BRPI0609809A2 - polipeptìdeo isolado ou recombinante, conjugado, composição, polinucleotìdeo isolado ou recombinante, célula hospedeira, vetor, métodos para preparar o polipeptìdeo, para preparar um conjugado, para inibir replicação de um vìrus em células infectadas com o vìrus para reduzir o numero de cópias de um vìrus em células infectadas com o vìrus, para reduzir o nìvel de rna de hcv no soro de um paciente infectado com hcv, para reduzir o nìvel de dna de hbv em soro de um paciente infectado com hbv e para reduzir o nìvel de rna de hiv em soro de um paciente infectado com hiv, e, uso do polipeptìdeo ou do conjugado - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEO ISOLADO OU RECOMBINANTE, CONJUGADO, COMPOSIçãO, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO OU RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA, VETOR, MéTODOS PARA PREPARAR O POLIPEPTìDEO, PARA PREPARAR UM CONJUGADO, PARA INIBIR REPLICAçãO DE UM VìRUS EM CéLULAS INFECTADAS COM O VìRUS, PARA REDUZIR O NUMERO DE CóPIAS DE UM VìRUS EM CéLULAS INFECTADAS COM O VìRUS, PARA REDUZIR O NìVEL DE RNA DE HCV NO SORO DE UM PACIENTE INFECTADO COM HCV, PARA REDUZIR O NìVEL DE DNA DE HBV EM SORO DE UM PACIENTE INFECTADO COM HBV E PARA REDUZIR O NìVEL DE RNA DE HIV EM SORO DE UM PACIENTE INFECTADO COM HIV, E, USO DO POLIPEPTìDEO OU DO CONJUGADO. A presente invenção fornece polipeptídeos desenvolvidos de alfa-interferon, e conjugados destes, e ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos. A invenção também inclui composições compreendendo estes polipeptídeos, conjugados e ácidos nucleicos; células contendo ou expressando os polipeptídeos, conjugados e ácidos nucleicos; métodos de fazer os polipeptídeos, conjugados e ácidos nucleicos; e métodos para usar dos polipeptídeos, conjugados e ácidos nucleicos.

Description

"POLEPEPTÍDEO ISOLADO OU RECOMBINANTE, CONJUGADO, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO OU RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, VETOR, MÉTODOS PARA PREPARAR O POLIPEPTÍDEO, PARA PREPARAR UM CONJUGADO, PARA INIBIR REPLICAÇÃO DE UM VÍRUS EM CÉLULAS INFECTADAS COM O VÍRUS, PARA REDUZIR O NÚMERO DE CÓPIAS DE UM VÍRUS EM CÉLULAS INFECTADAS COM O VÍRUS, PARA REDUZIR O NÍVEL DE RNA DE HCV NO SORO DE UM PACIENTE INFECTADO COM HCV, PARA REDUZIR O NÍVEL DE DNA DE HBV EM SORO DE UM PACIENTE INFECTADO COM HBV E PARA REDUZIR O NÍVEL DE RNA DE HTV EM SORO DE UM PACIENTE INFECTADO COM HIV, E, USO DO POLIPEPTÍDEO OU DO CONJUGADO"

REFERÊNCIA-CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

Conforme a 35 U.S.C. $ 119 (e), este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório de Patente Norte-Americana No. de Série 60/682.769 depositado em 18 de maio de 2005, a descrição do qual é incorporada por referência neste lugar em sua totalidade para todas as finalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere geralmente a polinucleotídeos e polipeptídeos codificados a partir destes, conjugados dos polipeptídeos, assim como vetores, células, anticorpos, e métodos para usar e produzir os polinucleotídeos, polipeptídeos, e conjugados.

ARTE DE FUNDO DA INVENÇÃO

Interferons-alfa são membros da diversa superfamília de feixes helicoidais de genes citocina (Sprang, S.R. et al. (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:815-827). Os interferons-alfa humanos são codificados por uma família de mais de 20 genes não alélicos sucessivamente duplicados e pseudogenes que compartilham 85-98% da identidade de seqüência no nível de aminoácido (Henco5 Κ. et al. (1985) J. Mol. Biol. 185:227-260). Genes que expressam proteínas interferon-alfa ativas foram agrupados em 13 famílias de acordo com Ioci genético. Proteínas interferon-alfa humanas expressas conhecidas e suas variações alélicas são arrumadas em forma de tabela em Allen G. and Diaz M.O. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:181-184.

Mostrou-se que os interferons-alfa inibem vários tipos de proliferação celular, e são especialmente úteis para o tratamento de uma variedade de desordens de proliferação celular freqüentemente associadas com câncer, particularmente malignidades hematológicas tal como leucemias. Estas proteínas mostraram atividade antiproliferativa contra mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, linfoma de baixo grau, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena crônica, carcinoma de célula renal, tumores da bexiga urinária e cânceres ovarianos (Bonnem, E.M. et al. (1984) J. Biol. Response Modifiers #:580; Oldham, R.K. (1985) Hospital Practice 20:71).

Interferons-alfa também são úteis contra vários tipos de infecções virais (Finter, N.B. et al. (1991) Drugs 42(5):749). Interferons-alfa têm atividade contra infecção por papilomavírus humano, infecções por hepatite B e hepatite C (Finter, N.B. et al., 1991, acima; Kashima, H. et al. (1988) Laryngoscope 98:334; Dusheiko, G.M. et al. (1986) J. Hematology 3 (Supple. 2):S199; Davis, GL et al. (1989) N. England J. Med. 321:1501). O papel dos interferons e receptores de interferons na patogênese de certas doenças auto-imunes e inflamatórias também foi investigado (Benoit, P. et al. (1993) J. Immunol. 150(3):707).

Embora estas proteínas tenham valor terapêutico no tratamento de diversas doenças, elas não foram otimizadas para uso como farmacêuticos. Por exemplo, toxicidade limitante de dose, reatividade cruzada do receptor, e meias-vidas de soro curtas reduziram significativamente a utilidade clínica de muitas destas citocinas (Dusheiko, G. (1997) Hepatology 26:112S-121S; Vial, T. e Descotes, J. (1994) Drug Experience 10:115-150; Funke, I. et al. (1994) Ann. Hematol. 68:49-52; Schomburg, A. et al. (1993) J. Câncer Res. Clin. Oncol. 119:745-755). Perfis de diversos e severos efeitos colaterais que acompanham a administração de interferon incluem sintomas parecidos com gripe, fadiga, alucinação, febre, elevação de enzima hepática, e leucopenia (Pontzer, C.H. et al. (1991) Câncer Res. 51:5304; Oldham, 1985, acima).

Vírus da hepatite C (HCV) é um vírus de RNA integrado não- hospedeiro com uma taxa de replicação muito alta e é portanto associado com um grande grau de diversidade genética. Pelo menos seis genótipos e mais do que trinta subtipos de RNA de HCV foram identificados. Foi mostrado que genótipo HCV é um preditor de resposta à terapia IFN-alfa. Foi encontrado que pacientes infectados com genótipos HCV 2 e 3 geralmente respondem bem à terapia com interferon. Pacientes infectados com genótipos 4, 5 e 6 tendem a responder não tão bem. Pacientes infectados com genótipo HCV 1 tendem a responder muito fracamente à terapia com interferon, com cerca de 50% dos pacientes com Genótipo 1 classificados com "não respondentes" para terapia com IFN-alfa. Genótipo 1 é atualmente a forma mais prevalente de hepatite C, infectando aproximadamente 70% dos pacientes nos Estados Unidos da América e 50% dos pacientes na Europa. Claramente, existe uma necessidade imperativa por terapias mais efetivas para infecção por HCV, particularmente da variedade Genótipo 1.

Existe evidência genética e bioquímica de que Genótipo HCV 1 (e outros subtipos) atenua ativamente a via de sinalização de IFN-alfa inibindo proteínas responsivas a IFN chave tal como a serina dsRNA- ativada/treonina proteína quinase PKR (Katze M.G. et al. (2002) Nat. Rev. Immunol. 2(9):675-687). Como uma provável conseqüência desta diversidade genética e inibição ativa da resposta antiviral, HCV (particularmente Genótipo 1) tem a capacidade de escapar da vigilância imune do hospedeiro, levando a uma alta taxa de infecção crônica. A extensiva heterogeneidade genética de HCV tem importantes implicações diagnosticas e clínicas, potencialmente respondendo por variações no curso clínico, dificuldades no desenvolvimento de vacinas, e falta de resposta à terapia.

A presente invenção se destina à necessidade de moléculas de interferon-alfa que exibam estimulada eficácia antiviral e/ou imunomoduladora. A invenção fornece novos polipeptídeos interferon-alfa e conjugados de polipeptídeos, ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos, e métodos de usar tais moléculas. Tais moléculas seriam de uso benéfico em uma variedade de aplicações, incluindo por exemplo, tratamentos terapêuticos e profiláticos, particularmente para infecções virais e doenças e condições associadas como infecções virais. A presente invenção responde a estas e outras necessidades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece novos polipeptídeos, incluindo variantes destes e proteínas de fusão compreendendo tais polipeptídeos. A invenção também fornece conjugados compreendendo um polipeptídeo da invenção covalentemente ligado a uma ou mais unidades não polipeptídicas. A invenção também fornece ácidos nucleicos codificando qualquer dos polipeptídeos da invenção, e vetores e células hospedeiras compreendendo tais ácidos nucleicos. Em adição, a invenção fornece métodos de fazer e usar tais polipeptídeos, conjugados, e ácidos nucleicos, e outras características perceptíveis com revisão adicional.

Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo isolado ou recombinante, o polipeptídeo compreendendo uma seqüência identificada como uma das SEQ ID NOil-SEQ ID NO: 319. A invenção também fornece proteínas de fusão e conjugados compreendendo qualquer destes polipeptídeos, ácidos nucleicos codificando estes polipeptídeos, e métodos de fazer e usar estes polipeptídeos.

A invenção também fornece polipeptídeos isolados ou recombinantes que compreendem cada uma seqüência que difere em O a 16 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:319, por exemplo, difere em 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 posições de aminoácidos, por exemplo, em 0-16 posições de aminoácidos, em 0-15 posições de aminoácidos, em 0-14 posições de aminoácidos, em 0-13 posições de aminoácidos, em 0-12 posições de aminoácidos, 0-11 posições de aminoácidos, em 0-10 posições de aminoácidos, em 0-9 posições de aminoácidos, em 0-8 posições de aminoácidos, em 0-7 posições de aminoácidos, em 0-6 posições de aminoácidos, em 0-5 posições de aminoácidos, em 0-4 posições de aminoácidos, em 0-3 posições de aminoácidos, em 0-2 posições de aminoácidos, ou em 0-1 posições de aminoácidos. Alguns tais polipeptídeos compreendem uma seqüência que difere em 0 a 16 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:94, SEQ ID N0:103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO:141, SEQ ED NO:148, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:195, SEQ ID N0:208, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:258, SEQ ID N0:260, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:293, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:298, SEQ ID N0:303, SEQ ID N0:306, SEQ ID N0:310, e SEQ ID NO:312. Alguns tais polipeptídeos exibem uma atividade de interferon-alfa (tal como, por exemplo, atividade antiviral, atividade de diferenciação de THl, e/ou atividade antiproliferativa).

A invenção também inclui polipeptídeos isolados ou recombinantes que compreendem cada uma seqüência que difere em 0 a 16 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:312 (M01); SEQ ID ΝΟ:262 (M04); SEQ ID ΝΟ:266 (M05); SEQ ID ΝΟ:232 (M23); SEQ ID ΝΟ:88 (M45); SEQ ID ΝΟ:297 (M20); SEQ ID NO: 167 (M27); SEQ ID NO: 107 (M09); SEQ ID Ν0:208 (M02); SEQ ID ΝΟ:94 (M33); SEQ ID NO: 141 (M37); SEQ ID ΝΟ:46 (M30); SEQ ID ΝΟ:171 (M22); SEQ ID Ν0:310 (M24); SEQ ID ΝΟ:176 (M44); SEQ ID ΝΟ:26 (M31); SEQ ID ΝΟ:89 (M10); SEQ ID ΝΟ:296 (M14); SEQ ID NO: 148 (M03); SEQ ID ΝΟ:18 (M46); SEQ ID Ν0:10 (M26); SEQ ID ΝΟ:87 (M21); SEQ ID Ν0:103 (M38); SEQ ID NQ:234 (M28); SEQ ID Ν0:30 (ΜΙ9); SEQ ID ΝΟ:179 (M11); SEQ ID Ν0:2 (M34); SEQ ID Ν0:260 (M07); SEQ ID Ν0:306 (M18); SEQ ID Ν0:140 (M40); SEQ ID NO: 127 (ΜΙ6); SEQ ID ΝΟ:293 (M25); SEQ ID ΝΟ:195 (M29); SEQ ID NO: 191 (M36); SEQ ID ΝΟ:263 (M06); SEQ ID NO: 1 (M32); SEQ ID ΝΟ:298 (M39); SEQ ID ΝΟ:24 (M42); SEQ ID ΝΟ:258 (M08); SEQ ID NO: 124 (M35); SEQ ID ΝΟ:7 (M41); SEQ ID ΝΟ:9 (M12); SEQ ID Ν0:303 (ΜΙ7); e SEQ ID ΝΟ:6 (M43); por exemplo, difere em O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 posições de aminoácidos, por exemplo, difere em 0-16 posições de aminoácidos, 0-15 posições de aminoácidos, em 0-14 posições de aminoácidos, em 0-13 posições de aminoácidos, em 0-12 posições de aminoácidos, 0-11 posições de aminoácidos, em 0-10 posições de aminoácidos, em 0-9 posições de aminoácidos, em 0-8 posições de aminoácidos, em 0-7 posições de aminoácidos, em 0-6 posições de aminoácidos, em 0-5 posições de aminoácidos, em 0-4 posições de aminoácidos, em 0-3 posições de aminoácidos, em 0-2 posições de aminoácidos ou em 0-1 posições de aminoácidos, tal como, por exemplo, polipeptídeos descritos abaixo. Alguns tais polipeptídeos exibem uma atividade de interferon-alfa (tal como, por exemplo, atividade antiviral, atividade de diferenciação de TH1, e/ou atividade antiproliferativa). Alguns tais polipeptídeos exibem pelo menos atividade antiviral duas vezes maior do que IFN-alfa humano 2a em um ensaio antiviral de HeLa/EMCV. Alguns tais polipeptídeos se ligam ao receptor de interferon-alfa humano com uma afinidade maior (EC50 menor) do que aquela de IFN-alfa 2a. Os polipeptídeos podem compreender adicionalmente um ou mais aminoácido(s) adicional(adicionais), tal como, por exemplo, uma metionina adicionada ao término Ν. A invenção também fornece proteínas de fusão e conjugados compreendendo estes polipeptídeos, e ácidos nucleicos isolados ou recombinantes codificando estes polipeptídeos.

A invenção também fornece conjugados compreendendo um polipeptídeo da invenção, tal como qualquer dos polipeptídeos da invenção descritos acima, e pelo menos uma unidade não polipeptídica ligada a um grupo de ligação do polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que o conjugado exibe uma atividade de interferon-alfa. Em algumas instâncias, a unidade não polipeptídica é um polímero (por exemplo, uma molécula de óxido de polialquileno, tal como um polietilenoglicol (PEG), tal como um monometoxipolietilenoglicol (mPEG)), ou uma unidade de açúcar. A pelo menos uma unidade não polipeptídica pode, por exemplo, ser ligada a uma cisteína, a uma lisina, ao grupo amino N-terminal do polipeptídeo, ou a um sítio de glicosilação in vivo do polipeptídeo. A invenção também fornece métodos de fazer e usar tais conjugados.

A invenção também fornece ácidos nucleicos isolados ou recombinantes codificando qualquer dos polipeptídeos da invenção. A invenção também fornece vetores e células hospedeiras compreendendo tais ácidos nucleicos, e métodos de fazer polipeptídeos da invenção compreendendo cultivar células hospedeiras compreendendo tais ácidos nucleicos.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de inibir replicação viral em células infectadas por vírus, o método compreendendo colocar em contato as células infectadas por vírus com um polipeptídeo ou um conjugado da invenção. A invenção também fornece um método de reduzir o número de cópias de um vírus em células infectadas por vírus, compreendendo colocar em contato as células infectadas por vírus com um polipeptídeo ou um conjugado da invenção.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratar uma condição que é responsiva a interferon-alfa, compreendendo administrar a um sujeito afligido com a condição uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção ou um conjugado da invenção em uma quantidade efetiva para melhorar um sintoma associado com a condição. Tais condições incluem infecção por vírus da Hepatite C Crônica, infecção por vírus da Hepatite B Crônica, Leucemia de Célula Capilar, Melanoma maligno, Linfoma Folicular, Condiloma Acuminado, Sarcoma de Kaposi relacionado à AIDS, Linfoma não Hodgkin, Leucemia Mielógena Crônica, Carcinoma de Célula Basal, Mieloma Múltiplo, tumores carcinóides, câncer de bexiga, Doença de Crohn, Linfoma da Célula T Cutânea, Carcinoma de Célula Renal, Esclerose Múltipla, e AIDS. A invenção também inclui o uso de uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção ou um conjugado da invenção para tratar uma condição que é responsiva a interferon-alfa, tal como por exemplo uma condição descrita acima.

Estes e outros objetivos e características da invenção se tornarão mais inteiramente perceptíveis quando a descrição detalhada seguinte for lida em conjunção com as figuras acompanhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra um alinhamento da seqüência de um polipeptídeo da invenção (SEQ ID NO:l) com as seguintes seqüências de polipeptídeos interferon-alfa humanos (huIFN-alfa): huIFN-alfa Ia (SEQ ID N0:320), huIFN-alfa 2b (SEQ ID NO:321), huIFN-alfa 4b (SEQ ID NO:323), huIFN-alfa 5 (SEQ ID NO:324), huIFN-alfa 6 (SEQ ID NO:325), huIFN-alfa 7a (SEQ ID NO:326), huIFN-alfa 8b (SEQ ID NO:327), huIFN-alfa IOa (SEQ ID NO:328), huIFN-alfa 14a (SEQ ID NO:329), huIFN-alfa 16 (SEQ ID N0:330), huIFN-alfa 17b (SEQ ID NO:331) e huIFN-alfa 21b (SEQ ID NO:332). As convenções de nomenclatura para as seqüências de huIFN-alfa estão de acordo com Allen G. and Diaz M.O. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:181-184. Posições de resíduos de aminoácidos em SEQ ID N0s:320-321 e 323-332 que são idênticas a SEQ ID NO:1 são indicadas com um ponto (.), e lacunas na seqüência são indicadas com um traço (-).

Figura 2 mostra um alinhamento da seqüência de um polipeptídeo da invenção (SEQ ID NO:312) com seqüências de polipeptídeos de interferon-alfa humano SEQ ID N0s:320-321 e 323-332, como descrito acima. Posições de resíduos de aminoácidos em SEQ ID N0s:320-321 e 323- 332 que são idênticas a SEQ ID NO:312 são indicadas com um ponto (.), e lacunas na seqüência são indicadas com um traço (-).

Figura 3 mostra atividade antiviral em um ensaio HeLa/EMCV, expressa como EC5O (ng/ml), para os seguintes polipeptídeos exemplares da invenção: M04 (SEQ ID NO:262); M05 (SEQ ID NO:266) M23 (SEQ ID NO:232); M45 (SEQ ID NO:88); MOl (SEQ ID NO:312) M20 (SEQ ID NO:297); M27 (SEQ ID NO: 167); M09 (SEQ ID NO: 107) M02 (SEQ ID N0:208); M33 (SEQ ID NO:94); M37 (SEQ ID NO: 141) M30 (SEQ ID NO:46); M22 (SEQ ID NO: 171); M24 (SEQ ID N0:310) M44 (SEQ ID NO:176); M31 (SEQ ID NO:26); MlO (SEQ ID NO:89); M14 (SEQ ID NO:296); M03 (SEQ ID NO:148); M46 (SEQ ID NO: 18); M26 (SEQ ID NO: 10); M21 (SEQ ID NO:87); M38 (SEQ ID N0:103); M28 (SEQ ID NO:234); M19 (SEQ ID N0:30); Mll (SEQ ID NO: 179); M34 (SEQ ID NO:2); M07 (SEQ ID N0:260); Ml 8 (SEQ ID N0:306); M40 (SEQ ID NO:140); M16 (SEQ ID NO:127); M25 (SEQ ID NO:293); M29 (SEQ ID NO:195); M36 (SEQ ID NO:191); M06 (SEQ ID NO:263); M32 (SEQ ED NO:1); M39 (SEQ ID NO:298); M42 (SEQ ID NO:24); M08 (SEQ ID NO:258); M35 (SEQ ID NO: 124); M41 (SEQ ID NO:7); M12 (SEQ ID NO:9); Ml7 (SEQ ID N0:303); e M43 (SEQ ID NO:6), quando comparada com a atividade de polipeptídeos interferon-alfa de referência hulFNa-2a (SEQ ID NO:322) e huIFNa-2b (SEQ ID NO:321).

Figura 4 mostra a matriz de substituição BLOSUM62.

Figuras 5A, 5B e 5C mostram exemplos de cálculos de escores de alinhamento usados para determinar alinhamentos ótimos de seqüências, usando os seguintes parâmetros: matriz BLOSUM62, penalidade de abertura de lacuna = 11, e penalidade de extensão de lacuna = 1. Figura 5 A mostra um alinhamento de resíduos 29-50 de SEQ ID NO:l (superior) com resíduos 30- 52 de SEQ ID NO:312 (inferior). Figuras 5B e 5C mostram cada um alinhamento de resíduos 29-50 de SEQ ID NO:312 (superior) com resíduos 30-50 de SEQ ID NO:321 (inferior), onde Figura 5B mostra o cálculo de escore de alinhamento sem introdução de uma lacuna no alinhamento, e Figura 5C mostra o cálculo de escore de alinhamento com uma introdução de uma lacuna no alinhamento.

Figuras 6A-6V mostram as seqüências de aminoácidos de polipeptídeos exemplares da invenção, identificadas neste lugar como SEQ ID NOs:l-319.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

DEFINIÇÕES

A menos que de outra forma definido neste lugar ou no resto do relatório, todos os termos técnicos e científicos usados neste lugar têm o mesmo significado como geralmente entendido por aqueles de ordinário verso na técnica a qual a invenção pertence.

Uma "seqüência de polipeptídeos" (por exemplo, uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, etc) é um polímero de aminoácidos compreendendo aminoácidos naturalmente ocorrentes ou análogos de aminoácido artificiais, ou uma série de partes representando um polímero de aminoácido, dependendo do contexto. Dada a degenerescência do código genético, um ou mais ácidos nucleicos, ou os ácidos nucleicos complementares destes, que codificam uma seqüência de polipeptídeos específica podem ser determinados a partir de seqüência de polipeptídeos.

Uma "seqüência de polinucleotídeos" (por exemplo, um ácido nucleico, polinucleotídeo, oligonucleotídeo, etc) é um polímero de nucleotídeos compreendendo nucleotídeos A,C,T,U,G ou outros nucleotídeos naturalmente ocorrentes ou análogos de nucleotídeos artificiais, ou uma série de partes representando um ácido nucleico, dependendo do contexto. Ou o dado ácido nucleico, ou o ácido nucleico complementar podem ser determinados a partir de qualquer seqüência de polinucleotídeos especificada.

Numeração de um dado polímero de aminoácidos ou polímero de ácidos nucleicos "corresponde a" ou é "relativa a" a numeração de um polímero de aminoácidos ou polímero de ácidos nucleicos selecionado quando a posição de qualquer componente do polímero dado (por exemplo, aminoácido, nucleotídeo, também referido genericamente como um "resíduo") é designada por referência ao mesmo ou uma posição equivalente no selecionado polímero de aminoácido ou ácido nucleico, preferivelmente do que pela posição numérica atual do componente no polímero dado. Assim, por exemplo, a numeração de uma dada posição de aminoácido em uma dada seqüência de polipeptídeos corresponde à mesma ou equivalente posição de aminoácido em uma seqüência de polipeptídeos selecionada usada como uma seqüência de referência.

Uma "posição equivalente" (por exemplo, uma "posição de aminoácido equivalente", ou "posição de ácido nucleico equivalente" ou "posição de resíduo equivalente") é definida neste lugar como uma posição (tal como, uma posição de aminoácido ou posição de ácido nucleico ou posição de resíduo) de uma seqüência de polipeptídeos de teste (ou de polinucleotídeos de teste) que se alinha com uma posição correspondente de uma seqüência de polipeptídeos de referência (ou de polinucleotídeos de referência), quando alinhado otimamente usando um algoritmo de alinhamento como descrito neste lugar. A posição de aminoácido equivalente do polipeptídeo teste necessita não ter o mesmo número de posição numérica do que a posição correspondente do polipeptídeo referência; da mesma maneira, a posição de ácido nucleico equivalente do polinucleotídeo teste necessita não ter o mesmo número de posição numérica do que a posição correspondente do polinucleotídeo referência. Como um exemplo, Figura 1 mostra a seqüência de um polipeptídeo da invenção identificada neste lugar como SEQ ID NO:1 (clone M32) otimamente alinhada com várias seqüências de polipeptídeos conhecidas de interferon-alfa humanos. Neste exemplo, posição de aminoácido número 90 de SEQ ID NO:1 (Tyr90, isto é Y90) é considerada como sendo uma posição de aminoácido equivalente (isto é "equivalente a") àquela de posição de aminoácido número 89 (Tyr89, isto é Y89) de SEQ ID NO:321 (IFN-alfa humano 2b), uma vez que aminoácido número 90 de SEQ ID NO:1 se alinha com aminoácido número 89 de SEQ ID NO:321. Em outras palavras, posição de aminoácido 90 de SEQ ID NO:1 "corresponde a" posição de aminoácido 89 de SEQ ID NO:321. Da mesma maneira, resíduo Y90 (Tyr90) em SEQ ID NO:1 é entendido por corresponder a, por exemplo, resíduo D90 (Asp90) em SEQ ID NO:312 (clone M01, veja Figura 2), de forma que, por exemplo, a substituição Y90F em relação a SEQ ID NO:1 é entendida por corresponder à substituição D90F em relação a, por exemplo, SEQ ID NO:312, e assim por diante.

Duas seqüências de polipeptídeos são "otimamente alinhadas" quando elas são alinhadas usando parâmetros definidos, isto é, uma matriz de substituição de aminoácido definida, penalidade de existência de lacuna (também chamada penalidade de abertura de lacuna), e penalidade de extensão de lacuna, de forma a chegar ao número de similaridade mais alto possível para o par de seqüências. A matriz BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89(22): 10915-10919) é freqüentemente usada como uma matriz de substituição de pontuação padrão em algoritmos de alinhamento de seqüência de polipeptídeos (tal como BLAST). A penalidade da existência de lacuna é imposta para a introdução de uma simples lacuna de aminoácido em uma das seqüências alinhadas, e a penalidade de extensão de lacuna é imposta para cada posição de resíduo na lacuna. A menos que de outra maneira determinado, parâmetros de alinhamento empregados neste lugar são: matriz de pontuação BLOSUM62, penalidade de existência de lacuna =11, e penalidade de extensão de lacuna =1. O escore de alinhamento é definido pelas posições de aminoácidos de cada seqüência na qual o alinhamento começa e termina (por exemplo a janela de alinhamento), e opcionalmente pela inserção de uma lacuna ou múltiplas lacunas em uma ou ambas seqüências, de forma a chegar ao número de similaridade mais alto possível, como descrito em mais detalhe abaixo na seção intitulada "Identidade de Seqüência Percentual".

A terminologia usada para identificar as posições de aminoácidos e substituições de aminoácidos é ilustrada como segue: Q52 indica que a posição número 52 é ocupada por um resíduo de glutamina (Gln) em uma seqüência de aminoácidos de referência, tal como SEQ ID NO:l. Q52E indica que o resíduo de glutamina de posição 52 foi substituído por um resíduo de ácido glutâmico (Glu). Substituições alternativas são indicadas com um "/", por exemplo, Q52E/P significa uma seqüência de aminoácidos na qual o resíduo de glutamina em posição 52 é substituído por um resíduo de ácido glutâmico ou um resíduo de prolina. Substituições múltiplas podem ser algumas vezes indicadas com um "+", por exemplo A51T + Q52E/P indica uma seqüência de aminoácidos que contém uma substituição do resíduo de alanina em posição 51 por um resíduo de treonina e uma substituição do resíduo de glutamina em posição 52 por um resíduo de ácido glutâmico ou um resíduo de prolina. Deleções são indicadas por um asterisco. Por exemplo, Q52* indica que o resíduo de glutamina em posição 52 foi deletado. Deleções de dois ou mais aminoácidos contínuos podem ser indicadas como segue, por exemplo, R161*-E166* indica a deleção de resíduos R161-E166 inclusive (isto é, resíduos 161, 162, 163, 164, 164, e 166 são deletados). Inserções são indicadas da seguinte maneira: Inserção de um resíduo de serina adicional depois do resíduo de glutamina localizado em posição 52 é indicada como Q52QS. Substituições e inserções combinadas são indicadas da seguinte maneira: Substituição do resíduo de glutamina em posição 52 por um resíduo de serina e inserção de um resíduo de alanina depois do resíduo de aminoácido em posição 52 é indicada como Q52SA.

A menos que de outra maneira indicado, a numeração da posição de resíduos de aminoácidos recitada neste lugar é em relação à seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:l. E para ser entendido que enquanto exemplos e modificações para o polipeptídeo parental são geralmente fornecidos neste lugar em relação à seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:l (ou em relação à outra seqüência especificada), os exemplos referem-se a outros polipeptídeos da invenção, e as modificações descritas neste lugar podem ser feitas em posições de aminoácidos equivalentes de qualquer dos outros polipeptídeos descritos neste lugar. Assim, como um exemplo, a substituição Y90F em relação a SEQ ID NO:l é entendida por corresponder à substituição D90F em SEQ ID NO:312, e assim por diante.

O termo "exibindo (por exemplo, exibe, ou tendo, ou tem) uma atividade de interferon-alfa" é pretendido para indicar que o polipeptídeo ou conjugado da invenção tem pelo menos uma atividade exibida por um polipeptídeo interferon-alfa de referência (tal como, por exemplo, uma polipeptídeo interferon-alfa humano, por exemplo, huINF-alfa 2b identificado neste lugar como SEQ ID NO:321, huINF-alfa 2a identificado neste lugar como SEQ ID NO:322, hINF-alfa 8b identificado neste lugar como SEQ ID NO:327, ou qualquer outro polipeptídeo interferon-alfa conhecido na técnica, tal como, por exemplo, aqueles listados em Allen G and Diaz M.O. (1996, acima)). Tal atividade inclui a capacidade de sinalizar através de um receptor de interferon-alfa, como evidenciado, por exemplo, por um ou mais de: inibição da replicação viral em células infectadas por vírus ("atividade antiviral"); aumento da diferenciação de células-T naíve para um fenótipo Th1 e/ou supressão da diferenciação de células-T naíve para um fenótipo Th2 ("atividade de diferenciação Th1); inibição da proliferação celular (" atividade antiproliferativa"). A uma ou mais atividade de interferon-alfa é ensaiada usando ensaios conhecidos na técnica e/ou descritos nos Exemplos.

Um polipeptídeo ou um conjugado exibindo uma atividade de interferon-alfa é considerado como tendo tal atividade quando ele apresenta uma atividade mensurável, por exemplo, uma mensurável atividade antiviral, atividade antiproliferativa, ou atividade de diferenciação ThI (por exemplo, como determinado por ensaios conhecidos na técnica e/ou descritos nos Exemplos). Alguém de verso na técnica reconhece que o que constitui uma atividade mensurável depende em parte da natureza do ensaio sendo empreendido, mas como uma diretriz geral uma atividade mensurável é uma na qual o sinal de ensaio gerado na presença do composto de teste (por exemplo, um polipeptídeo da invenção) é quantificável diferente do sinal de ensaio gerado na ausência do composto de teste. E para ser entendido que um polipeptídeo ou conjugado da invenção não necessita exibir todas das atividades conhecidas de um interferon-alfa de referência particular, ou exibir tais atividades na mesma extensão que o interferon-alfa de referência. Em algumas instâncias a atividade exibida por um polipeptídeo ou conjugado da invenção (como evidenciado, por exemplo, por um EC5o, atividade específica, ou outro valor relacionado à atividade), pode ser cerca de igual a, ser menos do que, ou maior do que aquela da atividade particular exibida por um interferon-alfa de referência.

Uma "variante" é um polipeptídeo compreendendo uma seqüência que difere em uma ou mais posições de aminoácidos daquela da seqüência de polipeptídeos parental. Por exemplo, uma variante pode compreender uma seqüência que difere da seqüência de polipeptídeos parental em até 10% do número total de resíduos da seqüência de polipeptídeos parental, tal como em até 8% dos resíduos, por exemplo, em até 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do número total de resíduos da seqüência de polipeptídeos parental. Por exemplo, uma variante de SEQ ID NO:l pode compreende uma seqüência que difere de SEQ ID NO :1 em 1 a 16 posições de aminoácidos (tal como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 posições de aminoácidos), por exemplo em 1-15 posições de aminoácidos, em 1-14 posições de aminoácidos, em 1-13 posições de aminoácidos, em 1-12 posições de aminoácidos, em 1-11 posições de aminoácidos, em 1-10 posições de aminoácidos, em 1-9 posições de aminoácidos, em 1-8 posições de aminoácidos, em 1-7 posições de aminoácidos, em 1-6 posições de aminoácidos, em 1-5 posições de aminoácidos, em 1-4 posições de aminoácidos, em 1-3 posições de aminoácidos, ou em 1-2 posições de aminoácidos.

O termo "polipeptídeo parental" ou "interferon-alfa parental" é pretendido para indicar a seqüência de polipeptídeos a ser modificada em conformidade com a presente invenção. A seqüência de polipeptídeos parental pode ser aquela de IFN-alfa naturalmente ocorrente (tal como IFN-alfa de mamífero, por exemplo, IFN-alfa de primata, tal como um IFN-alfa humano, tal como um polipeptídeo huIFN-alfa identificado neste lugar como SEQ ID NOs:320-332, ou outra seqüência de huIFN-alfa como aquelas descritas neste lugar e/ou em Allen G. and Diaz M.O. (1996), acima). A seqüência de polipeptídeos parental pode ser aquela de um interferon-alfa não naturalmente ocorrente (isto é, "sintético"), tal como um IFN-alfa Con 1 (SEQ ID NO:333). Em algumas instâncias, o polipeptídeo parental a ser modificado pode ele mesmo ser um polipeptídeo da invenção, tal como, por exemplo, qualquer uma de SEQ ID NOs:l-319.

"Naturalmente ocorrente" como aplicado a um objeto se refere ao fato de que o objeto pode ser encontrado na natureza em distinção de ser artificialmente produzido pelo homem. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeos ou polinucleotídeos que está presente em um organismo (incluindo tecidos de vírus, bactérias, protozoários, insetos, plantas ou mamíferos) que podem ser isolados de uma fonte na natureza e que não foi modificado intencionalmente pelo homem no laboratório é naturalmente ocorrente. "Não naturalmente ocorrente" (também denominado "sintético" ou "artificial") como aplicado a um objeto significa que o objeto não é naturalmente ocorrente - i.e, o objeto não pode ser encontrado na natureza em distinção de ser artificialmente produzido pelo homem.

Um "fragmento" ou "subseqüência" é qualquer porção de uma seqüência inteira, até mas não incluindo a seqüência inteira. Assim, um fragmento ou subseqüência se refere a uma seqüência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que compreende uma parte de uma seqüência maior de aminoácidos (por exemplo, polipeptídeo) ou ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeo).

Um tipo de fragmento contemplado pela presente invenção é um fragmento no qual resíduos de aminoácidos são removidos do término N ou do término C do polipeptídeo parental (ou ambas); tal um polipeptídeo é considerado sendo "truncado N-terminalmente" ou "truncado C- terminalmente", respectivamente. É conhecido que deleção de pelo menos dos quatro primeiros aminoácidos do término N não afeta significativamente a atividade de interferon-alfa (Lydon, N.B. et al. (1985) Biochemistry 24:4131- 41). Além disso, variantes retendo atividade de interferon-alfa foram descritas caracterizadas pelo fato de que entre 7 e 11 aminoácidos foram deletados do término C (Cheetham B.F. et al. (1991) Antiviral Res. 15(l):27-39; Chang N.T. et al. (9183) Arch. Biochem. Biophys. 221(2):585-589; Franke A.E. et al. (1982) DNA l(3):223-230).

Um "receptor" por exemplo, um "receptor de interferon-alfa" (também conhecido como um "receptor de interferon Tipo 1" é um receptor que é ativado nas células por um interferon-alfa, por exemplo, liga um interferon-alfa e inicia sinalização intracelular, tal como um receptor de interferon tipo 1 compreendendo subunidades de receptor IFNAR-2 e IFNAR-I (Domanski et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(6):3144-3147; Mogensen et al. (1999) Journal of Interferon and Cytokine Research, 19:1069-1098). No contexto desta invenção, também é pretendido que receptor inclua formas truncadas de uma molécula de receptor de comprimento total, tal como, por exemplo, uma molécula de receptor que carece de uma porção de ligação de membrana, tal como uma forma solúvel de uma molécula de receptor (também conhecida como "receptor solúvel") que compreende um domínio de ligação extracelular, que liga um interferon- alfa, mas pode não necessariamente ligar a uma membrana e/ou iniciar sinalização intracelular.

Uma "afinidade de ligação específica" entre duas moléculas, por exemplo, um ligante e um receptor, significa uma ligação preferencial de uma molécula com outra em uma mistura de moléculas. A ligação de moléculas é tipicamente considerada específica se a afinidade de ligação é de cerca de 1 χ IO4 M"1 a cerca de 1 χ IO9 M"1 ou maior (isto é, K0 de cerca de IO"4 a IO"9 ou menos). Afinidade de ligação entre um ligante e um receptor pode ser medida por técnicas padrão conhecidas por aqueles de verso na técnica. Exemplos não limitantes das técnicas bem conhecidas para medir afinidades de ligação incluem tecnologia Biacore® (Biacore AB, Sweden), microcalorimetria de titulação isotérmica (MicroCal LLC, Northampton, MA USA), ELISA, e citometria de fluxo (por exemplo,FACS). Por exemplo, métodos de citometria de fluxo podem ser usados para selecionar por populações de moléculas (tal como, por exemplo, ligantes que se apresentam em superfície celular) que se ligam especificamente ao associado membro do par de ligação (tal como um receptor). Complexos ligante-receptor podem ser detectados e classificados por fluorescência (por exemplo, reagindo o complexo com um anticorpo fluorescente que reconhece o complexo, ou reagindo um complexo compreendendo um ligante biotinilado com uma sonda fluorescente conjugada a estreptavidina). Moléculas de interesse que ligam a um membro associado do par de ligação (por exemplo, receptor) são classificadas e re-classificadas na presença de concentrações mais baixas do receptor. Realizando múltiplos ciclos de classificação na presença de concentrações decrescentes do receptor (uma variação de concentração exemplar sendo na ordem de IO"6 M abaixo até IO"9 M, isto é, 1 micromolar (μΜ) abaixo até 1 nanomolar (nM), ou menos, dependendo da natureza da interação ligante-receptor), populações enriquecidas de moléculas exibindo afinidade de ligação específica para o receptor podem ser obtidas.

Um polipeptídeo, ácido nucleico, ou outro componente é "isolado" quando ele é parcialmente ou completamente separado dos componentes com os quais é normalmente associado (outros peptídeos, polipeptídeos, proteínas (incluindo complexos, por exemplo, polimerases e ribossomos que podem acompanhar uma seqüência nativa), ácidos nucleicos, células, reagentes sintéticos, contaminantes celulares, componentes celulares, etc.), por exemplo, tal como de outros componentes com os quais é normalmente associado na célula da qual ele foi originalmente derivado. Um polipeptídeo, ácido nucleico, ou outro componente é isolado quando ele é parcialmente ou completamente recuperado ou separado dos componentes do seu ambiente natural, de forma que ele é a espécie predominante presente na composição, mistura, ou coleção de componentes (isto é, em uma base molar ele é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Em algumas instâncias, a preparação consiste de mais do que cerca de 60%, 70%, ou 75%, tipicamente mais do que cerca de 80%, ou preferivelmente mais do que cerca de 90% das espécies isoladas.

Um ácido nucleico "substancialmente puro" ou "isolado" (por exemplo, RNA ou DNA), polipeptídeo, proteína, ou composição também significa onde as espécies objeto (por exemplo, ácido nucleico ou polipeptídeo) compreendem pelo menos cerca de 50, 60, ou 70 por cento em peso (em uma base molar) de todas as macromoléculas presentes. Uma composição substancialmente pura ou isolada também pode compreender pelo menos cerca de 80, 90, ou 95 por cento em peso de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Uma espécie objeto isolada também pode ser purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) caracterizada pelo fato de que a composição consiste essencialmente de derivados de uma espécie macromolecular única. O termo "purificado" geralmente denota que um ácido nucleico, polipeptídeo, ou proteína leva a ocorrer essencialmente uma banda em um gel eletroforético. Isto significa tipicamente que o ácido nucleico, polipeptídeo, ou proteína é pelo menos cerca de 50% puro, 60% puro, 70% puro, 75% puro, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% puro, e mais preferivelmente ainda pelo menos cerca de 99% puro.

O termo "ácido nucleico isolado" pode se referir a um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) que não é imediatamente contíguo com ambas seqüências de codificação com as quais é imediatamente contíguo (isto é, um em 5' e outro no final 3') no genoma naturalmente ocorrente do organismo do qual o ácido nucleico da invenção é derivado. Assim, este termo inclui, por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou tratamento por endonuclease de restrição, se tal cDNA ou fragmento de DNA genômico é incorporado em um vetor, integrado ao genoma do mesmo ou de uma espécie diferente do organismo, incluindo, por exemplo, um vírus, do qual ele foi originalmente derivado, ligado a uma seqüência de codificação adicional para formar um gene híbrido codificando um polipeptídeo quimérico, ou independente de quaisquer outras seqüências de DNA. O DNA pode ser dupla fita ou fita simples, sentido ou anti-sentido.

Um "polinucleotídeo recombinante" ou um "polipeptídeo recombinante" é um polinucleotídeo ou polipeptídeo não naturalmente ocorrente que pode incluir seqüências de ácidos nucleicos ou aminoácidos, respectivamente, de mais de uma fonte de ácido nucleico ou polipeptídeo, cuja fonte de ácido nucleico ou polipeptídeo pode ser ácido nucleico ou polipeptídeo naturalmente ocorrente, ou pode ela própria ter sido sujeita a mutagênese ou outro tipo de modificação. Um ácido nucleico ou polipeptídeo pode ser julgado "recombinante" quando ele é sintético ou artificial ou manipulado, ou derivado de um polipeptídeo ou ácido nucleico sintético ou artificial ou manipulado. Um ácido nucleico recombinante (por exemplo, DNA ou RNA) pode ser feito pela combinação (por exemplo combinação artificial) de pelo menos dois segmentos da seqüência que não são tipicamente incluídos juntos, não tipicamente associados um com o outro, ou são de outra maneira tipicamente separados um do outro. Um ácido nucleico recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico formada pela reunião ou combinação de segmentos de ácido nucleico de diferentes fontes e/ou sintetizados artificialmente. Um "polipeptídeo recombinante" freqüentemente se refere a um polipeptídeo que resulta de um ácido nucleico clonado ou recombinante. Os polinucleotídeos ou polipeptídeos fonte dos quais as diferentes seqüências de ácidos nucleicos e polipeptídeos são derivadas são algumas vezes homólogos (isto é, tem, ou codificam um polipeptídeo que codifica, a mesma ou similar estrutura e/ou função), e são freqüentemente de diferentes isolados, sorotipos, linhagens, espécies, de organismo ou de diferentes estados de doença, por exemplo.

O termo "recombinante" quando usado em referência, por exemplo, a uma célula, polinucleotídeo, vetor, proteína, ou polipeptídeo tipicamente indica que a célula, polinucleotídeo ou vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico heterólogo (ou exógeno) ou pela alteração de um ácido nucleico nativo, ou que a proteína ou polipeptídeo foi modificado pela introdução de um aminoácido heterólogo, ou que a célula é derivada de uma célula também modificada. Células recombinantes expressam seqüências de ácidos nucleicos que não são encontradas na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam seqüências de ácidos nucleicos que seriam de outra maneira expressas anormalmente, sub-expressas, ou não expressas de forma alguma. O termo "recombinante" quando usado em referência a uma célula indica que a célula replica um ácido nucleico heterólogo, ou expressa um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico heterólogo. Células recombinantes podem conter seqüências de codificação que não são encontradas dentro forma nativa (não recombinante) da célula. Células recombinantes também podem conter seqüências de codificação encontradas na forma nativa da célula caracterizadas pelo fato de que seqüências de codificação são modificadas e re-introduzidas na célula por meios artificiais. O termo também abrande células que contêm ácido nucleico endógeno a célula que foi modificada sem remover o ácido nucleico da célula; tais modificações incluem aquelas obtidas por reposição gênica, mutação sítio-específica, recombinação, e técnicas relacionadas.

O termo "produzido recombinantemente" se refere a uma combinação artificial normalmente acompanhada por ou meios de síntese química, recombinação de seqüência recursiva de segmentos de ácidos nucleicos ou outros métodos de geração de diversidade (tal como, por exemplo, embaralhamento) de nucleotídeos, ou manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética conhecidas por aqueles com ordinário verso na técnica. "Expresso recombinantemente" tipicamente se refere a técnicas para a produção de um ácido nucleico recombinante in vitro e transferência do ácido nucleico recombinante para células in vivo, in vitro, ou ex vivo onde ele possa ser expresso ou propagado.

Uma "gaveta de expressão recombinante" ou simplesmente uma "gaveta de expressão" é uma construção de ácido nucleico, gerada recombinantemente ou sinteticamente, com elementos de ácidos nucleicos que são capazes de efetuar expressão de um gene estrutural em hospedeiros compatíveis com tais seqüências. Gavetas de expressão incluem pelo menos promotores e opcionalmente, sinais de terminação de transcrição. Tipicamente, a gaveta de expressão recombinante inclui um ácido nucleico a ser transcrito (por exemplo, um ácido nucleico codificando um polipeptídeo desejado), e um promotor. Fatores adicionais necessários ou úteis para efetuar expressão também podem ser usados como descrito neste lugar. Por exemplo, uma gaveta de expressão pode também incluir seqüências de nucleotídeos que codificam uma seqüência sinal que direciona a secreção de uma proteína expressa da célula hospedeira. Sinais de terminação de transcrição, estimuladores, e outras seqüências de ácidos nucleicos que influenciam expressão gênica, também podem ser incluídos em uma gaveta de expressão.

Um "imunogene" se refere a uma substância capaz de provocar uma resposta imune, e inclui, por exemplo, antígenos, autoantígenos que exercem um papel em indução de doenças autoimunes, e antígenos associados com tumores expressos em células cancerosas. Uma resposta imune geralmente se refere ao desenvolvimento de uma resposta celular ou mediada por anticorpo a um agente, tal como um antígeno ou fragmento deste ou ácido nucleico codificando tal agente. Em algumas instâncias, uma tal resposta compreende a produção de pelo menos um ou uma combinação de CTLs, células B, ou várias classes de células T que são direcionadas especificamente para células apresentando antígeno expressando o antígeno de interesse.

Um "antígeno" se refere a uma substância capaz de obter a formação de anticorpos em um hospedeiro, ou gerar população específica de linfócitos reativos com esta substância. Antígenos são tipicamente macromoléculas (por exemplo, proteínas e polissacarídeos) e são exógenas ao hospedeiro.

Um "adjuvante" se refere a uma substância que estimula as propriedades de estimulação imune de um antígeno ou o(s) efeito(s) farmacológico(s) de uma droga. Um adjuvante pode estimular não especificamente a resposta imune a um antígeno. "Adjuvante Completo de Freund", por exemplo, é uma emulsão de óleo e água contendo um imunogene, um agente emulsificante, e micobactérias. Outro exemplo, "Adjuvante incompleto de Freund", é o mesmo, mas sem micobactérias.

Um vetor é um componente ou composição para facilitar a transdução celular ou transfecção por um ácido nucleico selecionado, ou expressão do ácido nucleico na célula. Vetores incluem, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, vírus, YACs, bactérias, poli-lisina, etc. Um "vetor de expressão" é uma construto ou seqüência de ácidos nucleicos, gerada recombinantemente ou sinteticamente, com uma série de elementos de ácidos nucleicos específicos que permite transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula hospedeira. O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui tipicamente um ácido nucleico a ser transcrito ligado operavelmente a um promotor. O ácido nucleico a ser transcrito é tipicamente sob a direção ou controle do promotor.

"Substancialmente o comprimento total de uma seqüência de polinucleotídeos" ou "substancialmente o comprimento total de uma seqüência de polipeptídeos" se refere à pelo menos 50%, geralmente pelo menos cerca de 60%, 70%, ou 75%, normalmente pelo menos cerca de 80%, ou tipicamente pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de um comprimento de uma seqüência de polinucleotídeos ou seqüência de polipeptídeos. O termo "imunoensaio" inclui um ensaio que uso um anticorpo ou imunogene para ligar ou ligar especificamente um antígeno. O imunoensaio é tipicamente caracterizado pelo uso de propriedades de ligação específicas de um anticorpo particular para isolar, acertar, e/ou quantificar o antígeno.

O termo "sujeito" como usado neste lugar inclui, mas não é limitado a, um organismo; um mamífero, incluindo, por exemplo, um humano, primata não humano (babuíno, orangotango, macaco), camundongo, porco, vaca, cabra, gato, coelho, rato, porco da índia, hamster, cavalo, macaco, ovelha, ou outro mamífero não humano; um não mamífero, incluindo, por exemplo, um não mamífero vertebrado, tal como uma ave (por exemplo, uma galinha ou pato) ou um peixe, ou um não mamífero invertebrado.

O termo "composição farmacêutica" significa uma composição adequada para uso farmacêutico em um sujeito, incluindo um animal ou humano. Uma composição farmacêutica geralmente compreende uma quantidade efetiva de um agente ativo e um carreador, incluindo, por exemplo, um carreador farmaceuticamente aceitável.

O termo "quantidade efetiva" significa uma dosagem ou quantidade suficiente para produzir um resultado desejado. O resultado desejado pode compreender uma melhora objetiva ou subjetiva no destinatário da dosagem ou quantidade.

Um "tratamento profilático" é um tratamento administrado a um sujeito que não manifesta sinais ou sintomas de uma doença, patologia, ou desordem médica, ou manifesta apenas sinais prematuros de uma doença, patologia, ou desordem, tal que tratamento é administrado para o propósito de diminuir, prevenir, ou reduzir o risco de desenvolver a doença, patologia, ou desordem médica. Um tratamento profilático funciona como um tratamento preventivo contra uma doença ou desordem. Uma "atividade profilática" é uma atividade de um agente, tal como um ácido nucleico, vetor, gene, polipeptídeo, proteína, substância, ou composição destes que, quando administrada a um sujeito que não manifesta sinais ou sintomas de patologia, doença, ou desordem médica, ou manifesta apenas sinais prematuros de patologia, doença, ou desordem, diminui, previne, ou reduz o risco do sujeito desenvolver uma patologia, doença, ou desordem. Um agente ou composto (por exemplo, ácido nucleico ou polipeptídeo) "útil profilaticamente" se refere a um agente ou composto que é útil para diminuir, prevenir, tratar, ou reduzir desenvolvimento de patologia, doença, ou desordem.

Um "tratamento terapêutico" é um tratamento administrado a um sujeito que manifesta sintomas ou sinais de patologia, doença, ou desordem, no qual tratamento é administrado ao sujeito para o propósito de diminuir ou eliminar tais sinais ou sintomas de patologia, doença, ou desordem. Uma "atividade terapêutica" é uma atividade de um agente, tal como um ácido nucleico, vetor, gene, polipeptídeo, proteína, substância, ou composição destes que elimina ou diminui sinais ou sintomas de patologia, doença, ou desordem, quando administrado a um sujeito sofrendo de tais sinais ou sintomas. Um agente ou composto (por exemplo, ácido nucleico ou polipeptídeo) "útil terapeuticamente" indica que um agente ou composto é útil para diminuir, tratar, ou eliminar tais sinais ou sintomas de uma patologia, doença, ou desordem.

O termo "gene" amplamente se refere a qualquer segmento de DNA associado com uma função biológica. Genes incluem seqüências de codificação e/ou seqüências reguladoras requeridas para sua expressão. Genes também incluem segmentos de ácidos nucleicos com DNA não expresso que, por exemplo, formam seqüências de reconhecimento para outras proteínas (por exemplo, promotor, estimulador, ou outras regiões reguladoras). Genes podem ser obtidos de uma variedade de fontes, incluindo clonar de uma fonte de interesse ou sintetizar de informação de seqüência conhecida ou predita, e pode incluir seqüências projetadas para ter parâmetros desejados.

Geralmente, a nomenclatura usada daqui por diante e os procedimentos laboratoriais em cultura celular, genética molecular, biologia molecular, química de ácido nucleico, e química de proteína descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e geralmente empregados por aqueles de ordinário verso na técnica. Técnicas padrão, tal como descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (daqui por diante neste lugar "Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1994, suplementado por 1999) (daqui por diante neste lugar "Ausubel"), são usadas para métodos de ácido nucleico recombinante, síntese de ácido nucleico, métodos de cultura celular, e incorporação de transgene, por exemplo, eletroporação, injeção, pistola de gene, impressão através da pele, e lipofecção. Geralmente, etapas de síntese de oligonucleotídeo e purificação são realizadas de acordo com especificações. As técnicas e procedimentos são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais na técnica e várias referências gerais que são fornecidas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos ali sejam bem conhecidos por aqueles de ordinário verso na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor.

Como usado neste lugar, um "anticorpo" se refere a uma proteína compreendendo um ou mais polipeptídeos substancialmente ou parcialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. O termo anticorpo é usado para significar anticorpos inteiros e fragmentos de ligação destes. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon e mu, assim como os genes de região variável de miríade de imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas ou como kappa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilon, que no caso definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (por exemplo, anticorpo) típica compreende um tetrâmero.

Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 KDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 KDa). O término N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis primariamente por reconhecimento do antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) se referem a estas cadeias leves e pesadas, respectivamente.

Anticorpos também incluem anticorpos monoclonais de composto simples, anticorpos de cadeia única, incluindo anticorpos de cadeia única Fv (sFv) na qual uma pesada variável e uma cadeia leve variável são unidas juntas (diretamente ou através de um ligante peptídico) para formar um polipeptídeo contínuo, assim como diacorpos, tricorpos, e tetracorpos (Pack et al. (1995) J Mol Biol 246:28; Biotechnol 11:1271; e Biochemistry 31:1579). Os anticorpos são, por exemplo, policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado, cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, ou semelhantes.

O termo "epítopo" significa um determinante protéico capaz de ligação específica a um anticorpo. Epítopos normalmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tal como cadeias laterais de aminoácidos ou de açúcar e normalmente têm características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos em que a ligação ao primeiro mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes.

Um "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo é um fragmento de peptídeo ou polipeptídeo do anticorpo que se liga a um antígeno. Um sítio ligação a antígeno é formado por aqueles aminoácidos do anticorpo que contribuem para, são envolvidos em, ou afetam a ligação do antígeno. Veja Scott, T.A. and Mercer, E.I., Concise Encyclopedia: Biochemistry and Molecular Biology (de Gruyter, 3d ed. 1997), e Watson, J.D. et al., Recombinant DNA (2d ed. 1992) (daqui por diante neste lugar "Watson, Recombinant DNA"), cada qual é incorporada neste lugar pela referência na sua totalidade para todos propósitos.

O termo "triagem" descreve, em geral, um processo que identifica moléculas ótimas da presente invenção, tal como, por exemplo, polipeptídeos da invenção, e ácidos nucleicos codificando tais moléculas. Diversas propriedades destas respectivas moléculas podem ser usadas em triagem, por exemplo: capacidade de uma respectiva molécula para se ligar um ligante ou a um receptor, para inibir proliferação celular, para inibir replicação viral em células infectadas por vírus, para induzir ou inibir produção celular de citocina, para alterar uma resposta imune (por exemplo, induzir ou inibir uma resposta imune desejada), em um sistema de teste ou em uma aplicação in vitro, ex vivo ou in vivo. No caso de antígenos, diversas propriedades do antígeno podem ser usadas em seleção e triagem incluindo expressão do antígeno, dobramento, estabilidade, imunogenicidade e presença de epítopos de diversos antígenos relacionados.

"Seleção" é uma forma de triagem na qual identificação e separação física são atingidas simultaneamente. Um modo de seleção é seleção genética, que pode ser realizada, por exemplo, por expressão de um marcador de seleção, o que em algumas circunstâncias permite que células expressem o marcador para sobreviver enquanto outras células morrem (ou vice versa). Marcadores de seleção incluem droga e genes de resistência à toxina, e os semelhantes. Marcadores de triagem incluem, por exemplo, luciferase, beta-galactosidase e proteína fluorescente verde, e os semelhantes. Outro modo de seleção envolve classificação física baseada em um evento detectável, tal como ligação de um ligante a um receptor, reação de um substrato com uma enzima, ou qualquer outro processo físico que pode gerar um sinal detectável ou diretamente (por exemplo, utilizando um substrato ou ligante cromogênico/fluorogênico) ou indiretamente (por exemplo, reagindo com um anticorpo secundário cromogênico/fluorogênico ou ligante cromogênico/fluorogênico).

Seleção por classificação física pode ser realizada por uma variedade de métodos, tal como por citometria de fluxo, por exemplo em célula inteira ou formatos de microgota. Por exemplo, bibliotecas podem ser subclonadas em um vetor de apresentação em superfície para permitir expressão de polipeptídeos na superfície celular. Bibliotecas de polipeptídeos expressos em superfície então podem ser pré-enriquecidas por aqueles polipeptídeos que se ligam a um receptor, usando citometria de fluxo. Por exemplo, células apresentando polipeptídeos que se ligam ao receptor podem ser detectadas usando um anticorpo anti-receptor fluorescente-marcado, que, quando ligado ao receptor, indiretamente marca as células devido à interação do receptor com o polipeptídeo apresentado em superfície. Células que são fluorescentemente marcadas desta maneira então podem ser classificadas por citometria de fluxo, o que pré-enriquece a biblioteca por membros que codificam polipeptídeos expressos e dobrados que se ligam ao receptor. Bibliotecas pré-enriquecidas por ligantes de receptor então podem ser sujeitas a uma seleção usando um ensaio de competição para adicionalmente enriquecer por membros codificando polipeptídeos que se ligam fortemente ao receptor e/ou exibem uma taxa de dissociação lenta do receptor, em relação a um polipeptídeo de referência. Nesta abordagem, receptor é adicionado a uma população de células expressando polipeptídeos na superfície celular. As células são lavadas, e então um polipeptídeo de referência é adicionado. Populações celulares são classificadas por citometria de fluxo depois de várias vezes para selecionar por polipeptídeos apresentados em superfície que permanecem ligados ao receptor por períodos crescentes na presença do polipeptídeo de referência. Populações celulares selecionadas desta maneira são esperadas serem enriquecidas por membros de biblioteca que codificam polipeptídeos exibindo ligação mais forte com o receptor cognato, e permite o isolamento e identificação de polipeptídeos com atividades associadas com forte ligação de receptor.

Um ácido nucleico "exógeno", "segmento de DNA exógeno", "seqüência heteróloga", ou "ácido nucleico heterólogo", como usado neste lugar, é um que se origina de uma fonte exógena à célula hospedeira particular, ou, se da mesma fonte, é modificado a partir de sua forma original. Assim, um gene heterólogo em uma célula hospedeira inclui um gene que é endógeno à célula hospedeira particular, mas foi modificado. Modificação de uma seqüência heteróloga nas aplicações descritas neste lugar ocorre tipicamente através do uso de recombinação de seqüência recursiva. Os termos se referem a um segmento de DNA que é exógeno ou heterólogo para a célula, ou homólogo para a célula, mas em uma posição dentro do ácido nucleico da célula hospedeira em que o elemento não é ordinariamente encontrado. Segmentos de DNA exógenos são expressos para produzir polipeptídeos exógenos.

O termo "ácido nucleico" se refere a desoxiribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros destes ou em forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira similar aos nucleotídeos naturalmente ocorrentes. A menos que de outra maneira indicado, uma seqüência de ácidos nucleicos particular também abrange implicitamente variantes destes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códon degenerado) e seqüências complementares e assim como a seqüência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser atingidas gerando seqüências nas quais a terceira posição de um ou mais códon selecionado (ou todos) é substituída por base misturada e/ou resíduos de desoxiinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8:91-98). O termo ácido nucleico é usado permutavelmente com gene, cDNA e mRNA codificados por um gene.

"Ácido nucleico derivado de um gene" se refere a um ácido nucleico para o qual síntese do gene, ou uma subseqüência deste, serviu afinal como um modelo. Assim, um mRNA, um cDNA reverso transcrito a partir de um mRNA, um RNA transcrito a partir deste cDNA, um DNA amplificado a partir do cDNA, um RNA transcrito a partir do DNA amplificado, etc., são todos derivados do gene e detecção de tais produtos derivados é indicativa da presença e/ou abundância do gene original e/ou transcrito de gene em uma amostra.

Um ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando ele é colocado dentro de uma relação funcional com outra seqüência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor ou estimulador é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele aumenta a transcrição da seqüência de codificação. Operavelmente ligado significa que as seqüências de DNA sendo ligadas são tipicamente contíguas e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no quadro de leitura. Entretanto, uma vez que estimuladores geralmente funcionam quando separados do promotor por vários quilobases e seqüências intrônicas podem ser de vários comprimentos, alguns elementos de polinucleotídeos podem ser ligados operavelmente mas não contíguos.

O termo "citocina" inclui, por exemplo, interleucinas, interferons, quimiocinas, fatores de crescimento hematopoiéticos, fatores de necrose de tumor e fatores de transformação de crescimento. Em geral estes são proteínas de baixo peso molecular que regulam maturação, ativação, proliferação, e diferenciação de células do sistema imune.

Na presente descrição e reivindicações, qualquer referência a "um" componente, por exemplo no contexto de uma unidade não polipeptídica, um resíduo de aminoácido, uma substituição, um tampão, um cátion, etc., é pretendido para se referir a um ou mais de tais componentes, a menos que de outra maneira determinado ou a menos que esteja claro a partir do contexto particular que este não é o caso. Por exemplo, a expressão "um componente selecionado a partir de um grupo consistindo de A, B, e C" é pretendida para incluir todas as combinações de A, B, e C,por exemplo, A, B, C, A+B, A+C, B+C ou A+B+C.

Vários termos adicionais são definidos ou de outra maneira caracterizados neste lugar.

MOLÉCULAS E MÉTODOS DA INVENÇÃO

Moléculas da invenção (por exemplo, polipeptídeos da invenção, conjugados da invenção, e ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos) são úteis para o tratamento de doenças ou desordens que são responsivas ao tratamento por interferon-alfa, particularmente doenças associadas com infecção viral, tal como, por exemplo, infecção por HCV.

Pacientes com infecção por HCV crônica têm cargas virais tipicamente na extensão de IO4 - IO7 cópias de RNA de HCV/ml de soro antes do tratamento. Sob tratamento com IFN-alfa, carga viral nestes pacientes caracteristicamente passa por duas fases log-lineares de declínio distintas (Figura 1B; Neumann A.U., et al. (1998) Science 282:103-107). A queda rápida inicial na carga viral que ocorre dentro dos dois primeiros dias de terapia com IFN-alfa é acreditada ser devida à redução mediada por interferon-alfa em produção viral nas células do fígado infectadas e concomitante proteção das células naive contra infecção. A taxa de produção viral atinge um novo estado constante em cerca de dois dias, tempo no qual uma segunda fase log-linear menos rápida de depuração viral é observada. Esta segunda fase de depuração viral é acreditada ser devida em parte a assassinato mediado por célula-T de células do fígado infectadas (Neumann, et al., acima). Acredita-se que IFN-alfa exerça um papel chave na resposta biológica através da estimulação de antígenos específicos de células T para diferenciar em células Th 1. Além disso, acredita-se que o modo de ação da Ribavirina seja devido ao aumento da resposta do ThI, e acredita-se que seja a base mecanística da sua eficácia em terapia combinada com IFN-alfa. Pacientes HCV-infectados que são não responsivos a terapias com interferon- alfa atualmente em uso (geralmente chamados "não-responsores") exibem perfis de depuração de carga viral muito mais superficiais.

Embora a presente invenção não seja pretendida para ser limitada por uma teoria de mecanismo fundamental, é proposto que atividade antiviral em sistemas de ensaio substituto (tal como aqueles descritos em mais detalhe neste lugar) pode ser preditiva da eficácia de interferon-alfa, por exemplo, na primeira fase de depuração viral. Ensaios antivirais exemplares, descritos na seção dos Exemplos, monitoram a efetividade de IFN-alfa em proteger contra o efeito citopático de Vírus de Encefalomiocardite (EMCV) em células de carcinoma cervical humano HeLa como um sistema substituto para efetividade contra HCV em células de fígado humanas. Outros sistemas de ensaio vírus / célula úteis incluem EMCV em células âmnio-derivadas humanas WISH, EMCV em células derivados de fígado humano HuH7, Vírus de Estomatite Vesicular (VSV) em células HuH7, Vírus de Vaccinia (W) em células HeLa, Vírus da Febre Amarela (YFV) em células de hepatocarcinoma humanas HepG2, assim como Vírus de Imunodeficiência Humana (HIV) em células T+CD4 primárias. Exemplo 2 e Figura 3 mostram atividades antivirais de polipeptídeos representativos da invenção no ensaio antiviral EMCV/HeLa. Outro sistema de ensaio substituto útil para monitorar efetividade contra HCV em hepatócritos infectados inclui sistemas de replicon HCV, como descrito, por exemplo, por Lohmann V., et aL, (1999) Science 285(5424):285-293; Randall G. and Rice C.M. (2001) Curr Opin Infect Dis 14(6):743-7477; e Bartenschlager, R. (2002) Nature Reviews/Drug Discovery 1:911. Um exemplo de um sistema hospedeiro in vivo útil para monitorar eficácia antiviral de HCV é um camundongo SCID de fígado humano quimérico, como descrito por Mercer, et al. (2001) Nature Medicine 7(8):927-933.

E proposto mais adicionalmente, sem ser limitado pela teoria, que estimulação da diferenciação de ThI e/ou supressão da diferenciação de Th2 por IFN-alfa pode ser um fator contribuinte para eficácia de interferon- alfa, por exemplo, na segunda fase de depuração viral. De acordo com esta teoria, IFN-alfa desenvolvidos com aumentada potência nestas atividades biológicas (isto é, estimulação da diferenciação de ThI e/ou supressão da diferenciação de TH2) seriam preditos de terem eficácia aumentada em relação a, por exemplo, moléculas de interferon-alfa terapêuticas atualmente aprovadas administradas na mesma dosagem. Um ensaio exemplar, descrito na seção dos Exemplos neste lugar, monitora a estimulação da diferenciação de

ThI e/ou supressão da diferenciação de TH2 por IFN-alfa em célula ThO naíve, medindo a produção de citocinas associadas ao fenótipo-THl (por exemplo IFN-gama) e/ou fenótipo-TH2 (por exemplo, IL-5, IL-4) através de ELISA ou por coloração intracelular e classificação FAC S.

A eficácia terapêutica de moléculas de IFN-alfa tende a ser diminuída em parte devido a toxicidades dose-limitantes, por exemplo trombocitopenia e neutropenia. Embora não seja pretendido que a presente invenção seja limitada por uma teoria particular de mecanismo fundamental, é proposto que tal toxicidade pode estar associada com efeitos antiproliferativos de EFN-alfa em precursores de plaqueta e neutrófilo, e que atividade antiproliferativa em sistemas de ensaio substituto (tais como aqueles descritos neste lugar) pode ser preditiva da toxicidade relativa de uma molécula interferon-alfa. Assim, toxicidades dose-limitantes associadas com terapia com IFN-alfa podem ser diminuídas em moléculas de IFN-alfa que exibem reduzida atividade antiproliferativa em relação a, por exemplo, moléculas de IFN-alfa terapêuticas atualmente aprovadas, tais como ROFERON®-A (Interferon alfa-2a, recombinante; Hoffinann-La Roche Inc.), INTRON® A (Interferon alfa-2b, recombinante; Schering Corporation), e INFERGEN® (interferon alfacon-1; InterMune, Inc.). Um ensaio de atividade antiproliferativa exemplar, descrito na seção dos Exemplos neste lugar, monitora o efeito de IFN-alfa na proliferação de células linfóides Daudi humanas. Alternativamente, ou em adição, toxicidades dose-limitantes podem ser reduzidas como resultado de administrar mais moléculas terapeuticamente ativas, o que permitiria dosagem em concentrações inferiores ou em freqüências inferiores do que moléculas atualmente aprovadas.

E um objetivo da invenção fornecer novos polipeptídeos interferon-alfa, e ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos. Polipeptídeos da invenção são úteis para o tratamento de doenças e desordens que são responsivas a tratamento com interferon-alfa, particularmente doenças associadas à infecção viral, tal como, por exemplo, infecção por HCV. Alguns polipeptídeos da invenção exibem uma atividade de interferon- alfa, tal como, por exemplo, atividade antiviral, atividade antiproliferativa, e/ou atividade de diferenciação de Th 1. Alguns polipeptídeos da invenção exibem uma ou mais das seguintes propriedades: atividade antiviral aumentada ou diminuída comparada com um polipeptídeo interferon-alfa de referência; atividade de diferenciação de ThI aumentada ou diminuída comparada com um polipeptídeo interferon-alfa de referência; atividade antiproliferativa aumentada ou diminuída comparada com um polipeptídeo interferon-alfa de referência. O polipeptídeo interferon-alfa de referência pode compreender uma seqüência de um interferon-alfa não naturalmente ocorrente, tal como IFN-alfa Com 1 (SEQ ID NO:333), ou pode compreender uma seqüência de um interferon-alfa naturalmente ocorrente (isto é, tipo selvagem). Exemplos de seqüências de polipeptídeos interferon-alfa naturalmente ocorrentes incluem seqüências de polipeptídeos IFN-alfa humanos, tal como, por exemplo, huIFN-alfa 2b (SED ID NO:321), huIFN- alfa 2a (SED ID NO:322), huIFN-alfa 2c (SED ID NO:322 com posição 34 = Arg), huIFN-alfa 8b (SED ID NO:327), huIFN-alfa 8a (SED ID NO:327 com posições 98 = Vai, 99 = Leu, 100 = Cys, e 101 = Asp), huIFN-alfa 8c (SED ID NO:327 com posição 161 = Asp e aminoácidos em posições 162-166 deletados), huIFN-alfa 14a (SED ID NO:329), huIFN-alfa 14c (SED ID NO:329 com posição 152 = Leu), ou uma seqüência de qualquer outro polipeptídeo interferon-alfa humano naturalmente ocorrente, tal como aqueles listados em Allen G. and Diaz M=O. (1996), acima.

Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos interferon- alfa que exibem eficácia estimulada para depurar um vírus de células infectadas por vírus, comparando com uma molécula interferon-alfa de referência, tal como uma atualmente empregada como um terapêutico (tal como, por exemplo, ROFERON-A, INTRON A, ou INFERGEN). Vírus exemplares incluem, mas não são limitados a, vírus da família Flaviviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite C, Vírus da Febre Amarela, Vírus do Oeste do Nilo, Vírus da Encefalite Japonesa, Vírus da Dengue, e Vírus da Diarréia Viral Bovina; vírus da família Hepadnaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite B; vírus da família Picornaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Encefalomiocardite, Rinovírus Humano, e Vírus da Hepatite A; vírus da família Retroviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Imunodeficiência Humana, Vírus da Imunodeficiência Símia, Vírus Linfotrópico-T Humano, e Vírus do Sarcoma Rous; vírus da família Coronaviridae, tal como, por exemplo, coronavírus SARS; vírus da família Rhabdoviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Raiva e Vírus da Estomatite Vesicular; vírus da família Paramyxoviridae, tal como, por exemplo, Vírus Sincial Respiratório e Vírus de Parainfluenza; vírus da família Papillomaviridae, tal como, por exemplo, Papilomavírus Humano; e vírus da família Herpesviridae, tal como, por exemplo, Vírus do Herpes Simples. Tal eficácia estimulada pode resultar de atividade antiviral estimulada, atividade de diferenciação de ThI estimulada, ou ambas, em relação à molécula de referência. Por exemplo, alguns polipeptídeos interferon-alfa da invenção podem ser particularmente úteis em depurar vírus ou linhagens de vírus que mostram resposta fraca ao tratamento com moléculas de interferon-alfa atualmente em uso, tal como, por exemplo, Genótipo 1 de HCV.

Alguns polipeptídeos da invenção exibem uma aumentada proporção de (atividade antiviral/atividade antiproliferativa) comparando com a molécula EFN-alfa de referência, e/ou uma aumentada proporção de (atividade de diferenciação de ThI /atividade antiproliferativa) comparando com a molécula EFN-alfa de referência. Polipeptídeos exibindo tais propriedades podem ser particularmente efetivos em tratamento de infecções virais, tais como, por exemplo, infecção por um vírus listado acima. Alguns tais polipeptídeos podem, por exemplo, fornecer eficácia terapêutica estimulada sobre moléculas de interferon-alfa atualmente aprovadas no tratamento de HCV, em uma ou ambas as fases do perfil bifásico de depuração viral, e/ou podem exibir toxicidade reduzida. Alguns tais polipeptídeos podem fornecer eficácia terapêutica estimulada sobre moléculas de interferon-alfa atualmente aprovadas no tratamento de HCV Genótipo 1.

E um outro objetivo da invenção fornecer conjugados, tais conjugados compreendendo uma ou mais unidades não-polipeptídicas ligadas a um polipeptídeo da invenção, cujo conjugado exibe uma atividade de interferon-alfa (tal como uma ou mais das atividades listadas acima), e que exibe opcionalmente outras propriedades desejáveis, tal como meia vida no soro e/ou meia vida in vivo funcional aumentada, e/ou antigenicidade diminuída, comparado ao polipeptídeo não conjugado. Alguns de tais conjugados podem exibir eficácia estimulada em depurar um vírus de células infectadas por vírus, comparando com uma molécula interferon-alfa de referência, tal como um conjugado de interferon-alfa empregado atualmente como um terapêutico (tal como, por exemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a; Hoffinann-La Roche, Inc.) ou PEG-INTRON® (peginterferon alfa- 2b; Schering Corporation). Vírus exemplares incluem, mas não são limitados a, vírus da família Flaviviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite C, Vírus da Febre Amarela, Vírus do Oeste do Nilo, Vírus da Encefalite Japonesa, Vírus da Dengue, e Vírus da Diarréia Viral Bovina; vírus da família Hepadnaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite B; vírus da família Picornaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Encefalomiocardite, Rinovírus Humano, e Vírus da Hepatite A; vírus da família Retroviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Imunodeficiência Humana, Vírus da Imunodeficiência Símia, Vírus Linfotrópico-T Humano, e Vírus do Sarcoma Rous; vírus da família Coronaviridae, tal como, por exemplo, coronavírus SARS; vírus da família Rhabdoviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Raiva e Vírus da Estomatite Vesicular; vírus da família Paramyxoviridae, tal como, por exemplo, Vírus Sincial Respiratório e Vírus de Parainfluenza; vírus da família Papillomaviridae, tal como, por exemplo, Papilomavírus Humano; e vírus da família Herpesviridae, tal como, por exemplo, Vírus do Herpes Simples. Tal eficácia estimulada pode resultar de atividade antiviral estimulada, atividade de diferenciação de ThI estimulada, ou ambas, em relação à molécula de referência. Por exemplo, alguns conjugados de interferon-alfa da invenção podem ser particularmente úteis para depurar vírus ou linhagens de vírus que mostram resposta fraca ao tratamento com moléculas de interferon-alfa atualmente em uso, tal como, por exemplo, Genótipo 1 de HCV. Alguns conjugados da invenção exibem uma aumentada proporção de (atividade antiviral/atividade antiproliferativa) comparando com a molécula IFN-alfa de referência, e/ou uma aumentada proporção de (atividade de diferenciação de TH^1 /atividade antiproliferativa) comparando com a molécula IFN-alfa de referência. Conjugados exibindo tais propriedades podem ser particularmente efetivos em tratamento de infecções virais, tal como infecção por um vírus listado acima, tal como, por exemplo, HCV. Alguns de tais conjugados podem, por exemplo, fornecer eficácia terapêutica estimulada sobre moléculas de interferon-alfa atualmente aprovadas no tratamento de HCV, em uma ou ambas as fases do perfil bifásico de depuração viral, e/ou podem exibir toxicidade reduzida. Alguns de tais conjugados podem fornecer eficácia terapêutica estimulada sobre moléculas de interferon-alfa atualmente aprovadas no tratamento de HCV Genótipo 1.

E um outro objetivo da invenção fornecer um método de inibir replicação viral em células infectadas por vírus, o método compreendendo administrar a células infectadas por vírus um polipeptídeo ou conjugado da invenção em uma quantidade efetiva para inibir replicação viral em ditas células. A invenção também fornece um método de reduzir número de cópias de um vírus em células infectadas por vírus, compreendendo administrar a células infectadas por vírus um polipeptídeo ou conjugado da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir número de cópias do vírus em ditas células. O vírus pode ser um vírus da família Flaviviridaei tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite C, Vírus da Febre Amarela, Vírus do Oeste do Nilo, Vírus da Encefalite Japonesa, Vírus da Dengue, e Vírus da Diarréia Viral Bovina; um vírus da família Hepadnaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite B; um vírus da família Picornaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Encefalomiocardite, Rinovírus Humano, e Vírus da Hepatite A; um vírus da família Retroviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Imunodeficiência Humana, Vírus da Imunodeficiência Símia, Vírus Linfotrópico-T Humano, e Vírus do Sarcoma Rous; um vírus da família Coronaviridae, tal como, por exemplo, coronavírus SARS; um vírus da família Rhabdoviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Raiva e Vírus da Estomatite Vesicular; um vírus da família Paramyxoviridae, tal como, por exemplo, Vírus Sincial Respiratório e Vírus de Parainfluenza; um vírus da família Papillomaviridae, tal como, por exemplo, Papilomavírus Humano; e um vírus da família Herpesviridae, tal como, por exemplo, Vírus do Herpes Simples. O vírus pode por exemplo ser um vírus de RNA, tal como HCV, um vírus de DNA, tal como HBV, ou um retrovírus, tal como HTV. As células podem ser em cultura ou de outra maneira isoladas de um mamífero (isto é, in vitro ou ex vivo), ou podem ser in vivo, por exemplo, em um mamífero (por exemplo tal como um modelo de camundongo SCID como descrito por Mercer, et al. (2001) Nature Medicine, 7(8): 927-933), em um primata, ou em homem.

A invenção também fornece um método de estimular diferenciação ThI de células TH0, compreendendo administrar a uma população compreendendo células ThO um polipeptídeo ou conjugado da invenção em uma quantidade efetiva para aumentar a produção de uma citocina associada com o fenótipo-TH 1 (por exemplo, IFN-gama) e/ou diminuir a produção de uma citocina associada com o fenótipo-TH2 (por exemplo, IL-4 ou IL-5) em dita população. A população pode ser em cultura ou de outra maneira isolada de um mamífero (isto é, in vitro ou ex vivo), ou podem ser in vivo, por exemplo, em um mamífero, um primata, ou homem.

A invenção também fornece um método de inibir proliferação de uma população de células, compreendendo colocar em contato a população de células com um polipeptídeo, variante, ou conjugado da invenção em uma quantidade efetiva para diminuir proliferação da população de células. A população de células pode ser em cultura ou de outra maneira isolada de um mamífero (isto é, in vitro ou ex vivo), ou podem ser in vivo, por exemplo, em um mamífero, um primata, ou homem.

Estes e outros objetivos da invenção são discutidos em mais detalhe abaixo.

POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

A invenção fornece novos polipeptídeos interferon-alfa, coletivamente referidos neste lugar como "polipeptídeos da invenção". O termo "polipeptídeo(s) da invenção" é pretendido o tempo todo para incluir variantes das seqüências de polipeptídeos descritas neste lugar. Também são incluídas nesta invenção proteínas de fusão compreendendo polipeptídeos da invenção, e conjugados compreendendo polipeptídeos da invenção.

Fragmentos de ácidos nucleicos de interferon-alfa humano foram recorrentemente recombinados para formar bibliotecas de misturadores compreendendo polinucleotídeos recombinantes, a partir dos quais polipeptídeos da invenção foram derivados. Métodos para obter bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes e/ou para obter diversidade em ácidos nucleicos usados como os substratos para recombinação recorrente de seqüências são descritos abaixo.

Polipeptídeos exemplares da invenção incluem polipeptídeos compreendendo as seqüências identificadas neste lugar como SEQ ID NO:l- SEQ ID NO:319 (isto é, SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID ΝΟ:41, SEQ ID ΝΟ:42, SEQ ID ΝΟ:43, SEQ ID ΝΟ:44, SEQ ID ΝΟ:45, SEQ ID ΝΟ:46, SEQ ID ΝΟ:47, SEQ ID ΝΟ:48, SEQ ID ΝΟ:49, SEQ ID Ν0:50, SEQ ID ΝΟ:51, SEQ ID ΝΟ:52, SEQ ID ΝΟ:53, SEQ ID ΝΟ:54, SEQ ID ΝΟ:55, SEQ ID ΝΟ:56, SEQ ID ΝΟ:57, SEQ ID ΝΟ:58, SEQ ID ΝΟ:59, SEQ ID Ν0:60, SEQ ID ΝΟ:61, SEQ ID ΝΟ:62, SEQ ID ΝΟ:63, SEQ ID ΝΟ:64, SEQ ID ΝΟ:65, SEQ ID ΝΟ:66, SEQ ID ΝΟ:67, SEQ ID ΝΟ:68, SEQ ID ΝΟ:69, SEQ ID Ν0:70, SEQ ID ΝΟ:71, SEQ ID ΝΟ:72, SEQ ID ΝΟ:73, SEQ ID ΝΟ:74, SEQ ID ΝΟ:75, SEQ ID ΝΟ:76, SEQ ID ΝΟ:77, SEQ ID ΝΟ:78, SEQ ID ΝΟ:79, SEQ ID Ν0:80, SEQ ID ΝΟ:81, SEQ ID ΝΟ:82, SEQ ID ΝΟ:83, SEQ ID ΝΟ:84, SEQ ID ΝΟ:85, SEQ ID ΝΟ:86, SEQ ID ΝΟ:87, SEQ ID ΝΟ:88, SEQ ID ΝΟ:89, SEQ ID Ν0:90, SEQ ID ΝΟ:91, SEQ ID ΝΟ:92, SEQ ID ΝΟ:93, SEQ ID ΝΟ:94, SEQ ID ΝΟ:95, SEQ ID ΝΟ:96, SEQ ID ΝΟ:97, SEQ ID ΝΟ:98, SEQ ID ΝΟ:99, SEQ ID ΝΟ.ΙΟΟ, SEQ ID Ν0:101, SEQ ID Ν0:102, SEQ TD NO: 103, SEQ ID Ν0:104, SEQ ID Ν0:105, SEQ ID Ν0:106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID Ν0:108, SEQ ID Ν0:109, SEQ ID Ν0:110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID ΝΟ:113, SEQ ID ΝΟ:114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID ΝΟ:119, SEQ ID Ν0:120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID ΝΟ:122, SEQ ID 20 NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID ΝΟ:128, SEQ ID ΝΟ:129, SEQ ID Ν0:130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID ΝΟ:136, SEQ ID ΝΟ:137, SEQ ID ΝΟ:138, SEQ ID ΝΟ:139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID ΝΟ:141, SEQ ID ΝΟ:142, SEQ ID ΝΟ:143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID ΝΟ:145, SEQ ID ΝΟ:146, SEQ ID ΝΟ:147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID ΝΟ:149, SEQ ID Ν0:150, SEQ ID ΝΟ:151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID ΝΟ:161, SEQ ID ΝΟ:162, SEQ ID ΝΟ:163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID N0:200, SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID N0:204, SEQ ID N0:205, SEQ ID N0:206, SEQ ID N0:207, SEQ ID N0:208, SEQ ID N0:209, SEQ ID N0:210, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, SEQ ID N0:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239, SEQ ID N0:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, SEQ ID NO:254, SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:259, SEQ ID N0:260, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:269, SEQ ID N0:270, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:273, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:275, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:279, SEQ ID N0:280, SEQ ID ΝΟ:281, SEQ ID ΝΟ:282, SEQ ID ΝΟ:283, SEQ ID ΝΟ:284, SEQ ID ΝΟ:285, SEQ ID ΝΟ:286, SEQ ID ΝΟ:287, SEQ ID ΝΟ:288, SEQ ID ΝΟ:289, SEQ ID Ν0:290, SEQ ID ΝΟ:291, SEQ ID ΝΟ:292, SEQ ID ΝΟ:293, SEQ ID ΝΟ:294, SEQ ID ΝΟ:295, SEQ ID ΝΟ:296, SEQ ID ΝΟ:297, SEQ ID ΝΟ:298, SEQ ID ΝΟ:299, SEQ ID Ν0:300, SEQ ID Ν0:301, SEQ ID Ν0:302, SEQ ID Ν0:303, SEQ ID Ν0:304, SEQ ID Ν0:305, SEQ ID Ν0:306, SEQ ID Ν0:307, SEQ ID Ν0:308, SEQ ID Ν0:309, SEQ ID Ν0:310, SEQ ID ΝΟ:311, SEQ ID ΝΟ:312, SEQ ID ΝΟ:313, SEQ ID ΝΟ:314, SEQ ID ΝΟ:315, SEQ ID ΝΟ:316, SEQ ID ΝΟ:317, SEQ ID ΝΟ:318, e SEQ ID ΝΟ:319), mostradas em Figuras 6A-6V. Tais polipeptídeos exibem uma atividade de interferon-alfa, incluindo atividade antiviral em um ensaio antiviral de HeLa/EMCV. Os polipeptídeos podem compreender adicionalmente um ou mais aminoácido(s) adicional(adicionais), tal como, por exemplo, uma metionina adicionada ao término Ν. A invenção também fornece proteínas de fusão e conjugados compreendendo estes polipeptídeos, e ácidos nucleicos isolados ou recombinantes codificando estes polipeptídeos.

A invenção também inclui polipeptídeos isolados ou recombinantes que compreendem cada uma seqüência que difere em 0 a 16 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:319, por exemplo, difere em 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 posições de aminoácidos, por exemplo, difere em Ο- 16 posições de aminoácidos, 0-15 posições de aminoácidos, em 0-14 posições de aminoácidos, em 0-13 posições de aminoácidos, em 0-12 posições de aminoácidos, 0-11 posições de aminoácidos, em 0-10 posições de aminoácidos, em 0-9 posições de aminoácidos, em 0-8 posições de aminoácidos, em 0-7 posições de aminoácidos, em 0-6 posições de aminoácidos, em 0-5 posições de aminoácidos, em 0-4 posições de aminoácidos, em 0-3 posições de aminoácidos, em 0-2 posições de aminoácidos ou em 0-1 posições de aminoácidos. Alguns tais polipeptídeos compreendem uma seqüência que difere em 0 a 16 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:94, SEQ ID N0:103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:127, SEQ ID N0:140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:195, SEQ ID N0:208, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:258, SEQ ID N0:260, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:293, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:298, SEQ ID N0:303, SEQ ID N0:306, SEQ ID N0:310, e SEQ ID NO:312.

A invenção também inclui polipeptídeos isolados ou recombinantes que compreendem cada uma seqüência que difere em 0 a 16 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:312 (M01); SEQ ID NO:262 (M04); SEQ ID NO:266 (M05); SEQ ID NO:232 (M23); SEQ ID NO:88 (M45); SEQ ID NO:297 (M20); SEQ ID NO: 167 (M27); SEQ ID NO: 107 (M09); SEQ ID N0:208 (M02); SEQ ID NO:94 (M33); SEQ ID NO: 141 (M37); SEQ ID NO:46 (M30); SEQ ID NO: 171 (M22); SEQ ID N0:310 (M24); SEQ ID NO: 176 (M44); SEQ ID NO:26 (M31); SEQ ID NO:89 (M10); SEQ ID NO:296 (M14); SEQ ID NO: 148 (M03); SEQ ID NO:18 (M46); SEQ ID N0:10 (M26); SEQ ID NO:87 (M21); SEQ ID N0:103 (M38); SEQ ID NO:234 (M28); SEQ ID N0:30 (M19); SEQ ID NO:179 (Mil); SEQ ID NO:2 (M34); SEQ ID N0:260 (M07); SEQ ID N0:306 (Ml8); SEQ ID NO: 140 (M40); SEQ ID NO: 127 (Ml6); SEQ ID NO:293 (M25); SEQ ID NO:195 (M29); SEQ ID NO: 191 (M36); SEQ ID NO:263 (M06); SEQ ID NO:1 (M32); SEQ ID NO:298 (M39); SEQ ID NO:24 (M42); SEQ ID NO:258 (M08); SEQ ID NO: 124 (M35); SEQ ID NO:7 (M41); SEQ ID NO:9 (M12); SEQ ID N0:303 (Ml7); e SEQ ID NO:6 (M43); por exemplo, difere em 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 posições de aminoácidos, por exemplo, difere em 0-16 posições de aminoácidos, 0-15 posições de aminoácidos, em 0-14 posições de aminoácidos, em 0-13 posições de aminoácidos, em 0-12 posições de aminoácidos, 0-11 posições de aminoácidos, em 0-10 posições de aminoácidos, em 0-9 posições de aminoácidos, em 0-8 posições de aminoácidos, em 0-7 posições de aminoácidos, em 0-6 posições de aminoácidos, em 0-5 posições de aminoácidos, em 0-4 posições de aminoácidos, em 0-3 posições de aminoácidos, em 0-2 posições de aminoácidos ou em 0-1 posições de aminoácidos, tal como, por exemplo, polipeptídeos descritos abaixo. Alguns tais polipeptídeos exibem uma atividade de interferon-alfa (tal como, por exemplo, atividade antiviral, atividade de diferenciação de THl, e/ou atividade antiproliferativa). Alguns tais polipeptídeos exibem pelo menos atividade antiviral duas vezes maior do que IFN-alfa humano 2a em um ensaio antiviral de HeLa/EMCV. Alguns tais polipeptídeos se ligam ao receptor de interferon-alfa humano com uma afinidade maior (EC50 menor) do que aquela de IFN-alfa 2a. Os polipeptídeos podem compreender adicionalmente um ou mais aminoácido(s) adicional(adicionais), tal como, por exemplo, uma metionina adicionada ao término Ν. A invenção também fornece proteínas de fusão e conjugados compreendendo estes polipeptídeos, e ácidos nucleicos isolados ou recombinantes codificando estes polipeptídeos.

A invenção inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:l (clone M32), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:l, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:44, SEQ ID ΝΟ:69, SEQ ID ΝΟ:116, SEQ ID ΝΟ:163, SEQ ID Ν0:201, SEQ ID Ν0:207, SEQ ID ΝΟ:247, SEQ ID ΝΟ:255, SEQ ID Ν0:260, SEQ ID Ν0:290, ou SEQ ID Ν0:302. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em O a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:l, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:l, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:44, SEQ ID N0:260, ou SEQ ID N0:302. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:l, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:l, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO:44.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:2 (clone M34), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:2, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:2, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:2, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID ΝΟ:6, SEQ ID ΝΟ:8, SEQ ID ΝΟ:11, SEQ ID ΝΟ:21, SEQ ID ΝΟ:42, SEQ ID ΝΟ:49, ou SEQ ID ΝΟ:293. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:2, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:2, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:6 (clone M43), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:6, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:6, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:6, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:6, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:6, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:7 (clone M41), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:7, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:37, ou SEQ ID NO:313. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:7, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:7, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:37, ou SEQ ID NO:313. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:7, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:7, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:313.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:9 (clone M12), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:45, SEQ ID N0:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:73, SEQ ID ΝΟ:219, SEQ ID Ν0:220, SEQ ID ΝΟ:221, SEQ ID ΝΟ:224, SEQ ID ΝΟ:231, SEQ ID ΝΟ:238, SEQ ID Ν0:240, SEQ ID ΝΟ:294, ou SEQ ID Ν0:305. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 to 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:9, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:9, e que exibe uma atividade de interferon- alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:45, SEQ ID N0:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:238, SEQ ID N0:240, SEQ ID NO:294, ou SEQ ID N0:305.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 10 (clone M26), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:9, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:23, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:71, SEQ ID N0:205, SEQ ID N0:230, SEQ ID N0:306, ou SEQ ID N0:308. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 10, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO: 10, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:47, SEQ ID N0:205, ou SEQ ID N0:230.

Em outro aspecto, a invenção inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 18 (clone M46), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 18, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:69, SEQ ID N0:109, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:l 16, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:207, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:255, SEQ ID N0:260, SEQ ID N0:270, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:283, SEQ ID N0:290, ou SEQ ID N0:302. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 18, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO: 18, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:l 16, SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:207, SEQ ID NO:255, SEQ ID N0:260, SEQ ID N0:290, ou SEQ ID N0:302. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 18, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 18, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:44, ou SEQ ID N0:260.

Em outro aspecto, a invenção inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:24 (clone M42), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:24, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID ΝΟ:28, SEQ ID ΝΟ:32, ou SEQ ID ΝΟ:43. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:24, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:24, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:24, ou SEQ ID NO:32.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:26 (clone M31), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:26, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:li, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:26, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:26, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, ou SEQ ID NO:293.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:30 (clone M19), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID N0:30, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 10, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:40, ou SEQ ID NO:71. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ LD N0:30, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:30, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:71.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:46 (clone M30), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:46, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:310, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:46, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:46, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:310, ou SEQ ID NO:312.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:87 (clone M21), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:87, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:261, ou SEQ ID NO:299.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:88 (clone M45), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:88, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID N0:103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO: 199, SEQ ID N0:202, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:289, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:88, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:88, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:88, SEQID NO:91, SEQ ID NO: 113, SEQID NO:l 17, SEQID NO: 183, SEQID NO: 184, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:288, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:88, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:88, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:88 ou SEQ ID NO:288.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:89 (clone MIO), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:89, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:89 ou SEQ ID NO:298.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:94 (clone M33), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:94, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:255, ou SEQ ID NO:273.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 103 (clone M38), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 103, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID N0:104, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:284, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, SEQ ID N0:309, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 103, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO: 103, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:103, SEQ ID NO:l 13, SEQ ID N0:120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO: 199, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, SEQ ID N0:309, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em O a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 103, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 103, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO:113, SEQ ID N0:120, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO: 145, SEQID NO: 199, SEQID NO:295, ou SEQ ID NO:296.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 107 (clone M9), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 107, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID N0:301.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 124 (clone M35), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 124, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:103, SEQ ID N0:104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:117, SEQ ID N0:120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 199, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, SEQ ID N0:309, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 124, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO: 124, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:103, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO: 199, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 124, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 124, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 145, ou SEQIDNO:295.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 127 (clone Ml6), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 127, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO:261, ou SEQ ID NO:268.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ NO: 140 (clone M40), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 140, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO:272, ou SEQ ID NO:278.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 141 (clone M37), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 141, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 141 ou SEQ ID NO: 160.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 148 (clone M3) isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 148, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 170, ou SEQ ID NO:206. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 148, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO: 148, e que exibe uma atividade de interferon-alfa: tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 170.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 167 (clone M27), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 167, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:65, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:271, ou SEQ ID NO:315. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 167, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO: 167, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 181, ou SEQ ID ΝΟ:315. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 167, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 167, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 181, ou SEQ ID NO:315.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 191 (clone M36), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 191, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 191.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 195 (clone M29), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 195, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID N0:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID N0:101, SEQ ID N0:102, SEQ ID N0:105, SEQ ID N0:108, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:137, SEQ ID N0:150, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:234, ou SEQ ID NO:278. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 195, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO: 195, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 195, ou SEQ ID NO:278. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO: 195, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 195, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 195 ou SEQ ID NO:278.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:208 (clone M02), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID N0:208, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQID NO:67 ou SEQ ID N0:208.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:232 (clone M23), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:232, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:262, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:232, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:232, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:232 ou SEQ ID NO:262.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:234 (clone M28), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:234, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:278, ou SEQ ID NO:285. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:234, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:234, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:278, ou SEQ ID NO:285. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:234, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:234, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO:234.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:258 (clone M8), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:258, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:99 ou SEQ ID NO:258.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:260 (clone M07), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID N0:260, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:69, SEQ ID N0:109, SEQ ID NO:l 13, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 188, SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:206, SEQ ID N0:207, SEQ ID NO:218, SEQ ID ΝΟ:228, SEQ ID ΝΟ:237, SEQ ID ΝΟ:247, SEQ ID ΝΟ:255, SEQ ID ΝΟ:257, SEQ ID Ν0:260, SEQ ID ΝΟ:276, ou SEQ ID Ν0:290. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:260, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID N0:260, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 116, SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:207, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:255, SEQ ID N0:260, ou SEQ ID N0:290. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:260, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID N0:260, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID N0:260.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:262 (clone M04), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:262, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:262, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:262, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID NO:310, ou SEQ ID NO:312.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:266 (clone M05), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:266, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:79, SEQ ID N0:90, SEQ ID NO:l 14, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:266, ou SEQ ID NO:274. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:266, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:266, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:79, SEQ ID N0:90, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:266, ou SEQ ID NO:274.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:293 (clone M25), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:293, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:293, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:293, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:293, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:293, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:49, ou SEQ ID NO:293.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:296 (clone Ml4), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:296, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:288, SEQ ED NO:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:309, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:296, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:296, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID N0:120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:284, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, SEQ ID N0:309, ou SEQ ID NO:314. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:296, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:296, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 199, SEQ ID N0:290, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, ou SEQ ID NO:314.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:297 (clone M20), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:297, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:297, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:297, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:239, SEQ ID ΝΟ:241, SEQ ID ΝΟ:243, SEQ ID Ν0:250, SEQ ID ΝΟ:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID ΝΟ:297, SEQ ID Ν0:304, SEQ ID Ν0:310, ou SEQ ID ΝΟ:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em O a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:297, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:297, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID 4 10 NO:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:298 (clone M39), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:298, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:53, SEQ ID N0:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:143, SEQ ID N0:150, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:292, ou SEQ ID NO:298. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:298, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:298, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, ou SEQ ID NO:298. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:298, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:298, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO:298.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:303 (clone Ml7), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:303, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 15, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:256, ou SEQ ID N0:303. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:303, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID N0:303, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 15, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:256, ou SEQ ID N0:303. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:303, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID N0:303, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:256, ou SEQ ID N0:303.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:306 (clone M18), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID N0:306, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:23, SEQ ID ΝΟ:31, SEQ ID ΝΟ:36, SEQ ID ΝΟ:47, SEQ ID ΝΟ:65, SEQ ID ΝΟ:71, SEQ ID ΝΟ:153, SEQ ED ΝΟ:159, SEQ ID ΝΟ:166, SEQ ID Ν0:200, SEQ ID Ν0:205, SEQ ID Ν0:230, SEQ ID Ν0:306, ou SEQ ID Ν0:308. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:306, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID N0:306, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:166, SEQ ID N0:200, SEQ ID N0:205, SEQ ID N0:230, SEQ ID N0:306, ou SEQ ID N0:308. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:306, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:306, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:47, SEQ ID N0:205, SEQ ID N0:230, SEQ ID N0:306, ou SEQ ID N0:308.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:310 (clone M24), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:310, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:310, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID N0:310, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID N0:310, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID N0:310, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312.

A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:312 (clone MO1), isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO:312, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:312, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 96% idêntica a SEQ ID NO:312, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ED N0:250, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312. A invenção também inclui um polipeptídeo isolado ou recombinante que compreende uma seqüência que difere em O a 3 posições de aminoácidos da seqüência SEQ ID NO:312, isto é, compreende uma seqüência que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:312, e que exibe uma atividade de interferon-alfa; tal como, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo a seqüência SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:297, SEQ ID N0:304, SEQ ID N0:310, ou SEQ ID NO:312.

Outras modificações contempladas para polipeptídeos da invenção incluem aquelas descritas abaixo e na seção intitulada "CONJUGADOS DE INTERFERON-ALFA".

Variações de Seqüências

Como observado acima, polipeptídeos da presente invenção incluem polipeptídeos compreendendo seqüências que diferem de uma das SEQ ID NOil-SEQ ID NO:319 em 0 a 16 posições de aminoácidos. Alguns tais polipeptídeos exibem uma atividade de interferon-alfa.

Por exemplo, alguns polipeptídeos da invenção compreendem uma seqüência tendo um comprimento de cerca de 151 aminoácidos, tal como cerca de 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, ou 165 aminoácidos, correspondendo a uma deleção de entre 1 e 15 aminoácidos em relação a uma seqüência parental de polipeptídeos (tal como, por exemplo, uma das SEQ ID NOs:l-319). Em alguns exemplos, entre Iell5 por exemplo, entre 1 e 10, tal como entre 1 e 7, por exemplo entre 1 e 5, tal como entre 1 e 3 aminoácidos são deletados do término C, isto é o polipeptídeo é C terminalmente truncado comparado com a seqüência parental de polipeptídeos (tal como, por exemplo, uma das SEQ ID NOs: 1- 319) por 1-11 resíduos de aminoácidos (por exemplo por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 resíduos de aminoácidos), tal como por 1-10, 1-7, por exemplo, por 1-5 ou por 1-3 resíduos de aminoácidos. Alternativamente, ou em adição, alguns tais polipeptídeos são N terminalmente truncados comparado com a seqüência parental de polipeptídeos (tal como, uma das SEQ ID NOs: 1-319) por 1-4 resíduos de aminoácidos (por exemplo por 1, 2, 3, ou 4 resíduos de aminoácidos), por exemplo, 1-4, 1-3, 1-2 ou 1 resíduo(s) de aminoácido(s) são removidos do término N. Alguns tais polipeptídeos compreendem adicionalmente uma metionina no término N. Alguns tais polipeptídeos exibem uma atividade de interferon-alfa.

Como outro exemplo, alguns polipeptídeos da invenção compreendem uma seqüência contendo entre 1 e 16 substituições de aminoácidos em relação a SEQ ID NO:l (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 substituições de aminoácidos), tal como 1-14 ou 1-12 ou 1-10 ou 1-8 ou 1-7 ou 1-6 ou 1-5 ou 1-4 ou 1-3 ou 1-2 substituições de aminoácidos. Um ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas na seqüência de polipeptídeos de acordo com, por exemplo, um grupo de substituição (tal como, um grupo de substituição conservativa), tal como um apresentado abaixo. Alternativamente, ou em adição, uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais podem ser feitas na seqüência de polipeptídeos que introduz ou remove um resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de ligação para uma unidade não polipeptídica. Exemplos incluem introdução ou remoção de um ou mais sítio(s) de N- glicosilação, introdução ou remoção de um ou mais resíduo(s) de cisteína ou resíduo(s) de lisina ou resíduo(s) de histidina, e os semelhantes. Alguns tais polipeptídeos exibem uma atividade de interferon-alfa.

Como um exemplo não limitante, um polipeptídeo da invenção pode ter uma seqüência que difere de SEQ ID NO:1 em um total de até 16 posições (o que pode ser uma combinação de substituições de aminoácidos, deleções, e/ou inserções, incluindo aquelas descritas acima). Em algumas instâncias, nenhuma, alguns, ou todas as substituições são substituições de acordo com um grupo de substituição definido abaixo.

Substituições de aminoácidos em conformidade com a invenção podem incluir, mas não são limitadas a, uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos. Tabelas de substituições conservativas fornecendo aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. E fornecido um exemplo na tabela abaixo (Tabela 1), que descreve seis grupos exemplares que contêm aminoácidos que podem ser considerados "substituições conservativas" um para o outro. Tabela 1

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Outros grupos de substituição de aminoácidos podem ser previstos. Por exemplo, aminoácidos podem ser agrupados por função similar ou estrutura ou composição química (por exemplo, ácido, básico, alifático, aromático, contendo enxofre). Por exemplo, um agrupamento Alifático pode compreender: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (1). Outros grupos contendo aminoácidos que são considerados substituições conservativas um para o outro incluem: Aromáticos: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); Contendo Enxofre: Metionina (M), Cisteína

(C); Básicos: Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); Ácidos: Acido aspártico

(D), Acido glutâmico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q). Veja também Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company, para agrupamentos adicionais de aminoácidos. Listagem de uma seqüência de polipeptídeos neste lugar, em conjunção com os grupos de substituição acima, fornece uma listagem expressa de todas as seqüências de polipeptídeos conservativamente substituídas.

Identidade de Seqüência Percentual

Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos isolados ou recombinantes compreendendo cada uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência de aminoácido) com qualquer uma de SEQ ID NOs:l-319. Em algumas instâncias o polipeptídeo exibe uma atividade de interferon-alfa.

O grau pelo qual uma seqüência (polipeptídeo ou ácido nucleico) é similar à outra fornece uma indicação de propriedades estruturais e funcionais similares para as duas seqüências. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, seqüências que têm seqüência similar a qualquer seqüência exemplar dada são uma característica da presente invenção. Em particular, seqüências que têm identidades de seqüência percentual como definido abaixo são uma característica da invenção.

Diversos métodos de determinar relações entre seqüências podem ser usados, incluindo alinhamento manual e alinhamento e análise de seqüências auxiliados por computador. Diversos programas de computador para realizar alinhamentos de seqüência estão disponíveis, ou um alinhamento pode ser preparado manualmente por alguém de verso, como descrito abaixo.

Como observado acima, as seqüências de polipeptídeos e ácidos nucleicos empregadas na invenção sujeito não necessitam ser idênticas, mas podem ser substancialmente idênticas à seqüência correspondente de um polipeptídeo da invenção ou ácido nucleico da invenção. Por exemplo, polipeptídeos da invenção podem ser sujeitos a várias mudanças, tais como uma ou mais inserções, deleções, e/ou substituições de aminoácidos, ou conservativa ou não conservativa, incluindo onde, por exemplo, tais mudanças podem sustentar certas vantagens no seu uso, tais como em seu uso ou administração terapêutica ou profilática ou aplicação do diagnóstico. Os ácidos nucleicos da invenção também podem ser sujeitos a várias mudanças, tais como uma ou mais substituições de um ou mais ácidos nucleicos em um ou mais códons de forma que um códon particular codifica o mesmo ou um diferente aminoácido, resultando ou em uma variação silenciosa (como definido neste lugar) ou variação não silenciosa, ou uma ou mais deleções de um ou mais ácidos nucleicos (ou códons) na seqüência. Os ácidos nucleicos também podem ser modificados para incluir um ou mais códons que sustentam expressão ótima em um sistema de expressão (por exemplo de bactéria ou mamífero), embora, se desejado, um ou mais dos códons ditos codificam ainda o(s) mesmo(s) aminoácido(s). Tais mudanças de ácidos nucleicos podem sustentar certas vantagens no seu uso ou administração terapêutica ou profilática, ou aplicação do diagnóstico. Os ácidos nucleicos e polipeptídeos podem ser modificados em um número de maneiras tão grande quanto eles compreendem uma seqüência substancialmente idêntica (como definido abaixo) a uma seqüência em um respectivo ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção.

O termo "idêntico" ou "identidade", no contexto de duas ou mais seqüências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, se refere a duas ou mais seqüências que são a mesma ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas para similaridade máxima, como determinado usando o algoritmo de comparação de seqüências descrito abaixo ou por inspeção visual.

A "identidade de seqüência percentual" ("% identidade") de uma seqüência sujeito com uma seqüência referência (isto é de busca) significa que a seqüência sujeito é idêntica (isto é, em uma base aminoácido- por-aminoácido para uma seqüência de polipeptídeos, ou uma base nucleotídeo-por-nucleotídeo para um seqüência de polinucleotídeos) por uma porcentagem especificada à seqüência de busca sobre um comprimento de comparação.

A identidade de seqüência percentual de uma seqüência sujeito com uma seqüência de busca é calculada como segue. Primeiro, o alinhamento ótimo das duas seqüências é determinado usando um algoritmo de comparação de seqüências com parâmetros de alinhamento específicos. Esta determinação do alinhamento ótimo pode ser realizada usando um computador, ou pode ser calculada manualmente, como descrito abaixo. Então, as duas seqüências otimamente alinhadas são comparadas sobre o comprimento de comparação, e o número de posições no alinhamento ótimo nas quais ocorrem resíduos idênticos é determinado, o que fornece o número de posições pareadas. O número de posições pareadas é então dividido pelo número total de posições do comprimento de comparação (que, a menos que de outra maneira especificado, é o comprimento da seqüência de busca), e então o resultado é multiplicado por 100, para produzir a identidade de seqüência percentual da seqüência sujeito com a seqüência de busca.

Em consideração a seqüência de polipeptídeos, tipicamente uma seqüência é considerada como uma "seqüência de busca" (por exemplo, uma seqüência de polipeptídeos da invenção) com a qual uma ou mais outras seqüências, isto é, "seqüência(s) sujeito" (por exemplo, seqüências presentes em um banco de dados de seqüências) são comparadas. O algoritmo de comparação de seqüências usa os parâmetros de alinhamento designados para determinar o alinhamento ótimo entre a seqüência de busca e a(s) seqüência(s) sujeito. Quando comparando uma seqüência de busca com um banco de dados de seqüências, tal como, por exemplo, GENBANK® (Genetic Sequence Data Bank; US Department of Health and Human Services) ou GENESEQ® (Thomson Derwent; também disponível como DGENE® em STN), normalmente somente a seqüência de busca e os parâmetros de alinhamento são alimentadas no computador; alinhamentos ótimos entre a seqüência de busca alimentada e cada seqüência sujeito presente no banco de dados são retornados, geralmente para até um número desejado de seqüências sujeito.

Duas seqüências de polipeptídeos são "otimamente alinhadas" quando elas são alinhadas usando parâmetros definidos, isto é, uma matriz de substituição de aminoácido definida, penalidade de existência de lacuna (também chamado penalidade de abertura de lacuna), e penalidade de extensão de lacuna, de forma a chegar ao escore de similaridade mais alto possível para o par de seqüências. A matriz BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89(22): 10915-10919) é freqüentemente usada como uma matriz de substituição de pontuação padrão em algoritmos de alinhamento de seqüência de polipeptídeos (tal como BLAST, descrito abaixo). A penalidade de existência de lacuna é imposta para a introdução de uma simples lacuna de aminoácido em uma das seqüências alinhadas, e a penalidade de extensão de lacuna é imposta para cada posição de resíduo na lacuna. A menos que de outra maneira determinado, os parâmetros de alinhamento empregados neste lugar são: matriz de pontuação BLOSUM62, penalidade de existência de lacuna =11, e penalidade de extensão de lacima =1. O escore de alinhamento é definido pelas posições de aminoácidos de cada seqüência na qual o alinhamento começa e termina (por exemplo a janela de alinhamento), e opcionalmente pela inserção de um espaço ou múltiplos espaços em uma ou ambas seqüências, de forma a chegar ao escore de similaridade mais alto possível.

Embora alinhamento ótimo entre duas ou mais seqüências possa ser determinado manualmente (como descrito abaixo), o processo é facilitado pelo uso de um algoritmo de alinhamento computador- implementado tal como BLAST® (National Library of Medicine), por exemplo, BLASTP para seqüência de polipeptídeos e BLASTN para seqüências de ácidos nucleicos, descritos em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, e tornado disponível para o público através de várias fontes, tal como a página na rede mundial de computadores de National Center for Biotechnology Information (NCBI). Quando usando uma interface BLAST computadorizada, se existe a opção de usar um "filtro de baixa complexidade", esta opção deve ser desligada (isto é, sem filtro).

O alinhamento ótimo entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos pode também ser determinado por um cálculo manual do algoritmo BLAST (isto é, sem o auxílio de um computador) usando os mesmos parâmetros de alinhamento especificados acima (matriz = BLOSUM62, penalidade de existência de lacuna =11, e penalidade de extensão de lacuna =1). Para começar, as duas seqüências são inicialmente alinhadas por inspeção visual. Um escore de alinhamento inicial é então calculada como segue: para cada posição de alinhamento individual (isto é, para cada par de resíduos alinhados), um valor numérico é atribuído de acordo com a matriz BLOSUM62 (Fig. 4). A soma dos valores assinalados para cada par de resíduos no alinhamento é um escore de alinhamento inicial. Se as duas seqüências sendo alinhadas são altamente similares, freqüentemente este alinhamento inicial fornece um escore de alinhamento mais alto possível. O alinhamento com um escore de alinhamento mais alto é o alinhamento ótimo baseado nos parâmetros de alinhamento empregados. Fig. 5A mostra um exemplo de cálculo de um escore de alinhamento para duas seqüências, uma seqüência "de busca", identificada neste lugar como resíduos 29-50 de SEQ ID NO:l (superior) e uma seqüência "sujeito" identificada neste lugar como resíduos 30-52 de SEQ ID NO:312 (inferior). As seqüências foram alinhadas por inspeção visual, e valor numérico assinalado pela matriz BLOSUM62 para cada par de aminoácidos é mostrado abaixo de cada posição no alinhamento (para auxiliar na visualização, cada par de aminoácidos idêntico no alinhamento é mostrado em negrito). Neste exemplo, este alinhamento inicial forneceu o escore de alinhamento mais alto possível (a soma dos valores mostrada abaixo de cada posição alinhada); qualquer outro alinhamento destas duas seqüências, com ou sem lacunas, resultaria em um escore de alinhamento menor.

Em algumas instâncias, um escore de alinhamento maior pode ser obtido introduzindo um ou mais lacunas dentro do alinhamento. Toda vez que uma lacuna é introduzida dentro do alinhamento uma penalidade de abertura de lacuna é atribuída, e em adição uma penalidade de extensão de lacuna é acessada para cada posição de resíduo dentro da lacuna. Portanto, usando os parâmetros de alinhamento descritos acima (incluindo penalidade de abertura =Ile penalidade da extensão de lacuna =1), uma lacuna de um resíduo no alinhamento iria corresponder a um valor de-(11+(1 x 1)) = -12 atribuído à lacuna; uma lacuna de três resíduos iria corresponder a um valor de - (11+(3 x 1)) = -14 atribuído à lacuna, e assim por diante. Este cálculo é repetido para cada lacuna nova introduzida dentro do alinhamento. Figs. 5B e 5C mostram um exemplo que demonstra como a introdução de uma lacuna dentro do alinhamento pode resultar em um escore de alinhamento maior, apesar da penalidade de lacuna. Fig. 5B mostra um alinhamento inicial dos resíduos 29-50 de SEQ ID NO:312 (superior, de busca) e dos resíduos 30-50 de SEQ ID NO:321 (inferior, sujeito) feito por inspeção visual, que resultou em um escore de alinhamento inicial de 70. Fig. 5C mostra o efeito da introdução de uma lacuna de um resíduo na SEQ ID NO:321 no escore de alinhamento; apesar da penalidade de espaço de -12 o escore de alinhamento geral das duas seqüências aumenta para 93. Neste exemplo, o alinhamento mostrado na Fig. 5C fornece escore de alinhamento mais alto possível, e é assim o alinhamento ótimo destas duas seqüências; qualquer outro alinhamento destas duas seqüências (com ou sem lacunas) resultaria em um escore de alinhamento menor.

E para ser entendido que os exemplos de cálculos de alinhamento de seqüências descritos acima, que usam seqüências relativamente curtas, são fornecidos para propósitos ilustrativos somente; na prática, os parâmetros de alinhamento empregados (matriz = BLOSUM62, penalidade de abertura de lacuna = 11, e penalidade de extensão de lacuna = 1) são geralmente pretendidos para seqüências de polipeptídeos de 85 aminoácidos de comprimento ou maiores. A página na rede mundial de computadores de NCBI fornece os seguintes parâmetros de alinhamento para seqüências de outros comprimentos (que são adequados para cálculo de alinhamento auxiliado por computador assim como manual, usando o mesmo procedimento como descrito acima). Para seqüências de 50-85 aminoácidos de comprimento, parâmetros ótimos são matriz BLOSUM8O (Henikoff e Henikoff, acima), penalidade de abertura de lacuna = 10, e penalidade de extensão de lacuna = 1. Para seqüências de 35-50 aminoácidos de comprimento, parâmetros ótimos são matriz PAM70 (Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. (1978) "A model of evolutionary change in proteins". In Atlas of Protein Sequence and Srtucture, vol. 5, suppl. 3, M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), penalidade de abertura de lacuna =10, e penalidade de extensão de lacuna =1.

Para seqüências de menos do que 35 aminoácidos de comprimento, parâmetros ótimos são matriz PAM30 (Dayhoff, M.O., acima), penalidade de abertura de lacuna = 9, e penalidade de extensão de lacuna = 1.

Uma vez que as seqüências estão alinhadas Otimamente5 a identidade percentual da seqüência sujeito em relação à seqüência de busca é calculada contando o número de posições no alinhamento ótimo que contêm pares de resíduos idênticos, dividindo isto pelo número de resíduos do comprimento de comparação (que, a menos que de outra maneira especificado, é o número de resíduos na seqüência de busca), e multiplicando o número resultante por 100. De volta referindo-se aos exemplos mostrados na Fig. 5, em cada exemplo a seqüência designada como seqüência de busca é de 22 aminoácidos de comprimento. No alinhamento da Fig. 5A, 18 pares de resíduos de aminoácidos alinhados (mostrados em negrito) são idênticos no alinhamento ótimo da seqüência de busca (superior) com a seqüência sujeito (inferior). Assim, esta seqüência sujeito particular tem (18/22) χ 100 = 81,8% de identidade com todo o comprimento da seqüência de busca de 22 resíduos; em outras palavras, a seqüência sujeito no alinhamento de Fig. 5A tem pelo menos 81% de identidade de seqüência de aminoácidos com a seqüência de busca. No alinhamento da Fig. 5C, 18 pares de resíduos de aminoácidos (mostrados em negrito) no alinhamento ótimo são idênticos; assim, esta seqüência sujeito particular tem (18/22) x 100 = 81,8% de identidade com todo o comprimento da seqüência de busca de 22 resíduos; em outras palavras, a seqüência sujeito no alinhamento de Fig. 5C tem pelo menos 81% de identidade de seqüência de aminoácidos com a seqüência de busca.

Como aplicado a polipeptídeos, o termo "identidade substancial" (ou "substancialmente idêntico") significa tipicamente que quando duas seqüências de aminoácidos (isto é, uma seqüência de busca e uma seqüência sujeito) são alinhadas otimamente usando o algoritmo BLASTP (manualmente ou através de computador) usando parâmetros apropriados descritos acima, a seqüência sujeito tem pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade percentual de seqüência de aminoácidos com a seqüência de busca. Em algumas instâncias, a identidade substancial existe sobre um comprimento de comparação de pelo menos cerca de 100 resíduos de aminoácidos, tal como, pelo menos cerca de 110, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, ou 166 resíduos de aminoácidos.

Similarmente, como aplicado no contexto de duas seqüências de ácidos nucleicos, o termo identidade substancial (ou substancialmente idêntico) significa que quando duas seqüências de ácidos nucleicos (isto é, uma seqüência de busca e uma seqüência sujeito) são alinhadas otimamente usando o algoritmo BLASTN (manualmente ou através de computador) usando parâmetros apropriados descritos abaixo, a seqüência sujeito tem pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade percentual de seqüência de ácidos nucleicos com a seqüência de busca. Parâmetros usados para alinhamento de seqüência de ácidos nucleicos são: recompensa de igualdade 1, penalidade de desigualdade -3, penalidade de existência de lacuna 5, e penalidade de extensão de lacuna 2 (matrizes de substituição não são usadas no algoritmo BLASTN). Em algumas instâncias, a identidade substancial existe sobre um comprimento de comparação de pelo menos cerca de 300 resíduos de nucleotídeos, tal como, pelo menos cerca de 330, 360, 375, 390, 405, 420, 435, 450, 465, 480, 483, 486, 489, 492, 495, ou 498 nucleotídeos.

Aspectos adicionais

Qualquer polipeptídeo da invenção pode estar presente como parte de uma seqüência de polipeptídeos maior, por exemplo uma proteína de fusão, tal como ocorre a parir da adição de um ou mais domínios ou subseqüências para estabilização ou detecção ou purificação do polipeptídeo. Uma subseqüência de purificação de polipeptídeo pode incluir, por exemplo uma etiqueta de epítopo, uma etiqueta FLAG, uma seqüência de poliistidina, uma GST de fusão, ou qualquer outra subseqüência de detecção/purificação ou "etiqueta" conhecida na técnica. Estes domínios ou subseqüências adicionais ou têm pouco ou nenhum efeito na atividade do polipeptídeo da invenção, ou podem ser removidos por etapas de processamento pós-síntese tal como por tratamento com uma protease, inclusão de uma inteína, ou semelhantes.

A invenção inclui proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo da invenção, por exemplo, como descrito neste lugar, fusionado a uma molécula Ig, por exemplo uma dobradiça IgC Fc humano ("fragmento cristalizável," ou fragmento complemento ligação), domínio CH2 e domínio CH3, e seqüências de nucleotídeos codificando tal proteína de fusão. Fc é a porção do anticorpo responsável por ligar aos receptores de anticorpos em células e o componente Clq de complemento. Estas proteínas de fusão e seus ácidos nucleicos de codificação são úteis como drogas profiláticas e/ou terapêuticas ou como ferramentas de diagnóstico (veja também, por exemplo, Challita-Eid, P. et al. (1998) J. Immunol 160:3419-3426; Sturmhoefel, K. et al. (1999) Câncer Res 59:4964-4972). A invenção também inclui proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo da invenção, fusionado a uma molécula de albumina, tal como albumina no soro humano (HSA), como descrito, por exemplo, em Patente Norte-Americana No. 5.876.969, e seqüências de nucleotídeos codificando a proteína de fusão. As proteínas de fusão Ig e albumina podem exibir meia vida de polipeptídeo no soro e/ou meia vida in vivo funcional aumentada, antigenicidade de polipeptídeo reduzida, estabilidade de armazenamento do polipeptídeo aumentada, ou biodisponibilidade crescente, por exemplo AUCsc aumentada, e assim podem ser úteis como drogas profiláticas e/ou terapêuticas.

Qualquer polipeptídeo da invenção também pode compreender um ou mais aminoácidos modificados. O aminoácido modificado pode ser, por exemplo, um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma unidade lipídica, um aminoácido conjugado a um agente derivatizante orgânico. A presença de aminoácidos modificados pode ser vantajosa em, por exemplo, (a) aumentar meia vida de polipeptídeo no soro e/ou meia vida in vivo funcional, (b) reduzir antigenicidade de polipeptídeo, (c) aumentar estabilidade de armazenamento do polipeptídeo, ou (d) aumentar biodisponibilidade,, por exemplo aumentar o AUCsc- Aminoácidos são modificados, por exemplo, co- traducionalmente, ou pós-traducionalmente durante produção recombinante (por exemplo, glicosilação N-Iigada em motivos N-X-S/T durante expressão em células de mamíferos) ou modificados por meios sintéticos. Este aspecto é descrito em mais detalhe na seção neste lugar intitulada "CONJUGADOS DE

INTERFERON-ALFA"

A invenção também fornece uma composição compreendendo pelo menos um polipeptídeo da invenção, e um excipiente ou carreador. A composição pode ser uma composição compreendendo um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável. Composições exemplares e excipientes e carreadores são descritos abaixo. Fazendo polipeptídeos

Métodos recombinantes para produzir e isolar polipeptídeos da invenção são descritos neste lugar. Em adição à produção recombinante, os polipeptídeos podem ser produzidos por síntese de peptídeo direta usando técnicas de fase sólida (veja, por exemplo, Stewart et ai. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J. (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). Síntese de peptídeo pode ser realizada usando técnicas manuais ou por automação. Síntese automatizada pode ser atingida, por exemplo, usando Sintetizador de Peptídeos de Applied Biosystems 43IA (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) em conformidade com as instruções fornecidas pelo fabricante. Por exemplo, subseqüências podem ser separadamente sintetizadas quimicamente e combinadas usando métodos químicos para fornecer polipeptídeos de comprimento completo ou fragmentos destes. Alternativamente, tais seqüências podem ser encomendadas de qualquer número de companhias especialistas na produção de polipeptídeos. Mais geralmente, polipeptídeos da invenção podem ser produzidos expressando ácidos nucleicos de codificação e recuperando polipeptídeos, por exemplo, como descrito abaixo.

Métodos para produzir os polipeptídeos da invenção também são incluídos. Um tal método compreende introduzir dentro de uma população de células qualquer ácido nucleico da invenção descrito neste lugar, que é operavelmente ligado a uma seqüência reguladora efetiva para produzir o polipeptídeo codificado, cultivar as células em meio de cultura para expressar o polipeptídeo, e isolar o polipeptídeo das células ou do meio de cultura. Uma quantidade de ácido nucleico suficiente para facilitar absorção pelas células (transfecção) e/ou expressão do polipeptídeo é utilizada. O ácido nucleico é introduzido dentro de tais células por qualquer método de transferência descrito neste lugar, incluindo, por exemplo, injeção, pistola de gene, absorção passiva, etc. O ácido nucleico pode ser parte de um vetor, tal como um vetor de expressão recombinante, incluindo um vetor de DNA de plasmídeo, ou qualquer outro vetor descrito neste lugar. O ácido nucleico ou vetor compreendendo um ácido nucleico da invenção pode ser preparado e formulado como descrito neste lugar, acima. Um tal ácido nucleico ou vetor de expressão pode ser introduzido dentro de uma população de células de um mamífero in vivo, ou células selecionadas do mamífero (por exemplo, células de tumor) podem ser removidas do mamífero e o ácido nucleico vetor de expressão introduzido ex vivo dentro da população de tais células em uma quantidade suficiente de forma que absorção e expressão do polipeptídeo codificado acontecem. Ou, um ácido nucleico ou vetor compreendendo um ácido nucleico da invenção é produzido usando células cultivadas in vitro. Em um aspecto, o método de produzir um polipeptídeo da invenção compreende introduzir dentro de uma população de células um vetor de expressão recombinante compreendendo qualquer ácido nucleico da invenção descrito neste lugar em uma quantidade e fórmula de forma que absorção do vetor e expressão do polipeptídeo codificado irão acontecer; administrar o vetor de expressão dentro de um mamífero por qualquer formato de introdução/transferência descrito neste lugar; e isolar o polipeptídeo do mamífero ou de um subproduto do mamífero.

Anticorpos

Em outro aspecto da invenção, um polipeptídeo da invenção (ou um fragmento antigênico deste) é usado para produzir anticorpos que têm, por exemplo, usos diagnóstico, terapêutico ou profilático, por exemplo, em relação à atividade, distribuição, e expressão de polipeptídeos ou fragmentos destes. Anticorpos para polipeptídeos da invenção podem ser gerados por métodos bem conhecidos na técnica. Tais anticorpos podem incluir, mas não são limitados a, policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado, cadeia única, fragmentos Fab e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab. Anticorpos, por exemplo, aqueles que bloqueiam ligação do receptor, são especialmente preferidos para uso terapêutico e/ou profilático.

Polipeptídeos para indução de anticorpo não requerem atividade biológica; entretanto, os polipeptídeos ou peptídeos devem ser antigênicos. Peptídeos usados para induzir anticorpos específicos podem ter uma seqüência de aminoácidos consistindo de pelo menos cerca de 10 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 15 ou 20 aminoácidos ou pelo menos cerca de 25 ou 30 aminoácidos. Trechos curtos de um polipeptídeo podem ser fusionados com outra proteína, tal como hemocianina de caramujo Megathura crenulata, e anticorpo produzido contra a molécula quimérica.

Métodos para produzir anticorpos policlonais e monoclonais são conhecidos por aqueles de verso na técnica, e muitos anticorpos estão disponíveis. Veja, por exemplo, Current Protocols in Immunology, John Colligan et al., eds., Vols. I-IV (John Wiley & Sons, Inc., NY, 1991 e Suplemento de 2001); e Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4 ed.) Lange Medicai Publications, Los Altos, CA, e referências aí citadas; e Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; e Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497. Outras técnicas adequadas para a preparação de anticorpo incluem seleção de bibliotecas de anticorpos recombinantes em fago ou vetores similares. Veja, Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; e Ward et al. (1989) Nature 341:544-546. Anticorpos e anti-soros monoclonais e policlonais específicos irão normalmente se ligar com um Kd de pelo menos cerca de 0,1 μΜ, preferivelmente pelo menos cerca de 0,01 μΜ ou melhor, e mais tipicamente e preferivelmente 0,001 μΜ ou melhor.

Métodos detalhados para preparação de anticorpos quiméricos (humanizados) podem ser encontrados em Patente Norte-Americana 5.482.856. Detalhes adicionais em humanização ou outras técnicas de produção e engenharia de anticorpo podem ser encontrados em Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Praticai Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty), e Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul).

Em um aspecto, esta invenção sustenta anticorpos completamente humanizados contra os polipeptídeos da invenção ou fragmentos destes. Anticorpos humanizados são especialmente desejáveis em aplicações onde os anticorpos são usados como terapêuticos e/ou profiláticos in vivo em pacientes humanos. Anticorpos humanos consistem de seqüências de imunoglobulina caracteristicamente humanas. Os anticorpos humanos desta invenção podem ser produzidos usando uma ampla variedade de métodos (veja, por exemplo, Larrick et al., Patente Norte-Americana No.5.001.065, e Borrebaeck, McCafferty e Paul, acima, para uma revisão). Em um aspecto, os anticorpos humanos da presente invenção são produzidos inicialmente em células de trioma. Genes codificando os anticorpos são então clonados e expressos em outras células, tal como células de mamífero não humano. A abordagem geral para produzir anticorpos humanos por tecnologia de trioma é descrita por Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367, Ostberg, Patente Norte-Americana No. 4.634.664, e Engelman et al., Patente Norte- Americana No. 4.634.666. As linhagens de células produtoras de anticorpo obtidas por este método são chamadas trioma porque elas são descendentes de três células - duas humanas e uma de camundongo. Encontrou-se que triomas produzem anticorpo mais estavelmente do que hibridomas ordinários feitos a partir de células humanas.

Outros usos contemplados para polipeptídeos da invenção são fornecidos por toda parte do relatório.

CONJUGADOS DE INTERFERON-ALFA Em outro aspecto, a invenção se refere a um conjugado compreendendo um polipeptídeo exibindo uma atividade de interferon-alfa que compreende uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs:l-319, e pelo menos uma unidade não polipeptídica ligada ao polipeptídeo, tal como por exemplo, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, por exemplo 1 ou 2 unidades não polipeptídicas acopladas ao polipeptídeo. Será entendido que o conjugado também exibe uma atividade de interferon-alfa (tal como, atividade antiviral, atividade de diferenciação de Th 1, e/ou atividade antiproliferativa). Alguns tais conjugados compreendem adicionalmente um ou mais aminoácido(s) adicional(adicionais), tal como uma metionina adicionada ao término N do polipeptídeo.

Em outro aspecto o conjugado compreende um polipeptídeo exibindo uma atividade de interferon-alfa que compreende uma seqüência de aminoácidos que difere em 0 a 16 posições de aminoácidos de uma das SEQ ID NOrl-SEQ ID NO:319, e pelo menos uma unidade não polipeptídica ligada ao polipeptídeo, tal como por exemplo, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, por exemplo 1 ou 2 unidades não polipeptídicas acopladas ao polipeptídeo. Em algumas instâncias, a seqüência de aminoácidos compreende um ou mais substituições que introduz ou remove um grupo de ligação para a unidade não polipeptídica (por exemplo, por substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo diferente que compreende um grupo de ligação para a unidade não polipeptídica, ou por inserção de um resíduo de aminoácido adicional que compreende um grupo de ligação para a unidade não polipeptídica). Será entendido que o conjugado também exibe uma atividade de interferon-alfa (tal como, atividade antiviral, atividade de diferenciação de TH1, e/ou atividade antiproliferativa). Alguns tais conjugados compreendem adicionalmente um ou mais aminoácido(s) adicional(adicionais), tal como uma metionina adicionada ao término N do polipeptídeo.

O termo "conjugado" (ou permutavelmente "conjugado de polipeptídeo" ou "polipeptídeo conjugado") é pretendido para indicar uma molécula heterogênea (no sentido de composto) formada por ligação covalente de um ou mais polipeptídeos da invenção a uma ou mais unidades não-polipeptídicas. O termo "ligação covalente" significa que o polipeptídeo e a unidade não-polipeptídica são ou diretamente ligados covalentemente um ao outro, ou são indiretamente ligados covalentemente um ao outro através de unidade ou unidades interventoras, tais como uma ponte, espaçador, ou unidade ou unidades de ligação. Preferivelmente, um polipeptídeo conjugado é solúvel em concentrações e condições relevantes, isto é solúvel em fluidos fisiológicos tal como sangue. Exemplos de polipeptídeos conjugados da invenção incluem polipeptídeos glicosilados e/ou PEGuilados. O termo "polipeptídeo não conjugado" pode ser usado para se referir à parte de polipeptídeo do polipeptídeo conjugado.

O termo "unidade não-polipeptídica" é pretendido para significar uma molécula que é capaz de conjugar com um grupo de ligação do polipeptídeo. Exemplos preferidos de unidades não-polipeptídicas incluem moléculas de polímero, unidades de açúcar, compostos lipofílicos, ou agentes derivatizantes orgânicos, em particular moléculas de polímero ou unidades de açúcar. Será entendido que a unidade não-polipeptídica é ligada ao polipeptídeo através de um grupo de ligação do polipeptídeo. Exceto onde o número de unidades não-polipeptídicas, tal como molécula(s) de polímero, ligadas ao polipeptídeo é expressamente indicado, toda referência a "uma unidade não-polipeptídica" ligada ao polipeptídeo ou de outra maneira usada na presente invenção deve ser uma referência a uma ou mais unidades não- polipeptídicas ligadas ao polipeptídeo.

O termo "molécula de polímero" é definido como uma molécula formada por ligação covalente a dois ou mais monômeros, caracterizada pelo fato de que nenhum dos monômeros é um resíduo de aminoácidos. O termo "polímero" pode ser usado permutavelmente com o termo "molécula de polímero".

O termo "unidade de açúcar" é pretendido para indicar uma molécula ligada por glicosilação in vivo ou ex vivo, tal como glicosilação-N ou-O.

Um "sítio de N-glicosilação" tem a seqüência N-X-S/T/C, caracterizado pelo fato de que X é qualquer resíduo de aminoácidos exceto prolina, N é asparagina e S/T/C é ou serina, treonina ou cisteína, preferivelmente serina ou treonina, e mais preferivelmente treonina.

Um "sítio de O-glicosilação" compreende o grupo-OH de um resíduo de serina ou treonina.

O termo "grupo de ligação" é pretendido para indicar um grupo de resíduo de aminoácidos capaz de acoplar a unidade não- polipeptídica relevante tal como uma molécula de polímero ou unidade de açúcar. Exemplos não limitantes de grupos de ligação úteis e algumas unidades não-polipeptídicas correspondentes são fornecidos na tabela 2 abaixo.

Tabela 2 Grupos de ligação úteis e exemplos de unidades não polipeptídicas correspondentes

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Para glicosilação-N in vivo, o termo "grupo de ligação" é usado de uma maneira inconvencional para indicar resíduos de aminoácidos contendo um sítio de N-glicosilação (com a seqüência N-X-S/T/C, caracterizada pelo fato de que X é qualquer resíduo de aminoácidos exceto prolina, N é asparagina e S/T/C é ou serina, treonina ou cisteína, preferivelmente serina ou treonina, e mais preferivelmente treonina). Embora o resíduo de asparagina do sítio de N-glicosilação seja o qual é ligada a unidade de açúcar durante glicosilação, tal glicosilação não pode ser atingida a menos que outros resíduos de aminoácidos do sítio de N-glicosilação estejam presentes. Por conseguinte, quando a unidade não-polipeptídica é uma unidade de açúcar e conjugação deve ser atingida por N-glicosilação, o termo "resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de ligação para a unidade não-polipeptídica" como usado em conexão com alterações da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da invenção é para ser entendido como um, dois ou todos os resíduos de aminoácidos constituindo um sítio de N-glicosilação é/são para ser alterado de maneira tal que ou o sítio de N- glicosilação funcional é introduzido dentro da seqüência de aminoácidos, removido da dita seqüência, ou o sítio de N-glicosilação funcional é retido na seqüência de aminoácidos (por exemplo substituindo o resíduo de serina, que já constitui parte do o sítio de N-glicosilação, por um resíduo de treonina e vice versa).

O termo "introduzir" (isto é um resíduo de aminoácido "introduzido", "introdução" de um resíduo de aminoácido) é primariamente pretendido para significar substituição de um resíduo de aminoácido existente por outro resíduo de aminoácido, mas também pode significar inserção de um resíduo de aminoácido adicional.

O termo "remover" (isto é um resíduo de aminoácido "removido", "remoção" de um resíduo de aminoácido) é primariamente pretendido para significar substituição do resíduo de aminoácido a ser removido por outro resíduo de aminoácido, mas também pode significar deleção (sem substituição) do resíduo de aminoácido a ser removido.

O termo "resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de ligação para a unidade não-polipeptídica" é pretendido para indicar que o resíduo de aminoácido é um ao qual a unidade não-polipeptídica se liga (no caso de um resíduo de aminoácido introduzido) ou teria se ligado (no caso de um resíduo de aminoácido removido).

O termo "meia vida in vivo funcional" é usado em seu significado normal, isto é no tempo no qual que 50% da atividade biológica do polipeptídeo está ainda presente no corpo/órgão alvo, ou o tempo no qual que a atividade do polipeptídeo é 50% do valor inicial. A meia vida in vivo funcional pode ser determinada em um animal experimental, tal como rato, camundongos, coelho, cachorro, ou macaco. Preferivelmente, a meia vida in vivo funcional é determinada em um primata não humano, tal como um macaco. Além disso, a meia vida in vivo funcional pode ser determinada para uma amostra que foi administrada intravenosamente ou subcutaneamente.

Como uma alternativa para determinar meia vida in vivo funcional, "meia vida no soro" pode ser determinada, isto é tempo no qual 50% do polipeptídeo circula no plasma ou corrente sangüínea antes de ser depurado. Determinação de meia vida no soro é freqüentemente mais simples do que determinar meia vida in vivo funcional e a magnitude da meia vida no soro é normalmente uma boa indicação da magnitude da meia vida in vivo funcional. Alternativamente, termos para meia vida no soro incluem "meia vida no plasma", "meia vida circulante", "depuração no soro", "depuração no plasma" e "meia vida de depuração". A meia vida no soro pode ser determinada como descrito acima em conexão com determinação da meia vida in vivo funcional.

O termo "soro" é usado no seu significado normal, isto é como plasma sangüíneo sem fibrinogênio ou outros fatores coagulantes.

O termo "aumentada" como usado acerca de meia vida in vivo funcional ou meia vida no soro é usado para indicar que a meia vida relevante do conjugado da invenção é significativamente aumentada estatisticamente em relação à molécula de referência, tal como um interferon-alfa tipo selvagem, por exemplo interferon-alfa humano, tal como uma de SEQ ID N0:320- SEQ ID NO:332 (ou outras seqüências huIFN-alfa como descrito neste lugar e/ou em Allen G. and Diaz M.O. (1996), acima), ou o polipeptídeo não conjugado correspondente. Assim, conjugados interessantes da invenção incluem aqueles que têm uma meia vida in vivo funcional aumentada ou uma meia vida no soro aumentada quando comparado com uma molécula de referência mencionada acima.

O termo "AUCsc" ou "Area Sob a Curva quando administrado subcutaneamente" é usado no seu significado normal, isto é como a área sob a curva de atividade de interferon-alfa em soro vs. tempo, onde a molécula conjugada foi administrada subcutaneamente a um animal experimental. Uma vez que os momentos da atividade de interferon-alfa experimentais tenham sido determinados, o AUCsc pode ser convenientemente calculado por um programa de computador, tal como GraphPad Prism 3.01.

O termo "aumentada" como usado sobre AUCsc é usado para indicar que a Area Sob a Curva para um conjugado da invenção, quando administrado subcutaneamente, é significativamente aumentada estatisticamente em relação à molécula de referência, tal como um interferon- alfa tipo selvagem, por exemplo interferon-alfa humano, tal como uma de SEQ ID N0:320- SEQ ID NO:332 (ou outras seqüências huIFN-alfa como descrito neste lugar e/ou em Allen G. and Diaz M.O. (1996), acima), ou o polipeptídeo não conjugado correspondente, quando determinadas sob condições comparáveis. Evidentemente, a mesma quantidade de atividade de interferon-alfa deveria ser administrada para o conjugado da invenção e molécula de referência. Conseqüentemente, a fim de fazer comparações diretas entre diferentes moléculas de interferon-alfa, os valores AUCsc deveriam ser tipicamente normalizados, isto é ser expressos como AUCsc/dose administrada.

O termo "Tmax,sc" é usado acerca do momento na curva de atividade de interferon-alfa em soro vs. tempo onde a atividade de interferon- alfa mais alta em soro é observada.

Será entendido que embora os exemplos e modificações para o polipeptídeo parental sejam geralmente fornecidos neste lugar em consideração a SEQ ID NO:l, as modificações descritas também podem ser feitas em posições de aminoácidos equivalentes de qualquer dos outros polipeptídeos da invenção (incluindo SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:319 e variantes destas) descritos acima.

Removendo e/ou introduzindo resíduos de aminoácidos compreendendo um grupo de ligação para a unidade não-polipeptídica é possível adaptar especificamente o polipeptídeo de forma a fazer a molécula mais suscetível à conjugação com a unidade não-polipeptídica de escolha, para otimizar o padrão de conjugação (por exemplo assegurar uma distribuição ótima das unidades não-polipeptídicas na superfície da molécula interferon-alfa e por meio disso, por exemplo, proteger efetivamente epítopos e outras partes de superfície do polipeptídeo sem prejudicar significativamente a função deste). Por exemplo, pela introdução de grupos de ligação, o polipeptídeo interferon-alfa é alterado no conteúdo dos resíduos de aminoácidos específicos aos quais a unidade não-polipeptídica relevante se liga, com o qual uma conjugação mais eficiente, específica e/ou extensiva é atingida. Pela remoção de um ou mais grupos de ligação é possível evitar conjugação à unidade não-polipeptídica em partes do polipeptídeo nas quais tal conjugação é desvantajosa, por exemplo a um resíduo de aminoácido localizado em ou perto de um sítio funcional do polipeptídeo (uma vez que conjugação em tal sítio pode resultar em inativação ou atividade de interferon-alfa reduzida do conjugado resultante devido ao prejudicado reconhecimento do receptor). Ademais, pode ser vantajoso remover um grupo de ligação localizado perto de outro grupo de ligação.

Será entendido que o resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de ligação para uma unidade não-polipeptídica, quer ele seja removido ou introduzido, é selecionado com base na natureza da unidade não- polipeptídica e, em algumas instâncias, com base no método de conjugação a ser usado. Por exemplo, quando a unidade não-polipeptídica é uma molécula de polímero, tal como polietilenoglicol ou molécula derivada de óxido de polialquileno, resíduos de aminoácidos capazes de funcionar como um grupo de ligação podem ser selecionados a partir de grupo consistindo de cisteína, lisina (e/ou o grupo amino N-terminal do polipeptídeo), ácido aspártico, ácido glutâmico, histidina e arginina. Quando a unidade não-polipeptídica é uma unidade de açúcar, o grupo de ligação é um sítio de glicosilação-N ou -O in vivo ou ex vivo, preferivelmente um sítio de glicosilação-N.

Em algumas instâncias, quando um grupo de ligação para uma unidade não-polipeptídica está para ser introduzido dentro ou removido do polipeptídeo interferon-alfa, a posição do polipeptídeo interferon-alfa a ser modificada pode ser convenientemente selecionada como segue:

A posição a ser modificada pode ser localizada na superfície do polipeptídeo interferon-alfa, tal como uma posição ocupada por um resíduo de aminoácido que tem mais do que 25% da sua cadeia lateral exposta ao solvente, tal como mais do que 50% da sua cadeia lateral exposta ao solvente. Tais posições foram identificadas com base em uma análise de uma estrutura 3D da molécula 2a de interferon-alfa humano como descrito na seção "Materiais e Métodos" neste lugar.

A fim de determinar uma distribuição ótima dos grupos de ligação, a distância entre resíduos de aminoácidos localizados na superfície da molécula interferon-alfa foi calculada com base em uma estrutura 3 D de um polipeptídeo interferon-alfa. Mais especificamente, a distância entre CB 's de resíduos de aminoácidos compreendendo tais grupos de ligação, ou a distância entre o grupo funcional (NZ para lisina, CG para ácido aspártico, CD para ácido glutâmico, SG para cisteína) de um e o CB de outro resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de ligação foram determinadas. No caso de glicina, CA foi usado ao invés de CB. Na parte de polipeptídeo interferon-α de um conjugado da invenção, qualquer das ditas distâncias podem ser mais do que 8 Â, tal como mais do que 10 Â a fim de evitar ou reduzir conjugação heterogênea e fornecer uma distribuição uniforme dos grupos de ligação, por exemplo com a intenção de proteção do epítopo.

Além disso, na parte polipeptídeo interferon-α de um conjugado da invenção, em algumas instâncias grupos de ligação localizados em ou perto dos sítios de ligação do receptor de interferon-alfa são removidos, tal como por substituição do resíduo de aminoácido compreendendo tal grupo. Em algumas instâncias, resíduos de aminoácidos compreendendo um grupo de ligação para uma unidade não-polipeptídica, tal como cisteína ou lisina, são freqüentemente não introduzidos em ou perto dos sítios de ligação do receptor da molécula interferon-alfa.

Outra abordagem para modificar um polipeptídeo interferon- alfa é para proteger e por meio disso modificar ou destruir ou de outra maneira inativar um epítopo presente no interferon-alfa parental, por conjugação com uma unidade não-polipeptídica. Epítopos de polipeptídeos interferon-alfa podem ser identificados pelo uso de métodos conhecidos na técnica, também conhecidos como mapeamento de epítopo, veja por exemplo Romagnoli et al., J. Biol Chem., 1999, 380(5):553-9, DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:11-20, Van de Water et al., Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85(3):229-35, Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1):77-81, e Lane DP and Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268-71. Um método é estabelecer uma biblioteca de revelação de fago expressando oligopeptídeos aleatórios de, por exemplo, 9 resíduos de aminoácidos. Anticorpos IgGl de anti-soros específicos para interferon-alfa humano são purificados por imunoprecipitação e os fagos reativos são identificados por immunoblotting. Seqüenciando o DNA dos fagos reativos purificados, a seqüência de oligopeptídeo pode ser determinada seguida pela localização da seqüência na estrutura 3D do interferon-alfa. Alternativamente, epítopos podem ser identificados de acordo com o método descrito em Patente Norte-Americana 5.041.376. A região identificada por meio disso na estrutura constitui um epítopo que pode ser selecionado como região alvo para introdução de um grupo de ligação para a unidade não-polipeptídica. Preferivelmente, pelo menos um epítopo, tal como dois, três, ou quatro epítopos de interferon-alfa são protegidos por uma unidade não-polipeptídica de acordo com a presente invenção. Por conseguinte, em um aspecto, o conjugado da invenção tem pelo menos um epítopo protegido comparado com um interferon-alfa humano tipo selvagem, incluindo qualquer interferon-alfa disponível comercialmente. Isto pode ser feito por introdução de grupo de ligação para uma unidade não- polipeptídica dentro de uma posição localizada na vizinhança de (isto é dentro de 4 resíduos de aminoácidos na seqüência primária ou dentro de cerca de 10 Â na seqüência terciária) de um dado epítopo. A distância 10 Â é medida entre CB's (CA's no caso de glicina). Tais introduções específicas são descritas nas seções seguintes.

No caso de remoção de um grupo de ligação, o resíduo de aminoácido relevante compreendendo tal grupo e ocupando uma posição como definido acima pode ser substituído por um resíduo de aminoácido diferente que não compreende um grupo de ligação para a unidade não- polipeptídica em questão, ou pode ser deletado. Remoção de um grupo de N- glicosilação, pode também ser acompanhada por inserção ou remoção de um resíduo de aminoácido dentro do motivo N-X-S/T/C.

No caso de introdução de um grupo de ligação, um resíduo de aminoácido compreendendo tal grupo é introduzido na posição, tal como por substituição de um resíduo de aminoácido ocupando tal posição.

O número exato de grupos de ligação disponíveis para conjugação e presentes no polipeptídeo interferon-alfa é dependente do efeito que se deseja atingir por conjugação. O efeito a ser obtido é, por exemplo, dependente da natureza e grau de conjugação (por exemplo a identidade da unidade não-polipeptídica, o número de unidades não-polipeptídicas desejável ou possível de conjugar com o polipeptídeo, onde eles devem ser conjugados ou onde conjugação deve ser evitada, etc.). Por exemplo, se é desejado imunogenicidade reduzida, o número (e localização de) grupos de ligação deve ser suficiente para proteger a maioria ou todos os epítopos. Isto é normalmente obtido quando uma maior proporção do polipeptídeo interferon- alfa é protegida. Proteção efetiva dos epítopos é normalmente atingida quando o número total de grupos de ligação disponível para conjugação está na extensão de 1-6 grupos de ligação, por exemplo, 1-5, tal como na extensão de 1-3, tal como 1, 2, ou 3 grupos de ligação.

Meia vida in vivo funcional é i.a. dependente do peso molecular do conjugado, e o número de grupos de ligação necessário para fornecer meia vida in vivo funcional aumentada assim depende do peso molecular da unidade não-polipeptídica em questão. Alguns de tais conjugados compreendem 1-6, por exemplo, 1-5, tal como 1-3, por exemplo 1, 2, ou 3 unidades não-polipeptídicas tendo um MV de cerca de 2-40 kDa, tal como cerca de 2 kDa, cerca de 5 kDa, cerca de 12 kDa, cerca de 15 kDa, cerca de 20 kDa, cerca de 30 kDa, ou cerca de 40 kDa.

No conjugado da invenção, alguns, a maioria, ou substancialmente todos os grupos de ligação conjugáveis são ocupados pela unidade não-polipeptídica.

O conjugado da invenção pode exibir uma ou mais das seguintes propriedades melhoradas:

Por exemplo, o conjugado pode exibir uma imunogenicidade reduzida quando comparado com o polipeptídeo não conjugado correspondente, por exemplo uma redução de pelo menos 10%, tal como uma redução de pelo menos of 25%, tal como uma redução de pelo menos 50%, por exemplo uma redução de pelo menos 75% comparado com o polipeptídeo não conjugado.

Em outro aspecto o conjugado pode exibir uma reação reduzida ou nenhuma reação com anticorpos neutralizantes de pacientes tratados com interferon-alfa humano (tal como qualquer dos polipeptídeos definidos neste lugar como SEQ ID N0:320-SEQ ID NO:332, ou qualquer outro huIFN-alfa descrito neste lugar e/ou em Allen G. and Diaz M.O. (1996), acima) ou quando comparado com o polipeptídeo não conjugado correspondente, por exemplo uma redução de neutralização de pelo menos 10%, tal como pelo menos de 25%, tal como de pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 75%.

Em outro aspecto da invenção o conjugado pode exibir uma meia vida in vivo funcional aumentada e/ou uma meia vida no soro aumentada quando comparado com uma molécula de referência tal como um interferon- alfa humano (por exemplo qualquer dos polipeptídeos definidos neste lugar como SEQ ID NO:320-332 ou qualquer outro huIFN-alfa descrito neste lugar e/ou em Allen G. and Diaz M.O. (1996), acima) ou um interferon-alfa conjugado de referência (por exemplo, um IFNalfa 2a humano conjugado ou um IFN-alfa 2b humano conjugado), ou quando comparado com o polipeptídeo não conjugado correspondente. Conjugados preferidos particulares são tais conjugados onde a proporção entre a meia vida in vivo funcional (ou meia vida no soro) do dito conjugado e a meia vida in vivo funcional (ou meia vida no soro) da dita molécula de referência é pelo menos 1,25, tal como pelo menos 1,50, tal como pelo menos 1,75, tal como pelo menos 2, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5, tal como pelo menos 6, tal como pelo menos 7, tal como pelo menos 8. Como mencionado acima, a meia vida é convenientemente determinada em um animal experimental, tal como rato ou macaco, e pode ser baseada em administração intravenosa ou subcutânea.

Em um aspecto adicional o conjugado pode exibir uma biodisponibilidade aumentada quando comparado com uma molécula de referência tal como um interferon-alfa humano (por exemplo qualquer dos polipeptídeos definidos neste lugar como SEQ ID NO:320-332, ou qualquer outro huIFN-alfa descrito neste lugar e/ou in Allen G. and Diaz M.O. (1996), acima) ou um interferon-alfa conjugado de referência (por exemplo, um IFN- alfa 2a humano conjugado ou um IFNalfa 2b humano conjugado), ou o polipeptídeo não conjugado correspondente. Por exemplo, o conjugado pode exibir AUCsc aumentado quando comparado com uma molécula de referência tal como um interferon-alfa humano ou polipeptídeo não conjugado correspondente. Assim, conjugados exemplares são tais conjugados onde a proporção entre o AUCsc do dito conjugado e o AUCsc da dita molécula de referência é pelo menos 1,25, tal como pelo menos 1,50, tal como pelo menos 1,75, tal como pelo menos 2, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5 ou pelo menos 6, tal como pelo menos 7, tal como pelo menos 8, tal como pelo menos 9 ou pelo menos 10, tal como pelo menos 12, tal como pelo menos 14, por exemplo pelo menos 16, pelo menos 18 ou pelo menos 20 quando administrado subcutaneamente, em particular quando administrado subcutaneamente em um animal experimental tal como rato ou macaco. Analogamente, alguns conjugados da invenção são tais conjugados caracterizados pelo fato de que onde a proporção entre Tmax para dito conjugado e Tmax para dita molécula de referência, tal como um interferon- alfa humano ou polipeptídeo não conjugado correspondente, é pelo menos 1,2, tal como pelo menos 1,4, por exemplo pelo menos 1,6, tal como pelo menos 1,8, tal como pelo menos 2, por exemplo pelo menos 2,5, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 4, por exemplo pelo menos 5, tal como pelo menos 6, tal como pelo menos 7, por exemplo pelo menos 8, tal como pelo menos 9, tal como pelo menos 10, quando administrado subcutaneamente, em particular quando administrado subcutaneamente em um animal experimental tal como rato ou macaco.

Em algumas instâncias, a magnitude da atividade antiviral de um conjugado da invenção pode ser reduzida (por exemplo em pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 10%) ou aumentada (por exemplo em pelo menos cerca de 10%) ou é cerca de igual (por exemplo dentro de cerca de +/- 10% ou cerca de +/- 5%) àquela de um interferon-alfa humano (por exemplo qualquer dos polipeptídeos identificados neste lugar como SEQ ID NO:320-332, ou qualquer outro huIFN-alfa descrito neste lugar e/ou em Allen G. and Diaz M.O. (1996), acima), ou do polipeptídeo não conjugado correspondente. Em algumas instâncias o grau de atividade antiviral quando comparado à atividade antiproliferativa de um conjugado da invenção pode variar, e assim maior, menor ou cerca de igual àquela de um interferon-alfa ou do polipeptídeo não conjugado correspondente.

Conjugado da invenção onde unidade não-polipeptídica se liga a um resíduo de lisina ou à amina N-terminal

Em um aspecto, a invenção se refere a um conjugado exibindo uma atividade de interferon-alfa e compreendendo pelo menos uma unidade não-polipeptídica conjugada com pelo menos um resíduo de lisina e/ou grupo amina N-terminal de um polipeptídeo interferon-alfa compreendendo uma seqüência selecionada de SEQ ID NOs:l-319.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um conjugado exibindo uma atividade de interferon-alfa e compreendendo pelo menos uma unidade não-polipeptídica conjugada com pelo menos um resíduo de lisina e/ou grupo amina N-terminal de um polipeptídeo interferon-alfa compreendendo uma seqüência que (a) difere em 1 a 16 posições de aminoácidos (tal como em 1-15 posições de aminoácidos, em 1-14 posições de aminoácidos, em 1-13 posições de aminoácidos, em 1-12 posições de aminoácidos, 1-11 posições de aminoácidos, em 1-10 posições de aminoácidos, em 1-9 posições de aminoácidos, em 1-8 posições de aminoácidos, em 1-7 posições de aminoácidos, em 1-6 posições de aminoácidos, em 1-5 posições de aminoácidos, em 1-4 posições de aminoácidos, em 1-3 posições de aminoácidos, ou em 1-2 posições de aminoácidos) de uma das SEQ ID NOil-SEQ ID NO:319. Alguns conjugados de acordo com este aspecto compreendem pelo menos um resíduo de lisina removido e/ou pelo menos um resíduo de histidina removido, e/ou pelo menos um resíduo de lisina introduzido.

Unidades não-polipeptídicas contempladas para este aspecto da invenção incluem moléculas de polímeros, tal como qualquer molécula mencionada na seção intitulada "Conjugação para uma molécula de polímero", tal como PEG ou mPEG. A conjugação entre um polipeptídeo contendo lisina e a molécula de polímero pode ser atingida de qualquer maneira adequada, por exemplo como descrito na seção intitulada "Conjugação para uma molécula de polímero", por exemplo usando um método de uma etapa ou uma maneira etapa a etapa referida na dita seção. Um método exemplar para PEGuilar o polipeptídeo interferon-alfa é ligar covalentemente PEG a resíduos de lisina usando PEGs lisina-reativos. Diversos PEGs lisina-reativos altamente específicos (tal como, por exemplo, succinimidil propionato (SPA), succinimidil butanoato (SBA), N-hidroxi succinimida (NHS), e aldeído (por exemplo ButirALD)) e PEGs lineares ou ramificados de diferentes tamanhos (por exemplo, 2-40 kDa, tal como 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, ou 40 kDa) estão disponíveis comercialmente, por exemplo de Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL, USA ou SunBio, Anyang City, South Korea.

Conjugado da invenção onde unidade não-polipeptídica se liga a um resíduo de cisterna

Em um aspecto, a invenção se refere a um conjugado exibindo uma atividade de interferon-alfa e compreendendo pelo menos uma unidade não-polipeptídica conjugada com pelo menos um resíduo de cisteína de um polipeptídeo interferon-alfa compreendendo uma seqüência que (a) difere em 1 a 16 posições de aminoácidos (tal como em 1-15 posições de aminoácidos, em 1-14 posições de aminoácidos, em 1-13 posições de aminoácidos, em 1-12 posições de aminoácidos, em 1-11 posições de aminoácidos, em 1-10 posições de aminoácidos, em 1-9 posições de aminoácidos, em 1-8 posições de aminoácidos, em 1-7 posições de aminoácidos, em 1-6 posições de aminoácidos, em 1-5 posições de aminoácidos, em 1-4 posições de aminoácidos, em 1-3 posições de aminoácidos, ou em 1-2 posições de aminoácidos) de uma das SEQ ID NO: 1-319. Alguns conjugados de acordo com este aspecto compreendem pelo menos um resíduo de cisteína introduzido.

Em algumas instâncias, apenas um resíduo de cisteína único é introduzido a fim de evitar a formação de pontes dissulfeto entre dois ou mais resíduos de cisteína introduzidos.

Em interferons-alfa, ligações dissulfeto são formadas entre cisteínas nas posições 1/99 e 29/139. A ligação dissulfeto 29/139 é essencial para atividade biológica, enquanto a ligação 1/99 pode ser reduzida sem afetar significativamente atividade biológica (Beiharz, M.W. et ai. (1986) J. Interferon Res. 6(6):677-685). Assim, em outro aspecto da invenção um de Cl ou C99 é removido, preferivelmente por substituição, por exemplo ClS ou C99S, por causa disso deixando o outro resíduo de cisteína disponível para conjugação com uma unidade não-polipeptídica.

Unidades não-polipeptídicas contempladas neste aspecto da invenção incluem moléculas de polímeros, tal como qualquer das moléculas mencionadas na seção intitulada "Conjugação para uma molécula de polímero", tal como PEG ou mPEG. A conjugação entre o polipeptídeo contendo cisteína e a molécula de polímero pode ser atingida de qualquer maneira adequada, por exemplo como descrito na seção intitulada "Conjugação para uma molécula de polímero", por exemplo usando um método de uma etapa ou uma maneira etapa a etapa referida na dita seção. Um método exemplar para PEGuilar o polipeptídeo interferon-alfa é ligar covalentemente PEG a resíduos de cisteína usando PEGs cisteína-reativos. Diversos PEGs cisteína-reativos altamente específicos com diferentes grupos (por exemplo ortopiridil-dissulfeto (OPSS), maleimida (MAL) e vinilsulfona (VS)) e PEGs lineares ou ramificados de diferentes tamanhos (por exemplo, 2-40 kDa, tal como 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, ou 40 kDa) estão disponíveis comercialmente, por exemplo de Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL, USA ou SunBio, Anyang City, South Korea. Unidade não-polipeptídica do conjugado da invenção

Como indicado acima, a unidade não-polipeptídica do conjugado da invenção é geralmente selecionada a partir do grupo consistindo de uma molécula de polímero, um composto lipofílico, uma unidade de açúcar (por exemplo, pelo meio de glicosilação-N in vivo) e um agente derivatizante orgânico. Todos estes agentes podem conferir propriedades desejáveis à parte polipeptídica do conjugado, tal como reduzida imunogenicidade, meia vida in vivo funcional aumentada, meia vida no soro aumentada, biodisponibilidade aumentada e/ou AUCsc aumentado. A parte polipeptídica do conjugado é freqüentemente conjugada com apenas um tipo de unidade não-polipeptídica, mas também pode ser conjugada com dois ou mais diferentes tipos de unidade não-polipeptídica, por exemplo com uma molécula de polímero ou uma unidade de açúcar, etc. A conjugação com dois ou mais diferentes unidades não-polipeptídicas pode ser feita simultaneamente ou seqüencialmente. A escolha da unidade/unidades não- polipeptídica, depende especialmente do efeito desejado a ser atingido pela conjugação. Por exemplo, foram encontradas unidades de açúcar particularmente úteis para reduzir imunogenicidade, ao passo que moléculas de polímero tal como PEG são de uso particular para aumentar meia vida in vivo funcional e/ou meia vida no soro. Usar uma combinação de uma molécula de polímero e uma unidade de açúcar pode estimular a redução na imunogenicidade e o aumento na meia vida in vivo funcional e/ou meia vida no soro.

Nas seções seguintes "Conjugação com um composto lipofílico", "Conjugação com uma molécula de polímero", "Conjugação com uma unidade de açúcar", e "Conjugação com um agente derivatizante orgânico" é descrita conjugação com tipos específicos de unidades não- polipeptídicas.

Conjugação com um composto lipofilico Para conjugação com um composto lipofilico os seguintes grupos de polipeptídeos podem funcionar como grupos de ligação: término N ou término C do polipeptídeo, os grupos hidroxi dos resíduos de aminoácidos Ser, Thr ou Tyr5 o grupo ε-amino de Lys, o grupo SH de Cys, ou o grupo carboxila de Asp ou Glu. O polipeptídeo e o composto lipofílico podem ser conjugados um com outro ou diretamente ou pelo uso de um ligante. O composto lipofílico pode ser um composto natural tal como um ácido graxo saturado ou insaturado, um ácido graxo dicetona, um terpeno, uma prostaglandina, uma vitamina, um carotenóide ou esteróide, ou um composto sintético tal como um ácido de carbono, um álcool, uma amina e um ácido sulfônico com um ou mais alquil, aril, alquenil ou outros compostos insaturados múltiplos. A conjugação entre o polipeptídeo e o composto lipofílico, opcionalmente através de um ligante pode ser feita de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo como descrito por Bodansk)' in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 e em WO 96/12505.

Conjugação com uma molécula de polímero

A molécula de polímero a ser ligada ao polipeptídeo pode ser qualquer molécula de polímero adequada, tal como um homo-polímero ou heteropolímero natural ou sintético, tipicamente com um peso molecular na extensão de cerca de 300-100.000 Da, tal como cerca de 1000-50.000 Da, por exemplo na extensão de cerca de 1000-40.000 Da. Mais particularmente, a molécula de polímero, tal como PEG, em particular mPEG, irá tipicamente ter um peso molecular de cerca de 2, 5, 10, 12, 15, 20, 30, 40 ou 50 kDa, em particular um peso molecular de cerca de 5 kDa, cerca de 10 kDa, cerca de 12 kDa, cerca de 15 kDa, cerca de 20 kDa, cerca de 30 kDa ou cerca de 40 kDa. A molécula PEG pode ser ramificada (por exemplo, mPEG2), ou pode ser não ramificada (isto é, linear).

Quando usado acerca de moléculas de polímero neste lugar, a palavra "cerca" indica uma média aproximada de peso molecular e reflete o fato de que normalmente haverá uma certa distribuição de peso molecular em uma preparação de polímero dada.

Exemplos de homo-polímeros incluem um poliol (isto é, poli- OH), uma poliamina (isto é poli-NH2) e um ácido policarboxílico (isto é poli- COOH). Um hetero-polímero é um polímero que compreende um ou mais grupos de acoplamento diferentes, tal como um grupo hidroxila e um grupo amina.

Exemplos de moléculas de polímero adequadas incluem moléculas de polímero selecionadas a partir do grupo consistindo de óxido de polialquileno (PAO), incluindo polialquilenoglicol (PAG), tal como polietilenoglicol (PEG) e polipropilenoglicol (PPG), PEGs ramificados (PEG2), polivinil álcool (PVA), policarboxilato, poli-(vinilpirolidona), polietileno-co-maleico ácido anidrido, polistereno-co-málico ácido anidrido, dextrana incluindo carboximetil-dextrana, ou qualquer outro biopolímero adequado para reduzir imunogenicidade e/ou aumentar meia vida in vivo funcional e/ou meia vida no soro. Geralmente, polímeros derivados de polialquilenoglicol são biocompatíveis, não tóxicos, não antigênicos, não imunogênicos, têm várias propriedades de solubilidade em água, e são facilmente excretados de organismos vivos.

PEG é a molécula de polímero preferida para ser usada, uma vez que tem somente poucos grupos reativos capazes de reticular comparado com por exemplo polissacarídeos tal como dextrana. Em particular, PEG monofuncional, por exemplo, monometoxipolietilenoglicol (mPEG), é de interesse uma vez que sua química de acoplamento é relativamente simples (somente um grupo reativo é disponível para conjugação com grupos de ligação no polipeptídeo). Conseqüentemente, o risco de reticulação é eliminado, e os conjugados de polipeptídeos resultantes são mais homogêneos e a reação de moléculas de polímero com o polipeptídeo é mais fácil de controlar. Para efetuar ligação covalente da(s) molécula(s) de polímero ao polipeptídeo, os grupos hidroxila terminais da molécula de polímero devem ser fornecidos na forma ativada, isto é com grupos funcionais reativos (exemplos dos quais incluem grupos amino primários, hidrazida (HZ), tiol, succinato (SUC), succinimidil succinato (SS), succinimidil succinamida (SSA), succinimidil propionato (SPA), succinimidil butanoato (SBA), succinimidil carboximetilato (SCM), carbonato de benzotriazol (BTC), N- hidroxisuccinimida (NHS), aldeído, nitrofenilcarbonato (NPC), e tresilato (TRES)). Moléculas de polímero adequadamente ativadas estão disponíveis comercialmente, por exemplo de Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL, USA; PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK; ou SunBio, Anyang City, South Korea. Alternativamente, as moléculas de polímero podem ser ativadas por métodos convencionais conhecidos na técnica, por exemplo como descrito em WO 90/13540. Exemplos específicos de moléculas de polímero ativadas lineares ou ramificadas adequadas para uso na presente invenção são descritos em Nektar Therapeutics Inc. 2003 Catalog ("Nektar Molecule Engineering: Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced Pegylation, Catalog 2003"), incorporado pela referência neste lugar. Exemplos específicos de polímeros PEG ativados incluem os seguintes PEGs lineares: NHS-PEG, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI- PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, IODO-PEG, e MAL- PEG, e PEGs ramificados, tal como PEG2-NHS, PEG2-MAL, e aqueles descritos em Patente Norte-Americana 5.932.462 e Patente Norte-Americana 5.643.575, ambos dos quais são incorporados neste lugar pela referência. Além disso, as seguintes publicações, incorporadas neste lugar pela referência, revelam moléculas de polímero úteis e/ou químicas de PEGuilação: Patente Norte-Americana 5.824.778, Patente Norte-Americana 5.476.653, WO 97/32607, Patente Européia 229.108, Patente Européia 402.378, Patente Norte-Americana 4.902.502, Patente Norte-Americana 5.281.698, Patente Norte-Americana 5.122.614, Patente Norte-Americana 5.219.564, WO 92/16555, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, Patente Européia 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, Patente Européia 921 131, Patente Norte-Amerieana 5.736.625, WO 98/05363, Patente Européia 809 996, Patente Norte-Americana 5.629.384, WO 96/41813, WO 96/07670, Patente Norte-Americana 5.473.034, Patente Norte-Americana 5.516.673, Patente Européia 605 963, Patente Norte- Amerieana 5.382.657, Patente Européia 510 356, Patente Européia 400 472, Patente Européia 183 503 e Patente Européia 154 316.

A conjugação do polipeptídeo e das moléculas de polímero ativadas é conduzida pelo uso de qualquer método convencional, por exemplo como descrito nas referências seguintes (que também descrevem métodos adequados para ativação de moléculas de polímero): Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Mareei Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affmity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.

Para PEGuilação de resíduos de cisteína o polipeptídeo é normalmente tratado com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DDT) antes da PEGuilação. O agente redutor é subseqüentemente removido por qualquer método convencional, tal como por dessalinização. Conjugação de PEG com um resíduo de cisteína tipicamente acontece em um tampão adequado em pH 6-9 em temperaturas variando de 4 0C a 25 0C por períodos de até cerca de 16 horas. Exemplos de polímeros PEG ativados para acoplamento com resíduos de cisteína incluem os seguintes PEGs lineares e ramificados: vinilsulfona-PEG (PEG-VS), tal como uma vinilsulfona-mPEG (mPEG-VS); ortopiridil-dissulfeto-PEG (PEG-OPSS), tal como um ortopiridil-dissulfeto-mPEG (mPEG-OPSS); e maleimida-PEG (PEG-MAL), tal como maleimida-mPEG (mPEG-MAL) e maleimida-mPEG2 ramificada (mPEG2-MAL).

Peguilação de lisinas freqüentemente emprega PEG-N- hidroxilsuccinimida (por exemplo, mPEG-NHS ou mPEG2-NHS), ou ésteres tal como PEG succinimidil propionato (por exemplo, mPEG-SPA) ou PEG succinimidil butanoato (por exemplo, mPEG-SBA). Um ou mais PEGs podem ser ligados a uma proteína dentro de 30 minutos em pH 8-9,5 a temperatura ambiente se quantidades equimolares de PEG e proteína são misturadas. Uma proporção molar de PEG para grupos amino de proteína de 1-5 a 1 irão normalmente bastar. Crescente pH aumenta a taxa de reação, enquanto abaixar pH reduz a taxa de reação. Estes ésteres ativos altamente reativos podem ser acoplados em pH fisiológico, mas derivados menos reativos tipicamente requerem pH maior. Baixas temperaturas também podem ser empregadas se uma proteína lábil está sendo usada. Sob condições de baixa temperatura, um tempo de reação maior pode ser usado.

PEGuilação N-terminal é facilitada pela diferença entre os valores pKa do grupo α-amino do aminoácido N-terminal (-7,6 a 8,0) e do grupo ε-amino de lisina (-10). PEGuilação do grupo amino N-terminal freqüentemente emprega PEG-aldeídos (tal como mPEG-propionaldeído ou mPEG-butilaldeído), que são mais seletivos para aminas e assim são menos prováveis de reagir com o grupo imidazol de histidina; em adição, reagentes de PEG usados para conjugação da lisina (tal como mPEG-SPA, mPEG-SBA, ou mPEG-NHS) também podem ser usados para conjugação da amina N- terminal. Conjugação de um PEG-aldeído com grupo amino N-terminal tipicamente acontece em um tampão adequado (tal como, acetato de sódio 100 mM ou tampão bifosfato de sódio 100 mM com 20 mM cianoborohidreto de sódio) em pH — 5,0 durante a noite a temperaturas variando de cerca de 4 0C a 25 °C. Métodos e químicas de PEGuilação N-terminal úteis também são descritos em Patente Norte-Americana 5.985.265 e Patente Norte-Americana 6.077.939, ambas incorporadas neste lugar pela referência.

Tipicamente, polímeros PEG lineares e mPEG irão ter um peso molecular de cerca de 5 kDa, cerca de 10 kDa, cerca de 12 kDa, cerca de 15 kDa, cerca de 20 kDa, ou cerca de 30 kDa. Polímeros PEG ramificados (PEG2 ou mPEG2) irão tipicamente ter um peso molecular de cerca de 10 kDa, cerca de 20 kDa, ou cerca de 40 kDa. Em algumas instâncias, os reagentes de PEG2 ramificados de maior peso molecular, tal como 20 kDa ou 40 kDa PEG2, incluindo por exemplo mPEG2-NHS para PEGuilação da lisina, mPEG2-MAL para PEGuilação da cisteína, ou mPEG2-aldeído para PEGuilação N-terminal (todos disponíveis a partir de Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL), podem ser usados. A estrutura ramificada do composto PEG2 resulta em um volume molecular relativamente grande, de forma que menos moléculas ligadas (ou, uma molécula ligada) podem conceder as características desejadas da molécula PEGuilada.

A pessoa versada estará a par de que o método de ativação e/ou química da conjugação a serem usados depende do(s) grupo(s) de ligação do polipeptídeo interferon-alfa assim como dos grupos funcionais do polímero (por exemplo, sendo, amino, hidroxil, carboxil, aldeído ou sulfidril). A PEGuilação pode ser direcionada na direção da conjugação para todos os grupos de ligação disponíveis no polipeptídeo (isto é tais grupos de ligação que são expostos na superfície do polipeptídeo) ou pode ser direcionada para grupos de ligação específicos, por exemplo, resíduos de cisteína, resíduos de lisina, ou o grupo amino N-terminal. Além disso, a conjugação pode ser atingida em uma etapa ou de maneira etapa a etapa (por exemplo como descrito em WO 99/55377).

Em algumas instâncias, a conjugação do polímero sob condições auxiliando reagir tantos grupos de ligação disponíveis do polipeptídeo quanto possíveis com moléculas de polímero. Isto é atingido por meios de um excesso molar adequado do polímero em relação ao polipeptídeo. Proporções molares típicas de moléculas de polímero ativadas para polipeptídeo são de até cerca de 1000-1, tal como de até cerca de 200-1 ou de até cerca de 100-1. Em alguns casos, a proporção pode ser de alguma forma inferior, entretanto, tal como de até cerca de 50-1, 10-1 ou 5-1. Também podem ser usadas proporções equimolares.

Também é contemplado de acordo com a invenção acoplar moléculas de polímero ao polipeptídeo através de um ligante. Ligantes adequados são bem conhecidos por pessoa versada. Um exemplo preferido é cloreto cianúrico (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; Patente Norte-Americana 4.179.337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sei. Polym. Chem. D., 24, 375-378).

Subseqüente a conjugação moléculas de polímero ativadas residuais são bloqueadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo por adição de aminas primárias à mistura de reação, e as moléculas de polímero inativadas resultantes removidas por um método adequado.

Acoplamento covalente in vitro de uma unidade de açúcar a resíduos de aminoácidos de interferon-alfa pode ser usado para modificar ou aumentar o número ou perfil dos açúcares substituintes. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) carboidrato(s) pode(m) ser ligado(s) a a) arginina e histidina (Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI), b) grupos carboxila livres (por exemplo do resíduo de aminoácido C-terminal, asparagina ou glutamina), c) grupos sulfidrila livres tal como aquele da cisteína, d) grupos hidroxila livres tal como aqueles de serina, treonina, tirosina ou hidroxiprolina, e) resíduos aromáticos tal como aqueles de fenilalanina ou triptofano ou f) o grupo amida da glutamina. Estes resíduos de aminoácidos constituem exemplos de grupos de ligação para uma unidade de açúcar, que podem ser introduzidos e/ou removidos no polipeptídeo interferon-alfa. Métodos adequados de acoplamento in vitro são descritos em WO 87/05330 e em Aplin et al., CRC Crit Ver. Biochem., pp. 259-306, 1981. O acoplamento in vitro de unidades de açúcar ou PEG a proteína - e resíduos-Gln-peptídeo-ligado também pode ser realizado por transglutaminases (TGases), por exemplo como descrito por Sato et al., 1996 Biochemistry 35, 13072-12080 ou em EP 725145. Acoplando a uma unidade de açúcar

A fim de atingir glicosilação in vivo de um polipeptídeo interferon-alfa que foi modificado pela introdução de um ou mais sítios de glicosilação, a seqüência de nucleotídeos codificando a parte polipeptídica do conjugado é inserida em um hospedeiro de expressão glicosilante eucariótico. As células hospedeiras de expressão podem ser selecionadas de fungo (fungo filamentoso ou levedura), inseto, células de animais mamíferos, de células de plantas transgênicas ou de animais transgênicos. Além disso, a glicosilação pode ser atingida no corpo humano quando usando uma seqüência de nucleotídeos codificando a parte polipeptídica de um conjugado da invenção ou um polipeptídeo da invenção em terapia gênica. Em um aspecto a célula hospedeira é uma célula de mamífero, tal como uma célula CHO, uma célula COS, uma célula BHK ou HEK, por exemplo HEK293, ou uma célula de inseto, tal como uma célula SF9, ou uma célula de levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou qualquer outro hospedeiro glicosilante adequado, por exemplo como descrito adicionalmente abaixo. Opcionalmente, unidades de açúcar ligadas ao polipeptídeo interferon-α por glicosilação in vivo são modificadas adicionalmente pelo uso de glicosiltransferases, por exemplo usando a tecnologia GlycoAdvanceTM comercializado por Neose, Horsham, PA, USA. Por causa disso, é possível, por exemplo aumentar a sialização do polipeptídeo interferon-alfa glicosilado seguindo expressão e glicosilação in vivo por células CHO.

Acoplando a um agente derivatizante orgânico

Modificação covalente do polipeptídeo interferon-alfa pode ser realizada reagindo grupo(s) de ligação do polipeptídeo com um agente derivatizante orgânico. Agentes derivatizantes e métodos adequados são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, resíduos de cisteinil são mais geralmente reagidos com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), tal como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para gerar derivados de carboximetil ou carboxiamidometil. Resíduos de cisteinil também são derivados por reação com bromotrifluoracetona, a-bromo-P-(4-imidozoil)ácido propiônico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil dissulfeto, metil 2- piridil dissulfeto, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7-benzeno-2-oxa-1,3-diazol. Resíduos de histidil são derivados por reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. Para-bromofenacil brometo também é útil; a reação é preferivelmente realizada em cacodilato de sódio 0,1 M em pH 6,0. Resíduos de lisinil e amino terminais são reagidos com succínico ou outros ácidos carboxílicos anidridos. Derivatização com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinil. Outros reagentes adequados para derivatização de resíduos contendo a-amino incluem imidoésteres tal como metil picolinimidato; piridoxal fosfato; piridoxal; cloroborohidreto; ácido trinitrobenzenosulfônico; O-metilisouréia; 2,4-pentanodiona; e reação com glioxilato catalisada por transaminase.

Resíduos de arginil são modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, e ninhidrina. Derivatização de resíduos de arginina requer que reação seja realizada em condições alcalinas por causa do alto pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como com o grupo guanidino arginina. Grupos laterais de carboxila (aspartil ou glutamil ou resíduo de aminoácido C-terminal) são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R-N=C=N-R'), onde ReR' são diferentes grupos alquil, tal como l-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos de aspartil e glutamil são convertidos em resíduos de asparaginil e glutaminil por reação com íons de amônio. Bloqueando um sítio funcional

Uma vez que conjugação de polímero excessiva pode levar a uma perda de atividade do polipeptídeo interferon-α ao qual o polímero é conjugado, pode ser vantajoso remover grupos de ligação localizados no sítio funcional ou bloquear o sítio funcional antes da conjugação. Estas últimas estratégias constituem aspectos adicionais da invenção (a primeira estratégia sendo exemplificada adicionalmente acima, por exemplo, por remoção de resíduos de lisina que podem estar localizados próximos a um sítio funcional). Mais especificamente, de acordo com a segunda estratégia a conjugação entre o polipeptídeo interferon-alfa e a unidade não-polipeptídica é conduzida sob condições onde o sítio funcional do polipeptídeo é bloqueado por uma molécula auxiliar capaz de se ligar ao sítio funcional do polipeptídeo. Preferivelmente, a molécula auxiliar é uma que reconhece especificamente um sítio funcional do polipeptídeo, tal como um receptor, em particular o receptor de interferon tipo 1. Alternativamente, a molécula auxiliar pode ser um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal reconhecendo o polipeptídeo interferon-alfa. Em particular, a molécula auxiliar pode ser um anticorpo monoclonal neutralizante.

Ao polipeptídeo é permitido interagir com a molécula auxiliar antes de efetuar conjugação. Isto assegura que o sítio funcional do polipeptídeo é isolado ou protegido e conseqüentemente indisponível para derivatização pela unidade não-polipeptídica tal como um polímero. Seguindo sua eluição a partir da molécula auxiliar, o conjugado entre a unidade não- polipeptídica e o polipeptídeo pode ser recuperado com um sítio funcional pelo menos parcialmente preservado.

A conjugação subseqüente do polipeptídeo tendo um sítio funcional bloqueado com um polímero, um composto lipofílico, um agente derivatizante orgânico ou qualquer outro composto é conduzida da maneira normal, por exemplo, como descrito nas seções acima intituladas "Conjugação com....".

Independente da natureza da molécula auxiliar a ser usada para isolar o sítio funcional do polipeptídeo da conjugação, é desejável que a molécula auxiliar seja livre de ou compreenda apenas poucos grupos de ligação para a unidade não-polipeptídica de escolha em partes da molécula onde a conjugação com tais grupos iria obstruir a dessorção do polipeptídeo conjugado a partir da molécula auxiliar. Por meio disto, conjugação seletiva com grupos de ligação presentes em partes não isoladas do polipeptídeo podem ser obtidas e é possível reusar a molécula auxiliar para ciclos repetidos de conjugação. Por exemplo, se a unidade não-polipeptídica é uma molécula de polímero tal como PEG, que tem o grupo amino epsilon de uma lisina ou um resíduo de aminoácido N-terminal como um grupo de ligação, é desejável que molécula auxiliar esteja totalmente livre de grupos amino epsilon conjugáveis, preferivelmente livres de quaisquer grupos amino epsilon. Por conseguinte, em algumas instâncias a molécula auxiliar é uma proteína ou peptídeo capaz de se ligar ao sítio funcional do polipeptídeo, cuja proteína ou peptídeo é livre de quaisquer grupos de ligação conjugáveis com a unidade não-polipeptídica de escolha. Em um aspecto adicional a molécula auxiliar primeiro é ligada covalentemente a uma fase sólida tal como materiais de empacotamento de coluna, por exemplo Sephadex ou microesferas de agarose, ou uma superfície, por exemplo reator. Subseqüentemente, o polipeptídeo é carregado no material da coluna carregando a molécula auxiliar e conjugação é realizada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito nas seções acima intituladas "Conjugação com....'". Este procedimento permite que o conjugado do polipeptídeo seja separado da molécula auxiliar por eluição. O conjugado do polipeptídeo é eluído por técnicas convencionais sob condições fisicoquímicas que não levam a uma degradação substantiva do conjugado do polipeptídeo. A fase fluida contendo o conjugado do polipeptídeo é separada da fase sólida à qual a molécula auxiliar permanece covalentemente ligada. A separação pode ser atingida de outras maneiras: Por exemplo, a molécula auxiliar pode ser derivada com uma segunda molécula (por exemplo biotina) que pode ser reconhecida por um ligante específico (por exemplo estreptavidina). O ligante específico pode ser ligado a uma fase sólida por causa disso permitindo a separação do conjugado do polipeptídeo do complexo de molécula auxiliar-segunda molécula através da passagem sobre uma coluna segundo ajudante-fase sólida que irá reter, a partir de subseqüente eluição, o complexo de molécula auxiliar-segunda molécula, mas não o conjugado do polipeptídeo. O conjugado do polipeptídeo pode ser liberado da molécula auxiliar de qualquer modo apropriado. De-proteção pode ser atingida fornecendo condições nas quais a molécula auxiliar se dissocia do sítio funcional do interferon-α ao qual estava ligada. Por exemplo, um complexo entre um anticorpo ao qual um polímero é conjugado e um anticorpo anti-idiotípico pode ser dissociado ajustando o pH para um pH ácido ou alcalino.

Conjugação de um polipeptídeo interferon-alfa etiquetado

Em outro aspecto o polipeptídeo interferon-alfa é expresso como uma proteína de fusão com uma etiqueta, isto é uma seqüência de aminoácidos ou peptídeo constituído de tipicamente 1-30, tal como 1-20 ou 1- 15 ou 1-10 ou 1-5 resíduos de aminoácidos, por exemplo adicionados ao término N ou ao término C do polipeptídeo. Além de permitir purificação rápida e fácil, a etiqueta é uma ferramenta conveniente para atingir conjugação entre o polipeptídeo etiquetado e a unidade não-polipeptídica. Em particular, a etiqueta pode ser usada para atingir conjugação em placas de microtítulo ou outros carreadores, tal como microesferas paramagnéticas, às quais o polipeptídeo etiquetado pode ser imobilizado através da etiqueta. A conjugação para o polipeptídeo etiquetado em placas de microtítulo tem a vantagem de que o polipeptídeo etiquetado pode ser imobilizado nos placas de microtítulo diretamente do caldo de cultura (em principio sem qualquer purificação) e sujeito à conjugação. Por causa disso, o número total de etapas do processo (da expressão para conjugação) pode ser reduzido. Além disso, a etiqueta pode funcionar como uma molécula espaçadora assegurando uma acessibilidade melhorada para imobilizar polipeptídeo a ser conjugado. A conjugação usando um polipeptídeo etiquetado pode ser com qualquer das unidades não-polipeptídicas descritas neste lugar, por exemplo, com uma molécula de polímero tal como PEG.

A identidade da etiqueta específica a ser usada não é crítica com tanto que a etiqueta seja capaz de ser expressa com o polipeptídeo e seja capaz de ser imobilizada em uma superfície adequada ou material carreador. Diversas etiquetas adequadas estão disponíveis comercialmente, por exemplo a partir de Unizyme Laboratories, Denmark. Anticorpos contra tais etiquetas estão disponíveis comercialmente, por exemplo a partir de ADI, Aves Lab and Research Diagnostics.

POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

A invenção fornece ácidos nucleicos isolados ou recombinantes (também referidos neste lugar como polinucleotídeos), coletivamente referidos como "ácidos nucleicos (ou polinucleotídeos) da invenção", que codificam polipeptídeos da invenção. Os polinucleotídeos da invenção são úteis em uma variedade de aplicações. Como discutido acima, os polinucleotídeos são úteis para produzir polipeptídeos da invenção. Em adição, polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados em vetores de expressão úteis para terapia gênica, vacinação de DNA, e imunoterapia, como descrito em mais detalhe abaixo.

Em um aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que compreendem cada uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO:l- SEQ ID NO:319; ou, uma seqüência complementar de ácidos nucleicos desta.

A invenção também fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que compreendem cada uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que (a) difere em 0 a 16 posições de aminoácidos (tal como in 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 posições de aminoácidos, por exemplo, em 0-15 posições de aminoácidos, em 0-14 posições de aminoácidos, em 0-13 posições de aminoácidos, em 0-12 posições de aminoácidos, 0-11 posições de aminoácidos, em 0-10 posições de aminoácidos, em 0-9 posições de aminoácidos, em 0-8 posições de aminoácidos, em 0-7 posições de aminoácidos, em 0-6 posições de aminoácidos, em 0-5 posições de aminoácidos, em 0-4 posições de aminoácidos, em 0-3 posições de aminoácidos, em 0-2 posições de aminoácidos ou em 0-1 posições de aminoácidos) de uma das SEQ ID NO:l-SEQ ID NO:319, ou, uma seqüência de ácidos nucleicos complementar destes. Alguns polipeptídeos codificados por polinucleotídeos da invenção compreendem adicionalmente um ou mais aminoácido(s) adicional(adicionais), tal como uma metionina adicionada ao término N. Em algumas instâncias o polipeptídeo codificado exibe uma atividade de interferon-alfa.

A invenção também fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que compreendem cada uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência de aminoácidos) com qualquer uma das SEQ ID NOs:l-319, ou, uma seqüência complementar de ácidos nucleicos desta. Alguns polipeptídeos codificados por polinucleotídeos da invenção compreendem adicionalmente um ou mais aminoácido(s) adicional(adicionais), tal como uma metionina adicionada ao término N. Em algumas instâncias o polipeptídeo codificado exibe uma atividade de interferon-alfa. Aspectos Adicionais

Qualquer dos polinucleotídeos da invenção (o que inclui aqueles descritos acima) pode codificar uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma seqüência de aminoácidos adicional, tal como, por exemplo, uma seqüência de secreção/localização, uma seqüência útil para solubilização ou imobilização (por exemplo para apresentação em superfície da célula) do polipeptídeo, uma seqüência útil para detecção e/ou purificação do polipeptídeo (por exemplo uma subseqüência de purificação do polipeptídeo, tal como uma etiqueta do epítopo, uma seqüência de poliistidina, e semelhantes), ou uma seqüência útil para estabilizar ou estender a meia vida in vivo da proteína (tal como uma fusão de Ig ou uma fusão de albumina).

Em outro aspecto, a invenção fornece células compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. Tais células podem expressar um ou mais polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos da invenção.

A invenção também fornece vetores compreendendo quaisquer dos polinucleotídeos da invenção. Tais vetores podem compreender um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus, ou um fragmento de vírus. Tais vetores podem compreender um vetor de expressão, e se desejado, o ácido nucleico é operavelmente ligado a um promotor, incluindo aqueles discutidos neste lugar e abaixo. Além disso, em outro aspecto, a invenção fornece composições compreendendo um excipiente ou carreador e pelo menos um de quaisquer dos polinucleotídeos da invenção, ou vetores, células, ou hospedeiros compreendendo tais ácidos nucleicos. Tal composição pode ser composições farmacêuticas, e o excipiente ou carreador pode ser um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

A invenção também inclui composições compreendendo dois ou mais ácidos nucleicos da invenção, ou fragmentos destes (por exemplo como substratos para recombinação). A composição pode compreender uma biblioteca de ácidos nucleicos recombinantes, onde a biblioteca contém pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50, ou pelo menos 100 ou mais dos ácidos nucleicos descritos acima. Os ácidos nucleicos são opcionalmente clonados dentro de vetores de expressão, fornecendo bibliotecas de expressão.

Os polinucleotídeos da invenção e fragmentos destes, assim como vetores compreendendo tais polinucleotídeos, podem ser empregados para uso terapêutico ou profilático em combinação com um carreador adequado, tal como um carreador farmacêutico. Tais composições compreendem quantidade terapeuticamente efetiva e/ou profilaticamente do composto, e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tal carreador ou excipiente inclui, mas não é limitado a, salina, salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol, e combinações destes. A formulação deve se adequar ao modo de administração. Métodos de administrar ácidos nucleicos, polipeptídeos, e proteínas são bem conhecidos na técnica, e são adicionalmente discutidos abaixo.

A invenção também inclui composições produzidas digerindo um ou mais de quaisquer dos ácidos nucleicos da invenção com uma endonuclease de restrição, uma RNAase, ou uma DNAase (por exemplo como é realizado em certos dos formatos recombinantes observados acima); e composições produzidas fragmentando ou compartilhando um ou mais ácidos nucleicos da invenção por meios mecânicos (por exemplo sonicação, turbilhonamento, e semelhantes), que também podem ser usados para fornecer substratos para recombinação nos métodos descritos neste lugar. A invenção também fornece composições produzidas clivando pelo menos um de quaisquer dos ácidos nucleicos da invenção. A clivagem pode compreender clivagem mecânica, química ou enzimática, e a clivagem enzimática pode compreender clivagem com uma endonuclease de restrição, uma RNAase, ou uma DNAase.

Também são incluídas na invenção composições produzidas por um processo compreendendo incubar um ou mais dos ácidos nucleicos fragmentados da invenção na presença de ribonucleotídeo ou desoxiribonucleotídeo trifosfatos e uma polimerase de ácido nucleico. Esta composição resultante forma uma mistura recombinante para muitos dos formatos recombinantes observados acima. A polimerase de ácido nucleico pode ser uma RNA polimerase, uma DNA polimerase, ou uma DNA polimerase dirigida por RNA (por exemplo uma "transcriptase reversa"); a polimerase pode ser, por exemplo, uma DNA termostável polimerase (por exemplo, VENT, TAQ, ou semelhantes).

Similarmente, composições compreendendo conjuntos de oligonucleotídeos correspondendo a mais do que um ácido nucleico da invenção são úteis como substratos para recombinação e são uma característica da invenção. Para conveniência, estas misturas fragmentadas, compartilhadas, ou oligonucleotídeo sintetizadas são referidas como conjuntos de ácidos nucleicos fragmentados.

A invenção também fornece um ácido nucleico isolado ou recombinante codificando um polipeptídeo que exibe uma atividade de interferon-alfa, produzido por mutação ou recombinação de pelo menos um ácido nucleico da invenção. Fazendo Polinucleotídeos

Polinucleotídeos, oligonucleotídeos, e fragmentos de ácido nucleico da invenção põem ser preparados por métodos fase-sólida padrão, de acordo com métodos sintéticos conhecidos. Tipicamente, fragmentos de até cerca de 100 bases são sintetizados individualmente, e então reunidos (por exemplo, por métodos de ligação enzimáticos ou químicos, ou métodos de recombinação mediados por polimerase) para formar essencialmente qualquer seqüência contínua desejada. Por exemplo, os polinucleotídeos e oligonucleotídeos da invenção podem ser preparados por síntese química usando, por exemplo, método de fosforamidita clássico descrito por, por exemplo, Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-69, ou o método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO J 3:801-05, por exemplo, como é tipicamente praticado em métodos sintéticos automatizados. De acordo com o método de fosforamidita, oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, normalizados, ligados e clonados dentro de vetores apropriados.

Em adição, essencialmente qualquer polinucleotídeo pode ser encomendado a partir de qualquer de uma variedade de fontes comerciais, tal como Operon Biotechnologies Inc. (Huntsville, AL) e muitas outras. Similarmente, peptídeos e anticorpos podem ser encomendados costumeiramente de qualquer de uma variedade de fontes, tal como AnaSpec, Inc. (San Jose, CA).

Certos polinucleotídeos da invenção também podem ser obtidos triando bibliotecas de cDNA (por exemplo, bibliotecas geradas recombinando ácidos nucleicos homólogos como em métodos típicos de recombinação de seqüência recursiva) usando sondas de oligonucleotídeos que podem hibridizar com ou amplificar por PCR polinucleotídeos que codificam polipeptídeos interferon-alfa e fragmentos daqueles polipeptídeos. Procedimentos para triar e isolar clones de cDNA são bem conhecidos por aqueles de verso na técnica. Tais técnicas são descritas em, por exemplo, Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methos in Enzymol. Vol. 152, Acad. Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Sambrook, acima, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, acima. Alguns polinucleotídeos da invenção podem ser obtidos alterando uma seqüência naturalmente ocorrente, por exemplo, por mutagênese, recombinação de seqüência recursiva (por exemplo, embaralhamento), ou recombinação de oligonucleotídeo. Em outros casos, tais polinucleotídeos podem ser feitos em ambiente virtual ou através de métodos de recombinação de oligonucleotídeo como descrito nas referências citadas neste lugar.

Como descrito em mais detalhe neste lugar, os polinucleotídeos da invenção incluem polinucleotídeos que codificam polipeptídeos da invenção, seqüências de polinucleotídeos complementares a estas seqüências de polinucleotídeos, e polinucleotídeos que hibridizam sob pelo menos condições estringentes a seqüências definidas neste lugar. Uma seqüência de codificação se refere a uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo particular ou domínio, região, ou fragmento do dito polipeptídeo. Uma seqüência de codificação pode codificar (codificar para) um polipeptídeo da invenção exibindo uma atividade de interferon-alfa como descrito acima. Os polinucleotídeos da invenção podem ser na forma de RNA ou na forma de DNA, e incluem mRNA, cRNA, RNA sintético e DNA, e cDNA. Os polinucleotídeos podem ser de dupla fita ou de fita simples, e se de fita simples, pode ser fita de codificação ou fita não codificante (anti- senso, complementar). Os polinucleotídeos da invenção incluem a seqüência de codificação de um polipeptídeo da invenção (i) em isolamento, (ii) em combinação com uma ou mais seqüências de codificação adicionais, de forma a codificar, por exemplo, uma proteína de fusão, uma pré-proteína, uma prepo-proteína, ou semelhantes, (iii) em combinação com seqüências não codificantes, tal como íntrons, elementos de controle, tal como um promotor (por exemplo, promotor naturalmente ocorrente ou recombinante ou embaralhado), um elemento de terminação, ou regiões não traduzidas 5' e/ou 3' efetivas para expressão da seqüência de codificação em um hospedeiro adequado, e/ou (iv) em um vetor, célula, ou ambiente hospedeiro no qual a seqüência de codificação é um gene heterólogo.

Polinucleotídeos da invenção também podem ser encontrados em combinação com formulações composicionais típicas de ácidos nucleicos, incluindo na presença de carreadores, tampões, adjuvantes, excipientes, e semelhantes, como são conhecidos por aqueles de ordinário verso na técnica. Fragmentos de polinucleotídeos compreendem tipicamente pelo menos cerca de 200 bases de nucleotídeos, tal como pelo menos cerca de 250, 300, 350, 400, 450, 460, 470, ou mais bases. Os fragmentos de nucleotídeos de polinucleotídeos da invenção podem hibridizar sob condições altamente estringentes para uma seqüência de polinucleotídeos descrita neste lugar e/ou seqüências de aminoácidos codificadas tendo pelo menos uma das propriedades de polipeptídeos da invenção descritas neste lugar. Seqüências de Codificação Modificadas

Como será entendido por aqueles de ordinário verso na técnica, pode ser vantajoso modificar uma seqüência de codificação para estimular sua expressão em um hospedeiro particular. O código genético é redundante com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos usa preferivelmente um subconjunto destes códons. Os códons que são utilizados mais freqüentemente em uma espécie são considerados códons ótimos, e aqueles não utilizados muito freqüentemente são classificados como raros ou códons de baixa utilização (veja, por exemplo, Zhang, S. P. et al. (1991) Gene 105:61-72). Códons podem ser substituídos para refletir a utilização de códon preferida do hospedeiro, um processo algumas vezes chamado "otimização de códon" ou "controlando tendência de códon de espécie."

Seqüências de codificação modificadas contendo códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular (veja, por exemplo, Murray, E. et al. (1989) Nuc Acids Res 17:477-508; Griswold et al., (2003) Protein Expr. Purif. 27 (1): 134-42) podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de tradução ou produzir transcritos de RNA recombinantes tendo propriedades desejáveis, tal como uma meia vida maior, quando comparado com transcritos produzidos a partir de uma seqüência não otimizada. Códons de término de tradução também podem ser modificados para refletir preferência do hospedeiro. Por exemplo, códons terminadores preferidos para S. cerevisiae e mamíferos são UAA e UGA respectivamente. O códon terminador preferido para plantas monocotiledôneas é UGA, ao passo que insetos e E. coli preferem usar UAA como o códon terminador (Dalphin, M.E. et al. (1996) NucL Acids Res. 24:216-218).

As seqüências de polinucleotídeos da presente invenção podem ser manipuladas a fim de alterar uma seqüência de codificação da invenção por uma variedade de razões, incluindo mas não limitado a, alterações que modificam a clonagem, processamento e/ou expressão do produto do gene. Por exemplo, alterações podem ser introduzidas usando técnicas que são bem conhecidas na técnica, por exemplo, mutagênese sítio- direcionada, para inserir novos sítios de restrição, para alterar padrões de glicosilação, para introduzir ou remover grupos de ligação (por exemplo para peguilação ou outra conjugação), para mudar preferência de códon, para introduzir sítios de corte, etc. Variações Silenciosas

Por causa da degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer polipeptídeo dado. Por exemplo, inspeção da tabela de códon abaixo (Tabela 5) mostra que códons AGA, AGG, CGA, CGC, CGG e CGU todos codificam o aminoácido arginina. Assim, em qualquer posição em uma seqüência de ácidos nucleicos onde uma arginina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer dos códons correspondentes descritos acima sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas". E para ser entendido que U em uma seqüência de RNA corresponde a T em uma seqüência de DNA. Tabela 3 Tabela de Códon

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Será então perceptível para aqueles versados na técnica que devido à degenerescência do código genético, podem ser produzidas diversas seqüências de ácidos nucleicos codificando polipeptídeos da invenção, algumas das quais levam identidade de seqüência mínima com as seqüências de ácidos nucleicos explicitamente descritas neste lugar. Alguém de ordinário verso na técnica irá reconhecer que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG e UGC, que são ordinariamente os únicos códons para metionina e triptofano, respectivamente) pode ser modificado por técnicas padrão para codificar um polipeptídeo idêntico funcionalmente. Por conseguinte, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo é implícita em qualquer seqüência descrita. A invenção também fornece cada e toda variação possível de uma seqüência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo da invenção que pode ser feita selecionando combinações baseado em possíveis escolhas de códons. Estas combinações são feitas em conformidade com o código genético (por exemplo como exposto na Tabela 5) tripleto padrão (códon), quando aplicadas na seqüência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo da invenção. Todas tais variações de todo ácido nucleico neste lugar são especificamente fornecidas e descritas por consideração a seqüência em combinação com o código genético. Alguém de verso é plenamente capaz de gerar qualquer substituição silenciosa das seqüências listadas neste lugar.

Usando Polinucleotídeos

Os polinucleotídeos da invenção têm uma variedade de usos em, por exemplo, produção recombinante (isto é, expressão) dos polipeptídeos da invenção tipicamente através da expressão de um plasmídeo vetor de expressão compreendendo uma seqüência codificando o polipeptídeo ou fragmento deste; como terapêuticos, como profiláticos; como ferramentas de diagnóstico; como imunogenes; como adjuvantes; como sondas de diagnóstico para a presença de ácidos nucleicos complementares ou parcialmente complementares (incluindo para detecção de um ácido nucleico de interferon-alfa tipo selvagem), como substratos para reações adicionais, por exemplo, reações de recombinação de seqüência recursiva ou reações de mutação para produzir variantes novas e/ou melhoradas, e semelhantes.

Vetores, Promotores e Sistemas de Expressão

A presente invenção também inclui construtos recombinantes compreendendo uma ou mais seqüências de ácidos nucleicos como amplamente descrito acima. Os construtos compreendem um vetor, tal como, um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus, um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um cromossomo de levedura artificial (YAC), e semelhantes, onde a seqüência de ácido nucleico da invenção foi inserida, em uma orientação direta ou reversa. Em algumas instâncias, o construto compreende adicionalmente seqüências reguladoras, incluindo, por exemplo, um promotor, operavelmente ligado à seqüência de ácido nucleico. Grande número de vetores e promotores adequados é conhecido por aqueles de verso na técnica e é disponível comercialmente.

Textos gerais que descrevem técnicas biológicas moleculares úteis neste lugar, incluindo o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes, incluem Berger, acima·, Sambrook (1989); acima, e Ausubel, acima. Exemplos de técnicas suficientes para direcionar pessoas de verso, através de métodos de amplificação in vitro, incluindo a reação de cadeia de polimerase (PCR), a reação de cadeia de ligase (RCR), amplificação Qβ - replicase e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA), por exemplo, para a produção de ácidos nucleicos homólogos da invenção são encontrados em Berger, Sambrook e Ausubel, todos acima, assim como Mullis et al. (1987) Patente Norte-Americana No. 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal of NIH Research (1991) 3: 81- 94; (Kwoh et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 1173-1177; Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 1874-1878; Lomeli et al. (1989) J Clin Chem 35: 1826-1831; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560-569; Barringer et al. (1990) Gene 89: 117-122, e Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Métodos melhorados de clonagem in vitro de ácidos nucleicos amplificados são descritos em Wallace et al., Patente Norte-Americana No. 5.426.039. Métodos melhorados de amplificação de ácidos nucleicos grandes por PCR estão resumidos em Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 e nas referências aí dentro, nos quais PCR amplicons de até 40 quilobases são gerados. Alguém de verso irá perceber que essencialmente qualquer RNA pode ser convertido em um DNA de dupla fita adequado para digestão de restrição, expansão por PCR e seqüenciamento usando transcriptase e polimerase reversa. Veja Ausubel, Sambrook e Berger, todos acima.

A presente invenção também fornece células hospedeiras que são transduzidas com vetores da invenção, e a produção de polipeptídeo da invenção por técnicas recombinantes. Células hospedeiras são geneticamente manipuladas (por exemplo, transduzidas, transformadas ou transfectadas) com os vetores desta invenção, que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. O vetor pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, um fago etc. As células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas com meios nutritivos convencionais modificados como apropriado para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificar genes. As condições de cultura, como temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será perceptível para aqueles versados na técnica e nas referências citadas neste lugar, incluindo, por exemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York, e nas referências aí citadas.

Os polipeptídeos da invenção também podem ser produzidos em células não-animais, como vegetais, leveduras, fungos, bactérias e semelhantes. Em adição a Sambrook, Berger e Ausubel, detalhes em relação à cultura de células são encontrados em, por exemplo, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Spring Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg NY); Atlas & Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

Os polinucleotídeos da presente invenção e fragmentos destes podem ser incluídos em qualquer uma de uma variedade de vetores de expressão para expressar um polipeptídeo. Tais vetores incluem seqüências de DNA cromossômico, não-cromossômico e sintético, por exemplo, derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de leveduras, vetores derivados da combinação de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tal como vaccinia, adenovírus, vírus da síflis de galinha, pseudoraiva, vírus adeno-associados, retrovírus e muitos outros. Pode ser usado qualquer vetor que transduza material genético em uma célula, e, se replicação for desejada, que é replicável e viável no hospedeiro relevante.

A seqüência de ácidos nucleicos no vetor de expressão está operavelmente ligada à seqüência de controle de transcrição apropriada (promotor) para direcionar síntese de m-RNA. Exemplos de tais promotores incluem: promotor LTR ou SV40, promotor E. coli lac ou trp, promotor fago lambda P1, promotor CMV, e outros promotores conhecidos por controlar expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas e seus vírus. O vetor de expressão contém também um sítio de ligação de ribossomo para iniciar a tradução, e um terminador de transcrição. O vetor inclui opcionalmente seqüências apropriadas para amplificar expressão, por exemplo, um estimulador. Em adição, os vetores de expressão compreendem opcionalmente um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas, como dihidrofolato redutase ou resistência a neomicina para cultura de células eucarióticas, ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli.

O vetor contendo a seqüência de DNA apropriada codificando um polipeptídeo da invenção, assim como um promotor ou seqüência controle apropriados, podem ser empregados para transformar um hospedeiro apropriado para permitir o hospedeiro expressar o polipeptídeo. Exemplos de hospedeiros de expressão apropriados incluem: células bacterianas, como E. coli, Streptomyces, e Salmonella typhimurium; células fungicas, como Saccharomyces eerevisiae, Piehia pastoris e Neurospora crassa; células de insetos, como Drosophila e Spodoptera frugiperda\ células de mamíferos, como CHO, COS, BHK, HEK 293 ou melanoma de Bowes; células vegetais, etc. É para ser entendido que nem todas as células ou linhagens de células necessitam ser capaz de produzir peptídeos da invenção totalmente funcionais ou fragmentos destes; por exemplo, fragmentos antigênicos do polipeptídeo podem ser produzidos em um sistema de expressão bacteriano ou outro. A invenção não é limitada pelas células hospedeiras empregadas.

Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser selecionado dependendo do uso pretendido para o polipeptídeo ou fragmentos deste. Por exemplo, quando grandes quantidades de um polipeptídeo ou fragmentos deste são necessárias para a indução de anticorpos, podem ser necessários vetores que dirigem um alto nível de expressão de proteínas de fusão que são prontamente purificadas. Tais vetores incluem, mas não se limitam a, vetores multifuncionais de clonagem e expressão de E. eoli como BLUESCRIPT (Stratagene), no qual a seqüência de codificação do nucleotídeo pode ser ligada no vetor em quadro com seqüências para Met amino-terminal e os 7 resíduos subseqüentes de beta- galactosidase de modo a produzir uma proteína híbrida.; vetores pIN (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264: 5503-5509); vetores pET (Novagen, Madison WI); e semelhantes.

Similarmente, na levedura Saccharomyees eerevisiae diversos vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis tal como o fator alfa, álcool oxidase e PGH podem ser utilizados para a produção de polipeptídeos da invenção. Para revisões, veja Ausubel, acima, Berger, acima, e Grant et al. (1987) Methods in Enzimology 153: 516-544.

Em células hospedeiras de mamíferos, diversos sistemas de expressão, como sistemas baseados em vírus, podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, uma seqüência de codificação é opcionalmente ligada a um complexo transcrição/tradução de adenovírus consistindo do promotor tardio e seqüência líder tripartida. A inserção em uma região não-essencial El ou E3 do genoma viral resulta em um vírus viável capaz de expressar um polipeptídeo da invenção em células hospedeiras infectadas (Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655-3659). Em adição, estimuladores de transcrição, como o estimulador de vírus de sarcoma rous (RSV), são usados para aumentar expressão em células hospedeiras de mamíferos. Células hospedeiras, meios, sistemas de expressão e métodos de produção incluem aqueles conhecidos para clonagem e expressão de vários interferons-alfa de mamíferos (por exemplo, interferons-alfa humano). Elementos de Expressão Adicionais

Sinais de iniciação específicos podem auxiliar na tradução eficiente de um polinucleotídeo codificando seqüência da invenção e/ou de fragmentos desta. Estes sinais podem incluir, por exemplo, o códon de iniciação ATG e seqüências adjacentes. Em casos onde uma seqüência de codificação, seu códon de iniciação e seqüências anteriores são inseridos no vetor de expressão apropriado, nenhum sinal adicional de controle de tradução pode ser necessário. Todavia, em casos onde apenas a seqüência de codificação (por exemplo, uma seqüência de codificação de proteína madura), ou uma porção desta, é inserida, sinais de controle de transcrição de ácidos nucleicos exógenos, incluindo o códon de iniciação ATG devem ser fornecidos. Além disso, o códon de iniciação deve estar no quadro de leitura correto para assegurar a transcrição do inserto inteiro. Elementos transcricionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais como sintéticos. A eficiência da expressão pode ser estimulada pela inclusão de estimuladores apropriados no sistema celular em uso, (veja, por exemplo, ScharfD et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; e Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153: 516-544). Seqüências de Localização / Secreção

Polinucleotídeos codificando polipeptídeos da invenção também podem ser fusionados, por exemplo, em quadro com o ácido nucleico codificando uma seqüência de localização/secreção, para direcionar expressão de polipeptídeo a um compartimento celular desejado, membrana ou organela, ou para secreção do polipeptídeo direta para o espaço periplasmático ou no meio de cultura celular. Tais seqüências são conhecidas por aqueles de verso, e incluem líder de secreção ou peptídeos sinal, seqüências localizadoras de organelas (por exemplo seqüências de localização nuclear, sinais de retenção ER, seqüências de trânsito mitocondrial, seqüências de trânsito de cloroplastos), seqüências localização/ancoragem (por exemplo, seqüências terminadoras de transferência, seqüências de ancoragem GPI) e semelhantes.

Hospedeiros de Expressão

Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a células hospedeiras contendo quaisquer dos ácidos nucleicos, vetores, ou outros construtos da invenção descritos acima. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero, uma célula de levedura, ou uma célula vegetal, ou a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. Introdução do construto na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextran, eletroporação, pistola de gene ou vacina, injeção, ou outras técnicas comuns (veja, por exemplo, Davis, L., Dibner, M., and Battey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biology) para métodos in vivo, ex vivo ou in vitro.

Uma linhagem de células hospedeiras é opcionalmente escolhida por sua capacidade de modular a expressão das seqüências inseridas ou processar a proteína expressa da maneira desejada. Tais modificações da proteína incluem, mas não se limitam a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento pós-traducional que cliva uma forma da proteína "pré " ou "prepo " também pode ser importante para a correta inserção, dobramento e/ou função. Células hospedeiras diferentes, tal como E. coli, Bacillus sp., células de leveduras ou de mamíferos como CHO, HeLa, BHK, MDCK, HEK 293, WI38 etc., têm maquinário celular específico e mecanismos característicos para tais atividades pós-traducionais e podem ser escolhidas para assegurar a correta modificação e processamento da proteína exógena introduzida.

Expressão estável pode ser usada para produção a longo prazo de alto rendimento de proteínas recombinantes. Por exemplo, linhagens de células que expressam estavelmente um polipeptídeo da invenção são transduzidas usando vetores de expressão que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Seguindo a introdução do vetor, células podem ser deixadas para crescer por 1 -2 dias em um meio enriquecido antes de serem transferidas ao meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite crescimento e recuperação de células que expressam com sucesso as seqüências introduzidas. Por exemplo, conglomerados resistentes de células transformadas estavelmente podem ser proliferados usando técnicas de culturas de tecidos apropriadas ao tipo de célula.

Células hospedeiras transformadas com uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção são opcionalmente cultivadas sob condições adequadas à expressão e recuperação da proteína codificada a partir da cultura celular. O polipeptídeo produzido por uma célula recombinante pode ser secretado, ligado à membrana, ou contido intracelularmente, dependendo da seqüência e/ou do vetor usado. Como será entendido por aqueles de verso na técnica, vetores de expressão contendo polinucleotídeos codificando polipeptídeos da invenção podem ser projetados com seqüências sinais que direcionem secreção dos polipeptídeos maduros através de uma membrana de célula procariótica ou eucariótica.

Seqüências Adicionais

Os polinucleotídeos da presente invenção compreendem opcionalmente uma seqüência de codificação fusionada em quadro com uma seqüência marcadora que, por exemplo, facilita purificação e/ou detecção do polipeptídeo codificado. Tais subseqüências de purificação incluem, mas não são limitadas a, peptídeos de quelação de metal tal como módulos histidina- triptofano que permitem purificação em metais imobilizados, uma seqüência que liga glutationa (por exemplo GST), uma etiqueta de hemaglutinina (HA) (correspondendo a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza; Wilson, I. et al. (1984) Cell 37: 767), seqüências de proteínas ligando maltose, o epítopo FLAG utilizados no sistema de purificação de extensão/afinidade de FLAGS, e semelhantes. A inclusão de uma seqüência ligante de polipeptídeo protease-clivável entre o domínio de purificação e a seqüência de polipeptídeos é útil para facilitar a purificação.

Por exemplo, um vetor de expressão possível para o uso nas composições e métodos descritos neste lugar sustenta expressão de uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo da invenção fusionado a uma região de poliistidina separada por um sítio de clivagem de enteroquinase. Os resíduos de histidina facilitam purificação em IMIAC (cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado, como descrito em Porath et al. (1992) Protein Expression and Purification 3: 263-281) enquanto o sítio de clivagem de enteroquinase fornece um método para separar o polipeptídeo desejado da região de poliistidina. Vetores pGEX (Promega; Madison, WI) são opcionalmente usados para expressar polipeptídeos exógenos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas pela adsorção a ligante-microesferas de agarose (por exemplo, glutationa-agarose no caso de fusões GST) seguido por eluição na presença de ligante livre.

Uma construção adicional nas composições e métodos descritos neste lugar sustenta proteínas, e seus ácidos nucleicos codificantes, compreendendo polipeptídeos da invenção (ou um ou mais fragmentos destes), por exemplo, como descrito neste lugar, fusionado a uma molécula de Ig, por exemplo, dobradiça Fc de IgG humano ("fragmento cristalizável", ou ligação complementar de fragmento), domínio CH2 e domínio CH3 (e seqüências de nucleotídeos os codificando). Fc é a porção do anticorpo responsável por ligação aos receptores do anticorpo em células e ao componente Clq do complemento. Estas proteínas de fusão ou fragmentos destas e seus ácidos nucleicos codificantes são opcionalmente úteis como drogas profiláticas e/ou terapêuticas ou como ferramentas de diagnóstico (veja também, por exemplo, Challita-Eid, P. et ai. (1998) J Immunol 160: 3419-3426; Sturmhoefel, K. et al. (1999) Câncer Res 59: 4964-4972). Produção e Recuperação de Polipeptídeos

Após a transdução de uma linhagem hospedeira adequada e crescimento da linhagem hospedeira até uma densidade celular apropriada, o promotor selecionado é induzido por modos apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química) e as células são cultivadas por um período adicional. Células são tipicamente coletadas por centrifiigação, rompidas por modos físicos ou químicos, e o extrato bruto resultante é retido para posterior purificação. Células eucarióticas ou microbianas empregadas em expressão de proteínas podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclagem de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico, ou uso de agentes lisantes de célula, ou outros métodos, os quais são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Como observado, muitas referências estão disponíveis para a cultura e produção de muitas células, incluindo de origem bacteriana, vegetal, animal (especialmente de mamíferos) e arqueobacteriana. Veja, por exemplo, Sambrook, Ausubel e Berger (todos acima), assim como Freshne (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York e referências aí citadas; Doyle and Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition, W.H. Freeman and Company; e Ricciardelli et al. (1989) In vitro Cell Dev Biol 25: 1016- 1024. Para cultura e regeneração de células vegetais veja, por exemplo, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley and Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer Verlag (Berlin Heidelberg New York) e Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN O 12 198370 6. Meios de cultura celular em geral são expostos em Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Informação adicional para cultura de células é encontrada em literatura comercial disponível, tais como o Life Science Research Cell Cuture Catalogue de Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO) ("Sigma-LSRCCC") e, por exemplo, o Plant Culture Catalogue e seu suplemento, também de Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO) ("Sigma-PCCS").

Polipeptídeos da invenção podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por qualquer um de diversos métodos bem conhecidos na técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade (por exemplo, usando qualquer dos sistemas de etiquetagem assinalados neste lugar), cromatografia de hidroxiapatita, e cromatografia de lectina. Etapas para redobramento de proteínas podem ser usadas, como desejados, para complementar configuração da proteína madura ou de fragmentos destas. Finalmente, a cromatografia líquida de alta performance (HPLC) pode ser empregada nos etapas finais da purificação. Além das referências assinaladas, acima., diversos métodos de purificação são bastante conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles expostos em Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Aproach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification Principies and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; e Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

Sistemas de Expressão In vitro

Sistemas de transcrição/tradução livres de células também podem ser empregados para produzir polipeptídeos da invenção usando polinucleotídeos da presente invenção. Diversos tais sistemas estão disponíveis comercialmente. Um guia geral para protocolos de transcrição e tradução in vitro é encontrado em Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volume 37, Garland Publishing, NY.

Usos e Aplicações In Vivo

Polinucleotídeos que codificam um polipeptídeos da invenção, ou complementos dos polinucleotídeos (incluindo por exemplo, moléculas anti-sentido e ribozima), são opcionalmente administrados a uma célula para efetuar um processo terapeuticamente útil ou para expressar um produto terapeuticamente útil. Estas aplicações in vivo, incluem terapia gênica, incluem uma diversidade de técnicas pelas quais a expressão dos genes pode ser alterada em células. Tais métodos incluem, por exemplo, a introdução de genes para a expressão de, por exemplo, polipeptídeos úteis terapeuticamente e/ou profilaticamente, tal como os polipeptídeos da presente invenção.

Expressão Polipeptídica In Vivo

Polinucleotídeos codificando polipeptídeos da invenção são particularmente úteis em aplicações terapêuticas in vivo, utilizando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, células cultivadas são manipuladas ex vivo com pelo menos um polinucleotídeo (DNA ou RNA) da invenção e/ou outras seqüências de polinucleotídeos codificando, por exemplo, pelo menos um de um antígeno, citocina, outra molécula co-estimuladora, adjuvante, etc, e semelhantes, com as células manipuladas sendo, então, retornadas ao paciente. Células podem ser manipuladas, ainda, in vivo para a expressão de um ou mais polipeptídeos in vivo, incluindo polipeptídeos e/ou peptídeos antigênicos da invenção.

Diversos vetores virais adequados para transdução e expressão no organismo in vivo são conhecidos. Tais vetores incluem vetores retrovirais (veja por exemplo, Miller, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158: 1-24; Salmons and Gunzburg (1993) Human Gene Therapy 4: 129-141; Miller et ai. (1994) Methods in Enzymology 217: 581-599) e vetores adeno-associados (revisados em Carter (1992) Curr Opinion Biotech 3: 533-539; Muzcyzka (1992) Curr Top Microbiol Immunol 158: 97-129). Outros vetores virais que são usados incluem vetores adenovirais, vetores de herpes viral e vetores virais de Sindbis, como geralmente descrito em, por exemplo, Jolly (1994) Câncer Gene Therapy 1: 51-64; Latchman (1994) Molec Biotechnol 2: 179- 195; e Johanning et al. (1995) Nucl Acids Res 23: 1495-1501.

Em um aspecto, um vetor de vírus de síflis pode ser usado. O vetor viral de síflis é transfectado com uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo da invenção, tal como um polipeptídeo eIL-2, e é útil em aplicações profiláticas, terapêuticas e diagnosticas, onde estimulação de uma resposta imune, tal como proliferação de células T aumentada ou melhorada, é desejado. Veja vetores virais discutidos em, por exemplo, Berencsi et al., J Infect Dis (2001)183(8): 1171-9; Rosenwirth et al., Vaccine 2001 Feb 8;19(13-14):1661-70; Kittlesen et al., J Immunol (2000) 164(8):4204-11; Brown et al. Gene Ther 2000 7(19): 1680-9; Kanesa-thasan et al., Vaeeine (2000) 19(4-5):483-91; Sten (2000) Drug 60(2):249-71. Composições compreendendo tais vetores e um excipiente aceitável também são uma característica da invenção.

Terapia gênica e vacinas genéticas fornecem métodos para combater doenças infecciosas crônicas (por exemplo, infecção por HIV, hepatite viral), assim como doenças não infecciosas, incluindo câncer e algumas formas de defeitos congênitos, tal como deficiências enzimáticas, e tais métodos podem ser empregados com polinucleotídeos da invenção, incluindo, por exemplo, vetores e células compreendendo tais polinucleotídeos. Diversas abordagens para introduzir ácidos nucleicos e vetores dentro de células in vivo, ex vivo e in vitro foram usadas e podem ser empregadas com polinucleotídeos da invenção e vetores compreendendo tais polinucleotídeos. Estas abordagens incluem a transferência de genes baseada em lipossomo (Debs and Zhu (1993) WO 93/24640 e Patente Norte- Americana No. 5.641.662; Mannino and Gould-Forgerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose, Patente Norte-Americana No. 5.279.833; Brigham (1991) WO 91/06309; e Felgner et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413-7414; Brigham et al. (1989) Am J Med Sci 298: 278-281; Nabel et al. (1990) Science 249: 1285-1288; Hazinski et al. (1991) Am J resp Cell Molec Biol 4: 206-209; e Wang and Huang (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7851-7855); transferência de gene mediada por vetor adenoviral; por exemplo, para tratar câncer (ver, por exemplo, Chen et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 3054-3057; Tong et al. (1996) Gynecol Oncol 61: 175- 179; Clayman et al. (1995) Câncer Res 5: 1-6; 0'Malley et al. (1995) Câncer Res 55: 1080-1085; Hwang et al. (1995) Am J Respir Cell Mol Biol 13: 7-16; Haddada et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt. 3):297-306; Addison et al. (1995) Proe Natl Aead Sei USA 92: 8522-8526; Colak et al. (1995) Brain Res 691: 76-82; Crystal (1995) Science 270: 404-410; Elshami et al. (1996) Human Gene Ther 7: 141-148; Vincent et al. (1996) J Neurosurg 85: 648-654), e muitas outras. Vetores retrovirais de replicação defeituosa abrigando seqüências de polinucleotídeos terapêuticas como parte do genoma retroviral também foram usadas, particularmente em relação a vetores MuLV simples. Veja, por exemplo, Miller et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res 4:43; e Cornetta et al. (1991) Hum Gene Ther 2:215). Transporte de ácidos nucleicos acoplados a sistemas de transporte baseados em cátion, ligantes-específicos (Wu and Wu (1988) J Biol Chem, 263: 14621-14624) também foram usados. Vetores de expressão de DNA expostos também foram descritos (Nabel et al. (1990) acima)·, Wolff et al. (1990) Science, 247: 1465-1468). Em geral, estas abordagens podem ser adaptadas à invenção pela incorporação de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos da invenção nos vetores apropriados.

Textos gerais que descrevem protocolos de terapia gênica, que podem ser adaptados à presente invenção introduzindo os ácidos nucleicos da invenção em pacientes, incluem, por exemplo, Robbins (1996) Gene Therapy Protocols, Humana Press, NJ, e Joyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England. Tecnologia Anti-sentido

Em adição à expressão dos ácidos nucleicos da invenção como ácidos nucleicos substituintes de genes, os ácidos nucleicos também são úteis para supressão sentido e anti-sentido da expressão, por exemplo, para regular para baixo expressão de um ácido nucleico da invenção, uma vez, ou quando, a expressão de ácidos nucleicos não é mais desejada na célula. Similarmente, os ácidos nucleicos da invenção, ou subseqüências ou seqüências anti-sentido destes, também podem ser usados para bloquear a expressão de ácidos nucleicos homólogos naturalmente ocorrentes. Diversas tecnologias sentido e anti-sentido são conhecidas na técnica, por exemplo, como exposto em Lichtenstein and Nelen (1997) Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press at Oxford University, England, e em Agrawal (1996) Antisense Therapeutics Humana Press, NJ, e nas referências aí citadas. Uso como Sondas

Também contemplados são usos de polinucleotídeos, também referidos neste lugar como oligonucleotídeos, tendo tipicamente pelo menos 12 bases, preferivelmente pelo menos 15, mais preferivelmente pelo menos 20, pelo menos 30, ou pelo menos 50 ou mais bases, que hibridizam sob condições altamente estringentes a um polinucleotídeo da invenção ou fragmentos deste. Os polinucleotídeos podem ser usados como sondas, iniciadores, agentes sentido e anti-sentido, e semelhantes, de acordo com os métodos como observado acima.

USOS TERAPÊUTICOS

Vários polipeptídeos interferon-alfa e conjugados de interferon-alfa foram aprovados ou estão atualmente em desenvolvimento clínico para tratamento de uma variedade de condições tais como Hepatite C Crônica, Hepatite B Crônica, Leucemia de Célula Cabeluda, Melanoma maligno, Linfoma Folicular, Condiloma Acuminado, Sarcoma de Kaposi relacionado à AIDS, Linfoma não Hodgkin, Leucemia Mielógena Crônica, Carcinoma de Célula Basal, Mieloma Múltiplo, tumores carcinóides, câncer de bexiga, Doença de Crohn, Linfoma de Célula T Cutâneo, Carcinoma de Célula Renal, Esclerose Múltipla, e AIDS. Por conseguinte, a presente invenção inclui um método de tratar uma condição que é responsiva a interferon-alfa, tal como por exemplo uma condição descrita acima, compreendendo administrar a um sujeito afligido pela condição uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção ou um conjugado da invenção em uma quantidade efetiva para melhorar um sintoma associado com a condição. A invenção também inclui o uso de uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção ou um conjugado da invenção (isto é, uma "composição da invenção") para tratar uma condição que é responsiva a interferon-alfa, tal como uma condição descrita acima, ou qualquer outra condição que é responsiva a um polipeptídeo da invenção ou um conjugado da invenção.

Tratamento de Infecções Virais e Condições Associadas com Infecção Viral

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um sujeito infectado com um vírus, compreendendo administrar ao sujeito uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para diminuir o nível do vírus no sujeito e/ou para melhorar um sintoma ou condição associada com a infecção viral. Infecções virais exemplares contempladas para métodos de tratamento da invenção incluem, mas não são limitadas a, infecção por um vírus da família Flaviviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite C, Vírus da Febre Amarela, Vírus do Oeste do Nilo, Vírus da Encefalite Japonesa, Vírus da Dengue, ou Vírus da Diarréia Viral Bovina; infecção por um vírus da família Hepadnaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Hepatite B; infecção por um vírus da família Picornaviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Encefalomiocardite, Rinovírus Humano, e Vírus da Hepatite A; infecção por um vírus da família Retroviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Imunodeficiência Humana, Vírus da Imunodeficiência Símia, Vírus Linfotrópico-T Humano, e Vírus do Sarcoma Rous; infecção por um vírus da família Coronaviridae, tal como, por exemplo, coronavírus SARS; infecção por um vírus da família Rhabdoviridae, tal como, por exemplo, Vírus da Raiva e Vírus da Estomatite Vesicular; infecção por um vírus da família Paramyxoviridae, tal como, por exemplo, Vírus Sincial Respiratório e Vírus de Parainfluenza; infecção por um vírus da família Papillomaviridae, tal como, por exemplo, Papilomavírus Humano; e infecção por um vírus da família Herpesviridae, tal como, por exemplo, Vírus do Herpes Simples.

O seguinte fornece exemplos não limitantes para tratamento de infecções virais exemplares e doenças e condições associadas com tais infecções usando polipeptídeos e conjugados da invenção, incluindo tabelas de dosagem sugeridas para polipeptídeos e conjugados da invenção e abordagens para monitorar a eficácia de tais tratamentos. As tabelas de dosagem de polipeptídeos ou conjugados da invenção para o tratamento de outras infecções virais e doenças e condições associadas com infecções virais, e abordagens para monitorar a eficácia de tais tratamentos, é determinável por um versado na técnica.

Vírus da Hepatite C

Em um aspecto a invenção fornece um método de tratar um paciente infectado com Vírus da Hepatite C (HCV), compreendendo administrar ao paciente uma quantidade efetiva de uma composição da invenção compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção. A invenção também fornece uma composição para uso no tratamento de um paciente infectado com HCV, compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um paciente diagnosticado como infectado com HCV inclui um paciente exibindo RNA de HCV no sangue e/ou exibindo anticorpo anti-HCV no soro.

Uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HCV usando polipeptídeos interferon-alfa clinicamente aprovados, tal como, por exemplo ROFERON®- A (Interferon alfa-2a, recombinante; Hoffinann-La Roche Inc.), INTRON® A (Interferon alfa-2b, recombinante; Schering Corporation), e INFERGEN® (interferon alfacon-1; InterMune, Inc.). Tabelas de dosagem recomendadas exemplares de ROFERON ou INTRON A para o tratamento de HCV crônica é 3 milhões IU (aproximadamente 15 microgramas (mcg)) três vezes por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas. Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de INTERGEN para o tratamento de HCV crônica é 9 mcg três vezes por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas. Dependendo do número de fatores (incluindo mas não limitado à atividade e farmacocinética do polipeptídeo da invenção e o tamanho e saúde do paciente), o polipeptídeo pode ser administrado em quantidades inferiores (tal como, por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 mcg) e/ou menos freqüentemente (tal como uma vez por semana ou duas vezes por semana) do que descrito acima.

Da mesma forma, uma composição compreendendo um conjugado da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HCV usando conjugados de interferon-alfa clinicamente aprovados, tal como, por exemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a; Hoffrnann-La Roche, Inc.) ou PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b; Schering Corporation). Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de PEGASYS para o tratamento de HCV crônica é 180 mcg uma vez por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas. Dependendo de diversos fatores (incluindo mas não limitados a peso molecular, atividade, e farmacocinética do conjugado da invenção e o tamanho e saúde do paciente), o conjugado pode ser administrado em quantidades inferiores (tal como, por exemplo, cerca de 25, 50, 75, 100, 125, ou 150 mcg) e/ou menos freqüentemente (tal como uma vez a cada dez dias, ou uma vez a cada 2 semanas) do que descrito acima.

Em algumas instâncias o polipeptídeo ou conjugado da invenção é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser administrado em combinação com uma molécula pequena de droga antiviral tal como Ribavirina, que é vendida sob os nomes COPEGUS® (Hoffmann-La Roche, Inc.) e REBETOL® (Schering Corporation). Alternativamente, ou em adição a uma molécula pequena de droga antiviral, o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser administrado em combinação com uma ou mais citocinas adicionais, tal como, por exemplo, IFN-gama, que é vendida sob o nome Actimmune® (interferon gama-lb; InterMune, Inc.), IL-2, que é vendida sob o nome PROLEUKIN® IL-2 (interleucina-2 humana recombinante aldesleucina (rhIL-2); Chiron Corp.), ou IL-12 (interleucina-12).

A quantidade e freqüência precisas de administração do polipeptídeo ou conjugado da invenção irão depender de diversos fatores tal como a atividade específica e as propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo ou do conjugado, assim como a natureza da condição sendo tratada (tal como, o genótipo do Vírus da Hepatite C sendo tratado), entre outros fatores conhecidos por aqueles de verso na técnica. Normalmente, a dose deve ser capaz de prevenir ou diminuir a severidade ou espalhamento da indicação sendo tratada. Uma tal dose pode ser denominada uma quantidade "efetiva" ou "terapeuticamente efetiva". Será perceptível para aqueles de verso na técnica que uma quantidade efetiva de um polipeptídeo, conjugado ou composição da invenção depende, entre outras coisas, da condição sendo tratada, da dose, da tabela de administração, se o polipeptídeo ou conjugado ou composição é administrado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos, da meia vida no soro, e de outras propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo, conjugado ou composição, assim como do tamanho, idade e saúde geral do paciente. A dosagem e freqüência de administração são determináveis por um versado na técnica usando técnicas conhecidas.

A efetividade de tratamento pode ser determinada medindo carga viral, por exemplo determinando o título ou nível de vírus em soro ou plasma usando métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, monitorando os níveis de RNA viral usando testes quantitativos baseados em PCR5 tal como o COBAS AMPLICOR® HCV Test, v2.0 ou o COBAS AMPLICOR HCV MONITOR® Test, v2.0 (ambos de Roche Diagnostics). Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma que é suficiente para atingir uma redução em carga viral por pelo menos 2 unidades log, pelo menos 3 unidades log, pelo menos 4 unidades log, pelo menos 5 unidades log, pelo menos 6 unidades log ou pelo menos 7 unidades log no decurso do tratamento, comparado com a carga viral antes do tratamento (que é geralmente na extensão de 10 -10 cópias de RNA HCV/ml para pacientes de HCV crônica). Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir carga viral para níveis que são essencialmente indetectáveis, tal como, por exemplo, menos do que cerca de 500 cópias/ml soro ou menos do que cerca de 100 cópias/ml de soro. A invenção inclui um método de reduzir o nível de RNA de HCV em soro de um paciente infectado com HCV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de RNA de HCV comparado com o nível de RNA de HCV presente antes do início do tratamento.

A efetividade de tratamento pode alternativamente ou em adição ser determinada medindo um parâmetro indicativo de uma condição associada com infecção por HCV, tal como, por exemplo, lesão hepática. Por exemplo, o nível de alanina aminotransferase no soro (ALT) pode ser medido usando um ensaio padrão. Em geral, um nível ALT de menos do que cerca de 50 unidades internacionais/ml (IU/ml) de soro é considerado normal. Um nível ALT mais alto pode ser indicativo de lesão hepática em curso. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade efetiva para reduzir nível ALT, em um paciente com um nível ALT mais alto do que o normal, para menos do que cerca de 50 RJ/ml de soro. Assim, a invenção inclui um método de reduzir o nível de ALT no soro de um paciente infectado com HCV exibindo um nível inicial de ALT no soro maior do que 50 IU/ml, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de ALT para menos do que cerca de 50 IU/ml.

Vírus da Imunodeficiência Humana

Em outro aspecto a invenção fornece um método de tratar um paciente infectado com Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), tal como HIV-I ou HIV-2, ou uma doença ou condição associada com infecção por HIV, tal como, por exemplo, sarcoma de Kaposi relacionado a AIDS, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade efetiva de uma composição da invenção compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção, opcionalmente em associação com outros agentes terapêuticos antivirais como descrito abaixo. A invenção também fornece uma composição para uso no tratamento de um paciente infectado com HIV ou uma doença ou condição associada com infecção por HIV, compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um paciente diagnosticado como infectado com HIV inclui um paciente exibindo níveis detectáveis de RNA de HIV ou DNA proviral no sangue e/ou exibindo níveis detectáveis de antígeno p24 ou anticorpo anti-HIV em soro.

Uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HIV usando polipeptídeos interferon-alfa, tal como, por exemplo ROFERON®-A (Interferon alfa-2a, recombinante; Hoffinann-La Roche Inc.), INTRON® A (Interferon alfa-2b, recombinante; Schering Corporation), e INFERGEN® (interferon alfacon-1; InterMune, Inc.). Como foi observado acima, tabelas de dosagens recomendadas exemplares de ROFERON ou INTRON A para o tratamento de HCV crônica é 3 milhões IU (aproximadamente 15 microgramas (mcg)) três vezes por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas, e uma tabela de dosagem recomendada exemplar de INTERGEN para o tratamento de HCV crônica é 9 mcg três vezes por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas. Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de ROFERON para o tratamento de sarcoma de Kaposi relacionado à AIDS é 36 milhões de unidades diariamente por 10 a 12 semanas, depois 36 milhões de unidades 3 vezes por semana. Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de INTRON A para o tratamento de sarcoma de Kaposi relacionado à AIDS é 30 milhões IU/m2 três vezes por semana administrados subcutaneamente. Tais tabelas de dosagem fornecem extensões úteis para dosagem de um polipeptídeo da invenção para o tratamento de HIV ou uma doença ou condição associada com infecção por HIV. Dependendo de diversos fatores (incluindo mas não limitados à atividade e farmacocinética do polipeptídeo da invenção e o tamanho, idade e saúde do paciente), o polipeptídeo pode ser administrado em quantidades inferiores e/ou menos freqüentemente do que descrito acima.

Da mesma forma, uma composição compreendendo um conjugado da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HIV usando conjugados de interferon-alfa, tal como, por exemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a; Hoffmann-La Roche, Inc.) ou PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b; Schering Corporation). Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de PEGASYS para o tratamento de HIV é entre cerca de 1,0 mcg/kg/semana e 3,0 mcg/kg/semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas. Uma tal tabela de dosagem fornece uma extensão útil para dosagem de um conjugado da invenção para o tratamento de HIV. Dependendo de diversos fatores (incluindo mas não limitados a peso molecular, atividade, e farmacocinética do conjugado da invenção e o tamanho, idade e saúde do paciente), o conjugado pode ser administrado em quantidades inferiores (tal como, por exemplo, cerca de 0,1, 0,25, 0,50, ou 0,75 mcg/kg/semana) e/ou menos freqüentemente (tal como uma vez a cada 10 dias, ou uma vez a cada 2 semanas) do que descrito acima.

Em algumas instâncias o polipeptídeo ou conjugado da invenção é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Tratamentos clínicos atuais de infecção por HTV-I em homem incluem terapias de combinação de múltiplas drogas denominada Terapia Antiretroviral Altamente Ativa ("HAART"). O polipeptídeo ou conjugado da invenção pode assim ser administrado em combinação com HAART ou outros compostos terapêuticos antivirais. Componentes típicos de HAART, que envolvem várias combinações de nucleosídeos inibidores de transcriptase reversa ("NRTI") e não nucleosídeos inibidores de transcriptase reversa ("NNRTI") e inibidores de protease de HIV ("PI"), são descritos, por exemplo, em A.M. Vandamme et al. (1998) Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 9:187-203; "Drugs for HIV Infection" in The Medicai Letter Vol. 39 (Issue 1015) December 5, 1997, pages 111-116; e Pedido de Patente Norte-Americana publicado US 20020182179 Al; cada um dos quais incorporado pela referência neste lugar. Se o paciente infectado por HIV é também infectado por HCV, o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser administrado em combinação com uma droga antiviral tal como Ribavirina, que é vendida sob os nomes COPEGUS® (Hoffmann-La Roche, Inc.) e REBETOL® (Schering Corporation), juntamente com HAART.

A quantidade e freqüência precisas de administração do polipeptídeo ou conjugado da invenção, e administração de agentes terapêuticos adicionais tal como HAART e/ou Ribavirina, irá depender de diversos fatores tal como a atividade específica e as propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo ou do conjugado, assim como a natureza da condição sendo tratada (tal como, a presença de infecções virais adicionais tal como HCV), entre outros fatores conhecidos por aqueles de verso na técnica. Normalmente, a dose deve ser capaz de prevenir ou diminuir a severidade ou espalhamento da indicação sendo tratada. Tal dose pode ser denominada uma quantidade "efetiva" ou "terapeuticamente efetiva". Será perceptível para aqueles de verso na técnica que uma quantidade efetiva de um polipeptídeo, conjugado ou composição da invenção depende, entre outras coisas, da condição sendo tratada, da dose, da tabela de administração, se o polipeptídeo ou conjugado ou composição é administrado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos, da meia vida no soro e outras propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo, conjugado ou composição, assim como do tamanho, idade e saúde geral do paciente. A dosagem e freqüência de administração são determináveis por um versado na técnica usando técnicas conhecidas.

Em adição aos usos gerais descritos acima, um polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser administrado aos seguintes subconjuntos de pacientes infectados com HIV: como uma terapia adjuvante, por exemplo para HAART como descrito acima; como monoterapia ou terapia de combinação em pacientes em estágios iniciais quando a carga viral é geralmente alta; como um agente imunodulador e antiviral combinado para pacientes passando por interrupções de tratamento estruturadas (STI) ou "férias de droga"; como terapia de resgate em pacientes cujas opções HAART são limitadas; como um método antiviral de tratamento para manter carga viral sob controle sem iniciar terapia HAART a fim de atrasar o aparecimento de vírus resistentes a HAART.

A efetividade de tratamento pode ser determinada medindo a carga viral, por exemplo determinando o título ou nível de vírus no soro ou plasma usando métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, monitorando os níveis de RNA viral HIV-I usando testes quantitativos baseados em RT-PCR, tal como o AMPLICOR HIV-I MONITOR® Test, ν 1.5 (Roche Diagnostics). Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma que é suficiente para atingir uma redução na carga viral por pelo menos 0,5 unidade log, pelo menos 1 unidade log, pelo menos 2 unidades log, pelo menos 3 unidades log, pelo menos 4 unidades log, pelo menos 5 unidades log, pelo menos 6 unidades log ou pelo menos 7 unidades log no decurso do tratamento, comparado com a carga viral antes de tratamento. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir carga viral para níveis que são essencialmente indetectáveis, tal como, por exemplo, menos do que cerca de 50-100 cópias de RNA de HTV-I por ml de soro. A invenção inclui um método de reduzir o nível de RNA de HIV no soro de um paciente infectado com HIV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de RNA de HIV comparado com o nível de RNA de HIV presente antes do início de tratamento.

A efetividade de tratamento pode alternativamente ou em adição ser determinada por um marcador de soro para replicação de HIV, tal como a presença do antígeno p24 de HIV no sangue. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o nível de antígeno p24 no sangue para 50%, 25%, 10% ou 5% do nível presente antes do início de tratamento. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o nível de antígeno p24 para um nível que é essencialmente indetectável. A invenção inclui um método de reduzir o nível de antígeno p24 em soro de um paciente infectado com HIV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de antígeno p24 comparado com o nível de antígeno p24 presente antes do início de tratamento. Vírus da Hepatite B

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratar um paciente infectado com Vírus da Hepatite B (HBV), compreendendo administrar ao paciente uma quantidade efetiva de uma composição da invenção compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção. A invenção também fornece uma composição para uso no tratamento de um paciente infectado com HBV, compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Um paciente diagnosticado como infectado com HBV exibe antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg) detectável no soro. Infecção por HBV crônica é adicionalmente categorizada ou como "replicativa" ou "não- replicativa". Em infecção replicativa, o paciente normalmente tem uma concentração de DNA viral no soro relativamente alta e HBsAg detectável, que é uma proteína processada alternativamente de gene pré-core de HBV que é sintetizado sob condições de alta replicação viral. Entretanto, em linhagens raras de HBV com mutações no de gene pré-core, infecção replicativa pode ocorrer na ausência de HbsAg no soro detectável. Pacientes com hepatite B crônica e infecção replicativa têm um prognóstico pior geralmente e uma maior chance de desenvolver cirrose e/ou carcinoma hepatocelular do que aqueles sem HBsAg. Em infecção não replicativa, a taxa de replicação viral é baixa, concentração de DNA HBV no soro é geralmente baixa e antígeno Be de hepatite (HBeAg) não é detectado.

Uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HBV usando polipeptídeos interferon-alfa clinicamente aprovados, tal como, por exemplo INTRON® A (Interferon alfa-2b, recombinante; Schering Corporation). Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de INTRON A para o tratamento de HBV crônico em adultos é 30 a 35 milhões IU por semana por injeção subcutânea ou intramuscular, ou como 5 milhões IU por dia (qd) ou como 10 milhões IU três vezes por semana (tiw) por 16 semanas. Dependendo do número de fatores (incluindo, mas não limitado a, a atividade e farmacocinética do polipeptídeo da invenção, e o tamanho e saúde do paciente), o polipeptídeo pode ser administrado em quantidades inferiores (tal como, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25 milhões IU por semana) e/ou menos freqüentemente (tal como uma vez por semana ou duas vezes por semana) do que descrito acima.

Da mesma forma, uma composição compreendendo um conjugado da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HBV usando conjugados de interferon-alfa atualmente passando por experimentos clínicos, tal como, por exemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a; Hoffmann-La Roche, Inc.). Tabelas de dosagem exemplares de PEGASYS para o tratamento de HBV crônico é entre 90 mcg-270 mcg injetados uma vez por semana para um total de 24 semanas. Dependendo de diversos fatores (incluindo mas não limitados a peso molecular, atividade, e farmacocinética do conjugado da invenção e o tamanho e saúde do paciente), o conjugado pode ser administrado em quantidades inferiores (tal como, por exemplo, cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, ou 200 mcg) e/ou menos freqüentemente (tal como uma vez a cada 10 dias, ou uma vez a cada 2 semanas) do que descrito acima.

Em algumas instâncias o polipeptídeo ou conjugado da invenção é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser administrado em combinação com drogas antivirais tal como lamivudina (também conhecida como 3TC), que é vendida sob o nome Epivir-HBV® (GlaxoSmithKline), ou adefovir dipivoxil, que é vendido sob o nome Hepsera® (Gilead Sciences).

A quantidade e freqüência precisas de administração do polipeptídeo ou conjugado da invenção irão depender de diversos fatores tal como a atividade específica e as propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo ou do conjugado, assim como a natureza da condição sendo tratada (tal como, por exemplo no caso de infecção por HBV crônica, se a infecção é replicativa ou não replicativa), entre outros fatores conhecidos por aqueles de verso na técnica. Normalmente, a dose deve ser capaz de prevenir ou diminuir a severidade ou espalhamento da indicação sendo tratada. Tal dose pode ser denominada uma quantidade "efetiva" ou "terapeuticamente efetiva". Será perceptível para aqueles de verso na técnica que uma quantidade efetiva de um polipeptídeo, conjugado ou composição da invenção depende, entre outras coisas, da condição sendo tratada, da dose, da tabela de administração, se o polipeptídeo ou conjugado ou composição é administrado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos, da meia vida no soro, e de outras propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo, conjugado ou composição, assim como do tamanho, idade e saúde geral do paciente. A dosagem e freqüência de administração são determináveis por um versado na técnica usando técnicas conhecidas.

A efetividade de tratamento pode ser determinada por exemplo medindo a carga viral, por exemplo o nível de DNA viral no soro ou plasma, usando métodos conhecidos na técnica. Métodos para monitorar os níveis de DNA HBV incluem testes quantitativos baseados em PCR, tal como o COBAS AMPLICOR HBV MONITOR® Test, v2.0 ou o AMPLICOR HBV MONITOR® Test, v2.0 (ambos de Roche Diagnostics). Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir DNA viral para, por exemplo menos do que cerca de 500.000 cópias/ml de soro ou menos do que cerca de 100.000 cópias/ml de soro ou menos do que cerca de 10.000 cópias/ml de soro, ou para níveis que são essencialmente indetectáveis (tal como, por exemplo, menos do que cerca de 1000 cópias/ml de soro, menos do que cerca de 500 cópias/ml de soro, ou menos do que cerca de 200 cópias/ml de soro). A invenção inclui um método de reduzir o nível de DNA de HBV em soro de um paciente infectado com HBV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de DNA de HBV comparado com o nível de DNA de HBV presente antes do início de tratamento.

A efetividade de tratamento pode alternativamente ou em adição ser determinada medindo outro marcador de soro para replicação de HBV, tal como HBeAg. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o nível de HBeAg no soro para 50%, 25%, 10% ou 5% do nível presente antes do início de tratamento. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o nível de HBeAg para um nível que é essencialmente indetectável. A invenção inclui um método de reduzir o nível de HBeAg em soro de um paciente infectado com HBV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de HBeAg comparado com o nível de HBeAg presente antes do início de tratamento.

Como discutido acima, outro marcador de soro indicativo de infecção por HBV é HbeAg. Assim, a efetividade do tratamento pode alternativamente ou em adição ser determinada medindo o nível de HBeAg no soro. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o nível de HBeAg no soro para 50%, 25%, 10% ou 5% do nível presente antes do início de tratamento. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o nível de HBeAg para um nível que é essencialmente indetectável. A invenção inclui um método de reduzir o nível de HBeAg em soro de um paciente infectado com HBV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de HBeAg comparado com o nível de HBeAg presente antes do início de tratamento.

A efetividade de tratamento pode alternativamente ou em adição ser determinada medindo um parâmetro indicativo de uma condição associada com infecção por HBV, tal como, por exemplo, lesão hepática. Por exemplo, o nível de alanina aminotransferase no soro (ALT) pode ser medido usando um ensaio padrão. Em geral, um nível ALT de menos do que cerca e 50 unidades internacionais/ml (IU/ml) de soro é considerado normal. Um nível ALT mais alto pode ser indicativo de lesão hepática em curso. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade efetiva para reduzir nível ALT, em um paciente com um nível ALT mais alto do que o normal, para menos do que cerca de 50 IU/ml de soro. Assim, a invenção inclui um método de reduzir o nível de ALT no soro de um paciente infectado com HBV exibindo um nível inicial de ALT no soro maior do que 50 IU/ml, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de ALT para menos do que cerca de 50 IU/ml. Vírus Linfotrópico-THumano tipo 1

Em outro aspecto a invenção fornece um método de tratar um paciente infectado com Vírus Linfotrópico-T Humano tipo 1 (HTLV-1), ou uma doença ou condição associada com infecção por HTLV-1, tal como, por exemplo, linfoma/leucemia de célula-T de adulto (ATLL), mielopatia associada com HTLV-1 (HAM), Paraparesia Espástica Tropical (TSP), uveíte, ou artropatia. Os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade efetiva de uma composição da invenção compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção. A invenção também fornece uma composição para uso em tratamento de um paciente infectado com HTLV-I ou uma doença ou condição associada com HTLV-1, a composição compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um paciente diagnosticado com infecção por HTLV-I inclui um paciente exibindo níveis detectáveis de DNA proviral HTLV-I no sangue e/ou anticorpo para um antígeno de HTLV-I no soro.

Uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HCV ou oncologia usando polipeptídeos interferon-alfa aprovados clinicamente, tal como, por exemplo ROFERON®-A (Interferon alfa-2a, recombinante; Hoffmann-La Roche Inc.) e INTRON® A (Interferon alfa-2b, recombinante; Schering Corporation). Tabelas de dosagem recomendada exemplares de ROFERON ou INTRON A para o tratamento de HCV crônica é 3 milhões IU (aproximadamente 15 microgramas (mcg)) três vezes por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas. Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de ROFERON para o tratamento de leucemia de célula capilar é 2 milhões IU/m (metro quadrado de superfície do corpo) administrados subcutaneamente 3 vezes por semana por 6 meses. Uma tal tabela de dosagem fornece extensões úteis para dosagem de um polipeptídeo da invenção para o tratamento de HTLV-I ou uma doença ou condição associada com infecção por HTLV-I tal como linfoma/leucemia de célula-T de adulto (ATLL), mielopatia associada com HTLV-I (HAM), ou Paraparesia Espástica Tropical (TSP). Dependendo de diversos fatores (incluindo mas não limitado à atividade e farmacocinética do polipeptídeo da invenção e o tamanho, idade e saúde do paciente), o polipeptídeo pode ser administrado em quantidades inferiores e/ou menos freqüentemente do que descrito acima.

Da mesma forma, uma composição compreendendo um conjugado da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em terapêutica de HCV ou em regimes terapêuticos de oncologia usando conjugados de interferon-alfa aprovados clinicamente, tal como, por exemplo, PEGASYS® (Peginterferon alfa-2a; Hoffmann-La Roche, Inc.) ou PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b; Schering Corporation). Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de PEGASYS para o tratamento de HCV crônica é 180 mcg uma vez por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 24 a 48 semanas. Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de PEG-INTRON para o tratamento de leucemia mielogenosa crônica é 6 mcg/kg do peso corporal uma vez por semana por injeção subcutânea por, por exemplo, 52 semanas. Tal tabela de dosagem fornece uma extensão útil para dosagem de um conjugado da invenção para o tratamento de infecção por HTLV-1, ou uma doença ou condição associada com infecção por HTLV-I tal como linfoma/leucemia de célula-T de adulto (ATLL), mielopatia associada com HTLV-I (HAM), ou Paraparesia Espástica Tropical (TSP). Dependendo de diversos fatores (incluindo mas não limitados a peso molecular, atividade, e farmacocinética do conjugado da invenção e o tamanho, idade e saúde do paciente), o conjugado pode ser administrado em quantidades inferiores e/ou menos freqüentemente do que descrito acima.

Em algumas instâncias o polipeptídeo ou conjugado da invenção é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser administrado em combinação com uma droga antiretroviral tal como zidovudina (AZT) e/ou lamivudina (3TC). Também pode ser administrado em combinação com transplante de célula tronco de sangue periférico, quimioterapia convencional, ou quimioterapia de alta dose com transplante de medula óssea autólogo ou alogênico. Alternativamente, o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser combinado com outra imunoterapia, por exemplo, com anticorpos monoclonais receptores de anti- interleucina-2 ou injeção de células-t citotóxicas direcionadas contra antígenos de vírus.

A quantidade e freqüência precisas de administração do polipeptídeo ou conjugado da invenção irão depender de diversos fatores tal como a atividade específica e as propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo ou do conjugado, assim como a natureza da condição sendo tratada, entre outros fatores conhecidos por aqueles de verso na técnica. Normalmente, a dose deve ser capaz de prevenir ou diminuir a severidade ou espalhamento da indicação sendo tratada. Tal dose pode ser denominada uma quantidade "efetiva" ou "terapeuticamente efetiva". Será perceptível para aqueles de verso na técnica que uma quantidade efetiva de um polipeptídeo, conjugado ou composição da invenção depende, entre outras coisas, da condição sendo tratada, da dose, da tabela de administração, se o polipeptídeo ou conjugado ou composição é administrado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos, da meia vida no soro e outras propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo, conjugado ou composição, assim como do tamanho, idade e saúde geral do paciente. A dosagem e freqüência de administração são determináveis por um versado na técnica usando técnicas conhecidas.

A efetividade de tratamento pode ser determinada medindo a carga viral de HTLV-1, tal como, por exemplo, medindo o nível de DNA proviral HTLV-I no sangue usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por PCR quantitativo como descrito por Saito et ai., (2004) J. Infect. Dis. 189(l):29-40. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma que é suficiente para atingir uma redução na carga viral por pelo menos 0,5 unidade log, pelo menos 1 unidade log, pelo menos 2 unidades log, pelo menos 3 unidades log, pelo menos 4 unidades log, pelo menos 5 unidades log, pelo menos 6 unidades log ou pelo menos 7 unidades log no decurso do tratamento, comparado com a carga viral antes do tratamento. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir carga viral para níveis que são essencialmente indetectáveis. A invenção inclui um método de reduzir o nível de DNA proviral HTLV-1 em sangue de um paciente infectado com HTLV-1, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de DNA pro viral HTLV-1 comparado com o nível de DNA pro viral HTLV-1 presente antes do início de tratamento.

A efetividade de tratamento pode alternativamente ou em adição ser determinada medindo o título de um anticorpo anti HTLV-I no soro, usando métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, por testes disponíveis comercialmente tal como INNO-LIA™ HTVL I/II (Innogenetics; Gent Belgium) e Abbott HTLV-I/HTLV-II EIA (abbott Laboratories; Abbott Park, IL). Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o título de um anticorpo anti HTLV-I no soro para 50%, 25%, 10% ou 5% do título presente antes do início de tratamento. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o título de um anticorpo anti HTLV-I no soro para um nível que é essencialmente indetectável. A invenção inclui um método de reduzir o título de um anticorpo anti HTLV-I no soro de um paciente infectado com HTLV-1, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o título de um anticorpo anti HTLV-1 no soro comparado com aquele presente antes do início de tratamento.

Papilomavírus Humano

Em outro aspecto a invenção fornece um método de tratar um paciente infectado com Papilomavírus Humano (HPV), ou uma doença ou condição associada com infecção por HPV, tal como, por exemplo, verrugas nas mãos e pés, e lesões das membranas mucosas das cavidades oral, anal e genital. Enquanto muitos tipos de HPV são relativamente inofensivos, muitos outros tipos são disseminados através de contato sexual e causa para verrugas genitais ou venéreas (denominada condiloma acuminado) o que pode causar câncer cervical ou outros cânceres genitais. O método compreende administrar ao paciente infectado com HPV uma quantidade efetiva de uma composição da invenção compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção. A invenção também fornece uma composição para uso no tratamento de um paciente infectado com HPV ou uma doença ou condição associada com infecção por HPV, compreendendo um ou mais polipeptídeos ou conjugados da invenção e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um paciente diagnosticado como infectado com HPV inclui um paciente exibindo níveis detectáveis de DNA viral HPV em tecidos genitais biopsados, e algumas vezes (mas não sempre) exibindo lesões visíveis nos tecidos genitais.

Uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção irá geralmente ser administrada em uma dose e freqüência similar a que é empregada em regimes terapêuticos de HPV usando polipeptídeos interferon-alfa aprovados clinicamente, tal como, por exemplo, INTRON® A (Interferon alfa-2b, recombinante; Schering Corporation). Uma tabela de dosagem recomendada exemplar de INTRON A para o tratamento de condiloma acuminado é 1 milhão IU injetadas em cada lesão, para até 5 lesões, usando uma tuberculina ou seringa similar e uma agulha gaúche 25 a 30, três vezes por semana em dias alternados, por 3 semanas. Pacientes com 6 a 10 condilomas podem receber um segundo (seqüencial) curso de tratamento na tabela de dosagem acima, para tratar até cinco condilomas adicionais por curso de tratamento. Pacientes com mais do que 10 condilomas podem receber seqüências adicionais dependendo de quão grande um número de condilomas está presente. O interferon pode alternativamente ou em adição ser aplicado topicamente, por exemplo em uma forma de creme ou pomada (como descrito por exemplo em Stentella et al. (1996) Clin. Exp. Obstet. Gynecol. 23(l):29-36). Tais tabelas de dosagem fornecem extensões úteis para dosagem de um polipeptídeo da invenção para o tratamento de infecção por HPV ou uma doença ou condição associada com infecção por HPV tal como condiloma acuminado. Dependendo de diversos fatores (incluindo mas não limitado à atividade e farmacocinética do polipeptídeo da invenção e o tamanho, idade e saúde do paciente), o polipeptídeo pode ser administrado em quantidades inferiores e/ou menos freqüentemente do que descrito acima. Da mesma forma, uma composição compreendendo um conjugado da invenção irá geralmente ser administrada, por exemplo intralesionalmente ou topicamente, em uma dose efetiva para reduzir a quantidade de DNA viral HPV nos tecidos afetados ou para reduzir o tamanho/ou número de lesões genitais no indivíduo infectado.

Em algumas instâncias o polipeptídeo ou conjugado da invenção é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser administrado em combinação com um terapêutico anti- HPV tal como Podofilox (Condylox) e/ou Podofilina (Pododerm, Podocon- 25).

A quantidade e freqüência precisas de administração do polipeptídeo ou conjugado da invenção irão depender de diversos fatores tal como a atividade específica e as propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo ou do conjugado, assim como a natureza da condição sendo tratada, entre outros fatores conhecidos por aqueles de verso na técnica. Normalmente, a dose deve ser capaz de prevenir ou diminuir a severidade ou espalhamento da indicação sendo tratada. Tal dose pode ser denominada uma quantidade "efetiva" ou "terapeuticamente efetiva". Será perceptível para aqueles de verso na técnica que uma quantidade efetiva de um polipeptídeo, conjugado ou composição da invenção depende, entre outras coisas, da condição sendo tratada, da dose, da tabela de administração, se o polipeptídeo ou conjugado ou composição é administrado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos, da meia vida no soro e outras propriedades farmacocinéticas do polipeptídeo, conjugado ou composição, assim como do tamanho, idade e saúde geral do paciente. A dosagem e freqüência de administração são determináveis por um versado na técnica usando técnicas conhecidas.

A efetividade de tratamento pode ser determinada medindo a carga viral de HPV, tal como, por exemplo, medindo o nível de DNA viral de HPV em tecido biopsado. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma que é suficiente para atingir uma redução na carga viral por pelo menos 0,5 unidade log, tal como de pelo menos 1 unidade log, pelo menos 2 unidades log, pelo menos 3 unidades log, pelo menos 4 unidades log, pelo menos 5 unidades log, pelo menos 6 unidades log ou pelo menos 7 unidades log no decurso do tratamento, comparado com a carga viral antes de tratamento. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir carga viral para níveis que são essencialmente indetectáveis. A invenção inclui um método de reduzir o nível de DNA viral de HPV no tecido de um paciente infectado com HPV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o nível de DNA viral de HPV comparado com aquele presente antes do início de tratamento.

A efetividade de tratamento pode alternativamente ou em adição ser determinada observando o tamanho e número de lesões genitais (condiloma) no indivíduo infectado. Em algumas instâncias, uma quantidade efetiva de uma composição da invenção é uma quantidade que é suficiente para reduzir o tamanho e/ou número de condiloma no indivíduo infectado. A invenção inclui um método de reduzir o tamanho e/ou número de condiloma em um paciente infectado com HPV, compreendendo administrar ao paciente uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para reduzir o tamanho e/ou número de condiloma no paciente comparado com aqueles presentes antes do início de tratamento.

FORMULAÇÕES E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

Formulações terapêuticas do polipeptídeo ou conjugado da invenção são tipicamente administradas em uma composição que inclui um ou mais carreadores ou excipientes aceitáveis farmaceuticamente. Tais composições farmacêuticas podem ser preparadas de uma maneira conhecida per se na técnica para resultar em um polipeptídeo farmacêutico que é suficientemente estável em armazenamento e é adequado para administração para humanos e animais. Forma da droga

O polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser usado "como é" e/ou em uma forma de sal deste. Sais adequados incluem, mas não são limitados a, sais com metais alcalinos ou metais alcalinos terrosos, tal como sódio, potássio, cálcio e magnésio, assim como por exemplo sais de zinco. Estes sais ou complexos podem estar presentes como uma estrutura cristalina e/ou amorfa.

Excipientes

"Farmaceuticamente aceitável" significa um carreador ou excipiente que nas dosagens e concentrações empregadas não causam nenhum efeito adverso nos pacientes aos quais é administrado. Tais carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (veja Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. Pharmaceutical Press (2000)).

Mistura de drogas

A composição da invenção pode ser administrada sozinha ou em conjunção com outros agentes terapêuticos. Ribavirina, por exemplo, é freqüentemente co-administrada com EFN-alfa e foi mostrada aumentar eficácia de tratamentos antivirais, tal como tratamento de HCV. Uma variedade de pequenas moléculas está sendo desenvolvida contra ambos alvos virais (proteases virais, polimerase viral, assembléia de complexos de replicação viral) e alvos hospedeiros (proteases de hospedeiros requeridas para processamento viral, quinases de hospedeiros requeridas para fosforilação de alvos virais tal como NS5A e inibidores de fatores de hospedeiros requeridos para utilizar eficientemente o IRES viral). Outras citocinas podem ser co-administradas, tal como, por exemplo, IL-2, IL-12, IL- 23, IL-27, ou IFN-gama. Estes agentes podem ser incorporados como parte de uma mesma composição farmacêutica ou podem ser administrados separadamente do polipeptídeo ou conjugado da invenção, ou concorrentemente em conformidade com outra tabela de tratamento. Em adição, o polipeptídeo, conjugado ou composição da invenção pode ser usado como um adjuvante para outras terapias.

Pacientes

Um "paciente" para os propósitos da presente invenção inclui tanto humanos como outros mamíferos. Assim os métodos são aplicados tanto a terapias humanas como aplicações veterinárias.

Tipos de composição e via de administração

A composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo ou conjugado da invenção pode ser formulada em uma variedade de formas, por exemplo como um líquido, gel, liofilizada, ou como um sólido comprimido. A forma preferida irá depender da indicação particular sendo tratada e será perceptível para um versado na técnica. A administração das formulações da presente invenção pode ser realizada em uma variedade de meios, incluindo, mas não limitado a, oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intracerebralmente, intranasalmente, transdermicamente, intraperitonealmente,

intramuscularmente, intrapulmonarmente, vaginalmente, retalmente, intraocularmente, ou em qualquer outra maneira aceitável. As formulações podem ser administradas continuamente por infusão, embora injeção única seja aceitável, usando técnicas bem conhecidas na técnica, tal como bombas (por exemplo bombas osmóticas subcutâneas) ou implantação. Em algumas instâncias as formulações podem ser aplicadas diretamente como uma solução ou líquido pulverizável. Parenterais

Um exemplo de uma composição farmacêutica é uma solução designada para administração parenteral. Embora em muitos casos formulações de solução farmacêutica sejam fornecidas na forma líquida, apropriadas para uso imediato, tais formulações parenterais também podem ser fornecidas congeladas ou na forma liofilizada. No caso anterior, a composição deve ser descongelada antes do uso. A forma posterior é usada freqüentemente para estimular a estabilidade do composto ativo contido na composição sob uma variedade mais ampla de condições de armazenamento, como é reconhecido por aqueles versados na técnica que preparações liofilizadas são geralmente mais estáveis do que suas contrapartes líquidas. Tais preparações liofilizadas são reconstituídas antes do uso pela adição de um ou mais diluentes aceitáveis farmaceuticamente adequados tal como água estéril para injeção ou solução salina fisiológica estéril.

Parenterais podem ser preparados para armazenamento como formulações liofilizadas ou soluções aquosas misturando, como apropriado, o polipeptídeo tendo o grau desejado de pureza com um ou mais carreadores aceitáveis farmaceuticamente, excipientes ou estabilizantes tipicamente empregados na técnica (todos os quais são denominados "excipientes"), por exemplo agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes não iônicos, antioxidantes e/ou outros aditivos mistos.

Agentes tamponantes ajudam a manter o pH na extensão que aproxima condições fisiológicas. Eles estão tipicamente presentes em uma concentração variando de cerca de 2 mM a cerca de 50mM. Agentes tamponantes adequados para uso com a presente invenção incluem ambos ácidos orgânicos e inorgânicos e sais destes tais como tampões de citrato (por exemplo, mistura citrato monossódico-citrato dissódico, mistura ácido cítrico- citrato trissódico, mistura ácido cítrico-citrato monossódico, etc.) tampões de succinato (por exemplo mistura ácido succínico-succinato monossódico, mistura ácido succínico-hidróxido de sódio, mistura ácido succínico-succinato dissódico, etc.), tampões de tartrato (por exemplo mistura ácido tartárico- tartrato de sódio, mistura ácido tartárico-tartrato de potássio, mistura ácido tartárico-hidróxido de sódio, etc.), tampões de fumarato (por exemplo, mistura ácido fumárico-fumarato monossódico, mistura ácido fumárico- fumarato dissódico, mistura fumarato monossódico- fumarato dissódico, etc.), tampões de gluconato (por exemplo mistura ácido glucônico-gliconato de sódio, mistura ácido glucônico-hidróxido de sódio, mistura ácido glucônico- gliconato de potássio, etc.), tampão de oxalato (por exemplo, mistura de ácido oxálico e oxalato de sódio, mistura de ácido oxálico e hidróxido de sódio, mistura de ácido oxálico e oxalato de potássio, etc.), tampões de lactato (por exemplo, mistura de ácido lático e lactato de sódio, mistura de ácido lático e hidróxido de sódio, mistura de ácido lático e lactato de potássio, etc.), tampões de acetato (por exemplo, mistura de ácido acético e acetato de sódio, mistura de ácido acético e hidróxido de sódio, etc.). Possibilidades adicionais são tampões de fosfato, tampões de histidina, e sais trimetilamina tal como Tris. Conservantes são adicionados para retardar crescimento microbiano, e são tipicamente adicionados em quantidades de cerca de 0,2%- 1% (w/v). Conservantes adequados para uso com a presente invenção incluem fenol, benzil álcool, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, octadecildimetilbenzil cloreto de amônio, haletos de benzalcônio (por exemplo cloreto, brometo ou iodeto de benzalcônio), cloreto de hexametônio, alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol e 3-pentanol.

Isotonificantes são adicionados para assegurar isotonicidade das composições líquidas e incluem álcoois de açúcar poliídricos, preferivelmente álcoois de açúcar triídricos ou maiores, tal como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol. Alcoois poliídricos podem estar presentes em uma quantidade entre 0,1% e 25% em peso, tipicamente 1% a 5%, levando em conta as quantidades em relação dos outros ingredientes.

Estabilizantes se referem a uma ampla categoria de excipientes que pode variar em função de um agente de corpo a um aditivo que solubiliza o agente terapêutico ou ajuda a prevenir desnaturação ou aderência à parede contentora. Estabilizantes típicos podem ser álcoois de açúcar poliídricos (enumerados acima); aminoácidos tal como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, omitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc., açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar, tal como lactose, trealose, amidose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e semelhantes, incluindo ciclitóis tal como inositol; polietilenoglicol, polímeros de aminoácidos, agentes redutores contendo enxofre, tal como uréia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, α-monotioglicerol e tiosulfato de sódio; polipeptídeos de baixo peso molecular (isto é <10 resíduos); proteínas tal como albumina do soro humano, albumina do soro bovino, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; monossacarídeos tal como xilose, manose, frutose e glicose; dissacarídeos tal como lactose, maltose e sucrose; trissacarídeos tal como rafinose, e polissacarídeos tal como dextrana. Estabilizantes estão tipicamente presentes em uma extensão de 0,1 a 10.000 partes em peso baseado no peso da proteína ativa.

Tensoativos ou detergentes não iônicos (também conhecidos como "agentes umectantes") podem estar presentes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico assim como para proteger o polipeptídeo terapêutico contra agregação induzida por agitação, que também permite que formulação seja exposta a compartilhar estresse de superfície sem causar desnaturação do polipeptídeo. Tensoativos não iônicos adequados incluem polisorbatos (20, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188, etc.), polióis Pluronic®, polioxietileno sorbitan monoéteres (Tween®-20, Tween®-80, etc.).

Excipientes mistos adicionais incluem agentes de corpo ou enchimentos (por exemplo amido), agentes quelantes (por exemplo EDTA), antioxidantes (por exemplo ácido ascórbico, metionina, vitamina E) e cosolventes.

O ingrediente ativo também pode ser armazenado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo cápsulas de hidroximetilcelulose, gelatina ou poli-(metilmetacilato), em sistemas de transferência de droga coloidais (por exemplo lipossomos, microsferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, acima.

Formulações parenterais a serem usadas em administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Preparações de liberação sustentada

Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo ou conjugado, matrizes tendo uma forma adequada tal como um filme ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(vinilálcool)), poliactidas, copolímeros de L-ácido glutâmico e etil-L- glutamato, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros ácido lático- ácido glicólico degradáveis tal como a tecnologia ProLease® ou Lepron Depot® (microesferas injetáveis compostas de copolímero ácido lático-ácido glicólico e leuprolida acetato) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-vinil acetato e ácido lático-ácido glicólico habilitam a liberação de moléculas por longos períodos tal como até ou além de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando polipeptídeos encapsulados permanecem no corpo por um longo tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser formação de ligação S-S intermolecular através de intermudança tio-sulfeto, estabilização pode ser atingida modificando resíduos sulfidril, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o conteúdo de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições de matriz de polímero específicas.

Administração oral

Para administração oral, a composição farmacêutica pode ser na forma sólida ou líquida, por exemplo na forma de uma cápsula, tablete, suspensão, emulsão ou solução. A composição farmacêutica é preferivelmente feita na forma de uma unidade de dosagem contendo uma dada quantidade do ingrediente ativo. Uma dose diária adequada para um humano ou outro mamífero pode variar amplamente dependendo da condição do paciente e de outros fatores, mas pode ser determinada por pessoas versadas na técnica usando métodos de rotina.

Formas de dosagem sólidas para administração oral podem incluir cápsulas, tabletes, supositórios, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte tal como sucrose, lactose, ou amido. Tais formas de dosagem também podem compreender, como é prática normal, substâncias adicionais, por exemplo agentes lubrificantes tal como estearato de magnésio. No caso de cápsulas, tabletes e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes tamponantes. Tabletes e pílulas podem ser adicionalmente preparados com revestimentos entéricos.

O polipeptídeo ou conjugado pode ser misturado com adjuvantes tais como lactose, sucrose, pó de amido, ésteres de celulose de ácidos alcanóicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfurico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinil-pirrolidona, e/ou polivinil álcool, e marcada ou encapsulada para administração convencional. Alternativamente, eles podem ser dissolvidos em salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol, óleos (tal como óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de gergelim), goma tragacanto, e/ou vários tampões. Outros adjuvantes e modos de administração são bem conhecidos na técnica farmacêutica. O carreador ou diluente pode incluir material de atraso de tempo, tal como gliceril monoestearato ou gliceril diestearato sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica.

As composições farmacêuticas podem ser sujeitas a operações farmacêuticas convencionais tal como esterilização e/ou podem conter adjuvantes convencionais tal como conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, tampões, enchimentos, etc., por exemplo como descrito em outra parte neste lugar.

Formas de dosagem líquidas para administração oral podem incluir emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires aceitáveis farmaceuticamente contendo diluente inertes usados geralmente na técnica, tal como água. Tais composições também podem compreender adjuvantes tal como agentes umectantes, adoçantes, agentes aromatizantes e agentes perfumantes.

Transferência pulmonar

Formulações adequadas para uso com um nebulizador, ou a jato ou ultra-sônico, irá compreender tipicamente o polipeptídeo ou conjugado dissolvido em água a uma concentração de, por exemplo, cerca de 0,01 a 25 mg do conjugado por mL de solução, preferivelmente cerca de 0,1 a 10 mg/mL. A formulação também pode incluir um tampão e um açúcar simples (por exemplo, para estabilização de proteína e regulação de pressão osmótica), e/ou albumina do soro humano variando em concentração de 0,1 a 10 mg/ml. Exemplos de tampões que podem ser usados são acetato de sódio, citrato e glicina. Preferivelmente, o tampão terá uma composição e molaridade adequadas para ajustar a solução para um pH na extensão de 3 a 9. Geralmente, molaridades de tampão de 1 mM a 50 mM são adequadas para este propósito. Exemplos de açúcares que podem ser utilizados são lactose, maltose, manitol, sorbitol, trealose, e xilose, normalmente em quantidades variando de 1% a 10% em peso da formulação.

A formulação do nebulizador também pode conter um tensoativo para reduzir ou prevenir agregação da proteína induzida por superfície causada por atomização da solução na formação do aerosol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tal como polioxietileno de ácido graxo ésteres e álcoois, e polioxietileno sorbitan de ácido graxo ésteres. Quantidades irão geralmente variar entre 0,001% e 4% em peso da formulação. Um tensoativo especialmente preferido para propósitos desta invenção é monooleato de polioxietileno sorbitana.

Formulações específicas e métodos de gerar dispersões adequadas de partículas líquidas da invenção são descritos em WO 94/20069, Patente Norte-Americana 5.915.378, Patente Norte-Americana 5.960.792, Patente Norte-Americana 5.957.124, Patente Norte-Americana 5.934.272, Patente Norte-Americana 5.915.378, Patente Norte-Americana 5.855.564, Patente Norte-Amerieana 5.826.570 e Patente Norte-Americana 5.522.385 que são por aqui incorporadas pela referência.

Formulações para uso com um dispositivo inalador de dose medida irão geralmente compreender um pó finamente dividido. Este pó pode ser produzido por liofilização e depois moendo uma formulação conjugada líquida e pode também conter um estabilizante tal como albumina do soro humano (HSA). Tipicamente, mais do que 0,5% (w/w) de HSA é adicionado. Adicionalmente, um ou mais açúcares ou álcoois de açúcares podem ser adicionados na preparação se necessário. Exemplos incluem lactose, maltose, manitol, sorbitol, sorbitose, trealose, xilitol, e xilose. A quantidade adicionada à formulação pode variar de cerca de 0,01 a 200% (w/w), preferivelmente de aproximadamente 1 a 50% do conjugado presente. Tais formulações são então liofilizadas e moídas até o tamanho de partícula desejado.

As partículas dimensionadas apropriadamente são então suspensas em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser de qualquer material convencional empregado para este propósito, tal como um clorofluorocarboneto, um hidroclorofluorocarboneto, um hidrofluorocarboneto, ou um hidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, ou combinações destes. Tensoativos adequados incluem sorbitan trioleato e lecitina de soja. Acido oléico também pode ser útil como um tensoativo. Esta mistura é então carregada no dispositivo de transferência. Um exemplo de um inalador de dose medida disponível comercialmente adequado para uso na presente invenção é o inalador de dose medida Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC, USA. Formulações para inaladores de pós irão compreender um pó seco finamente dividido contendo conjugado e pode também incluir um agente de corpo, tal como lactose, sorbitol, sucrose, ou manitol em quantidades que facilitam dispersão do pó a partir do dispositivo, por exemplo, 50% a 90% em peso da formulação. As partículas do pó devem ter propriedades aerodinâmicas no pulmão correspondendo a partículas com uma densidade de cerca de 1 g/cm tendo um diâmetro médio de menos do que 10 micrômetros, preferivelmente de entre 0,5 e 5 micrômetros, mais preferivelmente de entre 1,5 e 3,5 micrômetros. Um exemplo de um inalador de pó adequado para uso em conformidade com os ensinamentos neste lugar é o inalador de pó Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, MA, USA.

Os pós para estes dispositivos podem ser gerados e/ou entregues por métodos descritos em Patente Norte-Americana 5.997.848, Patente Norte-Americana 5.993.783, Patente Norte-Americana 5.985.248, Patente Norte-Americana 5.976.574, Patente Norte-Americana 5.922.354, Patente Norte-Americana 5.785.049 e Patente Norte-Americana 5.654.007.

Dispositivos mecânicos projetados para transferência pulmonar de produtos terapêuticos, incluem mas não são limitados a nebulizadores, inaladores de dose medidas, e inaladores de pó, todos os quais são familiares para aqueles de verso na técnica. Exemplos específicos de dispositivos adequados disponíveis comercialmente para a prática desta invenção são o nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, MO, USA; o nebulizador Acorn II fabricado por Marquest Medicai Products, Englewood, CO, USA; o inalador de dose medida Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC, USA; o inalador de pó Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, MA, USA; o dispositivo "standing cloud" de Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, CA, USA; o inalador AIR fabricado por Alkermes, Cambridge, MA5USA; e o sistema de transferência de droga pulmonar AERx fabricado por Aradigm Corporation, Hayward, CA, USA.

KITS

A presente invenção também fornece kits incluindo polipeptídeos, conjugados, polinucleotídeos, vetores de expressão, células, métodos, composições, e sistemas, e aparatos da invenção. Conjuntos da invenção compreendem opcionalmente pelo menos um dos seguintes da invenção: (1) um aparato, sistema, componente de sistema, ou componente de aparato como descrito neste lugar; (2) pelo menos um componente do kit compreendendo um polipeptídeo ou conjugado ou polinucleotídeo da invenção; um plasmídeo vetor de expressão codificando um polipeptídeo da invenção; uma célula expressando um polipeptídeo da invenção; ou uma composição compreendendo pelo menos um de qualquer de tal componente; (3) instruções para praticar qualquer método descrito neste lugar, incluindo um método terapêutico ou profilático, instruções para usar qualquer componente identificado em (2) ou qualquer composição de qualquer tal componente; e/ou instruções para operar qualquer aparato, sistema ou componente descrito neste lugar; (4) um recipiente para manter dito pelo menos um de tal componente ou composição, e (5) materiais de empacotamento.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece para o uso de qualquer aparato, componente, composição ou kit descrito acima e neste lugar, para a prática de qualquer método ou ensaio descrito neste lugar, e/ou para o uso de qualquer aparato, componente, ou kit para praticar qualquer ensaio ou método descrito neste lugar.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar a presente invenção, mas não para limitar o espírito ou escopo da presente invenção de maneira nenhuma.

MATERIAIS E MÉTODOS I. DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS SUPERFÍCIE-ACESSÍVEIS Área de superfície acessível (.ASA)

O programa de computador Access (B. Lee and F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)) versão 2 (© 1983 Yale University) foi usado para computar a área de superfície acessível (ASA) dos átomos individuais na estrutura. Este método usa tipicamente um tamanho de sonda de 1,4 Â e define a Área de superfície acessível (ASA) como a área formada pelo centro da sonda. Antes deste cálculo todas as moléculas de água e átomos de hidrogênio devem ser removidas do conjunto coordenado, como devem outros átomos não diretamente relacionados à proteína. ASA fracional da cadeia lateral

A ASA fracional dos átomos da cadeia lateral é computada pela divisão da soma de ASA dos átomos na cadeia lateral por um valor representando a ASA dos átomos da cadeia lateral daquele tipo de resíduo em um tripeptídeo estendido ALA-x-ALA. Veja Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol 220, 507-530. Para este exemplo o átomo CA é considerado como uma parte da cadeia lateral de resíduos de glicina mas não para os resíduos restantes. Os valores seguintes são usados como ASA 100% padrão para a cadeia lateral (Tabela 6):

Ala 69,23 A2 Leu 140,76 A2 Arg 200,35 A2 Lys 162,50 A2 Asn 106,25 A2 Met 156,08 A2 Asp 102,06 A2 Phe 163,90 A2 Cys 96,69 A2 Pro 119,65 A2 Gln 140,58 A2 Ser 78,16 A2 Glu 134,61 A2 Thr 101,67 A2 Gly 32,28 A2 Tip 210,89 A2 His 147,00 A2 Tyr 176,61 A2 Ile 137,91 A2 Val 114,14 A2

Resíduos não detectados na estrutura são definidos com tendo 100% de exposição como se pensa que residam em regiões flexíveis. No caso em que um conjunto de estruturas NMR é analisado, o valor ASA médio do conjunto é usado. Determinação dos resíduos expostos na superfície quando nenhuma estrutura tri-dimensional está disponível:

Quando nenhuma estrutura tri-dimensional é disponível ou se estrutura não é detalhada o suficiente para determinar acessibilidade à superfície (por exemplo se somente a posição dos átomos CA é conhecida) a acessibilidade à superfície pode ser inferida a partir de um alinhamento de seqüência criada como segue:

A: Se estrutura é conhecida mas não detalhada o suficiente para determinar acessibilidade à superfície:

A estrutura de baixo detalhe é incluída em um alinhamento de seqüência baseado na estrutura para as estruturas conhecidas da família de seqüência usando o programa MODELER disponível a partir de Molecular Simulations, Inc.

B: Se nenhuma estrutura é conhecida:

A seqüência é alinhada com um alinhamento de seqüência pré- definido, incluindo as seqüências das estruturas conhecidas da família de seqüência, que podem ser preparadas usando a opção "profile/structure alignment" do programa ClustalW (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Research 22:4673-4680). A partir do alinhamento de seqüência obtido em A ou B, resíduos na seqüência a ser analisada nas posições equivalentes aos resíduos expostos em pelo menos uma das outras seqüências tendo uma estrutura conhecida são definidos como sendo expostos. O grau de exposição é tomado como sendo o maior valor para os resíduos equivalentes nas outras seqüências. Nos casos onde a seqüência a ser analisada está em uma inserção (isto é não existem nenhuns resíduos equivalentes nas outras seqüências) este resíduo é definido como sendo completamente exposto, como ele é mais provavelmente localizado em uma região giro/laço. Nos casos onde existe uma estrutura de baixo detalhe, aqueles resíduos não observados na estrutura são definidos como sendo completamente expostos, como se pensa que estejam em regiões flexíveis. Determinando distâncias entre átomos

A distância entre átomos é prontamente determinada usando software gráfico molecular, por exemplo Insightll® 98,0 a partir de Molecular Simulations, Inc.

II. EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

Seqüência de codificação de polipeptídeo interferon-alfa misturado foi amplificada por PCR usando polimerases Herculase (Stratagene) ou Phusion (Finnzyme) para introduzir sítios de restrição NdeI e NotI nas regiões flanqueadoras. O produto de PCR foi purificado com o kit de purificação Qiagen PCR, digerido com enzimas NdeI e NotI (NEB), e separado em um gel de agarose 1%. A banda apropriada (-520 bp) foi excisada e DNA extraído com o kit de extração Qiagen GeL O DNA inserido assim obtido foi ligado em um derivado do vetor pCMV-Mkan (Punnonen J. et al.,PCT Publication WO 2004/007664 ) que contém um promotor de CMV para dirigir expressão de interferon, uma seqüência sinal tipo IFNa5 no término N do inserto, uma etiqueta E (GAPVPYPDPLEPR; SEQ ID NO:334) e uma etiqueta S (KETAAAKFERQHMDS; SEQ ID NO:335) no término C do inserto, e um marcador de canamicina para seleção em E. coli. A ligação resultante foi dessalinizada com o kit de purificação Qiagen PCR, ressuspensa em um tampão IOmM Tris pH 8,0 e 1-2 1.1.1 foram eletroporados em células competentes para XLl-Blue Electroporation (Stratagene) como especificado pelo fornecedor.

Um dia antes de transfecção, 5-8 χ IO6 COS-7 células foram inseminadas em um frasco Tl 75 em 35 ml de DMEM suplementado com antibióticos e 10% de Soro Bovino Fetal (PBS; Hyclone). Logo antes da transfecção, o meio foi aspirado e substituído por 35 ml de OptiMEM (Gibco/Invitrogen) suplementado com antibióticos depois de um único enxágüe com 10 ml de OptiMEM. Para cada frasco T175, a mistura de transfecção foi preparada como segue: 1 ml OptiMEM + 5Oul de Reagente de Transfecção Fugeneó (Roche Diagnostics) foi incubado por 5 mM em temperatura ambiente no momento em que 10 )..tg de DNA livre de endotoxina (maxiprep livre de endotoxina de Qiagen, preparado como descrito no protocolo fornecido pelo fabricante) foi adicionado e a mistura foi incubada por um adicional de 30 min em temperatura ambiente antes de ser adicionada às células. O sobrenadante bruto foi coletado em 24h, clarificado por centrifugação a 1000 rpm por 10 min e armazenado a -80°C.

O polipeptídeo interferon foi purificado a partir do sobrenadante bruto usando o sistema AKTA Explorer HPLC (Amersham). Cerca de 140 ml (o sobrenadante de quatro frascos T175) foi carregado em uma coluna de etiqueta E (módulo RPAS Purification, Amersham 71- 5000-87) que havia sido pré-equilibrada com PBS. Primeiro a coluna foi lavada com 4 volumes de coluna de PBS pH 7,4, seguido por 3 volumes de coluna de Tampão Bl (20 mM de NaOAc, 150 mM de NaC 1, 1 mM de EDTA, pH 5,0). A proteína foi eluída usando uma eluição em etapas de tampão B2 e pH baixo (30 mM de ácido cítrico, 150mM de NaC 1, ImM de EDTA, pH 3,0) por 3 volumes de coluna. O principal pico de absorção de UV (aprox. 6 ml) foi coletado em 700 ill de 1 M Tris pH 8,0 para neutralizar o pH, e armazenado a 4°C. A amostra protéica teve o tampão trocado para 20 mM de Tris pH 8,0 em Agua Estéril para Irrigação (WFI; B. Braun Medicai Inc.) por diálise usando uma gaveta / lâmina de diálise de 10 kDa MWCO Pierce e subseqüentemente concentrada usando uma unidade de Amicon (10 kDa MWCO) por centrifugação a 3500 rpm por 15 mins a 4°C. A concentração de proteína foi medida usando o kit de ensaio de proteína BCA usando BSA (Pierce cat #23210) como um padrão e formulada em 5% de BSA / PBS pH 6,5 e aliquotada para armazenamento a -80°C. III. ENSAIOS DE ATIVIDADE Ensaio de Ligação IFNAR

Ligação de um polipeptídeo interferon-alfa ao receptor de interferon-alfa humano (EFNAR) pode ser determinada usando um ensaio de ligação competitiva por fluxo citométrico empregando uma linhagem celular de linfoma humano (Daudi) como uma fonte de célula expressando IFNAR, um polipeptídeo IFN-alfa biotinilado de referência como traçador, e estreptavidina conjugada a ficoeritrina (SA-PE) para detecção.

Resumidamente, células Daudi são incubadas com várias concentrações do polipeptídeo não marcado a ser testado (polipeptídeo "competidor") por aproximadamente quatro horas na presença de um polipeptídeo IFN-alfa biotinilado de referência (polipeptídeo "traçador") em uma concentração fixa igual a seu KD. A quantidade de polipeptídeo traçador que permanece ligada a IFNAR em cada concentração de polipeptídeo competidor é então determinada por coloração com SA-PE e verificando por citometria de fluxo. A concentração de polipeptídeo competidor que reduz a ligação de traçador em 50% (o valor de EC50) é diretamente relacionada à afinidade de ligação intrínseca do polipeptídeo competidor pelo receptor de interferon-alfa.

A linhagem celular de linfoma de célula b humano Daudi pode ser obtida a partir da American Tissue Culture Collection (ATCC #CCL-213). Ensaios de ligação de competição são realizados em células Daudi que são mantidas em cultura por menos do que 30 dias. As células Daudi são cultivadas em meio RPMI1640 completo (BioWhittaker #BE12-702F1U1) contendo 10% de soro bovino fetal (Hyclone, #SH30071.03), glicose 4,5 g/L (Sigma #G8769, 450 g/L), piruvato de sódio 1 mM (Gibco, #11360-039, 100 mM), penicilina (100 U/rnl) e estreptomicina (100 mg/ml). As células são mantidas em uma incubadora umidificada de 37°C com 5% CO2 em uma densidade celular entre 0,5 χ 10"6 e 2 χ 10"6 células/mL pela adição de meio fresco 2-3 vezes por semana e substituição de meio uma vez por semana. Polipeptídeo traçador é preparado por biotinilação de um polipeptídeo IFN-alfa de referência (tal como, por exemplo, IFN-alfa humano 2a) usando o Kit deBiotinilação de Fase Sólida EZ-Link® NHS-PEO (Pierce Biotechnology, Inc., product # 21450) usando o protocolo fornecido pelo fabricante. Os moles de biotina por mole de polipeptídeo traçador é quantificado usando o Kit de Quantificação EZ Biotin (Pierce Biotechnology, Inc., produto # 28005) usando o protocolo fornecido pelo fabricante. O KD de ligação de polipeptídeo traçador com células Daudi cells é determinado incubando células Daudi com quantidades variadas de polipeptídeo traçador e tratando as células com SA-PE (disponível a partir de BD Pharmingen, produto #554061 ou Dako, produto #R0438). A intensidade de fluorescência média (MFI) para uma concentração particular de traçador é representativa da quantidade de ligante ligado por célula. O perfil detectado com SA-PE apenas é subtraído dos valores de MFI obtidos e estes valores são então plotados versus concentração de traçador para produzir uma curva de saturação-ligação a partir da qual o KD é calculado usando regressão não linear, ajuste de curva de um sítio. Este KD é usado como a concentração de traçador em ensaios de ligação competitiva subseqüentes.

Para o ensaio de ligação por competição, células Daudi são emplacadas em uma densidade de 200.000 células por 50 ul por poço em uma placa de ensaio de fundo redondo de 96 poços (tal como VWR, #29442066) em salina tamponada com fosfato (PBS) mais 2% de soro bovino fetal (FBS). Entre 8 e 12 diluições de duas vezes do polipeptídeo competidor, variando de, por exemplo, 4μΜ a 1 pM, são preparadas. Cem microlitros das preparações de competidor diluídas 2X são transferidas para as placas de células para gerar uma concentração final de competidor em cada poço de, por exemplo, 2 1.1M a 0,5 pM. Cinqüenta microlitros de polipeptídeo traçador biotinilado a 4X o KD (como descrito acima) é adicionada aos 150 ul de células mais competidor, para gerar uma concentração final de IX o KD no ensaio. As placas são incubadas a 4°C por 4 horas com agitação intermitente em um agitador orbital. As células são então lavadas com PBS mais 2% de BS antes de coloração ser realizada usando 50 ul de SA-PE (uma diluição de 25 vezes de BD Pharmingen #554061 ou uma diluição de 40 vezes de Dako #R0438) por 30 minutos em gelo no escuro. Células são subseqüentemente lavadas duas vezes com PBS mais 2% de FBS antes de aquisição por citometria de fluxo (FacsCalibur, BD Bioscience) usando um auto-amostrador de múltiplos poços (BD Bioscience), aplicativo computacional CellQuestPro (BD Bioscience) e aplicativo computacional gerenciador de placa de múltiplos poços, MPM ver3.1 (AMS Cytek ou BD Bioscience).

O MFI de base (definido como o MFI de células coradas com SA-PE na ausência de traçador ou competidor) é subtraído do MFI gerado em cada concentração de competidor. Os valores resultantes são plotados como uma função da concentração de competidor, e valores de EC50 são determinados usando uma equação de análise de ligação de competição em um sítio por regressão não linear. Ensaio Antiviral HeLa-EMCV

Abaixo é fornecido um ensaio exemplar para atividade antiviral de polipeptídeos e conjugados de interferon-alfa da invenção. O ensaio é um ensaio dose-resposta baseado na célula usado para acessar a potência antiviral de uma droga, e é algumas vezes referido como ensaio de "proteção de efeito citopático" (ou PCPE), também chamado ensaio de inibição do efeito citopático (CPE). Resumidamente, células são incubadas com droga e expostas a vírus. Na ausência de droga, células expostas a vírus morrem. Com concentrações crescentes de droga, uma crescente proporção de células sobrevive. O número de células sobreviventes pode ser medido diretamente (por exemplo, por contagens visuais) ou indiretamente estimando taxa metabólica. Por exemplo, corantes metabólicas tal como MTT ou WST-I podem ser usadas como uma medida indireta da sobrevivência celular. Células vivas metabolizam tais corantes para formar produtos metabólicos que podem ser quantificados por espectrofotometria (densidade ótica). Materiais e Reagentes:

Células HeLa: Linha de célula de carcinoma cervical humano (ATCC # CCL-2). A linha de célula HeLa foi derivada de um adenocarcinoma cervical de uma fêmea de 35 anos de idade. As células HeLa são relatadas por conter seqüências de papilomavírus humano (HPV-18). A linha de célula foi recebida de ATCC na transição número 107.

Células L-929: Linha de célula de fibroblasto de murino (ATCC # CCL-1). A linha de célula L-929 é um clone de célula único isolado da passagem 95nd da linhagem parental, linhagem L, em 1948. Linhagem L foi isolada a partir do tecido subcutâneo areolar e adiposo de um camundongo C[3]H/Na macho de 100 dias normal.

Vírus da Encefalomiocardite (EMCV): linhagem adaptada de cultura de tecido (ATCC # VR-129B). Uma linhagem adaptada de cultura de tecido de vírus de encefalomiocardite (EMCV) foi adquirida de ATCC (# VR- 129B). Para o ensaio antiviral HeLa, o estoque viral de alto título foi produzido em células L929. O título viral do estoque viral produzido por L929 foi 4,0 χ 108 PFU/ml baseado nos resultados de um ensaio de placa em células L929.

MEM Completo:

Meios Essenciais Mínimos (MEM, Gibco Cat. No. 10370-021) 10% de Soro Bovino Fetal (FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03) 1 X Penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG, Gibco Cat. No. 10378-016) 25 ImM de piruvato de sódio (Gibco Cat. No. # 11360-070) MEM Soro Reduzido:

Meios Essenciais Mínimos (MEM, Gibco Cat. No. 10370-021)

2% de Soro Bovino Fetal (FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)

1 X Penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG, Gibco Cat. No. 10378-016) ImM de piruvato de sódio (Gibco Cat. No. #11360-070) Tripsina/EDTA (Gibco Cat. No. 25300-054) WST-I (Roche; Cat. No. 1 644 807)

Células HeLa foram mantidas em MEM Completo a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada. As células foram coletadas com tripsina e separadas duas vezes semanalmente quando confluente com uma densidade final de 2-4 x 10^6 células por 25 ml em um frasco T175. Um dia antes do ensaio, as células foram tripsinizadas e inseminadas dentro de novos frascos T175 em uma densidade final de 6 x 10^6 células por 25 ml para assegurar que células estivessem em fase Iog antes do ensaio. Procedimento de ensaio antiviral HeLa-EMCV:

No dia um do ensaio, células HeLa de fase Iog foram coletadas com tripsina, ressuspensas em MEM Soro Reduzido e concentradas por centrifugação. Os conglomerados celulares, correspondendo a 5 frascos de células T175, foram ressuspensos em 10 ml de MEM Soro Reduzido, filtrados através de um coador celular de Nylon de 40 micron e contados com um Contador Coulter. Viabilidade celular foi determinada por exclusão por azul de tripano com um hemocitômetro. As células foram ressuspensas em MEM Soro Reduzido para uma densidade final de 1 x 10^5 células/ml. Cem microlitros das células diluídas foram adicionados em cada poço de placas de um ensaio 96- poços (1 x 10^4 células/poço) e as placas foram incubadas a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada por 24 horas.

As potências de interferons-alfa "referência" e polipeptídeos interferon-alfa da invenção (também chamados "amostras teste") foram determinadas por análise dose-resposta. Em geral, foram 9 amostras teste e um IFN-alfa de referência por placa. Cada amostra foi testada como uma curva única em placas em duplicata por ensaio. Foram testadas quatro referências diferentes por ensaio, 2 testadas em duplicata e uma em replicatas de 6 para assegurar qualidade e desempenho consistentes de ensaio. Dois ensaios com 2 operadores diferentes foram realizados por semana, e duas semanas de ensaios foram realizadas no total, para um total de quatro ensaios separados. Em cada semana, os dois ensaios tiveram arranjos diferentes de amostras e referências por placa, para controlar quaisquer efeitos devido à localização da amostra. As curvas dose-resposta para os IFN-alfas de referência geralmente consistiram de 8 diluições de cinco vezes, com as diluições iniciais variando, dependendo da referência, de 100 ng/ml a 1 ng/ml. As diluições finais então variariam de 0,0013 ng/ml a 0,00001 ng/ml. Para as amostras teste de IFN-alfa, as diluições de cinco vezes variaram de 1 ng/ml a 0,00001 ng/ml. Oito poços de células foram tratados com vírus mas nenhum IFN-alfa e oito células sozinhas foram incluídas em cada placa como controles.

As diluições de IFN-alfa foram preparadas usando MEM Soro Reduzido. Cem microlitros das preparações de IFN-alfa diluídas foram transferidos para placas de ensaio. As placas de ensaio foram incubadas a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada por 16 horas.

No dia três, as células foram desafiadas com vírus EMC. Meio foi aspirado de cada poço da placa de ensaio. O estoque EMCV foi diluído 1:167 em MEM+ 2% FBS. Cem microlitros do vírus diluído, correspondendo a 3 x 10"5 de partículas virais foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas com vírus a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada por 24 horas.

No dia quatro, o número de células viáveis em cada poço foi quantificado por WST-I.. O reagente de WST-I foi diluído 1:2,3 em MEM Soro Reduzido, 13 μl do reagente de WST-I diluído foram adicionados a cada poço contendo 100 μl de meio mais vírus ou meio apenas, para uma diluição final de 1:20. As placas foram incubadas a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada por 60 minutos. O número de células viáveis em cada poço foi quantificado medindo OD a 450 nm em um leitor de placa. Análise:

A potência antiviral do IFN-alfa de referência e amostras de teste foram calculadas com a equação:

Potência antiviral =(Células viáveisc+i+v — Células viáveisc+v)/(Células viáveisc+i- Células viáveisc+v)*100%

onde células C+V= +EMCV, células C+I= +IFN-α, e células C+I+V= +IFN- a+EMCV

Curvas dose-resposta foram analisadas por regressão não linear usando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc.) A equação seguinte foi usada para os ajustes de curva:

<formula>formula see original document page 191</formula>

Fundo é o valor de Y no platô de fundo; Topo é o valor de Y no platô de topo, e LogEC50 é o valor de X quando a resposta está no meio do caminho entre Fundo e Topo. O método de Levenberg-Marquardt foi

usado como algoritmo de otimização.

Ensaio de diferenciação ThI

Abaixo é fornecido um ensaio exemplar para atividade de diferenciação ThI de polipeptídeos e conjugados de interferon-alfa da invenção.

Procedimento de Ensaio:

Camadas leuco-plaquetárias humanas (25-30 ml) contendo leucócitos e eritrócitos preparados a partir de 500 ml de sangue foram coletados de Stanford Boold Bank no dia da iniciação do ensaio (um dia antes do dia do ensaio) e mantidos a temperatura ambiente durante a noite. Cada camada leuco-plaquetária foi cuidadosamente transferida para um frasco T175 e diluída para 100 ml com PB S. Para cada camada leuco-plaquetária, 13 ml de Histopaque/Ficoll (Sigma H8889) foram pipetados dentro de 4 tubos de centrífuga de 50 ml, e 25 ml da amostra de sangue diluída foram cuidadosamente sobrepostos no topo do Histopaque/Ficoll sem romper interface. Os tubos foram então centrifugados (20°C, 2500 rpm) por 20 minutos. Usando pipetas de transferência de plástico de 3 ml a camada de célula mononuclear contendo PBMCs foi transferida para dois tubos cônicos de 5 Oml (células de 2 tubos Histopaque/Ficoll/ camada leuco-plaquetária para um tubo). Os PBMCs foram então diluídos para tubo/50ml com PBS e centrifugados (20°C, 1000 rpm) por 10 minutos para remover plaquetas. Depois da remoção de PBS, os PBMCs e RBCs remanescentes foram misturados para prevenir agregação. Dez milímetros de tampão Iise RBC (tampão cloreto de amônio) foram adicionados e dois tubos de células foram combinados em um tubo. Cada tubo, agora contendo o PBMC total e RBC isolado de um doador, foi incubado a temperatura ambiente por 10 min. Coágulos potenciais de células sangüíneas foram removidos filtrando as células com um coador celular (70μηι, Falcon Cat. No. 2350). PBS foi adicionado a um volume total de 50 ml seguido por centrifugação (20°C, 1000 rpm) por 10 minutos. O número de células foi finalmente contado usando um hemocitômetro.

Em seguida, uma fração de cada preparação PBMC foi pré- coada e analisada por FACS para selecionar preparações PBMC com uma porcentagem de células ThO naíve acima de 15%. Trezentos microlitros de PBMCs foram coados com 20 μΐ de FITC-conjugado anti-humano CD45RA (Pharmigen, Cat. No. 555488), 20 μΐ de Cy-cromo conjugado anti-humano CD4 (Pharmigen, Cat. No. 555348), 5 μΐ de PE-conjugado anti-humano CD8 (Pharmigen, Cat. No. 555367), 5 μΐ de PE-conjugado anti-humano CD14 (Pharmigen, Cat. No. 555398), e 5 μΐ de PE-conjugado anti-humano CD20 (Pharmigen, Cat. No. 555623), e incubados no gelo por 45 minutos. As células foram lavadas com PBS, ressuspensas em 1 ml de PBS, e filtradas com um coador celular de 40 μπι (Falcon, Cat. No. 2340). As porcentagens de células ThO naíve (positiva para CD4 e CD45RA e negativa para CD8, CD14, CD20) foram quantificadas por FAC S, e preparações PBMC com mais do que 15% de células ThO naíve foram selecionadas para o ensaio.

As preparações PBMC selecionadas foram coadas com 5000 μl de FITC-conjugado anti-humano CD45RA, 500 μΐ de Cy-cromo conjugado anti-humano CD4, 200 μΐ de PE-conjugado anti-humano CD8, 50 μl de PE- conjugado anti-humano CD14, e 50 μl de PE-conjugado anti-humano CD20, e incubadas no gelo por 60 minutos. As células foram lavadas com PBS, PI foi adicionado, e as células foram diluídas com IOml de PBS seguido por filtração com um coador celular de 40 μm. As células foram classificadas por FACS, 1 χ 10^4 células ThO naíve (positiva para CD4 e CD45RA e negativa para CD8, CD14, CD20) foram transferidas por MOFLO dentro de cada poço da placa de fundo redondo de 96 poço, contendo 160 μl de DMEM mais Penicilina-estreptomicina mais 2 mM de Glutamina e 10% de Soro Bovino Fetal (FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03).

Um vírgula sete microlitros de expansor de célula T Dynabeads CD3/CD28 (Dynal, Cat. No. 111,32) foram adicionados a cada poço. O efeito estimulador do Dynabeads foi calibrado antes do experimento para evitar variância muito-a-muito. Em seguida 20 μl/poço de amostras de proteína foram adicionados a placas de ensaio. Geralmente, variações de concentrações para padrões IL-4 e IL-12 (obtidos de R&D Systems) foram de 0,04 pg/ml a 10 ng/ml, e variações de concentrações para amostras teste de IFN-alfa e amostras referência de IFN-alfa foram de 0,76 pg/ml a 200 ng/ml.

As células foram incubadas a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada por 6 dias. Sobrenadantes de cada poço foram colhidos para determinar o grau de diferenciação ThI através da quantificação do conteúdo IFN-γ, usando um ELISA padrão (R&D Systems, Cat. # DIF50).

Análise:

Resposta = concentrações de IFN-γ em pg/ml

A equação seguinte foi usada para ajuste de curva:

Y = Fundo + · (Topo-Fundo)

1+10 (LogEC 50 - X).HillSlope A variável Fundo é o valor Y no platô de fundo; Topo é o valor Y no platô de topo, e LogEC50 é o valor X quando a resposta está na metade do caminho entre Fundo e Topo. O método Levenberg-Marquardt foi usado como algoritmo de otimização.

Ensaio de Antiproliferação Daudi

Abaixo é fornecido um ensaio exemplar para atividade antiproliferativa de polipeptídeos e conjugados de interferon-alfa da invenção.

Materiais:

Células Daudi: células de linfoma de Burkitt humano (ATCC Número: # CCL-213).

RPMI Completo:

RPMI 1640 (RPMI, Gibco Cat. No. 11875-143)

10% de Soro Bovino Fetal (FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)

1 X Penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG, Gibco Cat. No. 10378-016)

Células Daudi de linfoma de Burkitt humano crescidas em suspensão foram mantidas em frascos de tecido de cultura T175, contendo 5 Oml de RPMI completo a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada. As células foram separadas 1:10 quando confluente.

Procedimento de ensaio:

Células Daudi foram giradas para baixo e lavadas com lxPBS.

O número de células foi ajustado para IO5 células/ml. 80 μl de meio de cultura foi adicionado a cada poço na placa de fundo redondo de 96 poços seguido pela transferência de 100 μl de células (IO4 células/ poço) para cada poço.

Onze diluições do material referência de IFN-alfa e amostras teste de IFN-alfa,

variando de 200 ng/ml a 0,2 pg/ml (diluições de 4 vezes), foram preparadas em placas de diluição usando meio de cultura. Vinte μΐ das preparações de IFN-alfa diluídas foram então transferidos para placas de ensaio. As células foram incubadas a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada. Depois de 48 horas, 1uCi de metil-3 H timidina (Amersham Pharmacia, Cat. No. TRK758) foi adicionado a cada poço seguido por incubação por 24 horas a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada. As células foram coletadas no dia seguinte e incorporação de timidina foi determinada.

Alternativamente, o ensaio de antiproliferação Daudi pode ser realizado medindo o número de células Daudi viáveis, metabolicamente ativas baseado na quantidade de ATP presente em um poço de cultura seguindo tratamento com interferon. Neste procedimento, 8000 células Daudi são emplacadas em um volume de 50 μΐ em uma placa de fundo redondo de 96 poços. As células são permitidas incubarem a 37°C por 2 horas em uma incubadora CO2 5% antes da adição das diluições de interferon. Os interferons são diluídos 6 vezes (9 pontos) geralmente começando de 5-10 ng/ml. Seguindo a adição dos interferons, as células são incubadas por 72 horas a 37°C em uma incubadora CO2 5% umidificada. O número de células viáveis em cada poço é então determinado pela adição de 100 μl de CellTiter-Glo™ (Promega, cat #G7572). As células mais o reagente CellTiter-Glo™ são misturados por 2 minutos e incubados a temperatura ambiente no escuro por 30-60 minutos. A quantidade de sinal luminescente para cada poço é determinada usando um instrumento Analyst HT.

Análise:

O EC50 de IFN-alfa referência e amostras foram calculados usando a equação:

<formula>formula see original document page 195</formula>

onde Fundo é o valor Y no platô de fundo; Topo é o valor Y no platô de topo, e LogEC50 é o valor X quando a resposta está na metade do caminho entre Fundo e Topo. O método Levenberg-Marquardt foi usado como algoritmo de otimização. EXEMPLO 1: DETERMINAÇÃO DOS RESÍDUOS SUPERFÍCIE- ACESSÍVEIS DE INTERFERONS-ALFA

Exposição de superfície de resíduos de interferon-a humano 2a

Baseado nas estruturas 24 NMR de interferon-alfa humano 2a relatado por Klaus et al., J. Mol. Biol., 274: 661-675 (1997), a ASA fracional de cadeias laterais foi calculada. A numeração de seqüência usada abaixo é baseada na seqüência madura da proteína interferon-alfa 2a humana (identificada neste lugar como SEQ ID NO:322). É observado que esta estrutura conte, duas pontes dissulfeto envolvendo Cis1-Cis98 e Cis29- Cis 138, respectivamente. Computando a ASA e a ASA fracional e tomando a média das 24 estruturas, focando na ASA das cadeias laterais, foi determinado que os seguintes resíduos têm mais do que 25% de ASA fracional: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, G10, R12, R13, M16, A19, Q20, R22, K23,124, S25, L26, F27, S28, L30, K31, R33, H34, D35, G37, Q40, E41, E42, G44, N45, Q46, Q48, K49, A50, E51, E58, Q61, Q62, N65, S68, T69, K70, D71, S73, A74, D77, E78, T79, L80, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94, E96, A97, V99,1100, Q101, G102, V103, G104, T106, E107, T108, P109, L110, M111, K112, E113, D114, L117, R120, K121, Q124, R125, T127, L128, K131, E132, K133, K134, Y135, S136, P137, C138, A145, M148, R149, S152, L153, N156, Q158, E159, S160, L161, R162, S163, K164 e E165, com numeração de posição em relação àquela da seqüência de interferon-alfa 2a identificada neste lugar como SEQ ID NO:322.

Os seguintes resíduos foram determinados terem em média mais do que 50% de ASA fracional: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, R12, R13, M16, A19, S25, F27, S28, K31, R33, H34, D35, G37, E41, G44, N45, Q46, Q48, K49, N65, K70, A74, D77, E78, T79, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94, I100, Q101, G102, G104, T106, E107, T108, P109, L110, E113, D114, L117, R120, K121, Q124, R125, L128, K131, E132, K134, P137, R149, E159, L161, R162, S163, K164 e E165, com numeração de posição em relação àquela da seqüência de interferon-alfa 2a identificada neste lugar como SEQ ID NO:322.

Exposição de superfície de resíduos correspondente a SEQID NO: 1

Devido a uma inserção de um aminoácido depois da posição 44 dos 2 subtipos do interferon-alfa humano - tal como, por exemplo, interferon-alfa 2b (SEQ ID NO:321) e interferon-alfa 2a (SEQ ID NO:322) - em muitas seqüências de interferon-alfa, incluindo todas as seqüências de interferon-alfa humano conhecidas (à parte dos 2 subtipos de IFN-alfa) e certos polipeptídeos da invenção, a numeração da posição de resíduos superfície-expostos será mudada por um resíduo passado da posição número 44, por exemplo, nas seqüências mostradas na Figura 1 de alinhamento, em relação à numeração da seqüência denominada hlFNalfa 2b (SEQ ID NO:321).

Baseado na análise acima, as posições seguintes, numeradas em relação a SEQ ID NO:l, são consideradas contendo resíduos de aminoácidos tendo mais do que 25% de ASA fracional: posições 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 40, 41, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 59, 62, 63, 66, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 128, 129, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 146, 149, 150, 153, 154, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, e 166.

Da mesma maneira, as posições seguintes, de novo numeradas em relação a SEQ ID NO:l, são consideradas contendo resíduos de aminoácidos tendo mais do que 50% de ASA fracional de sua cadeia lateral: posições 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 25, 27, 28, 31, 33, 34, 35, 37, 41, 44, 46, 47, 49, 50, 66, 71, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 95, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 129, 132, 133, 135, 138, 150, 160, 162, 163, 164, 165, e 166. EXEMPLO 2: ATIVIDADES ANTIVIRAIS DE POLIPEPTÍDEOS INTERFERON-ALFA

O principal desafio técnico com HCV é que o vírus não pode ser crescido in vitro e foi apenas recentemente cultivado em modelos animais tratáveis. Existem, entretanto, vírus que se replicam in vitro que são considerados como sendo substitutos úteis para replicação viral de HCV. Ensaios substitutos in vitro acreditados serem preditivos de atividade antiviral de HCV in vivo incluem os ensaios descritos na seção Materiais e Métodos acima, que medem a capacidade de moléculas teste para proteger células do efeito citopático (CPE) da infecção viral, usando vírus de Encefalomiocardite (EMCV) na linhagem de células HeLa derivada de carcinoma cervical.

Figura 3 mostra atividade antiviral em um ensaio HeLa/EMCV, expressa como EC5O (ng/ml), para os seguintes polipeptídeos exemplares da invenção: M04 (SEQ ID NO:262); M05 (SEQ ID NO:266); M23 (SEQ ID NO:232); M45 (SEQ ID NO:88); MOl (SEQ ID NO:312); M20 (SEQ ID NO:297); M27 (SEQ ID NO: 167); M09 (SEQ ID NO: 107); M02 (SEQ ID N0:208); M33 (SEQ ID NO:94); M37 (SEQ ID NO: 141); M30 (SEQ ID NO:46); M22 (SEQ ID NO: 171); M24 (SEQ ID N0:310); M44 (SEQ ID NO:176); M31 (SEQ ID NO:26); MlO (SEQ ID NO:89); M14 (SEQ ID NO:296); M03 (SEQ ID NO: 148); M46 (SEQ ID NO: 18); M26 (SEQ ID NO: 10); M21 (SEQ ID NO:87); M38 (SEQ ID N0:103); M28 (SEQ ID NO:234); M19 (SEQ ID N0:30); Mll (SEQ ID NO:179); M34 (SEQ ID NO:2); M07 (SEQ ID N0:260); Ml8 (SEQ ID N0:306); M40 (SEQ ID NO: 140); M16 (SEQ ID NO:127); M25 (SEQ ID NO:293); M29 (SEQ ID NO: 195); M36 (SEQ ID NO:191); M06 (SEQ ID NO:263); M32 (SEQ ID NO:l); M39 (SEQ ID NO:298); M42 (SEQ ID NO:24); M08 (SEQ ID NO:258); M35 (SEQ ID NO: 124); M41 (SEQ ID NO:7); M12 (SEQ ID NO:9); M17 (SEQ ID N0:303); e M43 (SEQ ID NO:6), quando comparada com polipeptídeos interferon-alfa de referência huIFNa-2a (SEQ ID NO:322) e hulFNa-2b (SEQ ID NO:321).

EXEMPLO 3: PEGUILAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS INTERFERON-ALFA

Os seguintes fornecem procedimentos exemplares para preparar conjugados da invenção. PEGuilação-Cis

Um polipeptídeo da invenção que contém uma cisteína livre pode ser cisteína-PEGuilado como segue. O polipeptídeo é primeiro parcialmente reduzido com uma concentração equimolar de TCEP (Triscarboxietilfosfina) a 4°C por 30 min em 50 mM MÊS, 100 mM NaCl, pH 6,0. O polipeptídeo reduzido é então reagido com um excesso molar de 4 vezes de reagente mPEG-MAL (com uma unidade PEG tal como um mPEG linear de 20 kDa ou 30 kDa, ou um mPEG2 ramificado de 40 kDa) por Ih a 4°C sob as mesmas condições. A mistura de reação PEGuilada é carregada em uma coluna SP-Sefarose HP equilibrada com 50mM de MES, pH 6,0, IOOmM de NaCl. Depois de uma etapa de lavagem 10 CV (volume de coluna) um gradiente de 0-600 mM de NaCl é aplicado para fracionar as frações PEGuiladas e não PEGuiladas. Frações são coletadas e alíquotas são analisadas por SDS-PAGE. Frações contendo espécies monoPEGuiladas são agrupadas e formuladas para ensaios para atividade de interferon-alfa como descrito acima.

PEGuilação N-terminal

PEGuilação N-terminal com mPEG-butiraldeído (tendo uma unidade PEG tal como um mPEG linear de 20 kDa ou 30 kDa, ou um mPEG2 ramificado de 40 kDa) pode ser realizada a 4°C usando um excesso molar de 5 vezes de reagente rpolipeptídeo PEG por 4-8 horas em 50 mM de MES, pH 5,5, 100 mM de NaCl, e 20 mM de cianoborohidreto de sódio, ou em 50 mM de acetato de sódio, pH 5,5, 100 mM de NaCl, e 20 mM de cianoborohidreto de sódio. Conjugados são isolados por cromatografia sobre uma coluna SP- Sefarose HP equilibrada com 50mM de MES, pH 5,5, IOOmM de NaCl, usando um gradiente de 0-600 mM de NaCl em 50mM de MES5 pH 5,5. Frações contendo espécies monoPEGuiladas são agrupadas e formuladas para ensaios para atividade de interferon-alfa como descrito acima, e podem ser adicionalmente caracterizadas, por exemplo, usando HPLC analítico, análise de aminoácidos e/ou espectrometria de massa MALDI-TOF.

PEGuilação de Lisina

PEGuilação de lisina pode ser realizada usando um procedimento baseado naquele descrito por Foser et al. (2003) Protein Expression & Purification 30:78-87. Resumidamente, o polipeptídeo é reagido com um reagente de mPEG2-NHS (tal como, um mPEG linear de 20 kDa ou 30 kDa, ou um mPEG2 ramificado de 40 kDa) em uma proporção molar de 1:3 de polipeptídeo:PEG em 50 mM de tampão de borato, pH 9,0, por 2 h a 4°C. Conjugados são isolados por cromatografia de troca catiônica usando SP-Sefarose HP. Frações contendo espécies monoPEGuiladas podem ser combinadas e formuladas para ensaios de atividade de interferon-alfa como descrito acima, e podem ser adicionalmente caracterizadas por análise de aminoácidos e/ou espectrometria de massa MALDI-TOF.

EXEMPLO 4: ENSAIOS IN VIVO

Medidas de perfis farmacocinético (PK) e farmacodinâmico (PD) de um polipeptídeo ou conjugado da invenção

Medida de meia vida biológica ou no soro pode ser realizada de diversas formas descritas na literatura. Por exemplo, meia vida biológica pode ser determinada usando um método ELISA para detectar níveis de interferon-alfa no soro depois de por exemplo administração subcutânea ou intramuscular. Uso de um método ELISA para determinar a farmacocinética de interferon-alfa administrado subcutaneamente é por exemplo descrito por Rostaing et al. (1998), J. Am. Soe. Nephrol. 9(12): 2344-48. Merimsky et al. (1991), Câncer Chemother. Pharmacol. 27(5); 406-8, descrevem a determinação do nível no soro de um interferon-alfa administrado intramuscularmente.

Por exemplo, os perfis farmacocinético (PK) e farmacodinâmico (PD) de um conjugado da invenção podem ser estudados em macacos Cynomolgus {Macaca fascicularis) de acordo com o procedimento seguinte. Animais fêmeas de três a quatro anos de idade com um peso médio de 5-6 kg são usados no estudo. Animais são aclimatizados por um mínimo de 6 semanas entre a chegada e o início do tratamento com um período mínimo de 3 semanas de aclimatização para estudar condições de alojamento. Eles são alojados unicamente em gaiolas aramadas de aço inoxidável (pelo menos 540 χ 810 χ 760 mm) e são mantidos em uma dieta de primata comercial completa expandida (100 gramas/animal;dia) analisado para a ausência de contaminantes químico e bacteriano. Em adição, animais recebem fruta diariamente (maça ou banana). Animais são jejuados antes de todos os procedimentos requerendo anestesia.

Três dias antes da iniciação do estudo e no dia da iniciação do estudo antes da administração dos compostos, amostras de sangue são coletadas de todos os animais. Do começo ao fim do estudo, amostras de sangue (1 ml de todo o sangue) são retiradas de uma veia femoral ou cefálica/safenosa do animal retido manualmente não anestesiado. O regime de alimentação normal é mantido durante coleta. Amostras são coletadas em tubos sem anticoagulante, seguido por centrifugação a 3000 rpm (cerca de 1760 g) por 10 minutos a 4°C. As amostras de soro são então separadas em duas alíquotas (aproximadamente 200 μΐ cada) e armazenadas a -20°C.

Antes da iniciação do estudo, o conjugado da invenção é formulado em 20 mM de acetato de sódio (pH 6,0) e 140 mM de cloreto de sódio. Na iniciação do estudo, o conjugado é administrado uma vez por animal a ou 30 mcg conjugado/kg peso animal (quatro animais), ou 300 mcg/kg (quatro animais), usando uma seringa estéril e agulha introduzida subcutaneamente depois de desinfecção local com uma solução aquosa de álcool etílico. Amostras de sangue são coletadas nos seguintes momentos depois da administração do conjugado: 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 144 horas, 240 horas, 336 horas, 456 horas, 552 horas, 600 horas, 624 horas, 648 horas, 672 horas, 696 horas, 720 horas e 744 horas (ou outros momentos se apropriado).

Os animais são observados diariamente para detectar quaisquer sinais clínicos ou reação ao tratamento. Sítios de injeção são visualmente verificados diariamente a fim de avaliar tolerância local. Uma avaliação clínica detalhada é realizada antes da iniciação do tratamento e no término do estudo.

A concentração do conjugado nas amostras de soro isoladas são determinadas depois da compleção do estudo, usando um ensaio ELISA. A meia vida in vivo do conjugado em macacos Cynomolgus é então determinada baseado na concentração no soro dos compostos nos momentos especificados.

A resposta farmacodinâmica de macacos cynomolgus ao tratamento com um conjugado da invenção é avaliada medindo os níveis de 2',5'-oligoadenilato sintetase e neopterina em cada uma das amostras de soro, usando um RIA disponível comercialmente (Eiken Chemical Co., Tokyo) e um ELISA disponível comercialmente (IBL Immuno Biological Laboratories, Hamburg.), respectivamente. Baseado nas concentrações medidas destes dois biomarcadores para atividade de interferon nas amostras de soro, a Area Sob a Curva (AUC) é determinada para quantificar a atividade in vivo de cada composto em cada uma das duas dosagens.

Determinando imunogenicidade in vitro

Imunogenicidade reduzida de um polipeptídeo ou conjugado da invenção em relação a uma molécula de referência pode ser determinada pelo uso de um método ELISA medindo a imunoreatividade da molécula em relação a uma molécula ou preparação de referência, tipicamente uma proteína interferon-alfa conhecida. O método ELISA é baseado em anticorpos de pacientes tratados com a proteína de referência. A imunogenicidade é considerada ser reduzida quando o polipeptídeo ou conjugado da invenção tem uma resposta menor estatisticamente significativa no ensaio do que a molécula ou preparação de referência.

Embora a precedente invenção tenha sido descrita em algum detalhe para propósitos de clareza e compreensão, será claro para alguém versado na técnica a partir da leitura desta descrição que várias mudanças na forma e detalhe podem ser feitas sem afastar-se do verdadeiro escopo da invenção. É entendido que os exemplos e formas de realização descritos neste lugar são somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças na luz destes serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e são para serem incluídas no espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações inclusas. Por exemplo, todas as técnicas e equipamentos descritos acima podem ser usados em várias combinações. Todas publicações, patentes, pedidos de patente, e/ou outros documentos citados neste pedido são incorporados neste lugar pela referência na sua totalidade para todos os propósitos na mesma extensão como se cada publicação, patente, pedido de patente, e/ou outro documento individual fosse indicado individualmente para ser incorporado neste lugar pela referência em sua totalidade para todos os propósitos. LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Maxygen, Inc.

<120> POLIPEPTÍDEOS INTERFERON-ALFA DESENVOLVIDOS

<130> 0284.2IOWO

<150> US 60/682,769

<151> 2005-05-18

<160> 335

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Arg Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Pro Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 2 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45 Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Trp Val Gly Gly Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 3 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 3

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Arg Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 4 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 4

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile 1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Trp Val Gly Gly Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 5 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 5

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Met Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Val Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 6 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 6

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 43

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<213> Seqüência artificial <220>

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<213> Seqüência artificial <220>

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 46

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 47

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 48

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 49

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Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

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Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

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Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

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Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

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Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

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Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

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Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

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Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

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115 120 125

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 67

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 68

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 69

Cys Asp Leu Pro Gln Thr

1 5

Leu Leu Ala Gln Met Gly 20

Arg His Asp Phe Arg Ile 35

Gln Lys Ala Gln Ala Ile 50

Phe Asn Leu Phe Ser Thr 65 70

Leu Leu Glu Lys Phe Ser 85

Glu Ala Cys Val Ile Gln 100

Asn Val Asp Ser Ile Leu 115

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys 130

Arg Ala Glu Ile Met Arg 145 150

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético

His Ser Leu Gly Asn 10

Arg Ile Ser Pro Phe 25

Pro Gln Glu Val Phe 40

Ser Val Leu His Glu 55

Glu Asp Ser Ser Ala 75

Thr Glu Leu Tyr Gln 90

Glu Val Gly Val Glu 105

Ala Val Arg Lys Tyr 120

Lys Tyr Ser Pro Cys 135

Ser Phe Ser Phe Ser 155

Arg Arg Ala Leu Ile 15

Ser Cys Leu Lys Asp 30

Asp Gly Asn Gln Phe 45

Met Ile Gln Gln Thr 60

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Glu Thr Pro Leu Met 110

Phe Gln Arg Ile Thr 125

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Thr Asn Leu Gln Lys 160 <400> 70

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

100 105 110

Asn Glu Gly Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <4 00> 173

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <4 00> 174

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <4 00> 175

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <4 00> 176

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <4 00> 177

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15 10 15

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1 5 10 15

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 193

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <4 00> 194

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

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50 55 60

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Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

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Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 195 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <4 00> 195

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

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35 40 45

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 196

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Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30

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<212> PRT

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<220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético

<400> 197

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Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 198 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 198

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 214

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptídeo IFN-alfa sintético <400> 215

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptídeo IFN-alfa sintético <400> 216

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

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115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Gly Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

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Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 217

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 218

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 219

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15 10 15

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35 40 45

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50 55 60

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 235

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<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 236

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<220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 238

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<210> 241 <211> 166 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 241

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<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 264

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Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile 20

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu

35 40

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val

50 55

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp 65 70

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu 85

Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val 100

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val 115 120

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr

130 135

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe 145 150

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 265 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa <400> 265 Cys Asp Leu Pro 1

Leu Leu Ala Gln 20

Arg His Asp Phe 35

Gln Lys Ala Gln 50

Phe Asn Leu Phe 65

Leu Leu Glu Lys

Glu Ala Cys Val 100

10 15

Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 25 30

Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe 45

Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr 60

Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Arg

75 80

Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

90 95

Gly Val Thr Gly Ala Pro Leu Met 105 110

Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 125

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 140

Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 155 160

Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Ile

10 15

Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 25 30

Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 45

Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr 60

Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser

75 80

Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu

90 95

Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Arg 105 110

sintético

Gln Thr His Ser 5

Met Gly Arg Ile

Arg Ile Pro Gln 40

Ala Ile Ser Val 55

Ser Thr Glu Asp 70

Phe Tyr Ile Glu 85

Ile Gln Glu Val Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 266 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 266

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Ile

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 267 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220> <223> Polipeptideo IFN-alfa sintético

<400> 267

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 268 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 268

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Met Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

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Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 269 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 269

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Asp Thr Trp Asp Val Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 270 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 270

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 271 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptídeo IFN-alfa sintético <400> 271

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Arg Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Ile Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 272 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 272

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Leu Leu Asp Lys Phe Tyir Ιΐθ Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

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100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 273 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 273

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 274 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 274

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

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50 55 60

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Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 275 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 275

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 276 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 276

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 277 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 277

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 15 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

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35 40 45

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50 55 60

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Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 278 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 278

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 279 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 279

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Thr Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 280 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 280

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Leu Met

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Met Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys His Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 281 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 281

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Ile Gln Gln Thr

50 55 60

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Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

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115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 282 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 282

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Met Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 283 <211> 166 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 283

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Phe Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Met Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 284 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 284

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 285 <211> 166 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 285

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

15 10 15

Leu Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

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<213> Homo Sapiens <400> 320

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<213> Homo Sapiens <400> 321

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<213> Homo Sapiens <400> 322

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<213> Homo Sapiens

<400> 323

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<213> Homo Sapiens <400> 324

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<213> Homo Sapiens <400> 325

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Gln Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Ile Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Val Ala Trp Asp Glu Arg 65 70 75 80

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<210> 326 <211> 166 <212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 326

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

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<210> 327 <211> 166 <212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 327

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<210> 328 <211> 166 <212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 328

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Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Asp 165

<210> 329 <211> 166 <212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 329

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

15 10 15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Asp 165

<210> 330 <211> 166 <212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 330

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Gly Leu Arg Arg Lys Asp 165

<210> 331 <211> 166 <212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 331

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

15 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Met Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys 145 150 155 160

Ile Leu Arg Arg Lys Asp 165

<210> 332 <211> 166 <212> PRT

<213> Homo Sapiens <400> 332

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser 65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser* Thir Glu Leu. Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 333 <211> 167 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo IFN-alfa sintético <400> 333 Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

15 10 15

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

20 25 30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

35 40 45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

50 55 60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 65 70 75 80

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

85 90 95

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile

115 120 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

130 135 140

Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 145 150 155 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165

<210> 334 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo sintético etiqueta-E <400> 334

Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg

15 10

<210> 335 <211> 15 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo sintético etiqueta-S <400> 335

Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser 15 10 15

Claims (37)

1. Polipeptídeo isolado ou recombinante, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência que difere em 0 a 8 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:312; SEQ ID NO:262; SEQ ID NO:266; SEQ ID NO:232; SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:297; SEQ ID NO: 167; SEQ ID NO: 107; SEQ ID N0:208; SEQ ID NO:94; SEQ ID NO: 141; SEQIDNO:46; SEQ ID NO: 171; SEQIDNO:310; SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:89; SEQ ID NO:296; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO:87; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO:234; SEQ ID N0:30; SEQ ID NO: 179; SEQ ID NO:2; SEQ ID N0:260; SEQ ID N0:306; SEQ ID N0:140; SEQ ID NO:127; SEQ ID NO:293; SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 191; SEQ ID NO:263;SEQ BDNO:l; SEQ ID NO:298; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:258; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID N0:303; e SEQ ID NO:6, cujo polipeptídeo exibe atividade antiviral.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência que difere em 0 a 6 posições de aminoácidos de uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:312; SEQ ID NO:262; SEQ ID NO:266; SEQ ID NO:232; SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:297; SEQ ID NO:167; SEQ ID N0:107; SEQ ID N0:208; SEQ ID NO:94; SEQ ID NO:141; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:171; SEQ ID N0:310; SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:89; SEQ ID NO:296; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO:87; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO:234; SEQ ID N0:30; SEQ ID NO: 179; SEQ ID NO:2; SEQ BD N0:260; SEQ ID N0:306; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 127; SEQ ID NO:293; SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 191; SEQ ID NO:263;SEQ ID NO:l; SEQ ID NO:298; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:258; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ BD N0:303; e SEQ ID NO:6.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID NO:312; SEQ ID NO:262; SEQ ID NO:266; SEQ ID NO:232; SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:297; SEQ ID NO: 167; SEQ ID NO: 107; SEQ ID N0:208; SEQIDNO:94; SEQIDNO:141; SEQIDNO:46; SEQIDNO:171; SEQ ID N0:310; SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:89; SEQ ID NO:296; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO:87; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO:234; SEQ ID N0:30; SEQ ID NO: 179; SEQ ID NO:2; SEQ ID N0:260; SEQ ID N0:306; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 127; SEQ ID NO:293; SEQ ID NO:195; SEQ ID NO:191; SEQ ID NO:263;SEQ ID NO:l; SEQ ID NO:298; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:258; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID N0:303; e SEQ ID NO:6.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a atividade antiviral do polipeptídeo é pelo menos duas vezes maior do que a atividade antiviral de huIFN-alfa 2b ou huIFN-alfa 2a no ensaio antiviral HeLa/EMCV.

5. Conjugado, caracterizado pelo fato de compreender (i) o polipeptídeo como definido na reivindicação 1; e (ii) uma porção não polipeptídica covalentemente ligada ao polipeptídeo.

6. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos duas porções não polipeptídicas.

7. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender uma porção não polipeptídica covalentemente ligada a um resíduo de cisteína.

8. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender uma porção não polipeptídica covalentemente ligada a um resíduo de lisina ou ao grupo amino N-terminal.

9. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender uma porção não polipeptídica covalentemente ligada a um resíduo de lisina.

10. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender uma porção não polipeptídica ligada ao grupo amino N-terminal.

11. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a porção não polipeptídica é um polietilenoglicol.

12. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a porção não polipeptídica é um açúcar.

13. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o açúcar é ligado a um sítio de N-glicosilação do polipeptídeo.

14. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o conjugado como definido na reivindicação 5 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

16. Polinucleotídeo isolado ou recombinante, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

17. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16.

18. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16.

19. Vetor de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que é um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor.

20. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender o vetor como definido na reivindicação 18.

21. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

22. Método para preparar o polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: fornecer uma cultura compreendendo uma célula hospedeira, a célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo um promotor operavelmente ligado a um polinucleotídeo, o polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo, cultivar a cultura em condições que permitem expressão do polipeptídeo, e recuperar o polipeptídeo.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira bacteriana.

25. Método para preparar um conjugado, caracterizado pelo fato de compreender (i) fornecer o polipeptídeo como definido na reivindicação 1, e (ii) ligar pelo menos uma porção não polipeptídica ao polipeptídeo, em que o conjugado resultante exibe atividade antiviral.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a etapa de fornecer o polipeptídeo compreende: fornecer uma cultura compreendendo uma célula hospedeira, a célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo um promotor operavelmente ligado a um polinucleotídeo, o polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo, cultivar a cultura em condições que permitem expressão do polipeptídeo, e recuperar o polipeptídeo.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica ou uma célula hospedeira bacteriana.

28. Método para inibir replicação de um vírus em células infectadas com o vírus, caracterizado pelo fato de compreender: administrar às células o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou o conjugado como definido na reivindicação 5 em uma quantidade eficaz para inibir replicação do vírus nas células, com isto inibindo replicação do vírus em ditas células.

29. Método para reduzir o número de cópias de um vírus em células infectadas com o vírus, caracterizado pelo fato de compreender: administrar o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou o conjugado como definido na reivindicação 5 às células em uma quantidade eficaz para reduzir o número de cópias do vírus nas células, com isto reduzindo o número de cópias do vírus em ditas células.

30. Método para reduzir o nível de RNA de HCV no soro de um paciente infectado com HCV, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao paciente o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou o conjugado como definido na reivindicação 5 em uma quantidade eficaz para reduzir o nível de RNA de HCV comparado com o nível de RNA de HCV presente antes do início de tratamento.

31. Método para reduzir o nível de DNA de HBV em soro de um paciente infectado com HBV, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao paciente o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou o conjugado como definido na reivindicação 5 em uma quantidade eficaz para reduzir o nível de DNA de HBV comparado com o nível de DNA de HBV presente antes do início de tratamento.

32. Método para reduzir o nível de RNA de HIV em soro de um paciente infectado com HIV, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao paciente o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou o conjugado como definido na reivindicação 5 em uma quantidade eficaz para reduzir o nível de RNA de HIV comparado com o nível de RNA de HIV presente antes do início de tratamento.

33. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou o conjugado de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de ser para uso como um produto farmacêutico.

34. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou do conjugado como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um produto farmacêutico para inibir replicação de um vírus em células infectadas com o vírus.

35. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou do conjugado como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um produto farmacêutico para reduzir o número de cópias de um vírus em células infectadas com o vírus.

36. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou do conjugado como definido na reivindicação 5 caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um produto farmacêutico para reduzir o nível de um vírus no soro de um paciente infectado com o vírus.

37. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- -36, caracterizado pelo fato de que o vírus é HCV, HBV5 ou HIV.