KR100459105B1 - 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체 - Google Patents

변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체 Download PDF

Info

Publication number
KR100459105B1
KR100459105B1 KR10-2001-0007476A KR20010007476A KR100459105B1 KR 100459105 B1 KR100459105 B1 KR 100459105B1 KR 20010007476 A KR20010007476 A KR 20010007476A KR 100459105 B1 KR100459105 B1 KR 100459105B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
interferon
alpha
leu
glu
peg
Prior art date
Application number
KR10-2001-0007476A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020067105A (ko
Inventor
노광
박민구
현창민
이혁종
Original Assignee
선바이오(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 선바이오(주) filed Critical 선바이오(주)
Priority to KR10-2001-0007476A priority Critical patent/KR100459105B1/ko
Publication of KR20020067105A publication Critical patent/KR20020067105A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100459105B1 publication Critical patent/KR100459105B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 인터페론의 생리학적 활성도 저하를 감소시키면서 체내 잔존 시간을 증가시킬 수 있도록 PEG 유도체와 같은 생체 고분자와 특이적으로 결합할 수 있게 변형된 인터페론-알파 2a 및 2b, 그리고 이들과 PEG 유도체의 배합체에 관한 것으로, 인터페론-알파 2a 또는 2b의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 106 번 트레오닌 잔기 및 161 번 류신 잔기가 시스테인으로 치환된 인터페론-알파 2a 또는 2b와 PEG 유도체의 배합체(conjugate)는, 인터페론의 항바이러스 활성도 감소가 억제되고 체내 잔존 시간을 증가시킬 수 있으므로 B형, C형 간염 바이러스 치료제 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ 유도체와의 배합체 {MODIFIED INTERFERON-ALPHA 2Ａ AND 2Ｂ, AND CONJUGATE WITH ＰＥＧ DERIVATIVES THEREOF}
본 발명은 인터페론의 생리학적 활성도 저하를 감소시키면서 체내 잔존 시간을 증가시킬 수 있도록 PEG 유도체와 같은 생체 고분자와 특이적으로 결합할 수 있게 변형된 인터페론-알파 2a 및 2b, 그리고 이들과 PEG 유도체의 배합체에 관한 것이다.
인터페론(interferon, IFN)은 핵이 존재하는 대부분의 세포로부터 유래하는 당단백질로, 바이러스의 복제를 억제함으로써 항 바이러스 성질을 가지며, 세포 증식을 억제하고 면역 반응을 조절한다. 인터페론은 세포 표면 세포막의 특정 수용체와 결합하여 일련의 세포내 반응을 개시하는데, 이러한 세포내 반응에는 특정 효소들의 활성화 유도, 세포 증식의 억제 등이 포함되고, 면역조절 반응으로서 대식세포(macrophage)의 식세포(phagocytosis) 활성의 증가, 표적 세포에 대한 임파구들의 세포 독성 증가, 그리고 바이러스에 감염된 세포들의 바이러스 증식 억제 등이 포함된다.
인간의 인터페론은 현재 5 종류가 알려져 있다. 인터페론-알파는 말초 혈액 백혈구나 림프 모세포가 분비하고, 인터페론-베타는 섬유모세포(섬유아세포, fibroblast)가, 그리고 인터페론-감마는 B 세포가 분비하는데, 이외에도 오메가 및 타우 인터페론이 존재한다.
인터페론-알파는 말초 혈액 백혈구나 림프 모세포가 바이러스, 이중 나선 RNA 또는 세균 물질에 노출되었을 때 분비하는 것으로, 항 바이러스 성질뿐 아니라 자연 살상(natural killer, NK) 세포들을 활성화시키고 항 세포증식 성질을 가져 항암제로서도 사용될 수 있다. 항원성 및 구조적 특성으로 인해 인터페론-알파에는 24 가지의 서브타입이 존재하는데, 이들 간의 아미노산 서열 유사성은 90 % 정도이다. 또한, 인터페론-알파는 pH 2 정도의 강산 환경에서도 안정적이어서 재조합 단백질을 분리하는 과정에서 활성 소실을 줄일 수 있다는 장점도 있다. 이와 같은 인터페론-알파의 다면발현성(pleiotropic) 활성이 임상 측면에서 중요한 것은, 쉐링-플라우(Schering-Plough)사가 재조합 인간 인터페론-알파 2b를 인트론 A(Intron A)라는 제품명으로 하여 모발상세포 백혈병(hairy-cell leukemia), 첨형습우(尖形濕尤, condyloma acuminatum), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 및 간염(hepatitis)을 포함하는 14 종류의 질병 치료제로 미국 FDA의 승인을 받은 것으로부터 알 수 있다 [Nagabhushan, T.L. & Giaquinto, A., 1995, In Regulatory Practice for Biopharmaceutical Production].
인터페론-알파 2는 165 개의 아미노산으로 구성되며 나머지 인터페론-알파 단백질들은 166개의 아미노산으로 구성된다. 분자량은 19∼26 킬로달톤(kDa)이고,1 번과 98 번, 그리고 29 번과 138 번 시스테인 아미노산 간에 2 개의 이황화 (disulfide) 결합을 포함한다.
한편 PEG(polyethylene glycol)는 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로서, 친수성이 강하므로 의약 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시키기도 한다. 단백질에 결합되는 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000∼100,000으로, PEG의 분자량이 1,000 이상일 경우 독성은 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. 분자량 범위 1,000∼6,000의 PEG는 전신에 분포하며 신장을 통해 대사되고, 특히 분자량 40,000의 분지 PEG는 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어진다.
비경구(parenteral) 경로를 통해 투여되는 의학적, 약리학적으로 유용한 단백질들은 항원성을 가지며, 대체로 수용성이 낮고 체내 잔존기간이 짧다는 단점이 있다. 데이비스(Frank F. Davis) 등의 미국특허 제4,179,337호에서는, PEG와 결합된 단백질 및 효소 등을 치료제로 사용할 경우 PEG가 갖는 장점인 항원성의 감소, 수용성의 증가, 체내 잔류 기간 증가 등의 효과가 있음을 개시하고 있다. 이 특허 이후, 단백질을 PEG와 결합시켜 생리활성 단백질의 단점을 극복하고자 하는 시도가 이루어지고 있는데, 예를 들어, 베로니즈 등(Veroneseet al.,Applied Biochem. and Biotech. 11:141-152, 1985)은 리보뉴클레아제(ribonuclease)와 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)를 PEG와 결합시키고 있다. 또한, 카터 등(Katreet al.)은 미국특허 제4,766,106호와 제4,917,888호에서 단백질들에 PEG를 포함한 폴리머(polymer, 중합체)를 결합시켜 단백질의 수용성을 증가시켰다는 내용을 개시하고 있으며, 나이테키 등(Niteckiet al.)은 미국특허 제4,902,502호에서 PEG나 다른 중합체들을 재조합 단백질에 결합시켜 항원성을 줄이고 체내 잔존 기간을 증가시키고 있다.
PEG와 단백질의 결합에는 이와 같은 장점 외에 결점도 존재한다. 즉, PEG는 대개 결합할 단백질의 하나 또는 그 이상의 자유 라이신(lysine, Lys) 잔기에 공유결합을 통해 결합하게 되는데, 이때 단백질의 표면 부위중 단백질의 활성도와 직접적인 관계가 있는 부위가 PEG와 결합할 경우, 그 부위는 더 이상 생물학적 기능을 수행할 수 없게 되어 단백질의 활성도가 감소하게 된다. 또한, PEG와 라이신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로 일어나게 되므로 많은 종류의 PEG-단백질 배합체들이 혼합물로 존재하게 되고, 따라서 원하는 배합체를 순수 분리하는 과정이 복잡하고 어려워지게 된다. 예를 들어, 인터페론-알파 2b의 경우에는 단백질 표면에 8 개의 자유 라이신 잔기가 존재하는데, 이 잔기들 중에서 인터페론의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 아미노산 부위에 위치 선택적인 방법으로 PEG를 결합시킬 필요가 있게 된다.
호프만 라-로쉬(Hoffmann La-Roche)사의 미국특허 제5,382,657호에 의하면, 분자량 범위 1,100∼10,000의 피리디닐옥시카보닐메틸(pyridinyloxycarbonyl methyl)기를 활성 그룹으로 갖는 PEG를 인터페론-알파 2a의 자유 아민기에 비선택적으로 결합시켰을 때, 결합된 PEG의 분자량이 낮을수록, 또한 1 개의 PEG 분자가 결합한 것이 1 개 이상의 PEG 분자가 결합한 것에 비하여 인터페론의 항바이러스 활성이 높았다고 한다.
또한, 쉐링-플라우(Schering-Plough)사의 미국특허 제5,908,621호에서는, 분자량 12,000의 PEG를 카바메이트(carbamate) 결합을 통해 인터페론-알파 2b의 자유 라이신 잔기에 비특이적으로 부착시켰을 경우, 일주일에 1 회 투여(0.5, 1.0, 1.5 ㎍/㎏)하는 것이 기존의 일주일에 3 회 투여(3 Million International Unit)하는 재조합 인터페론과 동일한 효능을 나타내고 부작용은 줄었다고 기술하고 있다.
엔존(Enzon)사의 미국특허 제5,981,709호에 의하면, 분자량 12,000의 석시니미딜 카보네이트-PEG(Succinimidyl Carbonate-PEG; SC-PEG)를 인터페론-알파 2b에 결합시킬 경우 1 또는 2 개의 PEG가 결합된 배합체가 주요 결합물이었고, 세포 변성 분석(cytopathic effect assay, CPE assay)에서는 2 개의 PEG가 결합된 배합체가 7.7 %의 항 바이러스 활성을 나타내는 반면 1 개의 PEG가 결합된 배합체는 29 %의 항 바이러스 활성을 나타내어, 1 개의 PEG가 단백질에 결합할 경우 단백질의 활성 감소가 줄어들었음을 보고하고 있다.
엔존(Enzon)사의 미국특허 제5,985,263호에서는 분자량 12,000의 SC-PEG를 인터페론-알파 2b에 위치선택적(site-specific)으로 결합시키고 있다. 즉, 인터페론-알파 2b의 표면에는 SC-PEG와 결합 가능한 8 개의 자유 아민기가 존재하는데, 인터페론의 N-말단인 Cys1와 His34를 제외한 나머지 6 개는 Lys 잔기들로서, 이들 3 종류의 아미노산은 각각 다른 pKa 값을 갖기 때문에 이를 이용한 위치선택적 결합이 가능하다고 한다. 여기에서 하나의 실시예에 의하면, 히스티딘(Histidine, His) 아미노산의 pKa 값이 6.0임을 이용하여 결합 반응의 pH를 6.0 부근으로 맞춤으로써 PEG를 인터페론-알파 2b의 히스티딘 잔기 His34에 선택적으로 결합시키고있는데, 결과적으로 인터페론에 하나의 SC-PEG가 결합된 배합체들 중에서는 55 %가 히스티딘에 선택적으로 결합했고 20 %는 Cys1에, 12 %는 Lys 잔기들에 결합하였다. 그리고 이들 배합체의 항 바이러스 활성을 측정했을 때 His34에 결합된 배합체는 50.6 %의 활성을 나타내었으며, Lys134 배합체는 38.4 %, Lys31 배합체는 11.2 %, Cys1 배합체는 12.8 %, 그리고 Lys121 및 Lys131 배합체는 27.6 %의 활성을 나타내었다. 또 다른 실시예에서는 인터페론-알파 2b에 벤조트리아졸 카보네이트-PEG (benzotriazole carbonate, BTC-PEG)를 결합시켰으며, 이때 사용한 BTC-PEG의 분자량은 5,000, 12,000 및 20,000이었다.
암젠(Amgen)사의 미국특허 제5,985,265호에서는 컨센서스(consensus) 인터페론-알파에 분자량 12,000의 메톡시PEG-알데히드(methoxyPEG-aldehyde)를 N-말단에 결합시키고 있다. 이 결합 반응으로는 한 개의 PEG만이 N-말단에 결합하게 되며, 이 배합체의 항 바이러스 활성은 20 %였다.
엔존(Enzon)사의 미국특허 제6,042,822호에서는 인터페론-알파 2b에 SC-PEG를 선택적으로 결합시켰는데, 반응의 pH를 5.5∼6.5로 조절하여 SC-PEG가 주로 His34 잔기에 결합하도록 하였으며, 또한 pH 8.0∼10.0에서의 반응으로 SC-PEG가 대부분 Lys 잔기들에 결합하도록 하였다. 그리고 자연(native) 인터페론의 짧은 체내 잔존 기간을 늘이고 활성 감소를 줄이기 위해 분자량 5,000인 SC-PEG와 인터페론의 결합 반응에 SDS(sodium dodecyl sulphate)를 첨가하고 있는데, SDS를 0.1 %(w/v) 첨가할 경우 한 개의 분자량 5,000인 SC-PEG가 결합된 인터페론 배합체에서는 잔존 기간이 6.8 시간이고 항 바이러스 활성이 30 %였는데 반해, 분자량 5,000인 SC-PEG가 2 개 결합된 배합체는 잔존 기간이 5.8 시간이고 항 바이러스 활성은 69 %로 2 배 이상 증가하였음을 개시하고 있다. 한편, 자연(native) 인터페론의 경우 활성은 100 %이지만 부작용이 있고 잔존 기간이 0.17 시간에 불과하였다.
로쉬(Hoffmann La-Roche)사는 쉬어워터(Shearwater)사의 PEG 기술을 이용해서 인터페론-알파 2a의 Lys 잔기에 분자량 40,000의 분지 메톡시PEG(branched methoxyPEG, 40 kDa)를 결합시킨 것을 시험 중에 있는데, 180 마이크로그램 (microgram, ㎍) 용량을 주 1 회 투여하는 C형 간염 바이러스에 대한 치료제를 제품명 페가시스(Pegasys)로 임상 3 기 진행 중이다. 단독 치료요법 이외에 병용 치료요법으로도 임상 시험이 진행 중인데, 리바비린(ribavirin) 또는 히스타민 디하이드로클로라이드(histamine dihydrochloride)를 사용하여 환자의 바이러스에 대한 지속적인 반응성(sustained virologic response, SVR)을 더욱 증가시킬 수 있었다.
또한, 쉐링-플라우(Schering-Plough)사에서는 엔존(Enzon)사의 PEG 기술을 이용해서 인터페론-알파 2b의 Lys 잔기나 His 잔기에 분자량 12,000의 직선 PEG (linear PEG, 12 kDa)을 결합시켜 임상 3 기 시험을 진행중이다. 제품명은 PEG-인트론(PEG-INTRON)이며, 병용 치료요법으로 리바비린(ribavirin)을 사용하여 C형 간염, 악성흑색종(malignant melanoma)과 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia)등에 대하여 적용하고 있다.
현재, B형과 C형 간염 바이러스에 대한 치료제로 미국 FDA의 승인을 받아 시판 중인 인터페론은 재조합 형태의 것이 유일하였는데, 2001년 1월에 쉐링-플라우사가 PEG-인트론을 만성 C형 간염 치료제로 미국 FDA의 승인을 받았다. 이 PEG-인트론은 2000년 5월에 유럽연합(European Union)으로부터 승인을 받은 바 있다.
이상의 내용을 종합해보면, 재조합 단백질에 PEG 등의 생체 고분자를 결합시킬 경우, 단백질의 항원성을 감소시키고 체내 잔존 기간을 증가시킬 수 있는 반면 생물학적 활성도의 저하가 문제로 되는 것을 알 수 있다. 따라서, 인터페론-알파 2a나 2b와 같은 재조합 단백질에 PEG 유도체와 같은 생체 고분자를 결합시켜 체내 잔존 시간을 증가시키면서도 활성도 저하를 최대한 감소시킬 수 있다면 바람직할 것이다.
본 발명에서는 인터페론과 PEG의 결합에 대한 연구 결과를 고려하여 이루어진 것으로, 야생형(wild type) 재조합 인터페론-알파 2a 또는 2b의 특정 잔기를 치환시켜서 위치 선택적인 방식으로 PEG을 결합시킴으로써 생리학적 활성도의 저하를 최대한 줄이면서 체내 잔존 시간을 증가시키도록 한 인터페론-알파 2a 또는 2b, 그리고 이와 같은 인터페론-알파 2a 또는 2b와 PEG 유도체의 배합체(conjugate)를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인터페론-알파 2a 또는 2b는, 인터페론-알파 2a 또는 2b의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 106 번 트레오닌 잔기 및 161 번 류신 잔기가 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기와 같은 인터페론-알파 2a 또는 2b와 PEG 유도체의 배합체(conjugate)를 제공하는데, 여기에서 PEG 유도체는 분자량이 5,000∼100,000 범위인 것이 바람직하고, 직선형 메톡시폴리에틸렌글리콜-말레이미드, 분지형 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 또는 펜던트 폴리에틸렌글리콜-말레이미드일 수 있다. 또한, 이들의 결합에 있어서는, 인터페론-알파 2a 또는 2b 1 몰당 PEG 유도체의 몰비가 1∼10 배 범위에 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서는, 로쉬사와 쉐링-플라우사 등의 종래 기술에서와 같이 야생형 (wild type) 재조합 인터페론-알파 2a나 2b를 이용하는 것이 아니라, 인터페론-알파 2a나 2b에서 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 아미노산 잔기에 위치 지정 돌연변이를 일으키고 그 부위에 위치선택적인 방식으로 PEG 유도체를 결합시키는 방법에 의해, 인터페론의 생리학적 활성도의 감소는 최대한 줄이면서 체내 잔존 시간은 수 배 증가시킬 수 있도록 하였다. 즉, 재조합 인터페론-알파 2a와 2b 단백질을 클로닝하는 과정에서 106 번 및 161 번 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환하고, 또한 치환된 시스테인 잔기의 설프히드릴(sulfhydryl; -SH)기에 선택적으로 결합할 수 있는 특수한 반응기를 갖는 직선형(linear) PEG, 분지형(branched) PEG, 또는 펜던트(pendant) PEG를 선택적으로 결합시킴으로써, 면역반응 유발성을 낮추고 인터페론의 활성도 감소를 줄이면서 체내 잔존 시간을 증가시켜, 투여 횟수와 용량을 줄이면서도 기존의 야생형 또는 재조합 인터페론-알파 2 단백질과 동등한 치료 효과를 얻도록 하였다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
1. 인터페론-알파 2a와 2b의 위치 지정 돌연변이
인터페론-알파 2a와 2b는 각각 165 개 아미노산으로 이루어지며, 23 번 아미노산 잔기만 틀릴뿐 나머지 164 개 아미노산 서열은 동일하다. 즉, 인터페론-알파 2a는 23 번 잔기가 라이신(lysine)이고, 2b는 아르기닌(arginine)이다.
서열 번호 1 및 2는 야생형 인간 인터페론-알파 2a 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 서열 번호 3 및 4는 야생형 인간 인터페론-알파 2b 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
본 발명에서 인터페론-알파 2a와 2b의 106 번 트레오닌(threonine, Thr) 잔기와 161 번 류신(leucine, Leu) 잔기를 위치 지정 돌연변이 유발 부위로 선정한 이유는 다음과 같다.
인터페론-알파 2의 유연한(flexible) 4 개 부위, 즉 N-말단 5 개 잔기 (1∼5), AB3 루프(loop) 6 개 잔기(45∼50), CD 루프 9 개 잔기(103∼111), C-말단 6 개 잔기(160∼165)는 용매에 노출되는 부위로 PEG 분자의 결합이 용이할 것으로 추측되며, 3차원 구조상에서는 한쪽 끝에 치우쳐 존재한다. 또한, N-말단 4 개 잔기(1∼4), CD 루프 10 개 잔기(102∼111) 및 C-말단 10 개 잔기(156∼165)의 결실 (deletion)이 인터페론-알파 2의 항 바이러스 활성에 영향을 미치지 않는다는 보고를 고려하면[Valenzuelaet al.,1985,Nature313: 698-700; Edgeet al.,1986,Interferon7: 1-46; Levyet al.,1981,Proc. Natl. Acad. Sci.78: 6186-6190], 본 발명에 따라 106 번 잔기와 161 번 잔기를 시스테인으로 치환하는 것은 인터페론-알파 2의 활성에 영향을 주지 않을 것으로 예상할 수 있다.
(1) 106 번 잔기의 위치 지정 돌연변이 대상 선정 이유
래머스워미(Ramaswamy,Structure,1996, 4: 1453-1463) 등은 인터페론-알파 2의 100 번 이소류신(isoleucine) 잔기와 113 번 글루타메이트(glutamate) 잔기 간의 12 개 아미노산 부위가 상당히 이동적(mobile)이고 3차원 구조상에서 용매, 즉 외부 환경에 노출되는 부분이라고 밝혔다.
또한, 스테른베르그(Sternberg,Int. J. Biol. Macromol.1982, 4: 137-144) 등은 인터페론-알파 2의 CD 루프라 부르는 아미노산 잔기 101부터 110 잔기까지 10 개 잔기를 결손(deletion)시켰을 때 인터페론의 활성에 변화가 없었다고 밝혔다.
클라우스(Klaus,J. Mol. Biol.1997, 274: 661-675) 등은 CD 루프가 인터페론-알파 2의 수용체와 결합하리라 예상되는 부위와는 정반대에 위치한다고 보고하였다.
또한 CD 루프는 인터페론-알파 2의 다른 부위와 결합하지 않는 것으로 알려져 있다.
(2) 161 번 잔기의 위치 지정 돌연변이 대상 선정 이유
웨젤(Wetzel,Chemistry and Biology of Interferons: Relationship to Therapeutics,1982, pp. 365-376) 등은 161 번 류신 잔기를 포함하는 인터페론-알파 2의 C-말단 15 개 아미노산은 인터페론의 생물학적 활성에 중요한 역할을 하지 않기에 PEG 결합이 가능하다고 밝혔다.
또한 엣지(Edge,Interferon,1986, 7: 1-46) 등은 C-말단 5 개 아미노산이 결실된 인터페론-알파 2(1-160)와 10 개 아미노산이 결실된 인터페론-알파 2(1-155)가 야생형 인터페론-알파 2와 항 바이러스, 항 증식 활성 그리고 자연살상(NK) 세포 활성에서 모두 차이가 없었음을 보고하였다.
아른하이터(Arnheiter,Proc. Natl. Acad. Sci.1983, 80: 2539-2543) 등은 인터페론-알파 2의 150-165 번 잔기 부위는 높은 분자량의 항체가 고친화력으로 결합하는 항원결정기(epitope) 부위이며, 이 항체는 인터페론-알파 2가 이의 수용체와 결합하는데 있어 단지 약하게 억제해서 인터페론의 활성에는 거의 영향을 미치지 않고, 따라서 PEG을 결합시키기 위해 시스테인 잔기를 도입할 수 있는 최적부위는 157-165 번 잔기라고 밝혔다.
이상의 연구 결과들을 고려하여, 본 발명에서는 인터페론-알파 2a 및 2b에서 106 번 트레오닌 및 161 번 류신 아미노산의 DNA 염기 서열 상에서 시스테인으로 치환한 위치지정 돌연변이체(mutant)를 제조하였다. 이와 같은 돌연변이의 합성은 기존의 분자생물학 기술과 방법들을 통해 효율적으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 발렌주엘라 등(Valenzuela,et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm.1986, 134: 1404-1411)은 인터페론-알파 2에 위치 지정 돌연변이를 유도하는 과정을 기술하고 있다.
서열 번호 5 및 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 106 번 트레오닌 및 161 번 류신 잔기에 대하여 시스테인으로 위치 지정 돌연변이를 유도시킨 인간 인터페론-알파 2a 유전자의 염기 서열과 아미노산 서열을 나타내고, 서열 번호 7 및 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 106 번 트레오닌 및 161 번 류신 잔기에 대하여 시스테인으로 위치 지정 돌연변이를 유도시킨 인간 인터페론-알파 2b 유전자의 염기 서열과아미노산 서열을 나타낸다.
2. 위치 지정 돌연변이가 유도된 인간 인터페론-알파 2a 및 2b와 PEG의 배합체
본 발명에서는 106 번 트레오닌 잔기 및 161 번 류신 잔기가 시스테인으로 치환된 인간 인터페론-알파 2a 또는 인터페론-알파 2b와 폴리에틸렌글리콜을 티오에테르(thioether) 결합을 통해 결합시킨 배합체(conjugate)를 제공한다. 즉, 치환된 시스테인 잔기의 설프히드릴(sulfhydryl; -SH)기와 결합할 수 있는 특수한 반응기, 예를 들어 말레이미드기를 갖는 직선형(linear) PEG, 분지형(branched) PEG, 또는 펜던트(pendant) PEG가 선택적으로 결합하여 본 발명의 배합체를 형성하게 된다.
여기에서 직선형 PEG는 예를 들어 메톡시폴리에틸렌글리콜-말레이미드일 수 있고, 분지형 PEG는 글리신(glycine)을 뼈대(backbone)로 하여 2 개의 PEG 분자가 가지(branch) 형태로 결합된 구조를 갖는 것, 펜던트 PEG는 분자량 10,000∼40,000 달톤(dalton) 범위의 PEG 분자를 뼈대로 하여 2∼20 개의 말레이미드 그룹을 포함하는 반응기들이 작은 가지(arm) 형태로 일정한 간격으로 결합된 구조를 갖는 것이 바람직하다.
이들 PEG와 인간 인터페론-알파 2a 또는 2b와의 결합은, 본 발명에 따라 시스테인 잔기를 갖도록 돌연변이 유도된 인터페론-알파 2a 또는 2b에, 말레이미드 (maleimide) 또는 S-피리딜(S-pyridyl) 그룹 등을 포함하는 반응기(reactive group)가 결합된 PEG를 pH 6∼7.5 조건에서 수 시간 내지 24 시간까지 반응시킴으로써 특이적으로 이루어진다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명이 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1)야생형 인간-인터페론-알파 2a 및 2b의 클로닝(cloning)
매니아티스 등(Maniatis T.et al.,Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)의 방법에 따라 인간 상보 DNA 라이브러리(cDNA library)로부터 야생형 인간 인터페론-알파 2a와 인터페론-알파 2b를 연쇄중합반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 클로닝하였다. cDNA의 정확한 크기는 전기영동(electrophoresis)을 통해 1.1 kb임을 확인하였다. 뉴클레오타이드 서열은 생거의 디데옥시 시퀀싱(Sanger's dideoxy sequencing) 방법을 통해 확인하였다.
서열 번호 1 및 2는 야생형 인간 인터페론-알파 2a 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 서열 번호 3 및 4는 야생형 인간 인터페론-알파 2b 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
(2)인간 인터페론-알파 2a 및 2b의 위치지정 돌연변이
인터페론-알파 2a와 2b의 106 번 트레오닌 및 161 번 류신 잔기를 DNA 염기 서열 상에서 위치지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통해 시스테인으로 치환하였다. 이러한 돌연변이의 합성은 기존의 분자생물학 기술과 방법들을 통해 효율적으로 수행하였다(Valenzuelaet al., Biochem. and Biophys. Res. Comm.,1986, 134: 1404-1411).
서열 번호 5 및 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 106 번 트레오닌 및 161 번 류신 잔기에 대하여 시스테인으로 위치 지정 돌연변이를 유도시킨 인간 인터페론-알파 2a 유전자의 염기 서열과 아미노산 서열을 나타내고, 서열 번호 7 및 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 106 번 트레오닌 및 161 번 류신 잔기에 대하여 시스테인으로 위치 지정 돌연변이를 유도시킨 인간 인터페론-알파 2b 유전자의 염기 서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
[실시예 2]
돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 및 2b와 직선형 PEG의 결합
분자량 5,000의 메톡시폴리에틸렌글리콜-말레이미드에 퍼옥사이드(peroxide)를 함유하지 않은 건조된 디에틸에테르(diethyl ether)를 첨가해서 침전시킨 후, 에테르(ether)로 세척하였다. 산물은 진공 건조시키고 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR)법과 겔여과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)법 등을 통해 순도와 분자량 범위를 측정하여 PEG 결합에 적합한지 여부를 확인하였다. 본 실시예에서 PEG는 선바이오 주식회사에서 생산된 것을 사용하였다.
다음 구조식은 분자량 5,000의 메톡시폴리에틸렌글리콜-말레이미드(mPEG-maleimide)를 나타내는 것으로, 여기에서 n은 110∼115의 정수이다.
확인된 산물은 실시예 1에 따라 돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 또는 2b와 함께 pH 6∼7.5의 인산나트륨(NaH2PO4) 완충용액(buffer) 조건에서 각각 결합시켰다. 완충용액은 DTT(dithiothreitol), EDTA(ethylenediaminetetraacetate), 염산 구아니딘(guanidine HCl) 등을 포함시켰다. 결합 반응은 4 ℃에서 2 시간 내지 24 시간 수행하였다. 결합물은 SDS 아크릴아마이드 젤(SDS acrylamide gel)을 통해 전기영동하여 분석하였다.
다음 반응식은 돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 또는 2b와 직선형 폴리에틸렌글리콜-말레이미드의 결합 방법을 나타낸 것이다. 여기에서 x+y=n이고 n은 110∼115의 정수이다.
[실시예 3]
돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 및 2b와 분지형 PEG의 결합
분자량 40,000의 분지형 폴리에틸렌글리콜에 퍼옥사이드(peroxide)를 함유하지 않은 건조된 디에틸에테르(diethyl ether)를 첨가해서 침전시킨 후, 에테르 (ether)로 세척하였다. 산물은 진공건조시키고 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR)법과 겔여과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)법 등을 통해 순도와 분자량 범위를 측정하여 PEG 결합에 적합한지 여부를 확인하였다.
다음 구조식은 분자량 40,000의 분지형 폴리에틸렌글리콜(branched polyethyleneglycol)을 나타내는 것으로, 여기에서 x는 450∼460의 정수이다.
확인된 산물과 실시예 1에 따라 돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 또는 2b를 pH 6∼7.5의 인산나트륨(NaH2PO4) 완충용액(buffer) 조건에서 각각 결합시켰다. 결합 반응 및 조건은 실시예 2와 동일하게 수행하였다.
다음 반응식은 돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 또는 인터페론-알파 2b와 분지형 폴리에틸렌글리콜의 결합 방법을 나타낸 것이다. 여기에서 x는 450∼460의 정수이다.
[실시예 4]
(1)펜던트 PEG의 합성
분자량 10,000∼40,000 달톤 범위의 폴리에틸렌글리콜을 아크릴산과 반응시킬 때 개시제로서 t-부틸퍼옥시벤조에이트(t-butyl peroxybenzoate), 분산제로서 노난(nonane)과 반응시켜 프로피온산이 PEG 뼈대에 가지(arm) 같은 펜던트 형태로 결합한 폴리에틸렌글리콜-프로피온산을 합성하였다. 첨가하는 아크릴산의 당량을 조절하여 펜던트의 숫자(다음 반응식 3에서 m 값)를 2∼20 개 범위 내에서 조절할 수 있다.
합성한 폴리에틸렌글리콜-프로피온산을 디에틸렌트리아미닐 말레이미드 (diethylenetriaminyl maleimide), N,N'-디사이클로헥실 카보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide), 4-(디메틸아미노)-피리딘(4-(dimethylamino)-pyridine)과 반응시켜 펜던트 폴리에틸렌글리콜-말레이미드를 합성하였다.
또는 합성한 폴리에틸렌글리콜-프로피온산을 N-히드록시 석시니미드(N-hydroxy succinimide), N,N'-디사이클로헥실 카보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide)와 반응시킨 후, 디에틸렌트리아미닐 말레이미드와 반응시켜 합성할 수도 있다.
다음 구조식은 분자량 10,000∼40,000의 펜던트 폴리에틸렌글리콜(pendant polyethyleneglycol)을 나타내는 것으로, 여기에서 n는 110∼460의 정수이고, m은 2∼20의 정수이다.
(2)돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 및 2b와 펜던트 PEG의 결합
분자량 10,000∼40,000 달톤 범위의 펜던트 폴리에틸렌글리콜-말레이미드에 퍼옥사이드(peroxide)를 함유하지 않은 건조된 디에틸에테르(diethyl ether)를 첨가해서 침전시킨 후, 에테르(ether)로 세척하였다. 산물은 진공건조시키고 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR)법과 겔여과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)법 등을 통해 순도와 분자량 범위를 측정하여 PEG 결합에 적합한지 여부를 확인하였다.
확인된 산물과 실시예 1에 따라 돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 또는2b를 pH 6∼7.5의 인산나트륨(NaH2PO4) 완충용액(buffer) 조건에서 각각 결합시켰다. 결합 반응 및 조건은 실시예 2와 동일하게 수행하였다.
다음 반응식은 펜던트 폴리에틸렌글리콜의 합성 및 펜던트 폴리에틸렌글리콜과 돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 또는 2b의 결합 방법을 나타낸 것으로, 여기에서 n는 110∼460의 정수이고, m은 2∼20의 정수이다.
여기에서, 펜던트 폴리에티렌글리콜-말레이미드 1 분자당 돌연변이가 유도된 인터페론-알파 2a 또는 2b 분자들은 2∼10 개 범위 내에서 결합할 수 있다.
[효과 시험예]
실시예 3에 따라 인터페론-알파 2a와 분자량 40,000의 분지형 폴리에틸렌글리콜-말레이미드를 결합시킨 배합체에 대하여 체내 잔존 시간 및 항바이러스 활성도를 측정하고 그 결과를 재조합 인터페론-알파 2a와 비교하였다. 그 결과를 다음 표에 나타낸다.
인터페론 체내 잔존 시간(t½) 항바이러스 활성도(% In vivo activity)
재조합 인터페론-알파 2a 3∼5 시간 100 %
분지형 PEG-인터페론-알파 2a 50∼80 시간 90∼100 %
상기 표에서 보듯이, 본 발명에 따라 재조합 인터페론-알파 2a 또는 2b에서 106번 트레오닌 및 161번 류신 잔기를 시스테인으로 치환시킨 후 PEG 유도체를 결합시킨 배합체는, 재조합 인터페론의 항바이러스 활성도와 동등한 정도가 유지되면서 체내 잔존 시간을 크게 증가시킬 수 있게 된다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따라 야생형 인간 인터페론-알파 2a 또는 2b에 위치 지정 돌연변이를 통해 106번 트레오닌 및 161번 류신 잔기를 시스테인으로 치환시킨 변형된 인터페론-알파 2a 또는 2b에서, 시스테인 잔기와 특이적으로 결합할 수 있는 생체 고분자로서 PEG 유도체를 결합시킨 인터페론-알파 2a 또는 2b와 PEG의 배합체는, 인터페론의 항바이러스 활성도 감소가 억제되고 체내 잔존 시간을 증가시킬 수 있으므로 B형, C형 간염 바이러스 치료제 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.
<110> SUNBIO INC. <120> MODIFIED INTERFERON-ALPHA 2A AND 2B, AND CONJUGATE WITH PEG DERIVATIVES THEREOF <130> PPB10045 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 567 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (70)..(564) <400> 1 atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60 tctgtgggc tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg acc 111 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 1 5 10 ttg atg ctc ctg gca cag atg agg aaa atc tct ctt ttc tcc tgc ttg 159 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 15 20 25 30 aag gac aga cat gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag 207 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 35 40 45 ttc caa aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag 255 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln 50 55 60 atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat gag 303 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 65 70 75 acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat gac 351 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 80 85 90 ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg aca gag act ccc ctg 399 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu 95 100 105 110 atg aag gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc 447 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 115 120 125 act ctc tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt 495 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 130 135 140 gtc aga gca gaa atc atg aga tct ttt tct ttg tca aca aac ttg caa 543 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 145 150 155 gaa agt tta aga agt aag gaa tga 567 Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 160 165 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 3 <211> 567 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (70)..(564) <400> 3 atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60 tctgtgggc tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg acc 111 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 1 5 10 ttg atg ctc ctg gca cag atg agg aga atc tct ctt ttc tcc tgc ttg 159 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 15 20 25 30 aag gac aga cat gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag 207 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 35 40 45 ttc caa aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag 255 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln 50 55 60 atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat gag 303 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 65 70 75 acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat gac 351 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 80 85 90 ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg aca gag act ccc ctg 399 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu 95 100 105 110 atg aag gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc 447 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 115 120 125 act ctc tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt 495 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 130 135 140 gtc aga gca gaa atc atg aga tct ttt tct ttg tca aca aac ttg caa 543 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 145 150 155 gaa agt tta aga agt aag gaa tga 567 Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 160 165 <210> 4 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 5 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified human interferon-alpha 2a <220> <221> CDS <222> (70)..(564) <400> 5 atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60 tctgtgggc tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg acc 111 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 1 5 10 ttg atg ctc ctg gca cag atg agg aaa atc tct ctt ttc tcc tgc ttg 159 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 15 20 25 30 aag gac aga cat gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag 207 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 35 40 45 ttc caa aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag 255 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln 50 55 60 atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat gag 303 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 65 70 75 acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat gac 351 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 80 85 90 ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg tgt gag act ccc ctg 399 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Cys Glu Thr Pro Leu 95 100 105 110 atg aag gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc 447 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 115 120 125 act ctc tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt 495 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 130 135 140 gtc aga gca gaa atc atg aga tct ttt tct ttg tca aca aac ttg caa 543 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 145 150 155 gaa agt tgt aga agt aag gaa tga 567 Glu Ser Cys Arg Ser Lys Glu 160 165 <210> 6 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Cys Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Cys Arg Ser Lys Glu 165 <210> 7 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified human interferon-alpha 2b <220> <221> CDS <222> (70)..(564) <400> 7 atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60 tctgtgggc tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg acc 111 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 1 5 10 ttg atg ctc ctg gca cag atg agg aga atc tct ctt ttc tcc tgc ttg 159 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 15 20 25 30 aag gac aga cat gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag 207 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 35 40 45 ttc caa aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag 255 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln 50 55 60 atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat gag 303 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 65 70 75 acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat gac 351 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 80 85 90 ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg tgt gag act ccc ctg 399 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Cys Glu Thr Pro Leu 95 100 105 110 atg aag gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc 447 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 115 120 125 act ctc tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt 495 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 130 135 140 gtc aga gca gaa atc atg aga tct ttt tct ttg tca aca aac ttg caa 543 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 145 150 155 gaa agt tgt aga agt aag gaa tga 567 Glu Ser Cys Arg Ser Lys Glu 160 165 <210> 8 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Cys Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Cys Arg Ser Lys Glu 165

Claims (10)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열에서 106 번 트레오닌 잔기 및 161 번 류신 잔기가 시스테인으로 치환된 단백질을 코딩하는 변형된 인간 인터페론-알파 2a 유전자.
  2. 서열번호 4의 아미노산 서열에서 106 번 트레오닌 잔기 및 161 번 류신 잔기가 시스테인으로 치환된 단백질을 코딩하는 변형된 인간 인터페론-알파 2b 유전자.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 서열 번호 5의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
  6. 서열 번호 7의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항의 인간 인터페론-알파 2a 유전자 또는 제2항의 인간 인터페론-알파 2b 유전자에 PEG 유도체가 결합된 배합체(conjugate).
  8. 제 7 항에 있어서, PEG 유도체는 직선형(linear) 메톡시폴리에틸렌글리콜-말레이미드, 분지형(branched) 폴리에틸렌글리콜-말레이미드, 및 펜던트(pendant) 폴리에틸렌글리콜-말레이미드의 적어도 하나인 배합체.
  9. 제 7 항에 있어서, PEG 유도체는 분자량 범위가 5,000 내지 100,000인 배합체.
  10. 제 7 항에 있어서, 인터페론-알파 2a 또는 2b 1 몰당 PEG 유도체가 1∼10 몰 범위로 결합한 배합체.
KR10-2001-0007476A 2001-02-15 2001-02-15 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체 KR100459105B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0007476A KR100459105B1 (ko) 2001-02-15 2001-02-15 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0007476A KR100459105B1 (ko) 2001-02-15 2001-02-15 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020067105A KR20020067105A (ko) 2002-08-22
KR100459105B1 true KR100459105B1 (ko) 2004-12-03

Family

ID=27694440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2001-0007476A KR100459105B1 (ko) 2001-02-15 2001-02-15 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100459105B1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100511749B1 (ko) * 2001-11-06 2005-09-02 선바이오(주) 변형된 인터페론-베타, 및 이의 화학적으로 변형된 배합체
KR100480429B1 (ko) * 2001-12-04 2005-04-06 선바이오(주) 인터페론-알파와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
US7314613B2 (en) 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
WO2005113592A2 (en) 2004-05-19 2005-12-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
BRPI0609809A2 (pt) 2005-05-18 2011-10-11 Maxygen Inc polipeptìdeo isolado ou recombinante, conjugado, composição, polinucleotìdeo isolado ou recombinante, célula hospedeira, vetor, métodos para preparar o polipeptìdeo, para preparar um conjugado, para inibir replicação de um vìrus em células infectadas com o vìrus para reduzir o numero de cópias de um vìrus em células infectadas com o vìrus, para reduzir o nìvel de rna de hcv no soro de um paciente infectado com hcv, para reduzir o nìvel de dna de hbv em soro de um paciente infectado com hbv e para reduzir o nìvel de rna de hiv em soro de um paciente infectado com hiv, e, uso do polipeptìdeo ou do conjugado
CN1970572A (zh) * 2006-12-21 2007-05-30 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物

Also Published As

Publication number Publication date
KR20020067105A (ko) 2002-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU739359B2 (en) Improved interferon polymer conjugates
ES2280107T3 (es) Conjugados de proteina-polimero por histidina sustancialmente puros.
AU691225B2 (en) Improved interferon polymer conjugates
US5738846A (en) Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5981709A (en) α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
JP5325884B2 (ja) ポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂならびにその製造方法および使用
KR100511749B1 (ko) 변형된 인터페론-베타, 및 이의 화학적으로 변형된 배합체
KR101483814B1 (ko) 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ａ, 이의 합성 방법 및 용도
KR100459105B1 (ko) 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체
JP2006519235A (ja) ポリエチレングリコール修飾インターフェロン組成物およびその使用方法
MXPA99011862A (es) Conjugados mejorados de polimero de interferon

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121210

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131118

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141117

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151119

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161121

Year of fee payment: 13

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171116

Year of fee payment: 14

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181112

Year of fee payment: 15

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191111

Year of fee payment: 16