사용은 인터페론 알파에 10~11개(아형에 따라)의 라이신과 반응할 수 있으며, 또 N-말단의 아미노산에도 결합을 할 수 있다(Monkarsh et.al. 1997). 더욱이 이들 동종체들은 인터페론에 mono-, di-, multiple-PEG가 결합할 수도 있다. 호프만 라-로슈의 특허 US Pat 5,382,657에 따르면 결합한 PEG의 분자량이 낮을수록, PEG가 인터페론에 1개 결합한 것이 1개 이상의 PEG가 결합한 것보다 항바이러스 활성이 높았다고 보고하고 있다. 따라서 인터페론의 활성을 최대한 유지하기 위해서는 인터페론에 결합하는 PEG의 숫자를 최소한으로 하면서 PEG의 장점을 갖기 위해서는 PEG의 분자량이 큰 것을 선택할 것을 주장하고 있다.
Amine-PEGylated 인터페론 알파 2는 PEG가 결합하지 않은 인터페론 알파 2와 비교하여 in vitro에서 상당히 낮은 정도의(4~14배 낮은 활성) 생물학적 활성을 갖기 때문에 환자를 치료하기 위해 요구되는 단백질의 양을 증가시켜 사용하게 된다. 이 생물학적 활성의 감소는 인터페론 알파가 큰 분자량의 PEG(즉, 20-, 40- kDa PEG)로 수식될 때 크게 나타난다(Monkarsh et.al.,1997; Wang et.al.,2000; Bailon et.al.,2001). 이러한 종류의 PEG는 반감기를 증대시키는데 유용한 크기의 PEG이다. 또 단백질에 결합한 PEG는 크기가 증가함에 따라 신장에서의 배출되는 양은 줄고, 간에서의 분해가 증가 되는 등의 신체 내에서의 분포가 변하게 된다(Yamaoka et.al., 1994).
인터페론 알파 2에는 수용체와 결합하는 데 중요한 부위에 일부 라이신이 포함되어 있다(Radhakrishnan et.al. 1996). 그러므로 하나 혹은 그 이상의 주요 라이신 위치에 amine-reactive PEG가 결합하게 되면 활성의 감소를 일으키게 된다.
쉐링-푸라우사의 특허 US Pat 5,908,621, US Pat 5,985,263과 US Pat 5,951,974,에서 분자량 12,000 Da의 PEG를 34번 아미노산이 히스티딘에만 1개 결합한 PEG 인터페론의 경우 29%의 항바이러스 효과를 나타낸다고 발표하였다. 이와 같은 결과를 볼 때 체내 지속성을 증대시키기 위해 PEG를 결합할 경우 PEG가 결합하는 인터페론의 아미노산 위치가 매우 중요함을 알 수 있다.
단백질의 특정 위치에 PEG를 결합시키려는 시도는 인터루킨-2에서 이미 실시하였다(Goodson RJ, and Katre NV, 1990).
Rosendahl등은(2005) 사람 인터페론 알파 2b의 여러 부위의 아미노산을 치환 혹은 교체, 추가하여 이들의 생물학적 활성을 조사하였고, 또한 인터페론 알파의 특정 부위에 PEG를 결합할 수 있도록 시스테인으로 변형된 단백질에 maleimide-PEG를 결합하여 이들에 대한 생물학적 활성과 체내 지속성에 대한 조사를 수행하였다.
위치 특이적 PEG 결합은 이 황화 결합에 참여하지 않는 시스테인 잔기를 위치 지정 돌연변이를 유발시켜 단백질의 특정부위에 도입하는 것이다. 그리고 나서 시스테인 특이적 반응을 하는 PEG 조성물을 사용하여 새로이 도입된 시스테인에 공유결합으로 결합시켜 변형을 실시하는 것이다. 여기에서의 중요한 의의는 생물학적 활성을 미치지 않는 부위를 선정하여 시스테인으로 기존의 아미노산을 교체하고, 이 위치에 PEG 결합을 시키는 것이다. 위치 특이적 PEG 결합으로 인터페론 알파에 PEG를 결합하게 되면, 구조적으로 동질 한 제품을 만들 수 있을 뿐만 아니라, amine-PEGylated 인터페론보다 높은 비활성을 갖는 PEG-인터페론을 만들 수 있다. 그 결과 기존의 PEG-인터페론과는 유사한 정도의 반감기를 유지할 수 있어 투여 빈도를 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 더 나아가서는 적은 용량의 PEG-인터페론을 투여할 수도 있을 것으로 기대된다. 이는 PEG-인터페론의 투여 용량의 감소로 인터페론이 갖고 있는 고유의 부작용을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라 경제적인 치료도 가능할 것으로 기대된다.
본 발명에서는 PEG의 특이적 결합 위치로서 사람 인터페론 알파 단백질의 C-말단에 프롤린-시스테인 또는 시스테인을 추가하여, 이 위치에 시스테인 특이적 PEG를 결합시켜 비활성과 체내 지속성의 증대를 이루고자 하였다. 사람 인터페론 알파 단백질의 C-말단에 프롤린-시스테인 추가는 본 발명에서 처음 시도된 것이며, 시스테인의 추가는 Rosendahl 등에 의해 연구된 바 있으나, 이들은 이 C-말단에 시스테인이 추가된 인터페론을 대장균에서 생산할 때 불용성의 상태로 존재하여 중요성을 부여하지 않았다. 본 발명에서는 불용성 상태로 존재하는 인터페론을 수용성의 상태로 효율적으로 전환시켜 문제점을 해결하였다. 또한, 본 발명의 특징은 PEG가 결합하는 위치뿐만 아니라, PEG의 크기에 대한 연구이다. PEG 분자량의 크기가 증대함에 따라 인터페론 알파의 체내 지속성의 증대 효과가 증가하지만, 비활성 정도는 그 반대의 결과를 나타낸다. 따라서 본 발명에서는 지속성을 증대시킬 수 있는 최소 크기의 PEG 선정을 주장한다. 본 발명에서는 PEG 분자량의 크기는 20,000 Da 이상 40,000 Da 미만의 PEG 사용이 비활성은 30%~52.9%의 범위를 나타냄으로써, 감소를 최소화할 수 있으며, 체내 지속성도 유지시킬 수 있음을 확인하였다.
Bailon et.al. "Rational design of a potent, long-lasting form of interferon: a 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon alpha-2a for the treatment of hepatitis C." Bioconjug Chem. 12,195-202(2001)
Barouki et.al. "Time course of interferon levels, antiviral state, 2',5'-oligoadenylate synthetase and side effects in healthy men." J Interferon Res. 7,29-39(1987)
Choueiri et.al. "Evolving role of pegylated interferons in metastatic renal cell carcinoma."Expert Rev Anticancer Ther.3,823-9(2003)
Craxi A, Licata A "Clinical trial results of peginterferons in combination with ribavirin."Semin Liver Dis.23(Suppl 1),35-46(2003)
Goodson RJ, Katre NV "Site-directed pegylation of recombinant interfleukin-2 at its glycosylation site." Biotechnology, 8,343-6(1990)
Heathcote et.al. "Peginterferon alfa-2a in patients with chronic hepatitis C and cirrhosis." N Engl J Med.343,1673-80(2000)
Monkarsh et.al. "Positional isomers of monopegylated interferon alpha-2a: isolation, characterization, and biological activity." Anal Biochem.247,434-40(1997)
Perry CM, Jarvis B "Peginterferon-alpha-2a (40 kD): a review of its use in the management of chronic hepatitis C." Drugs. 61,2263-88(2001)
Radhakrishnan et.al. "Zinc mediated dimer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography." Structure,4,1453-63(1996)
Rosendahl et.al. "A long-acting, highly potent interferon alpha-2 conjugate created using site-specific PEGylation." Bioconjug Chem.16,200-207(2005)
Rubinstein et.al. "Convenient assay for interferons." J Virol. 37,755-8(1981)
Stark et.al. "How cells respond to interferons." Annu Rev Biochem.67, 227-64(1998)
Valenzuela et.al. "Is sequence conservation in interferons due to selection for functional proteins?" Nature.313,698-700(1985)
Wang et.al. "Identification of the major positional isomer of pegylated interferon alpha-2b." Biochemistry, 39,10634-40(2000)
Wills RJ "Clinical pharmacokinetics of interferons." Clin Pharmacokinet.19,390-9(1990)
Yamaoka et.al. "Distribution and tissue uptake of poly(ethylene glycol) with different molecular weights after intravenous administration to mice." J Pharm Sci. 83,601-6(1994)
Zeuzem et.al. "Peginterferon alfa-2a in patients with chronic hepatitis C." N Engl J Med.343,1666-72(2000)
PEG가 결합한 인터페론 알파 단백질은 체내 지속성은 증가 되었으나 비활성이 낮기 때문에 치료를 위해서는 많은 양의 투여가 불가피하다. 따라서 본 발명에서는 PEG가 결합한 인터페론 알파의 지속성 증가와 더불어 PEG-인터페론 알파 비활성의 향상을 해결하였다.
사람 인터페론 알파 단백질 유전자의 특정 부위에 아미노산 변형을 일으켜서 위치 특이적으로 적정한 크기의 PEG가 결합하게 함으로써 체내 지속성은 물론 비활성까지도 향상시켰다.
치료제로서 사용할 때 PEG-인터페론 알파의 투여량 감소에도 동일한 효과를 가질 수 있다.
도면 1.은 인터페론 알파 단백질 동종체에 PEG를 결합시킴으로써 분자량이 증가한 것을 SDS-PAGE에서 확인한 것이다. A)는 SDS-PAGE 전개한 다음, 10% 초산용액에서 전개된 시료를 폴리 아크릴 아미드 젤에 고정한 다음 KI-I2용액에 염색한 것으로 PEG가 존재하는 부위에서만 발색 하므로 분자량의 증가는 PEG가 결합한 결과임을 알 수 있다. B)의 CBB는 KI-I2염색을 증류수로 탈색을 시킨 다음에 Coomassie Brilliant Blue로 다시 염색한 후 탈색한 결과이다. 각 칼럼의 시료들은 도면 하단에 표시되어 있다.
도면 2.는 PEG-인터페론 알파의 생물학적 활성을 조사한 것이다.
각 시료들에 대해서 연속적으로 희석한 시료를 96 well 플레이트에 넣고 일정시간 MDBK세포주에 접촉하도록 한 다음, VSV를 공격용 바이러스로 사용하여 생존 세포의 수를 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 조사하여 항바이러스 효과를 조사한 것이다. PEG가 결합하지 않은 인터페론 알파 및 그 동종체(standard: 표준품, a2b: 본 발명에서 제작된 인터페론 알파, C+: IFNAC+, PC: IFNAPC) 들은 낮은 농도에서도 50% 활성(IC50)을 나타내고 있으며, 다음으로 사슬 형 PEG 30 kDa이 결합한 인터페론 알파 동종체(3C: PEG-30 kDa-IFNAC+, 3PC: PEG-30 kDa-IFNAPC)들이 중간 정도의 활성을 나타낸다. 마지막으로 Y 형태 PEG 40 kDa가 결합한 인터페론 알파 동종체의 (4C: PEG-40 kDa-IFNAC+ 4PC: PEG-40 kDa-IFNAPC) 활성이 가장 낮게 나타남을 보여준다.
도면 3.은 PEG-인터페론 알파의 in vivo 지속성을 조사한 것이다.
Rat에서 PEG-인터페론 알파의 지속성을 조사한 것으로서, Non-PEG는 IFNA 2b를 사용하였으며, C+30은 PEG-30 kDa-IFNAC+을 나타낸 것이며, PC30은 PEG-30 kDa-IFNAPC을 나타내며, C+40은 PEG-40 kDa-IFNAC+을 표시한 것이다. 이 결과에서 볼 때 IFNA 2b의 지속성은 급격히 감소 됨을 보여주고, PEG-인터페론 알파를 168시간까지 조사했을 때 체내 지속성이 있음을 보여 주는데, PEG-40 kDa-IFNAC+가 PEG-30 kDa-IFNAC+과 PEG-30 kDa-IFNAPC 보다 조금 높은 농도로 지속 됨을 보여 주고 있으나, 지속성의 양상은 매우 유사함을 보여주고 있다.
도면 2.는 PEG-인터페론 알파의 생물학적 활성을 조사한 것이다.
각 시료들에 대해서 연속적으로 희석한 시료를 96 well 플레이트에 넣고 일정시간 MDBK세포주에 접촉하도록 한 다음, VSV를 공격용 바이러스로 사용하여 생존 세포의 수를 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 조사하여 항바이러스 효과를 조사한 것이다. PEG가 결합하지 않은 인터페론 알파 및 그 동종체(standard: 표준품, a2b: 본 발명에서 제작된 인터페론 알파, C+: IFNAC+, PC: IFNAPC) 들은 낮은 농도에서도 50% 활성(IC50)을 나타내고 있으며, 다음으로 사슬 형 PEG 30 kDa이 결합한 인터페론 알파 동종체(3C: PEG-30 kDa-IFNAC+, 3PC: PEG-30 kDa-IFNAPC)들이 중간 정도의 활성을 나타낸다. 마지막으로 Y 형태 PEG 40 kDa가 결합한 인터페론 알파 동종체의 (4C: PEG-40 kDa-IFNAC+ 4PC: PEG-40 kDa-IFNAPC) 활성이 가장 낮게 나타남을 보여준다.
도면 3.은 PEG-인터페론 알파의 in vivo 지속성을 조사한 것이다.
Rat에서 PEG-인터페론 알파의 지속성을 조사한 것으로서, Non-PEG는 IFNA 2b를 사용하였으며, C+30은 PEG-30 kDa-IFNAC+을 나타낸 것이며, PC30은 PEG-30 kDa-IFNAPC을 나타내며, C+40은 PEG-40 kDa-IFNAC+을 표시한 것이다. 이 결과에서 볼 때 IFNA 2b의 지속성은 급격히 감소 됨을 보여주고, PEG-인터페론 알파를 168시간까지 조사했을 때 체내 지속성이 있음을 보여 주는데, PEG-40 kDa-IFNAC+가 PEG-30 kDa-IFNAC+과 PEG-30 kDa-IFNAPC 보다 조금 높은 농도로 지속 됨을 보여 주고 있으나, 지속성의 양상은 매우 유사함을 보여주고 있다.
실시예 1.
1) 사람 인터페론 알파 유전자의 제작
사람 인터페론 알파 유전자 제작을 위해 전체 유전자 염기서열에 대한 올리고뉴클레오티드 DNA를 합성하여 각각의 합성 DNA에 대한 상보적인 염기쌍의 합성 DNA를 넣고 중합효소 반응으로 전체 유전자를 제작하였다.
| Name | Sequence |
| F1 | 5' ATGTGCGATC TGCCGCAGAC CCAT 3' |
| F2 | 5' AGCCTGGGCA GCCGTCGTAC CCTGATGCTG CTGGCGCAGA 3' |
| F3 | 5' TGCGTCGTAT CAGCCTGTTT AGCTGCCTGA AAGATCGTCA 3' |
| F4 | 5' TGATTTTGGC TTTCCGCAGG AAGAATTTGG CAACCAGTTT 3' |
| F5 | 5' CAGAAAGCGG AAACCATCCC GGTGCTGCAT GAAATGATCC 3' |
| F6 | 5' AGCAGATCTT TAACCTGTTT AGCACCAAAG ATAGCAGCGC 3' |
| F7 | 5' GGCGTGGGAT GAAACCCTGC TGGATAAATT TTATACCGAA 3' |
| F8 | 5' CTGTATCAGC AGCTGAACGA TCTGGAAGCG TGCGTGATCC 3' |
| F9 | 5' AGGGCGTGGG CGTGACCGAA ACCCCGCTGA TGAAAGAAGA 3' |
| F10 | 5' TAGCATCCTG GCGGTGCGTA AATATTTTCA GCGTATCACC 3' |
| F11 | 5' CTGTATCTGA AAGAAAAAAA ATATAGCCCG TGCGCGTGGG 3' |
| F12 | 5' AAGTGGTGCG TGCGGAAATC ATGCGTAGCT TTAGCCTGAG 3' |
| F13 | 5' CACCAACCTG CAAGAAAGCC TGCGTAGCAA AGAATAGTAA 3' |
| R1 | 5' TTACTATTCT TTGCTACGCA GGCT 3' |
| R2 | 5' TTCTTGCAGG TTGGTGCTCA GGCTAAAGCT ACGCATGATT 3' |
| R3 | 5' TCCGCACGCA CCACTTCCCA CGCGCACGGG CTATATTTTT 3' |
| R4 | 5' TTTCTTTCAG ATACAGGGTG ATACGCTGAA AATATTTACG 3' |
| R5 | 5' CACCGCCAGG ATGCTATCTT CTTTCATCAG CGGGGTTTCG 3' |
| R6 | 5' GTCACGCCCA CGCCCTGGAT CACGCACGCT TCCAGATCGT 3' |
| R7 | 5' TCAGCTGCTG ATACAGTTCG GTATAAAATT TATCCAGCAG 3' |
| R8 | 5' GGTTTCATCC CACGCCGCGC TGCTATCTTT GGTGCTAAAC 3' |
| R9 | 5' AGGTTAAAGA TCTGCTGGAT CATTTCATGC AGCACCGGGA 3' |
| R10 | 5' TGGTTTCCGC TTTCTGAAAC TGGTTGCCAA ATTCTTCCTG 3' |
| R11 | 5' CGGAAAGCCA AAATCATGAC GATCTTTCAG GCAGCTAAAC 3' |
| R12 | 5' AGGCTGATAC GACGCATCTG CGCCAGCAGC ATCAGGGTAC 3' |
| R13 | 5' GACGGCTGCC CAGGCTATGG GTCTGCGGCA GATCGCACAT 3' |
구체적인 방법으로는 F1과 R13, F2와 R12, F3와 R11, F4와 R10, F5와 R9, F6와 R8, F7과 R7, F8과 R6, F9과 R5, F10과 R4, F11과 R3, F12와 R2, 그리고 F13과 R1 합성 DNA를 각 각 100 pmol을 50㎕ 중합효소 반응액에 넣어 프라이머 없이 반응시켜 각 각의 상보적인 서열에서 미합성 부분에 대한 염기서열을 합성하였다.다음으로, 합성이 이루어진 반응액을 각 각 1㎕를 취하여, 새로운 중합효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)을 수행하였다. F1과 R13 반응액 1㎕ + F2와 R12 반응액 1㎕에 프라이머로는 F1과 R12를 넣고(반응A), F3와 R11 반응액 1㎕ + F4와 R10 반응액 1㎕에 프라이머로는 F3와 R10을 넣고(반응B), F5와 R9 반응액 1㎕ + F6와 R8 반응액 1㎕에 프라이머로는 F5와 R8를 넣고(반응C), F7과 R7 반응액 1㎕ + F8과 R6 반응액 1㎕에 프라이머로는 F7과 R6를 넣고(반응D), F9과 R5 반응액 1㎕ + F10과 R4반응액 1㎕에 프라이머로는 F9과 R4를 넣고(반응E), F11과 R3 반응액 1㎕ + F12와 R2 반응액 1㎕에 프라이머로는 F11과 R2(반응F)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때 프라이머의 농도는 10 pmol로 하고, 중합효소 연쇄반응 조건은 94℃에서 5분간 denaturation 시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 75℃에서 1분간의 반응을 25회 반복하여 수행하고, 마지막 반응은 75℃에서 5분간 실시하였다. 이들 반응이 수행한 다음, 2% 아가로스 젤 전기영동에서 DNA 단편의 크기가 증가 되었음을 확인하고, 다시 합성이 이루어진 반응액을 각 각 1㎕를 취하여 새로운 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. A 반응액 1㎕ + B 반응액 1㎕에 프라이머로는 F1과 R10을 넣고(반응G), C 반응액 1㎕ + D 반응액 1㎕에 프라이머로는 F5와 R6를 넣고(반응H), E 반응액 1㎕ + F 반응액 1㎕에 프라이머로는 F9과 R2를 넣고(반응I) 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응이 종료된 다음 다시 아가로스 젤 전기영동에서 DNA 단편의 크기가 증가하였음을 확인한 다음 다시 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. G 반응액 1㎕ + H 반응액 1㎕에 프라이머로는 F1과 R6를 넣고(반응J), I 반응액 1㎕ + F13과 R1 반응액 1㎕에 프라이머로는 F9과 R1을 넣고(반응K) 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응 조건은 앞에서와 동일하게 수행하였다. 1.5% 아가로스 젤에서 DNA 단편의 크기가 증가 되었음을 확인한 다음 J 반응액 1㎕와 K 반응액 1㎕에 프라이머로는 F1과 R1 프라이머를 사용하여 사람 인터페론 유전자를 합성하였다.
합성된 사람 인터페론 알파 유전자를 다음의 프라이머를 사용하여 N-말단에 Xba I, C-말단에 BamH I 제한효소 절단부위를 제작하였다.
| Name | Sequence |
| N-Xba I | 5' CGCCTCTAGA AATAATTTTG TTTAACTTTA AGAAGGAGAT ATACATATGT GCGATCTGCC G 3' |
| C-BamH I | 5' GAATTCGGAT CCTTACTATT CTTTGCTACG CAGGCT 3' |
중합효소 연쇄반응이 완료된 후 합성된 DNA 단편을 정제하여 제한 효소 Xba I과 BamH I으로 절단한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pET28a(+) 플라스미드 DNA에 접합하고, 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하였다. 제한 효소 및 DNA 접합을 위한 T4 DNA ligase의 사용은 제조사의 방법에 따라 실시하였다. pET28a(+) 플라스미드 DNA의 N-말단 부위와 C-말단 부위에는 단백질 정제의 편의를 위해 His-Tag 서열이 있다. 그러나 본 발명에서는 이 아미노산 서열이 필요하지 않기 때문에 이를 제거하기 위해 N-말단 부위를 변형하였다. C-말단 부위는 목적 단백질이 His-Tag 앞에서 단백질 합성이 종료되기 때문에 이 서열의 영향을 받지 않으므로 변형을 하지 않았다. 형질 전환된 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 T7 promoter 프라이머와 T7 terminator 프라이머를 사용한 염기서열 분석을 하였으며, 그 결과 사람 인터페론 유전자가 완전하게 합성되었음을 확인하였다.
1) 사람 인터페론 알파 동종체 유전자의 제작
사람 인터페론 알파의 C-말단 부위에 시스테인 또는 프롤린-시스테인을 추가하여 추가된 시스테인 위치에 PEG를 결합시키기 위해 인터페론 알파의 동종체를 제작하였다. C-말단에 시스테인을 추가하여 PEG를 결합시킨 예는 선행 보고(Rosendahl et.al., 2005)가 있다. Rosendahl등은 C-말단에 시스테인의 추가는 인터페론 활성에 영향을 미치지 않았으나, 문제점으로 언급한 내용으로는 대장균으로부터 인터페론 알파의 단백질이 활성을 갖지 않는 불용성 상태로 발현되고, 또한 PEG 결합 반응이 약하다는 것인데, 이러한 이유로 그들은 C-말단에 대하여 중요성을 부여하지 않았다. 본 실험에서도 C-말단에 시스테인 또는 프롤린-시스테인의 추가가 인터페론의 활성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 본 발명에서는 사람 인터페론 알파 동종체를 불용성의 상태인 봉입체 (inclusion body)를 재구성(refolding)하여 인터페론 생산을 하였으며, 이로부터 분리 정제한 단백질에 대해 PEG 결합 반응을 수행하였다. 동종체의 제작 방법으로는 실시예 1의 1) 항에서 제작된 인터페론 유전자에 대해 N-Xba I 프라이머 와 프라이머 C+ 또는 N-Xba I 프라이머와 프라이머 PC를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 제작하여 증폭된 DNA 단편을 정제한 다음, 제한 효소 Xba I과 BamH I으로 절단한 다음 동일한 제한 효소로 절단한 pET28a(+) 플라스미드 DNA에 접합하여 BL21(DE3)에 형질 전환하였다.
| Name | Sequence |
| Primer C+ | 5' GAATTCGGAT CCTTACTAGC ATTCTTTGCT ACGCAGGCTT TC 3' |
| Primer PC | 5' GAATTCGGAT CCTTACTAGC ACGGTTCTTT GCTACGCAGG CTTTC 3' |
두 동종체 역시 플라스미드 DNA를 분리하여 T7 promoter 프라이머와 T7 terminator 프라이머를 사용한 염기서열 분석에서 사람 인터페론 유전자가 완전하게 합성되었음을 확인하였다.
실시예 2.
사람 인터페론 알파 동종체의 발현 및 정제
실시예 1에서 제조된 형질 전환 대장균을 50㎍/ml 가나마이신이 포함된 2 X YT 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양한 종균을 새로운 50㎍/ml 가나마이신이 포함된 2 X YT 배지에 5% 접종한 다음 2시간 배양한 후 IPTG가 최종 1mM되게 첨가한 후 5시간 배양함으로써 사람 인터페론 알파 및 동종체의 발현을 유도하였다. 이를 확인하기 위해서 배양액으로부터 시료를 채취하여 원심분리 후, SDS-PAGE 시료용 용액에 처리여 SDS-PAGE로 전개한 다음 발현을 확인하였다.
2X YT 배지를 사용하여 5L 발효조 배양액으로부터 사람 인터페론 알파 및 동종체를 정제하였다. 배양액에서 균체를 원심분리한(10,000g, 30분) 다음 호모게나이저로 균체를 파쇄하고 파쇄액을 원심 분리하여 상등액을 제거함으로써 봉입체를 회수하였다. 회수한 봉입체를 증류수에 현탁한 후, 원심 분리하여 침전물을 회수함으로써 깨끗이 세척하였다. 봉입체를 8M 요소(urea)와 50mM 글리신 완충용액(pH 11)에 완전히 용해시킨 후, 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 요소의 농도가 2M이 되도록 봉입체 용해액에 50mM의 글리신 용액을 첨가한 다음 수산화나트륨 용액으로 pH를 9.0이 되도록 조정하였다. pH가 조정된 용해액을 상온에서 15시간 동안 서서히 교반하여 단백질의 재구성(refolding)을 수행하였다. 단백질 재구성이 완료된 용액을 pH 5.5로 조정한 다음, 원심분리를 하여 침전물을 제거하였다. 상등 액을 취하여 염산으로 pH를 3.0으로 조정한 후, 분자량 10 kDa를 분획하는 필터를 사용하여 단백질 농도가 1~5mg/ml이 되게 농축하였다. 농축된 용액을 음이온 교환수지를 이용하여 정제하였다.
실시예 3. PEGylation
정제한 인터페론 알파 동종체 1mg(약 50 nmol)의 단백질을 50mM Tris(pH 8.5)에 TCEP-HCl[{Tris(2-carboxyethyl)-Phosphine} Hydrochloride, Thermo사] 1umole되도록 넣고 실온에서 10분간 방치한 다음 PEG 반응을 수행하였다.
PEG는 40 mg branched maleimide PEG-40 kDa(NOF사, Sunbright GL2-400MA, Japan) 또는 30 mg의 single chained maleimide PEG 30 kDa (Sunbio, PIMAL-30, Korea)를 넣고 실온에서 1시간 반응시킨다. 1시간 반응 후, 증류수로 10배 희석한 다음, pH를 3.0으로 맞춘 다음, 50mM 아세트산 완충용액(pH 3.0)으로 평형화시킨 Carboxy Methyl Sepharose 수지로 충진한 칼럼에 시료를 load하였다. 시료를 loading 한 다음, 50mM 아세트산 완충용액 (pH 4.75)로 세척한 다음, 50mM 아세트산 완충용액(pH 4.75)에 NaCl이 각 각 50mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM들어 있는 용액으로 사람 인터페론 알파 PEG 중합체를 분리하였다. PEGylated-인터페론은 50mM의 NaCl에서 peak로 용출되며, NaCl의 농도가 증가함에 따라 PEG 반응이 일어나지 않은 사람 인터페론 동종체 monomer, 사람 인터페론 동종체 dimer가 용출되었다.
실시예 4. 인터페론 알파의 활성조사
인터페론 알파의 활성은 MDBK 세포주와 VSV를 이용하여 인터페론의 항바이러스 정도로 cytopathic 효과를 조사하였다. 방법은 Rubinstein 등의 방법을 변형하여 사용하였다. (Rubinstein S., Familletti P., Pestka S.: Convienience assay for interferons, J. Virol. (1981), 37, 755-758).
구체적으로는 96-well의 평판 플레이트의 각 홈에 MDBK 세포주를 약 6 X 104 cells/50㎕를 넣고, 순차적으로 희석한 인터페론 시료를(50 ㎕) 넣고 37℃의 CO2가 공급되는 배양기에서 2시간 방치한 다음 희석된 VSV 50㎕를 각각의 홈에 넣고 다시 20시간 배양한 다음 배양액에 세포를 2% Neutral Red(Sigma St. Louis, MO)를 넣고 microplate reader에서 540 nm파장으로 측정하였다.
인터페론의 활성도는 VSV에 대한 50% 방어 효과가 있는 인터페론의 농도(IC50)로 비교 분석하였다. 각 시료는 표와 같다.
| Name | IC50 (pg/ml) |
비활성(Specific acivity) | 비고 | |||
| 표준품(IFN-alpha-2a) | 40.423 | 100 | 식품의약품 안전청으로부터 입수한 표준품: Code 01/003 3,290,000 IU/vial | |||
| IFN-alpha-2b | 30.204 | 100 | 자체 제작한 인터페론 표준품 | |||
| IFNAC+ | 25.833 | 100 | 인터페론 동종체 | |||
| IFNAPC | 34.232 | 100 | 인터페론 동종체 | |||
| PEG-30 kDa-IFNAC+ | 86.048 | 46.9 | 35.1 | 30.0 | 39.7 | 30 kDa single chained PEG가 결합한 인터페론 중합체 |
| PEG-40 kDa-IFNAC+ | 346.70 | 11.7 | 8.7 | 7.4 | 9.8 | 40 kDa branched PEG가 결합한 인터페론 중합체 |
| PEG-30 kDa-IFNAPC | 76.430 | 52.9 | 39.5 | 33.8 | 44.8 | 30 kDa single chained PEG가 결합한 인터페론 중합체 |
| PEG-40 kDa-IFNAPC | 267.278 | 15.1 | 11.3 | 9.6 | 12.8 | 40 kDa branched PEG가 결합한 인터페론 중합체 |
30 kDa의 사슬 형 PEG를 인터페론 알파 동종체에 결합하였을 때의 비활성 정도는 30%~52.9%(IFNAC+의 경우는 30%~46.9%; IFNAPC의 경우는 33.8%~52.9%)정도로 나타났으며. 40 kDa의 가지 형 PEG를 인터페론 알파 동종체에 결합하였을 때의 비활성 정도는 7.4%~15.1%(IFNAC+의 경우는 7.4%~11.7%; IFNAPC의 경우는 9.6%~15.1%)의 범위를 나타내고 있다.
이 결과로 볼 때, 사람 인터페론 알파의 활성에 영향을 미치지 않는 부위에 PEG를 결합하여도 PEG의 크기에 따라 비활성의 차이가 크게 나타남을 알 수 있다. 또한, IFNAC+와 IFNAPC의 인터페론 알파 동종체는 본 실시예에서 IFNAPC가 비활성이 다소 높게 나고 있다.
실시예 5.
인터페론 알파의 체내 지속성 조사
| Name | |
| IFN-alpha-2b | 자체 제작한 인터페론 표준품 |
| PEG-30 kDa-IFNAC+ | 30 kDa single chained PEG가 결합한 인터페론 중합체 |
| PEG-40 kDa-IFNAC+ | 40 kDa branched PEG가 결합한 인터페론 중합체 |
| PEG-30 kDa-IFNAPC | 30 kDa single chained PEG가 결합한 인터페론 중합체 |
PEG-인터페론 중합체의 체내 지속성을 조사하기 위해 각 시료에 대해서 3마리씩의 Sprague Dawley Rats에 각각 100㎍/Kg의 용량으로 꼬리정맥에 단 회 투여한 다음 시간별로(최대 168시간: 7일) 시료를 0.4ml씩 채취하여 ELISA(Human Interferon alpha(Hu-IFN-α) ELISA kit, PBL Biomedical Lab. 사)로 분석하였다.
IFNA 2b의 지속성은 급격히 감소함을 보여주고, PEG-인터페론 알파는 168시간까지 조사했을 때 체내 지속성이 있음을 보여주는데, PEG-40 kDa-IFNAC+이 PEG-30 kDa-IFNAC+과 PEG-30 kDa-IFNAPC 보다 높은 농도로 지속함을 보여 주고 있으나, 지속성의 양상은 매우 유사함을 보여주고 있다.
PEG는 polyethylene glycol의 약자이며, 사람 인터페론 동종체는 인터페론의 활성을 가지는 물질을 총칭하며, 좁은 의미로서 동종체는 사람 인터페론 알파 유전자에 돌연변이를 유발한 다음 분리정제한 단백질을 말하고, 넓은 의미로는 PEG가 결합한 인터페론 알파까지도 포함하고 있다. 사람 인터페론 알파 PEG 중합체는 사람 인터페론 알파 동종체에 PEG 결합을 한 단백질을 말하며 넓은 의미로 사람 인터페론 알파 동종체이다.
Claims (3)
- 아미노산 서열의 변형을 통해서 특정 위치에 PEG결합이 가능한 사람 인터페론 알파의 중합체.
- 1항에서 아미노산 서열의 변형은 C-말단에 프롤린-시스테인인 또는 시스테의 아미노산 서열을 추가한 사람 인터페론 알파의 동종체.
- 1항에서 아미노산 서열이 추가된 동종체에 PEG중합체를 제작함에 있어서 PEG의 크기는 분자량 20,000 Da 이상 40,000 Da 미만의 PEG 사용.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020100103420A KR20120041980A (ko) | 2010-10-22 | 2010-10-22 | 페길레이션된 인터페론 알파 동종체 |
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|---|---|---|---|
| KR1020100103420A KR20120041980A (ko) | 2010-10-22 | 2010-10-22 | 페길레이션된 인터페론 알파 동종체 |
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| KR20240063697A (ko) | 2022-11-03 | 2024-05-10 | 김나연 | 도시텃밭 입문자를 위한 스마트 농업키트 |
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