CN101501068A

CN101501068A - 改进的α-干扰素多肽

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Publication number: CN101501068A
Application number: CNA2006800222000A
Authority: CN
Inventors: 马丹·M·佩邓加特; 伊恩·萨斯; 托马斯·布奎因; 戴维·林; 泰迪·陈; 道格拉斯·格普蒂尔; 埃米·布里迪厄-安德森; 史蒂文·H·巴斯; 菲利普·A·帕滕
Original assignee: Maxygen Inc
Current assignee: Maxygen Inc
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2009-08-05
Also published as: US7619067B2; WO2007044083A3; JP2008545393A; MX2007014524A; IL186880A0; BRPI0609809A2; CA2607651A1; WO2007044083A2; AU2006299901A1; US20080226597A1; KR20080019619A; EP1888633A4; EP1888633A2

Abstract

本发明提供了改进的α－干扰素多肽及其偶联物，以及编码该多肽的核酸。本发明还包括包含这些多肽、偶联物和核酸的组合物；含有或表达该多肽、偶联物和核酸的细胞；制备该多肽、偶联物、核酸的方法；和使用该多肽、偶联物和核酸的方法。

Description

改进的α-干扰素多肽

相关申请的交叉引用

根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求获得2005年5月18日提交的美国临时专利申请流水号60/682,769的利益，并引证其公开的全部内容。

发明领域

本发明一般地涉及多核苷酸及其编码的多肽、多肽的偶联物，以及载体、细胞、抗体，和使用与生产该多核苷酸、多肽和偶联物的方法。

发明背景

α-干扰素是种类繁多的细胞因子基因螺旋束超家族的成员(Sprang，S.R.et al.(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3：815-827)。编码人α-干扰素的基因家族由超过20个串联重复非等位基因和假基因组成，它们在氨基酸水平上有85-98％的相似性(Henco，K.et al.(1985)J.Mol.Biol.185：227-260)。表达活性α-干扰素蛋白的基因可根据遗传座位分成13个家族。已知表达的人类α-干扰素蛋白及其等位变化形式在下文中有列表：Allen G.and Diaz M.O.(1996)J.Interferon and Cytokine Res.16：181-184。

α-干扰素可抑制各种类型的细胞增殖，尤其有用于治疗经常与癌症相关的多种细胞增殖紊乱，特别是血液恶性病变如白血病。这些蛋白质对抗多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、低度淋巴瘤、卡波西肉瘤、慢性骨髓性白血病、肾细胞癌、膀胱肿瘤和卵巢癌显示有抗增殖活性(Bonnem，E.M.etal.(1984)J.Biol.Response Modifiers 3：580；Oldham，R.K.(1985)HospitalPractice 20：71)。

α-干扰素还可用于对抗各种类型的病毒感染(Finter，N.B.et al.(1991)Drugs 42(5)：749)。α-干扰素具有抗人乳头瘤病毒感染、乙型肝炎和丙型肝炎感染的活性(Finter，N.B.et al.，1991，见前文；Kashima，H.et al.(1988)Laryngoscope 98：334；Dusheiko，G.M.et al.(1986)J.Hematology 3(Supple.2)：S199；Davis，GL et al.(1989)N.England J.Med.321：1501)。干扰素和干扰素受体在某些自身免疫和炎症疾病发病机理中的作用也有研究(Benoit，P.et al.(1993)J.Immunol.150(3)：707)。

尽管这些蛋白质在许多疾病的治疗中均具有治疗价值，但是尚未有人将它们最优化以供用作药物。例如，对剂量造成限制的毒性、受体交叉反应性、以及较短的血清半衰期，显著地降低了许多这类细胞因子的临床效用(Dusheiko，G.(1997)Hepatology 26：112S-121S；Vial，T.and Descotes，J.(1994)Drug Experience 10：115-150；Funke，I.et al.(1994)Ann.Hematol.68：49-52；Schomburg，A.et al.(1993)J.Cancer Res.Clin.Oncol.119：745-755)。伴随着干扰素的施用产生多种严重的副作用，包括流行性感冒样症状、疲劳、幻觉、发热、肝酶升高和白细胞减少(Pontzer，C.H.et al.(1991)Cancer Res.51：5304；Oldham，1985，见前文)。

丙型肝炎病毒(HCV)是非宿主整合性RNA病毒，具有极高的复制率(rateofreplication)，因此具有高度的遗传多样性。已经鉴定了至少6种HCV RNA基因型和超过30种亚型。HCV基因型已被证明是预测对IFN-α治疗的响应的指标。已发现感染HCV基因型2和3的患者通常对干扰素治疗响应良好。感染基因型4、5和6的患者响应往往较差。感染HCV基因型1的患者对干扰素治疗的响应往往非常差，其中大约50％的基因型1患者被归为IFN-α治疗“无响应者”。基因型1是目前最普遍的丙型肝炎形式，美国患者的大约70％、欧洲患者的50％是受其感染的。显然，对HCV感染特别是基因型1变型感染更有效的治疗方法是人们亟需的。

有遗传和生物化学证据表明，基因型1HCV(及其它亚型)通过抑制关键的IFN响应蛋白，例如ds-RNA激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKR，而积极地减弱IFN-α的信号通路(Katze M.G.，et al.(2002)Nat.Rev.Immunol.2(9)：675-687)。上述遗传多样性和积极抑制抗病毒响应可能造成的一个结果，就是HCV(特别是基因型1)具有逃逸宿主免疫监视的能力，从而导致较高的慢性感染率。HCV广泛的遗传异质性具有重要的诊断和临床意义，它可能为临床过程中的变化、疫苗难于开发和对治疗缺乏响应等问题提供解释。

本发明致力于解决对于表现更高的抗病毒和/或免疫调制效能的α-干扰素分子的需求。本发明提供了新型α-干扰素多肽和多肽偶联物、编码这些多肽的核酸，和使用这些分子的方法。这些分子可有益地用于多种用途，包括例如，治疗和预防处理，尤其是用于病毒感染和与病毒感染相关的疾病和病症的治疗和预防处理。本发明满足这些和其它的需要。

发明概述

本发明提供了新型多肽，包括它们的变体和包含这些多肽的融合蛋白。本发明还提供了包含与一个或多个非多肽部分共价连接的本发明多肽的偶联物。本发明还提供了编码本发明任何一种多肽的核酸，和包含这些核酸的载体和宿主细胞。此外，本发明提供了制备和使用这些多肽、偶联物和核酸的方法，以及通过进一步研究可以明了的其它特征。

在一个方面中，本发明提供了分离或重组的多肽，该多肽包含标识为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：319之一的序列。本发明还提供了包含这些多肽之中的任何多肽的融合蛋白和偶联物，编码这些多肽的核酸，以及制备和使用这些多肽的方法。

本发明还提供了分离或重组的多肽，它们各自包含如下所述的序列：该序列与选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：319中的序列相比，在0-16个氨基酸位置上不同，例如在0，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置上不同，例如在0-16个氨基酸位置上不同，在0-15个氨基酸位置不同，在0-14个氨基酸位置上不同，在0-13个氨基酸位置上不同，在0-12个氨基酸位置上不同，在0-11个氨基酸位置上不同，在0-10个氨基酸位置上不同，在0-9个氨基酸位置上不同，在0-8个氨基酸位置上不同，在0-7个氨基酸位置上不同，在0-6个氨基酸位置上不同，在0-5个氨基酸位置上不同，在0-4个氨基酸位置上不同，在0-3个氨基酸位置上不同，在0-2个氨基酸位置上不同，或在0-1个氨基酸位置上不同。某些这样的多肽包含如下所述的序列，该序列与选自下组的序列相比在0到16个氨基酸位置上不同：SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：46，SEQID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：140，SEQ IDNO：141，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：179，SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：208，SEQ IDNO：232，SEQ ID NO：234，SEQ ID NO：258，SEQ ID NO：260，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：263，SEQ ID NO：266，SEQ ID NO：293，SEQ ID NO：296，SEQ IDNO：297，SEQ ID NO：298，SEQ ID NO：303，SEQ ID NO：306，SEQ ID NO：310，和SEQ ID NO：312。某些这样的多肽表现α-干扰素活性(例如抗病毒活性、T_H1分化活性、和/或抗增殖活性)。

本发明还包括分离或重组多肽，它们各自包含这样的序列，该序列与选自下组的序列相比，在0到16个氨基酸位置上不同：SEQ ID NO：312(M01)；SEQ ID NO：262(M04)；SEQ ID NO：266(M05)；SEQ ID NO：232(M23)；SEQID NO：88(M45)；SEQ ID NO：297(M20)；SEQ ID NO：167(M27)；SEQ IDNO：107(M09)；SEQ ID NO：208(M02)；SEQ ID NO：94(M33)；SEQ IDNO：141(M37)；SEQ ID NO：46(M30)；SEQ ID NO：171(M22)；SEQ IDNO：310(M24)；SEQ ID NO：176(M44)；SEQ ID NO：26(M31)；SEQ ID NO：89(M10)；SEQ ID NO：296(M14)；SEQ ID NO：148(M03)；SEQ ID NO：18(M46)；SEQ ID NO：10(M26)；SEQ ID NO：87(M21)；SEQ ID NO：103(M38)；SEQ IDNO：234(M28)；SEQ ID NO：30(M19)；SEQ ID NO：179(M11)；SEQ ID NO：2(M34)；SEQ ID NO：260(M07)；SEQ ID NO：306(M18)；SEQ ID NO：140(M40)；SEQ ID NO：127(M16)；SEQ ID NO：293(M25)；SEQ ID NO：195(M29)；SEQID NO：191(M36)；SEQ ID NO：263(M06)；SEQ ID NO：1(M32)；SEQ IDNO：298(M39)；SEQ ID NO：24(M42)；SEQ ID NO：258(M08)；SEQ IDNO：124(M35)；SEQ ID NO：7(M41)；SEQ ID NO：9(M12)；SEQ ID NO：303(M17)；和SEQ ID NO：6(M43)；例如在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置上不同，例如在0-16个氨基酸位置上不同，在0-15个氨基酸位置上不同，在0-14个氨基酸位置上不同，在0-13个氨基酸位置上不同，在0-12个氨基酸位置上不同，在0-11个氨基酸位置上不同，在0-10个氨基酸位置上不同，在0-9个氨基酸位置上不同，在0-8个氨基酸位置上不同，在0-7个氨基酸位置上不同，在0-6个氨基酸位置上不同，在0-5个氨基酸位置上不同，在0-4个氨基酸位置上不同，在0-3个氨基酸位置上不同，在0-2个氨基酸位置上不同，或在0-1个氨基酸位置上不同，例如下面描述的多肽。某些这样的多肽表现α-干扰素活性(例如抗病毒活性、T_H1分化活性、和/或抗增殖活性)。某些这样的多肽在HeLa/EMCV抗病毒测定中显示比人IFN-α2a高至少两倍的抗病毒活性。某些这样的多肽与人α-干扰素受体结合的亲和力比IFN-α 2a更高(EC₅₀更低)。这些多肽还可以进一步包括一个或多个额外的氨基酸，例如添加到N末端的甲硫氨酸。本发明还提供了包含这些多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码这些多肽的分离或重组的核酸。

本发明还提供了偶联物，它包含本发明的多肽，例如任何如上所述的本发明多肽，和至少一个与该多肽的连接基团连接的非多肽部分，其中该偶联物显示α-干扰素活性。在一些实例中，非多肽部分是聚合物(例如，聚环氧烷烃分子，如聚乙二醇(PEG)，例如单甲氧基聚乙二醇(mPEG))，或者糖部分。所述至少一个非多肽部分可以，例如，连接于半胱氨酸、赖氨酸、多肽的N末端氨基、或多肽的体内糖基化位点。本发明还提供了制备和使用这些偶联物的方法。

本发明还提供了编码任何本发明多肽的分离或重组的核酸。本发明还提供了包含这些核酸的载体和宿主细胞，以及制备本发明多肽的方法，包括培养包含这些核酸的宿主细胞。

在另一个方面中，本发明提供了一种在感染病毒的细胞内抑制所述病毒复制的方法，该方法包括使感染病毒的细胞与本发明的多肽或偶联物接触。本发明还提供了在感染病毒的细胞内减少病毒拷贝数的方法，包括使感染病毒的细胞与本发明的多肽或偶联物接触。

在另一个方面中，本发明提供了治疗对α-干扰素有响应的病症的方法，包括向患有该病症的受试者施用包含本发明多肽或本发明偶联物的组合物，其中本发明多肽或本发明偶联物的量足以改善所述病症的相关症状。上述病症包括慢性丙型肝炎病毒感染、慢性乙型肝炎病毒感染、毛细胞白血病、恶性黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、AIDS相关的卡波西肉瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性粒细胞白血病、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、类癌、膀胱癌、克罗恩病(Crohn’s disease)、皮肤T细胞淋巴瘤、肾细胞癌、多发性硬化和AIDS。本发明还包括包含本发明多肽或本发明偶联物的组合物用于治疗对α-干扰素有响应的病症，例如上述病症的用途。

联系附图阅读下文的详细说明书，本发明的这些和其它目的和特征将更加显而易见。

附图简述

图1显示了一种本发明多肽的序列(SEQ ID NO：1)与下列人α-干扰素(huIFN-α)多肽序列的比对：huIFN-α 1a(SEQ ID NO：320)，huIFN-α 2b(SEQID NO：321)，huIFN-α 4b(SEQ ID NO：323)，huIFN-α 5(SEQ ID NO：324)，huIFN-α 6(SEQ ID NO：325)，huIFN-α 7a(SEQ ID NO：326)，huIFN-α 8b(SEQID NO：327)，huIFN-α 10a(SEQ ID NO：328)，huIFN-α 14a(SEQ ID NO：329)，huIFN-α 16(SEQ ID NO：330)，huIFN-α 17b(SEQ ID NO：331)和huIFN-α21b(SEQ ID NO：332)。huIFN-α序列的命名规则是根据Allen G.and Diaz M.O.(1996)J.Interferon and Cytokine Res.16：181-184。SEQ ID NO：320-321和SEQ ID NO：323-332中与SEQ ID NO：1一致的氨基酸残基位置用句点(.)表示，序列中的缺口用短横线(-)表示。

图2显示了一种本发明多肽的序列(SEQ ID NO：312)与上述人α-干扰素多肽序列SEQ ID NOs：320-321和323-332的比对。SEQ ID NOs：320-321和323-332中与SEQ ID NO：312一致的氨基酸残基位置用句点(.)表示，序列中的缺口用短横线(-)表示。

图3显示了本发明如下示例多肽在HeLa/EMCV测定中的抗病毒活性，用EC₅₀(ng/ml)表示：M04(SEQ ID NO：262)；M05(SEQ ID NO：266)；M23(SEQID NO：232)；M45(SEQ ID NO：88)；M01(SEQ ID NO：312)；M20(SEQ IDNO：297)；M27(SEQ ID NO：167)；M09(SEQ ID NO：107)；M02(SEQ IDNO：208)；M33(SEQ ID NO：94)；M37(SEQ ID NO：141)；M30(SEQ ID NO：46)；M22(SEQ ID NO：171)；M24(SEQ ID NO：310)；M44(SEQ ID NO：176)；M31(SEQ ID NO：26)；M10(SEQ ID NO：89)；M14(SEQ ID NO：296)；M03(SEQ IDNO：148)；M46(SEQ ID NO：18)；M26(SEQ ID NO：10)；M21(SEQ ID NO：87)；M38(SEQ ID NO：103)；M28(SEQ ID NO：234)；M19(SEQ ID NO：30)；M11(SEQ ID NO：179)；M34(SEQ ID NO：2)；M07(SEQ ID NO：260)；M18(SEQ IDNO：306)；M40(SEQ ID NO：140)；M16(SEQ ID NO：127)；M25(SEQ IDNO：293)；M29(SEQ ID NO：195)；M36(SEQ ID NO：191)；M06(SEQ IDNO：263)；M32(SEQ ID NO：1)；M39(SEQ ID NO：298)；M42(SEQ ID NO：24)；M08(SEQ ID NO：258)；M35(SEQ ID NO：124)；M41(SEQ ID NO：7)；M12(SEQ ID NO：9)；M17(SEQ ID NO：303)；和M43(SEQ ID NO：6)，与对照α-干扰素多肽huIFNα-2a(SEQ ID NO：322)和huIFNα-2b(SEQ ID NO：321)的活性比较。

图4显示了BLOSUM62替代矩阵。

图5A，5B和5C显示了用于确定最优序列比对的比对分数计算实例，使用如下的参数：BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分＝11，缺口延伸罚分＝1。图5A显示了SEQ ID NO：1第29-50残基(上)与SEQ ID NO：312第30-52残基(下)的比对。图5B和5C分别显示了SEQ ID NO：312第29-50残基(上)与SEQ IDNO：321第30-50残基(下)的比对，其中图5B显示了比对中没有引入缺口的比对分数计算，而图5C显示了在比对中引入缺口的比对分数计算。

图6A-6V显示了本发明示例多肽的氨基酸序列，本文标识为SEQ IDNO：1-319。

发明详述

定义

除非在文中或说明书的其余部分另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通晓的相同的意义。

取决于上下文，“多肽序列”(例如蛋白质、多肽、肽等)是指由天然存在的氨基酸或人工氨基酸类似物构成的氨基酸的聚合物，或者是代表氨基酸聚合物的字符串。考虑到遗传密码的简并，可以根据具体的多肽序列确定出一种或多种编码该多肽序列的核酸或其互补核酸。

“多核苷酸序列”(例如核酸、多核苷酸、寡核苷酸等)是包括核苷酸A、C、T、U、G或其它天然存在的核苷酸或人工核苷酸类似物的核苷酸聚合物，或者代表核酸的字符串，这取决于上下文。根据任何具体的多核苷酸序列可以确定给定的核酸或互补核酸。

若任何给定聚合物部分(例如氨基酸、核苷酸，也统称“残基”)的位置是依据选定氨基酸聚合物或核酸聚合物中一致或等同的位置，而非给定聚合物部分的实际数字位置指定，则所述给定氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号“相应于”或“针对”所述选定氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号。因此，例如，给定多肽序列中给定氨基酸位置的编号相应于用作参照序列的选定多肽序列中一致或等同的氨基酸位置。

“等同位置”(例如，“等同氨基酸位置”或“等同核酸位置”或“等同残基位置”)在本文中的定义为，当使用本文所述的比对算法最佳对齐时，与参照多肽(或参照多核苷酸)序列的相应位置对齐的测试多肽(或测试多核苷酸)序列的位置(例如氨基酸位置或核酸位置或残基位置)。测试多肽的等同氨基酸位置不一定与参照多肽的相应位置具有相同的数字位置编号；同样地，测试多核苷酸的等同核酸位置不一定与参照多核苷酸的相应位置具有相同的数字位置编号。例如，图1显示，本文标识为SEQ ID NO：1(克隆M32)的本发明多肽的序列与多种已知的人α-干扰素序列处于最佳对齐。在本实例中，SEQID NO：1的第90号氨基酸位置(Tyr90，也就是Y90)可看作SEQ ID NO：321(人IFN-α2b)的第89号氨基酸位置(Tyr89，也就是Y89)的等同氨基酸位置(也就是“等同于”)，这是因为SEQ ID NO：1的第90号氨基酸位置与SEQ ID NO：321的第89号氨基酸位置对齐。换言之，SEQ ID NO：1的第90号氨基酸位置“相应于”SEQ ID NO：321的第89号氨基酸位置。同样地，可以理解，SEQ ID NO：1的残基Y90(Tyr90)相应于例如SEQ ID NO：312(克隆M01，见图2)中的残基D90(Asp90)，从而，例如，针对SEQ ID NO：1的Y90F替代，可以理解为相应于，例如，针对SEQ ID NO：312的D90F替代，依此类推。

当使用确定的参数，即确定的氨基酸替代矩阵、缺口存在罚分(也称缺口开放罚分)和缺口延伸罚分进行比对，而获得这对序列可能的最高相似性分数时，则称这两个多肽序列被“最优对齐”。在多肽序列比对算法(例如BLASTP)中，经常用BLOSUM62矩阵(Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(22)：10915-10919)作为默认的得分替代矩阵。针对对齐的序列之一中单个氨基酸缺口的引入施加缺口存在罚分，针对缺口中的每一个残基位置施加缺口延伸罚分。除非另外说明，本文采用的比对参数如下：BLOSUM62得分矩阵，缺口存在罚分＝11，缺口延伸罚分＝1。对齐分数取决于每条序列上比对开始和结束(例如比对窗)的氨基酸位置，任选地取决于为达到最高的可能相似性得分而向这一条或两条序列中插入的一个或多个缺口，这一点在下文标题为“百分比序列同一性”的部分中有更详细的说明。

下面举例说明用于标识氨基酸位置和氨基酸替代的术语：Q52表示参照氨基酸序列如SEQ ID NO：1中第52号位置被谷氨酰胺(Gln)残基所占据。Q52E表示第52号位置的谷氨酰胺残基被谷氨酸(Glu)残基替代。可选择的替代用“/”表示，例如Q52E/P意味着第52号位置的谷氨酰胺残基被谷氨酸残基或脯氨酸残基替代的氨基酸序列。多重替代有时可以用“+”表示，例如A51T+Q52E/P表示在第51位苏氨酸残基替代丙氨酸残基，在第52位谷氨酸残基或脯氨酸残基替代谷氨酰胺残基的氨基酸序列。删除用星号表示。例如，Q52^*表示第52位的谷氨酰胺残基被删除。删除两个或更多个连续的氨基酸可以表示如下：例如R161^*-E166^*表示删除了R161-E166(含)的残基(即删除了残基161，162，163，164，164，165和166)。插入用如下方式表示：“Q52QS”表示在位于第52位的谷氨酰胺残基后面插入额外的丝氨酸。替代和插入的组合以如下方法表示：“Q52SA”表示用丝氨酸残基替代第52位的谷氨酰胺残基且在第52位氨基酸残基之后插入丙氨酸残基。

除非另外表示，本文记载的氨基酸残基的位置编号均针对氨基酸序列SEQ ID NO：1。可以理解的是，尽管本文中的实例和针对亲本多肽的修饰可能是针对序列SEQ ID NO：1(或者针对其它具体序列)来提供的，但是这些实例也适用于本发明其它的多肽，且本文描述的修饰可以在本文所述任何其它多肽的等同氨基酸位置(如上所述)上进行。因此，作为实例，针对SEQ IDNO：1的Y90F替代，可以理解为相应于SEQ ID NO：312的D90F替代，依此类推。

术语“表现(例如表现或具有)α-干扰素活性”意在表明本发明的多肽或偶联物具有参照α-干扰素多肽所表现的至少一种活性(所述参照α-干扰素多肽例如人α-干扰素多肽，如本文标识为SEQ ID NO：321的huIFN-α 2b，本文标识为SEQ ID NO：322的huIFN-α 2a，本文标识为SEQ ID NO：327的huIFN-α8b，或者任何其它本领域已知的α-干扰素多肽，例如在Allen G.and Diaz M.O.(1996，见前文)中列举的那些)。这类活性包括通过α-干扰素受体传导信号的能力，这种能力体现为，例如，下述的一种或多种活性：抑制感染病毒的细胞内的病毒复制或抑制致细胞病变效应(“抗病毒活性”)；促进幼稚T细胞分化成TH1表型和/或抑制幼稚T细胞分化成T_H2表型(“T_H1分化活性”)；或者抑制细胞增殖(“抗增殖活性”)。所述一种或多种α-干扰素活性用本领域已知的和/或实施例中描述的测定方法加以测定。

对于表现α-干扰素活性的多肽或偶联物而言，若它显示可测量的活性，例如可测量的抗病毒活性、抗增殖活性或T_H1分化活性(例如通过本领域已知的和/或实施例中描述的测定方法所确定的活性)，则认为该多肽或偶联物具有α-干扰素活性。本领域的技术人员公认，什么可构成可测量的活性在一定程度上取决于所进行测定的性质，但是作为一般的指导方针，可测量的活性指的是当存在测试化合物(例如本发明的多肽)时产生的测定信号与不存在测试化合物时产生的测定信号相比具有可以计量的差异。应当理解的是，本发明的多肽或偶联物并不需要表现某一特定参照α-干扰素的所有已知活性，或者表现与参照α-干扰素程度相同的所述活性。在一些情况下，本发明多肽或偶联物所表现的活性(例如体现为EC₅₀、比活性、或其它与数值相关的活性)可以大约等于、小于或大于由参照α-干扰素所表现的该种活性。

“变体”是包含与亲本多肽序列在一个或多个氨基酸位置上有差异的序列的多肽。例如，变体序列可包含这样的序列，它可以与亲本多肽序列在高达亲本多肽序列残基总数的10％的氨基酸中，例如高达亲本多肽序列残基总数的8％，例如6％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸中有差异。例如，SEQ ID NO：1的变体的序列可以与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置上(例如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置上)有差异，例如在1-15个氨基酸位置上，在1-14个氨基酸位置上，在1-13个氨基酸位置上，在1-12个氨基酸位置上，在1-11个氨基酸位置上，在1-10个氨基酸位置上，在1-9个氨基酸位置上，在1-8个氨基酸位置上，在1-7个氨基酸位置上，在1-6个氨基酸位置上，在1-5个氨基酸位置上，在1-4个氨基酸位置上，在1-3个氨基酸位置上，或在1-2个氨基酸位置上有差异。

术语“亲本多肽”或“亲本α-干扰素”意在表示根据本发明要加以修饰的多肽序列。亲本多肽序列可以是天然存在的IFN-α(诸如哺乳动物IFN-α，例如灵长类IFN-α，诸如人IFN-α，如本文标识为SEQ ID NO：320-332的huIFN-α多肽，或者其它huIFN-α多肽序列，如在本文和/或Allen G.and Diaz M.O.(1996)(见前文)中描述的huIFN-α多肽序列)的序列。亲本多肽序列可以是非天然存在的(即“合成的”)α-干扰素，例如IFN-α Conl(SEQ ID NO：333)的序列。在一些情况中，要修饰的亲本多肽自身即可以是本发明的多肽，例如SEQ ID NO：1-319中的任一个。

“天然存在”用于某个对象时，是指该对象可以在自然界中发现，区别于人工制造的对象。例如，存在于生物体(包括病毒、细菌、原生生物、昆虫、植物或哺乳动物组织)中，能够从自然来源分离，而未经人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列，是天然存在的。“非天然存在”(也称作“合成的”或“人工的”)用于目标对象是指该对象不是天然存在的——也就是，对象不能在自然界中发现，区别于人类人工制造的。

“片段”或“子序列”是整个序列的任何部分，上至但不包括整个序列。因此，片段或子序列是包含较长的氨基酸序列(例如，多肽)或核酸序列(例如，多核苷酸)的一部分的氨基酸序列或核酸序列。

本发明预期的一种片段类型是从亲本多肽的N末端或C末端(或者两者)除去了氨基酸残基的片段；这种多肽被分别看作是“N末端截短的”或“C末端截短的”。从N末端删除至少前4个氨基酸不会显著影响α-干扰素的活性(Lydon，N.B.et al.(1985)Biochemistry 24：4131-41)。还有人描述了从C末端删除了7和11个氨基酸且保留α-干扰素活性的变体(Cheetham B.F.et al.(1991)Antiviral Res.15(1)：27-39；Chang N.T.etal.(1983)Arch.BiochemBiophys.221(2)：585-589；Franke A.E.et al.(1982)DNA1(3)：223-230)。

“受体”例如“α-干扰素受体”(也称作“I型干扰素受体”)是指这样的受体：它在细胞中被α-干扰素所激活，例如结合α-干扰素并引发细胞内信号传导；这样的受体的例子有包含IFNAR-2和IFNAR-1受体亚单元的I型干扰素受体(Domanski et al.(1998)J.Biol.Chem.273(6)：3144-3147；Mogensen et al.，(1999)Journal of Interferon and Cytokine Research，19：1069-1098)。在本发明的背景下，受体还意图包括全长受体分子的截短形式，例如缺乏膜结合部分的受体分子，诸如包含胞外结合域的可溶形式的受体分子(也称作“可溶性受体”)：该截短形式结合α-干扰素，但不一定结合膜和/或发起细胞内信号传导。

两种分子(例如配体与受体)之间的“特异性结合亲力”是指一种分子对多种分子的混合物中另一种分子的优先结合。典型地，如果结合亲和力为大约1 x 10⁴M^-1至大约1 x 10⁹M^-1或者更高(即KD大约10^-4M-10^-9M，或者更低)，则认为分子结合是特异的。配体与受体的结合亲和力可以通过本领域技术人员已知的标准技术加以测量。用于测量结合亲和力的公知技术的非限制性实例包括Biacore

技术(Biacore AB，Sweden)，等温滴定微量热法(isothermal titration microcalorimetry)(MicroCal LLC，Northampton，MAUSA)、ELISA，和流式细胞术(例如FACS)。例如，可使用流式细胞术方法选择与相关结合对成员(例如受体)特异结合的分子群体(例如细胞表面展示配体)。配体-受体复合体可通过荧光加以检测和分选(例如通过使复合体与可识别该复合体的荧光抗体反应，或者使包含生物素化配体的复合体与偶联有链霉抗生物素蛋白的荧光探针反应)。将结合相关结合对成员(例如受体)的目标分子合并，并在较低浓度的受体的存在下再次加以分选。通过在递减浓度的受体的存在下进行多个轮次的细胞分选(示例浓度范围为10^-6M-10^-9M数量级，也就是1微摩尔(μM)到1纳摩尔(nM)或者更低，依配体-受体相互作用的性质而定)，可以获得对受体表现特异结合亲和力的、经过富集的分子群体。

当多肽、核酸或其它组分与通常与之相伴随的组分(其它肽、多肽、蛋白质(包括复合体，例如可能伴有天然序列的聚合酶和核糖体)、核酸、细胞、合成试剂、细胞污染物、细胞组分等)，例如在其初始来源细胞中通常与其伴随的其它组分部分地或完全地分离时，称这些多肽、核酸或其它组分是“分离的”。当多肽、核酸或其它组分从其自然环境的其它组分中被部分或者完全地回收或分离出来，成为组合物、混合物或组分集合中主要的种类(也就是说，以摩尔数计，其多于组合物中其它任何一个种类)时，称多肽、核酸或其它组分是“分离的”。在一些情况下，制备物的超过大约60％、70％或75％，通常超过大约80％，或者优选超过大约90％是由分离种类构成的。

“基本上纯的”或“分离的”核酸(例如RNA或DNA)、多肽、蛋白质或组合物还意味着，该目标种类(例如核酸或多肽)占全部现有大分子种类的至少大约50、60或70重量％(以摩尔数计)。“基本上纯的”或“分离的”组合物还可占组合物中全部现有大分子种类的至少大约80、90或95重量％。分离的目标种类还可以纯化到实质上(essentially)均一(用常规检测方法从该组合物中检测不到污染种类)，其中组合物实质上由单一大分子种类的衍生物构成。术语“纯化的”一般是指，核酸、多肽或蛋白质在电泳凝胶上实质上只产生一个条带。它通常意味着核酸、多肽或蛋白质至少为大约50％纯，60％纯，70％纯，75％纯，更优选地至少大约85％纯，最优选至少大约99％纯。

术语“分离的核酸”可以指这样的核酸(例如DNA或RNA)，其不再直接毗邻于本发明核酸的来源生物体的天然存在基因组中与其直接毗邻的那两个编码序列(即一个位于5′端，另一个位于3′端)。因此，该术语包括，例如，cDNA，或者聚合酶链式反应(PCR)或限制性核酸内切酶处理所产生的基因组DNA片段，不管这种cDNA或基因组DNA片段是包含在载体中、整合到与所述cDNA或基因组DNA片段所来源的生物体相同或不同的物种(包括例如病毒)的基因组中、连接于其它编码序列而形成编码嵌合多肽的杂交基因、抑或是独立于任何其它的DNA序列。DNA可以是双链或单链DNA，正义或反义DNA。

“重组多核苷酸”或“重组多肽”是非天然存在的多核苷酸或多肽，它可以分别包括来自多于一种源核酸或多肽的核酸或氨基酸序列，其中所述源核酸或多肽可以是天然存在的或者核酸或多肽，或者其本身可能已经过诱变或其它类型的修饰。当核酸或多肽是合成的、人工的、工程化的，或者是衍生自合成、人工或工程化多肽或核酸时，其可看作是“重组的”。重组核酸(例如DNA或RNA)可通过将至少两段序列片段组合(例如人工组合)而成，其中这些序列片段典型地不被包含在一起、典型地彼此不相伴随、或者以其它方式典型地彼此分离。重组核酸可包括通过联合或组合不同来源的核酸片段而形成的，和/或人工合成的核酸分子。“重组多肽”经常指来源于克隆或重组核酸的多肽。不同核酸或氨基酸序列所来源的源多核苷酸或多肽有时是同源的(即：具有相似的结构和/或功能，或者它们编码的多肽编码相似的结构和/或功能)，经常来自于与生物体不同的分离株、血清型、菌株、物种，或来源于例如不同的疾病状态。

术语“重组的”在用于例如细胞、多核苷酸、载体、蛋白质或多肽时，通常意味着下面几点：该细胞、多核苷酸或载体已经通过异源(或外来)核酸的引入或通过天然核酸的改变而被修饰；或者，该蛋白质或多肽已经通过引入异源氨基酸而被修饰；或者，该细胞来源于经过如此修饰的细胞。重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中不出现的核酸序列，或者，重组细胞表达原本异常表达、欠表达或根本不表达的核酸序列。术语“重组的”在用于细胞时，是指细胞复制异源核酸，或表达由异源核酸编码的多肽。重组细胞可以包含在该细胞的天然(非重组)形式中不出现的编码序列。重组细胞还可以包含在细胞的天然形式中出现的编码序列，其中该编码序列已经过人工方式修饰并重新引入到所述细胞中。该术语还包括这样的细胞：该细胞包含对其而言为内源，并且已经在不从所述细胞除去该核酸的条件下接受了修饰的核酸；所述修饰包括通过基因置换、位点特异性诱变、重组和相关技术获得的修饰。

术语“重组产生”是指通常通过下列手段实现人工组合：化学合成手段、核酸片段的循环(recursive)序列重组、或其它核苷酸多样性生成方法(例如改组(shuffling))、或对核酸分离片段的操作，例如通过本领域普通技术人员已知的基因工程技术。“重组表达的”通常是指用于在体外产生重组核酸，以及将重组核酸以体外、体内或离体方式转移到其可以表达或扩增的细胞中的技术。

“重组表达盒”或直接称为“表达盒”，是一种重组或合成产生的核酸构建体，它具有某些核酸元件，这些元件能够导致结构基因在与这些序列兼容的宿主中得到表达。表达盒至少包括启动子和可选的转录终止信号。典型地，重组表达盒包括待转录的核酸(例如编码期望多肽的核酸)和启动子。还可以如本文所述使用对实现表达而言必需或有用的其它因子。例如，表达盒还可以包括编码指导表达蛋白从宿主细胞分泌的信号序列的核酸序列。表达盒中还可以包含翻译终止信号、增强子和其它影响基因表达的核酸序列。

“免疫原”是指能够激起免疫应答的物质，包括例如，抗原、在诱发自身免疫疾病中发挥作用的自身抗原、和癌细胞上表达的肿瘤相关抗原。免疫应答一般是指针对媒介物(agent)，例如抗原或其片段或编码该媒介物的核酸，产生的细胞或抗体介导的响应。在一些情况下，这种响应包括产生至少一种特异针对表达目的抗原的抗原呈递细胞的CTL、B细胞或各类T细胞，或其组合。

“抗原”是指，能够在宿主中引起抗体形成或产生与该物质反应的特异淋巴细胞群体的物质。抗原通常是对宿主而言外来的大分子(例如蛋白质和多糖)。

“佐剂”是指提高抗原免疫刺激性或药物药理效果的物质。佐剂可以非特异地提高对抗原的免疫响应。例如，“弗氏完全佐剂”是油和水的乳浊液，含有免疫原、乳化剂和分枝杆菌。另一个实例，“弗氏不完全佐剂”与此相似，但没有分枝杆菌。

载体是帮助所选核酸的细胞转导或转染，或核酸在细胞中表达的组分或组合物。载体包括，例如，质粒、粘粒、病毒、YACs、细菌、多聚赖氨酸等。“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列允许特殊核酸在宿主细胞中表达的核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒，或核酸片段的一部分。表达载体通常包括可操作连接于启动子的待转录核酸。待转录核酸通常受启动子的指导或控制。

“基本上全长的多核苷酸序列”或“基本上全长的多肽序列”是指一段多核苷酸序列或多肽序列的至少50％，一般至少大约60％、70％或75％，通常至少大约80％，或者通常至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

术语“免疫测定”包括使用抗体或免疫原结合或特异性结合抗原的测定法。免疫测定的特征通常在于利用特定抗体的特异性结合性质来对抗原加以分离、靶向和/或定量。

本文使用的术语“受试者”包括，但不仅限于，生物体；哺乳动物，包括例如人、非人灵长动物(例如狒狒、猩猩、猴)、小鼠、猪、牛、山羊、猫、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴、绵羊、或其它非人哺乳动物；非哺乳动物，例如非哺乳类脊椎动物，如鸟类(例如鸡或鸭)或鱼，和非哺乳类非脊椎动物。

术语“药用组合物”是指，适合于在受试者(包括动物或人)中供药用的组合物。药用组合物一般包括有效量的活性剂和载体，包括例如药用载体。

术语“有效量”是指足以产生期望结果的剂量或量。期望的结果可以包括在该剂量或量的受体中产生的客观或主观改善。

“预防性处理”是对没有显示疾病、病理或医学紊乱的体征或症状的受试者，或者仅显示疾病、病理或紊乱早期体征的受试者进行的处理，因而施加此类处理的目的是减少、防止或降低发生所述疾病、病理或医学紊乱的风险。预防性处理起防止疾病或紊乱的处理的作用。“预防活性”是指某种药剂，例如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、物质(substance)或其组合物，在施用于未显示病理、疾病或紊乱的体征或症状，或者仅显示病理、疾病或紊乱的早期体征或症状的受试者之后，消除、防止或降低该受试者发生疾病、病理或紊乱的风险的活性。“预防上有用的”药剂或化合物(例如核酸或多肽)表明药剂或化合物可用于减少、防止、处理或降低病理、疾病或紊乱的发生。

“治疗性处理”是指，对显示病理、疾病或紊乱的症状或体征的受试者施加的处理，其中向受试者施加处理的目的是减少或消除病理、疾病或紊乱的所述体征或症状。“治疗活性”是指某种药剂，例如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、物质或其组合物，在施用于罹患病理、疾病或紊乱的体征或症状的受试者之后，消除或减少所述体征或症状的活性。“治疗上有用的”药剂或化合物(例如核酸或多肽)表明药剂或化合物可用于减少、处理或消除病理、疾病或紊乱的体征或症状。

术语“基因”广义地指任何与生物功能相关的DNA片段。基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还包括例如形成其它蛋白质的识别序列的非表达的DAN核酸片段(例如启动子、增强子或其它调节区域)。基因可以从多种来源获得，包括从目标源克隆或根据已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计为具有期望参数的序列。

一般地，后文使用的命名法以及下文中描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学的实验室程序是本领域普通技术人员公知且普遍采用的。重组核酸方法、核酸合成、细胞培养方法和转基因整合，例如电穿孔、注射、基因枪、透皮印记(impressing through the skin)和脂质体法使用标准的技术，例如在Sambrook et al.，Molecular Cloning-ALaboratory Manual(2nd Ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，1989(后文称为“Sambrook”)和Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel et al.，eds.，Current Protocols，a joint venturebetween Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.(1994，supplemented through 1999)(后文称为“Ausubel”)中描述的。一般地，寡核苷酸合成和纯化步骤根据技术规范执行。技术和程序一般根据本领域的常规方法和本文件全文提供的各个通用参考文件加以执行。我们认为这里的程序是本领域普通技术人员众所周知的，提供它们是为了读者的方便。

如本文使用的，“抗体”是指包含一个或多个基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽的蛋白质。术语“抗体”用于表示完整的抗体和其结合片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及许许多多免疫球蛋白可变区基因。轻链可分为κ或λ。重链可分为γ、μ、α、δ或ε，而这些又决定了免疫球蛋白的类别，分别是IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(例如抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一个“轻”链(大约25KDa)和一个“重”链(大约50-70KDa)。每条链的N末端限定一个大约100-110或者更多氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指这些轻链和重链。

抗体还包括单臂复合单克隆抗体、单链抗体，包括单链Fv(sFv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽接头)形成连续的多肽，以及双抗体(diabodies)、三抗体(tribodies)和四抗体(tretrabodies)(Pack et al.(1995)J Mol Biol 246：28；Biotechnol 11：1271；and Biochemistry 31：1579)。抗体是例如多克隆、单克隆、嵌合、人化、单链、Fab片段、由Fab表达文库产生的片段等。

术语“表位”是指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇(determinant)。抗原决定部位通常由氨基酸等分子的化学活性表面基团或糖侧链构成，通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象性表位与非构象性表位的区别在于当变性溶剂存在时，与前者的结合丧失，但与后者的结合不会丧失。

抗体的“抗原结合片段”是抗体结合抗原的肽或多肽片段。抗原结合位点是由抗体中有助于、参与或影响抗原结合的那些氨基酸形成的。见Scott，T.A.and Mercer，E.I.，Concise Encyclopedia：Biochemistry and Molecular Biology(de Gruyter，3d ed.1997)和Watson，J.D.et al.，Recombinant DNA(2d ed.1992)(hereinafter“Watson，Recombinant DNA”)，本文分别引证它们的所有内容。

术语“筛选”一般地描述鉴定本发明的最优分子(例如本发明的多肽)以及编码这些分子的核酸的过程。这些分子分别有若干性质可用于筛选，例如：在测试系统或体外、回体或体内应用中，分子结合配体或受体，抑制细胞增殖，抑制病毒感染细胞中的病毒复制，诱导或抑制细胞因子产生，改变免疫应答(例如诱导或抑制期望的免疫应答)的能力。对于抗原而言，抗原的若干性质可用于选择和筛选，包括抗原表达、折叠、稳定性、免疫原性和存在来自数种相关抗原的抗原决定部位。

“选择”是一种同时实现鉴定和物理分离的筛选形式。选择模式之一是遗传选择，其可以通过例如表达选择标记来实现，选择标记在某些情况下可以令表达该标记的细胞存活而其它的细胞死亡(或者相反)。选择标记包括药物抗性基因和毒素抗性基因等。筛选标记包括，例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白等。另一种选择模式涉及根据可检测事件的物理分选，其中可检测事件例如配体对受体的结合，底物与酶的反应，或者任何其它能直接(例如利用发色/荧光底物或配体)或间接(例如与发色/荧光二次抗体或发色/荧光配体反应)地产生可检测信号的物理过程。

物理分选可以通过各种方法实现，例如通过流式细胞术，例如以全细胞模式或微滴模式进行。例如，可以将文库亚克隆到表面展示载体内，使多肽得以表达在细胞表面。然后可以使用流式细胞术对表面表达的多肽文库中与受体结合的那些多肽进行预富集。例如，可使用荧光标记的抗受体抗体来检测展示与受体结合的多肽的细胞，其中所述抗体在与受体结合时，由于受体与表面展示多肽之间的相互作用，间接地标记了该细胞。然后可以通过流式细胞术对这样荧光标记的细胞进行分选，对文库中编码被表达并折叠的、可结合所述受体的多肽的成员进行预富集。然后使用竞争测定，针对预富集了受体结合成员的文库中编码如下多肽的成员进行进一步的富集：该多肽与参照多肽相比，与受体结合紧密和/或显示较慢的受体脱离速度。在这种方法中，将受体添加到一群在细胞表面上表达多肽的细胞中。清洗细胞，然后添加参照多肽。经过不同的时间后，通过流式细胞术对细胞群体进行多次分选，以选择在递增的参照多肽存在时间下保持与受体结合的表面展示多肽。经过如此选择的细胞群体可望富集这样的文库成员：它们编码与同源受体结合紧密的多肽，为分离和鉴定具有与受体紧密结合相关的活性的多肽提供了可能。

本文使用的“外源”核酸、“外源DNA片段”、“异源序列”或“异源核酸”是这样的核酸、片段或序列：它来自特定宿主细胞之外的来源，或者，如果它来自于相同的来源，则它相对于其最初形式受到了修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞是内源的、但经过修饰的基因。本文描述的应用中的异源序列的修饰通常通过循环序列重组实现。这些术语是指这样的DNA片段，它对细胞而言是外来的或异源的，或者与细胞同源但位于宿主细胞核酸中通常不会出现该元件的位置。外源DNA片段表达产生外源多肽。

术语“核酸”是指单或双链形式的脱氧核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非明确限制，该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，它们具有与参照核酸相似的结合性质，并具有与天然存在的核苷酸相似的代谢方式。除非另外指出，特定核酸序列默示地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子替代)和互补序列，以及明示的序列。具体地说，简并密码子替代可以通过产生这样的序列来实现：该序列中一个或多个选定的(或全部)密码子中的第三位置被替代为混合碱基和/或脱氧肌苷残基(Batzer et al.(1991)NucleicAcid Res 19：5081；Ohtsuka et al.(1985)J Biol Chem 260：2605-2608；Cassol etal.(1992)；Rossolini et al.(1994)Mol Cell Probes 8：91-98)。术语“核酸”与“基因”、“cDNA”和“基因编码的mRNA”可以互换使用。

“基因衍生的核酸”是指这样的核酸：所述基因或其子序列从根本上说充当了该核酸合成的模板。因此，mRNA、由mRNA反转录的cDNA、由该cDNA转录的RNA、由该cDNA扩增的DNA以及由该扩增的DNA转录的RNA等都衍生自所述基因，这些衍生产物的检测可以表明样品中原始基因和/或基因转录本的存在和/或丰度。

当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系之中时，称核酸是“可操作连接的”。例如，若启动子或增强子可增加编码序列的转录，则称其与编码序列可操作连接。“可操作连接”意味着被连接的DNA序列通常是毗邻的，并且，若需要连结两个蛋白质编码区，是毗邻并且共阅读框的。然而，由于增强子与启动子间隔数千个碱基时一般仍可发挥功能，而且内含序列可以具有不同的长度，因此某些多核苷酸元件可以是可操作连接但并不毗邻的。

术语“细胞因子”包括，例如，白细胞介素、干扰素、趋化因子、造血生长因子、肿瘤坏死因子和转化生长因子。一般而言，这些是低分子量蛋白质，调节免疫系统细胞的成熟、激活、增殖和分化。

在本说明书和权利要求书中，称“一种”或“一个”组分，例如在“一种(个)非多肽部分”、“一种(或一个)”氨基酸残基、“一种(或一个)”替代、“一种(或一个)”缓冲液、“一种(或一个)”阳离子等语境中，意图指代一种(或一个)或多种(或多个)这类组分，除非另外说明或除非从具体的上下文明显可知不是如此。例如，在表达“从A、B和C构成的组中选择的一种(或一个)组分”是指包括A、B和C的所有组合，例如A、B、C、A+B、A+C、B+C或A+B+C。

本文中还定义或者表征了其它多个术语。

本发明的分子和方法

本发明的分子(例如本发明的多肽、本发明的偶联物和编码所述多肽的核酸)可用于治疗对α-干扰素治疗有响应的疾病和紊乱，特别是与病毒感染例如HCV感染有关的疾病。

患有慢性HCV感染的患者在治疗之前具有的典型病毒载量范围是每毫升血清有10⁴-10⁷个拷贝的HCV RNA。用α-干扰素治疗后，这些患者体内的病毒载量会特征性地经历两个不同的对数-线性降低期(Neumann A.U.，etal.(1998)Science 282：103-107)。在α-干扰素治疗的前两天出现的病毒载量初始快速降低被认为是受感染肝细胞内α-干扰素介导的病毒生产降低和与之相伴的幼稚细胞抗感染保护作用所致。大约第2天时，病毒生产速率达到一个新的稳定状态，此时可以观察到第二个较慢的对数-线性病毒清除期。通常认为第二个病毒清除期在一定程度上是由于对受感染肝细胞的T细胞介导的杀伤作用(Neumann，et al.，见前文)所致。人们认为IFN-α通过刺激抗原特异性T细胞分化成T_H1细胞而在这一生物响应过程中发挥关键作用。而且，人们认为利巴韦林(Ribavirin)的作用模式是由于T_H1响应的放大，并认为该作用模式是其与IFN-α联合治疗的效力的机理基础。而对目前使用的α-干扰素治疗无响应的HCV感染患者(一般称作“无响应者”)所显示的病毒载量清除曲线要浅得多。

尽管本发明意图不受限于潜在机制的具体理论，申请人提出，在替代测定系统(例如本文更详细说明的那些)中的抗病毒活性可以预示α-干扰素的功效，例如在病毒清除的第一时期。在实施例部分中描述的抗病毒测定实例监测了在作为人肝细胞中抗HCV效力测定的替代系统的HeLa人子宫颈癌细胞中α-干扰素针对脑心肌炎病毒(EMCV)致细胞病变效应的保护效力。其它有用的病毒/细胞测定系统包括WISH人羊膜衍生细胞中的EMCV，HuH7人肝衍生细胞中的EMCV，HuH7细胞中的水泡性口炎病毒(VSV)，HeLa细胞中的痘苗病毒(VV)，HepG2人肝癌细胞中的黄热病毒(YFV)，以及原代CD4+T-细胞中的人免疫缺陷病毒(HIV)。实施例2和图3显示了本发明的代表性多肽在EMCV/HeLa抗病毒测定中的抗病毒活性。

其它可用于监测受感染肝细胞中抗HCV效力的替代测定系统包括HCV复制子系统，例如在如下文献中描述的：Lohmann V.，et al.，(1999)Science285(5424)：285-293；Randall G.and Rice C.M.(2001)Curr Opin Infect Dis14(6)：743-7477；和Bartenschlager，R.(2002)Nature Reviews/Drug Discovery1：911。用于监测HCV抗病毒效力的有用体内宿主系统的一个实例是嵌合人肝SCID小鼠，如Mercer，et al.(2001)Nature Medicine 7(8)：927-933中描述的。

不受限于任何理论，申请人进一步提出，IFN-α提高T_H1分化和/或抑制T_H2分化可能是α-干扰素的效力(例如在病毒清除的第二时期的效力)的贡献因素。根据这一理论可以预测，上述生物活性(即提高T_H1分化和/或抑制T_H2分化)的效力提高的改良IFN-α，相比于例如目前已批准的治疗用α-干扰素分子，在以相同剂量的施用时可具有更高的效力。本文实施例部分中描述了一个测定实例，它通过以ELISA或细胞内染色及FACS分选为手段对T_H1-表型(例如IFN-γ)和/或T_H2-表型(例如IL-5，IL4)相关的细胞因子的产生进行测量，对IFN-α对天然T_H0细胞的促T_H1分化和/或抑T_H2分化作用进行了监测。

IFN-α分子的治疗效力渐趋减小，这在一定程度上是由于剂量限制性毒性作用，例如血小板减少和嗜中性粒细胞减少造成的。尽管本发明不受限于潜在机制的具体理论，但是申请人提出，这种毒性可能与IFN-α对血小板和嗜中性粒细胞前体的抗增殖作用有关，并且在替代测定系统(如本文中描述的那些)中的抗增殖活性可以指示α-干扰素分子的相对毒性。因此，在表现更低抗增殖活性(例如相对低于目前已批准的治疗性α-干扰素分子，诸如ROFERON

-A(Interferon alfa-2a，重组体；Hoffmann-La Roche Inc.)、INTRON

A(Interferon alfa-2b，重组体；Schering Corporation)及INFERGEN

(interferon alfacon-1；InterMune，Inc.))的α-干扰素分子中，与α-干扰素治疗相关的剂量限制毒性可能有所减小。本文实施例部分中描述的一个抗增殖活性测定实例监测了α-干扰素对人Daudi淋巴细胞增殖的效果。或者/另外，可以通过施用治疗活性更高的分子来导致剂量限制毒性的降低；与目前已批准的分子相比，治疗活性更高的分子可以以更低的浓度或更低的频率给药。

本发明的一个目的是提供新型α-干扰素多肽和编码该多肽的核酸。本发明的多肽可用于治疗对α-干扰素治疗有响应的疾病和紊乱，特别是与病毒感染例如HCV感染相关的疾病。本发明的一些多肽表现α-干扰素活性，例如抗病毒活性、抗增殖活性、和/或T_H1分化活性。本发明的一些多肽显示一种或多种如下的性质：与参照IFN-α多肽相比更高或更低的抗病毒活性；与参照IFN-α多肽相比更高或更低的T_H1分化活性；与参照IFN-α多肽相比更高或更低的抗增殖活性。参照IFN-α多肽可以包含非天然存在的α-干扰素的序列，例如IFN-α Con1(SEQ ID NO：333)，或者可以包含天然存在的(即野生型)α-干扰素多肽的序列。天然存在的α-干扰素多肽的序列的实例包括：人IFN-α多肽的序列，例如huIFN-α 2b(SEQ ID NO：321)，huIFN-α 2a(SEQ ID NO：322)，huIFN-α 2c(SEQ ID NO：322，第34位＝Arg)，huIFN-α 8b(SEQ ID NO：327)，huIFN-α 8a(SEQ ID NO：327，第98位＝Val，第99位＝Leu，第100位＝Cys，第101位＝Asp)，huIFN-α 8c(SEQ ID NO：327，第161位＝Asp且第162-166位的氨基酸被删除)，huIFN-α 14a(SEQ ID NO：329)，huIFN-α 14c(SEQ ID NO：329，第152位＝Leu)，或者任何其它天然存在的人α-干扰素多肽的序列，例如在Allen G.and Diaz M.O.(1996)(见前文)中列举的。

在另一个方面中，本发明提供的α-干扰素多肽与参照α-干扰素分子，例如目前用于治疗的α-干扰素多肽(如ROFERON-A，INTRON A，或INFERGEN)相比，表现更高的从病毒感染细胞清除病毒的效力。病毒实例包括，但不仅限于，黄病毒(Flaviviridae)科病毒，例如丙型肝炎病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒和牛病毒性腹泻病毒；嗜肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)病毒，例如乙型肝炎病毒；微小核糖核酸病毒(Picornaviridae)家族病毒，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒和甲型肝炎病毒；逆转录病毒科(Retroviridae)病毒，例如人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、人亲T-淋巴细胞病毒(T-lymphotropic virus)和劳氏肉瘤病毒；冠状病毒科(Coronaviridae)病毒，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒，例如狂犬病毒和水泡性口炎病毒；副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒，例如人呼吸道合胞病毒和副流感病毒；乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)病毒，例如人乳头瘤病毒；和疱疹病毒科(Herpesviridae)家族病毒，例如单纯疱疹病毒。这种更高的效力可能是缘于比参照分子更高的抗病毒活性、更高的T_H1-分化活性、或者两者都有。例如本发明的某些α-干扰素多肽可以特别有用于清除用目前使用的α-干扰素分子治疗时显示响应较差的病毒株，例如基因型1HCV。

本发明的一些多肽与参照IFN-α分子相比具有更高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或与参照IFN-α分子相比具有更高的(T_H1分化活性/抗增殖活性)比率。表现这种活性的多肽对于治疗病毒感染，例如上文列举的病毒感染，可能是特别有效的。例如，某些这样的多肽在HCV治疗中与目前已批准的的α-干扰素分子相比，在二期病毒清除曲线中的一期或两期中，可以提供更高的治疗效力，和/或表现更低的毒性。某些这样的多肽与目前使用的α-干扰素分子相比，在基因型1 HCV的治疗中可提供更高的治疗效力。

本发明的另一个目的是提供一种偶联物，它包括一个或多个与本发明多肽连接的非多肽部分，该偶联物表现α-干扰素活性(例如上文列举的一种或多种活性)，并且任选地显示其它理想的性质，诸如与非偶联多肽相比，增加血清半衰期和/或功能性体内半衰期，和/或降低抗原性。某些这样的偶联物与参照α-干扰素分子，诸如目前用于治疗的α-干扰素偶联物(例如PEGASYS

(Peginterferon alfa-2a；Hoffmann-La Roche，Inc.)或PEG-INTRON

(peginterferon alfa-2b；Schering Corporation))相比，显示更高的从感染病毒的细胞中清除病毒的效力。病毒实例包括，但不限于，黄病毒科病毒，例如丙型肝炎病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒和牛病毒性腹泻病毒；嗜肝脱氧核糖核酸病毒科病毒，例如乙型肝炎病毒；微小核糖核酸病毒科病毒，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒和甲型肝炎病毒；逆转录病毒科病毒，例如人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、人亲T-淋巴细胞病毒和劳氏肉瘤病毒；冠状病毒科病毒，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科病毒，例如狂犬病毒和水泡性口炎病毒；副粘病毒科病毒，例如人呼吸道合胞病毒和副流感病毒；乳头瘤病毒科病毒，例如人乳头瘤病毒；和疱疹病毒科家族病毒，例如单纯疱疹病毒。这种更高的效力可能是缘于比参照分子更高的抗病毒活性、更高的TH1-分化活性、或者两者都有。例如本发明的某些α-干扰素偶联物可以特别有用于清除用目前使用的α-干扰素分子治疗时显示响应较差的病毒株，例如基因型1HCV。

本发明的一些偶联物与参照IFN-α分子相比具有更高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或与参照IFN-α分子相比具有更高的(TH1分化活性/抗增殖活性)比率。表现这种活性的偶联物对于治疗病毒感染，诸如上文列举的病毒感染，例如HCV感染，可能是特别有效的。此类偶联物在HCV治疗中与目前已批准的α-干扰素分子相比，在二期病毒清除曲线中的一期或两期中，可以提供更高的治疗效力，和/或表现更低的毒性。某些这样的偶联物与目前使用的α-干扰素分子相比，在基因型1HCV的治疗中可提供更高的治疗效力。

本发明的另一个目的是提供在感染病毒的细胞中抑制病毒复制的方法，该方法包括对感染病毒的细胞施用可有效抑制所述细胞内病毒复制的量的本发明多肽或偶联物。本发明还提供了降低感染病毒的细胞中病毒拷贝数的方法，包括向病毒感染细胞施加可有效降低所述细胞内病毒拷贝数的量的本发明多肽或偶联物。病毒可以是如下的病毒：黄病毒科病毒，例如丙型肝炎病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒或牛病毒性腹泻病毒；嗜肝脱氧核糖核酸病毒科病毒，例如乙型肝炎病毒；微小核糖核酸病毒科病毒，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒或甲型肝炎病毒；逆转录病毒科病毒，例如人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、人亲T-淋巴细胞病毒或劳氏肉瘤病毒；冠状病毒科病毒，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科病毒，例如狂犬病毒或水泡性口炎病毒；副粘病毒科病毒，例如人呼吸道合胞病毒或副流感病毒；乳头瘤病毒科病毒，例如人乳头瘤病毒；和疱疹病毒科家族病毒，例如单纯疱疹病毒。病毒可以是例如RNA病毒，诸如HCV；DNA病毒，诸如HBV；或逆转录病毒，诸如HIV。细胞可以是培养中的或者是从哺乳动物分离的(即体外或离体)，或者可以在体内，例如在哺乳动物(例如Mercer，et al.(2001)Nature Medicine.7(8)：927-933中描述的SCID小鼠模型)中，在灵长动物中或在人类中。

本发明还提供了提高T_H0细胞的T_H1分化的方法，包括向包含T_H0细胞的群体施用本发明多肽或偶联物，施用的量可有效提高所述群体内与T_H1-表型相关的细胞因子(例如IFN-γ)的产生和/或降低与T_H2-表型相关的细胞因子(例如IL-4或IL-5)的产生。该群体可以是培养中的或者是从哺乳动物分离的(即体外或回体)，或者可以在体内，例如在哺乳动物中，在灵长动物中或在人类中。

本发明还提供了抑制细胞群体增殖的方法，包括使细胞群体接触本发明的多肽、变体或偶联物，其中所述本发明的多肽、变体或偶联物的量可有效降低细胞群体增殖。所述细胞群体可以是培养中的或者是从哺乳动物分离的(即体外或离体)，或者可以在体内，例如在哺乳动物中，在灵长动物中或在人类中。

本发明的这些目的和其它目的将在下文更详细地加以说明。

本发明的多肽

本发明提供了新型α-干扰素多肽，本文统称为“本发明的多肽”。术语“本发明的多肽”在任何地方均意图包含本文公开多肽序列的变体。本发明还包括包含本发明的多肽的融合蛋白和包含本发明的多肽的偶联物。

将人α-干扰素核酸的片段进行循环重组，形成由重组多核苷酸构成的改组体(shafflant)文库，本发明的多肽即衍生自该文库。下文中说明了获得重组多核苷酸文库的方法和/或获得用作循环序列重组底物的核酸中的多样性的方法。

示例性的本发明的多肽包括这样的多肽，其包含本文标识为SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：319的序列(即SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：65，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69，SEQID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78，SEQ IDNO：79，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQID NO：84，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ IDNO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQID NO：98，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：106，SEQ IDNO：107，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：115，SEQ IDNO：116，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：124，SEQ IDNO：125，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ IDNO：134，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：142，SEQ IDNO：143，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：151，SEQ IDNO：152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：160，SEQ IDNO：161，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：168，SEQ ID NO：169，SEQ IDNO：170，SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：172，SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174，SEQ ID NO：175，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：177，SEQ ID NO：178，SEQ IDNO：179，SEQ ID NO：180，SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：187，SEQ IDNO：188，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：192，SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：196，SEQ IDNO：197，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：202，SEQ ID NO：203，SEQ ID NO：204，SEQ ID NO：205，SEQ IDNO：206，SEQ ID NO：207，SEQ ID NO：208，SEQ ID NO：209，SEQ ID NO：210，SEQ ID NO：211，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：213，SEQ ID NO：214，SEQ IDNO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：222，SEQ ID NO：223，SEQ IDNO：224，SEQ ID NO：225，SEQ ID NO：226，SEQ ID NO：227，SEQ ID NO：228，SEQ ID NO：229，SEQ ID NO：230，SEQ ID NO：231，SEQ ID NO：232，SEQ IDNO：233，SEQ ID NO：234，SEQ ID NO：235，SEQ ID NO：236，SEQ ID NO：237，SEQ ID NO：238，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：240，SEQ ID NO：241，SEQ IDNO：242，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：244，SEQ ID NO：245，SEQ ID NO：246，SEQ ID NO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：251，SEQ ID NO：252，SEQ ID NO：253，SEQ ID NO：254，SEQ ID NO：255，SEQ ID NO：256，SEQ ID NO：257，SEQ ID NO：258，SEQ ID NO：259，SEQ IDNO：260，SEQ ID NO：261，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：263，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：265，SEQ ID NO：266，SEQ ID NO：267，SEQ ID NO：268，SEQ IDNO：269，SEQ ID NO：270，SEQ ID NO：271，SEQ ID NO：272，SEQ ID NO：273，SEQ ID NO：274，SEQ ID NO：275，SEQ ID NO：276，SEQ ID NO：277，SEQ IDNO：278，SEQ ID NO：279，SEQ ID NO：280，SEQ ID NO：281，SEQ ID NO：282，SEQ ID NO：283，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：285，SEQ ID NO：286，SEQ IDNO：287，SEQ ID NO：288，SEQ ID NO：289，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：291，SEQ ID NO：292，SEQ ID NO：293，SEQ ID NO：294，SEQ ID NO：295，SEQ IDNO：296，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：298，SEQ ID NO：299，SEQ ID NO：300，SEQ ID NO：301，SEQ ID NO：302，SEQ ID NO：303，SEQ ID NO：304，SEQ IDNO：305，SEQ ID NO：306，SEQ ID NO：307，SEQ ID NO：308，SEQ ID NO：309，SEQ ID NO：310，SEQ ID NO：311，SEQ ID NO：312，SEQ ID NO：313，SEQ IDNO：314，SEQ ID NO：315，SEQ ID NO：316，SEQ ID NO：317，SEQ ID NO：318，和SEQ ID NO：319)，如图6A-6V所示。这些多肽表现α-干扰素活性，包括HeLa/EMCV抗病毒测定中的抗病毒活性。多肽可以进一步包括一个或多个额外的氨基酸，例如添加在N末端的甲硫氨酸。本发明还提供了包含这些多肽的融合蛋白质和偶联物，以及编码这些多肽的分离或重组核酸。

本发明还包括分离或重组多肽，其各自包含这样的序列：所述序列与选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：319中的序列相比，在0-16个氨基酸位置上不同，例如在0，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置上不同，例如在0-16个氨基酸位置上不同，在0-15个氨基酸位置不同，在0-14个氨基酸位置上不同，在0-13个氨基酸位置上不同，在0-12个氨基酸位置上不同，在0-11个氨基酸位置上不同，在0-10个氨基酸位置上不同，在0-9个氨基酸位置上不同，在0-8个氨基酸位置上不同，在0-7个氨基酸位置上不同，在0-6个氨基酸位置上不同，在0-5个氨基酸位置上不同，在0-4个氨基酸位置上不同，在0-3个氨基酸位置上不同，在0-2个氨基酸位置上不同，或在0-1个氨基酸位置上不同。某些这样的多肽包含如下所述的序列，该序列与选自下组的序列相比在0到16个氨基酸位置上不同：SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：46，SEQID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：140，SEQ IDNO：141，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：179，SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：208，SEQ IDNO：232，SEQ ID NO：234，SEQ ID NO：258，SEQ ID NO：260，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：263，SEQ ID NO：266，SEQ ID NO：293，SEQ ID NO：296，SEQ IDNO：297，SEQ ID NO：298，SEQ ID NO：303，SEQ ID NO：306，SEQ ID NO：310，和SEQ ID NO：312。

本发明还包括分离或重组多肽，它们各自包含这样的序列，该序列与选自下组的序列相比，在0到16个氨基酸位置上不同：SEQ ID NO：312(M01)；SEQ ID NO：262(M04)；SEQ ID NO：266(M05)；SEQ ID NO：232(M23)；SEQID NO：88(M45)；SEQ ID NO：297(M20)；SEQ ID NO：167(M27)；SEQ IDNO：107(M09)；SEQ ID NO：208(M02)；SEQ ID NO：94(M33)；SEQ IDNO：141(M37)；SEQ ID NO：46(M30)；SEQ ID NO：171(M22)；SEQ IDNO：310(M24)；SEQ ID NO：176(M44)；SEQ ID NO：26(M31)；SEQ ID NO：89(M10)；SEQ ID NO：296(M14)；SEQ ID NO：148(M03)；SEQ ID NO：18(M46)；SEQ ID NO：10(M26)；SEQ ID NO：87(M21)；SEQ ID NO：103(M38)；SEQ IDNO：234(M28)；SEQ ID NO：30(M19)；SEQ ID NO：179(M11)；SEQ ID NO：2(M34)；SEQ ID NO：260(M07)；SEQ ID NO：306(M18)；SEQ ID NO：140(M40)；SEQ ID NO：127(M16)；SEQ ID NO：293(M25)；SEQ ID NO：195(M29)；SEQID NO：191(M36)；SEQ ID NO：263(M06)；SEQ ID NO：1(M32)；SEQ IDNO：298(M39)；SEQ ID NO：24(M42)；SEQ ID NO：258(M08)；SEQ IDNO：124(M35)；SEQ ID NO：7(M41)；SEQ ID NO：9(M12)；SEQ ID NO：303(M17)；和SEQ ID NO：6(M43)；例如在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置上不同，例如在0-16个氨基酸位置上不同，在0-15个氨基酸位置上不同，在0-14个氨基酸位置上不同，在0-13个氨基酸位置上不同，在0-12个氨基酸位置上不同，在0-11个氨基酸位置上不同，在0-10个氨基酸位置上不同，在0-9个氨基酸位置上不同，在0-8个氨基酸位置上不同，在0-7个氨基酸位置上不同，在0-6个氨基酸位置上不同，在0-5个氨基酸位置上不同，在0-4个氨基酸位置上不同，在0-3个氨基酸位置上不同，在0-2个氨基酸位置上不同，或在0-1个氨基酸位置上不同，例如下面描述的多肽。某些这样的多肽表现α-干扰素活性(例如抗病毒活性、T_H1分化活性、和/或抗增殖活性)。某些这样的多肽在HeLa/EMCV抗病毒测定中显示比人IFN-α2a高至少两倍的抗病毒活性。某些这样的多肽与人α-干扰素受体结合的亲和力比IFN-α2a更高(EC₅₀更低)。这些多肽还可以进一步包括一个或多个额外的氨基酸，例如添加到N末端的甲硫氨酸。本发明还提供了包含这些多肽的融合蛋白和偶联物，以及编码这些多肽的分离或重组核酸。

本发明包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：1(克隆M32)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：1(克隆M32)有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：44，SEQ IDNO：69，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：207，SEQ ID NO：247，SEQ ID NO：255，SEQ ID NO：260，SEQ ID NO：290或SEQ IDNO：302。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：1在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：1有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：260或SEQID NO：302。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ IDNO：1在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：1有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQID NO：1，SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：44。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：2(克隆M34)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：2有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：2在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：2有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：2在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：2有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：6(克隆M43)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：6有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：6在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：6有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：6在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：6有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：49或SEQ IDNO：293。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：7(克隆M41)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：7有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：37或SEQ IDNO：313。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：7在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：7有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：313。SEQID NO：7，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：313。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：7在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：7有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：313。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：9(克隆M12)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：9有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：45，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQID NO：221，SEQ ID NO：224，SEQ ID NO：231，SEQ ID NO：238，SEQ IDNO：240，SEQ ID NO：294，或SEQ ID NO：305。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：9在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：9有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：51，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：221，SEQ ID NO：238，SEQ ID NO：240，SEQ ID NO：294或SEQ ID NO：305。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：10(克隆M26)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：10有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：31，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：205，SEQID NO：230，SEQ ID NO：306或SEQ ID NO：308。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：10在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：10有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：205或SEQ ID NO：230。

在另一个方面，本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：18(克隆M46)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：18有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：169，SEQ IDNO：170，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：207，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：237，SEQ ID NO：247，SEQ IDNO：255，SEQ ID NO：260，SEQ ID NO：270，SEQ ID NO：276，SEQ ID NO：283，SEQ ID NO：290或SEQ ID NO：302。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：18在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：18有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：207，SEQ ID NO：255，SEQ ID NO：260，SEQ ID NO：290，或SEQ ID NO：302。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：18在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：18有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：44或SEQ ID NO：260。

在另一个方面，本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：24(克隆M42)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：24有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：43。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：24在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：24有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：32。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：26(克隆M31)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：26有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：26在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：26有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：42，或SEQ ID NO：293。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：30(克隆M19)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：30有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：40，或SEQ ID NO：71。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：30在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：30有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：30或SEQID NO：71。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：46(克隆M30)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：46有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：213，SEQ IDNO：216，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ IDNO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：46在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：46有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：250，SEQID NO：310或SEQ ID NO：312。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：87(克隆M21)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：87有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：299。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：88(克隆M45)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：88有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：88，SEQ IDNO：91，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：183，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：202，SEQ ID NO：223，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：288，SEQ ID NO：289，SEQ ID NO：290，SEQ IDNO：295，SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：88在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：88有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：183，SEQ IDNO：184，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：288，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：295，SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：88在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：88有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：288。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：89(克隆M10)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：89有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：298。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：94(克隆M33)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：94有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：237，SEQ ID NO：255或SEQID NO：273。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：103(克隆M38)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：103有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ IDNO：104，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：151，SEQ IDNO：184，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：223，SEQ ID NO：244，SEQ ID NO：276，SEQ ID NO：283，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：295，SEQ IDNO：296，SEQ ID NO：309或SEQ ID NO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：103在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：103有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：120，SEQ IDNO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：295，SEQ ID NO：296，SEQ ID NO：309或SEQ IDNO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ IDNO：103在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：103有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：113，SEQ IDNO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：295或SEQ ID NO：296。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：107(克隆M9)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：107有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：301。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：124(克隆M35)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：124有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：112，SEQ IDNO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：184，SEQ IDNO：199，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：295，SEQ ID NO：296，SEQ ID NO：309或SEQ ID NO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：124在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：124有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ IDNO：145，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：295，SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：124在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：124有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：98，SEQ I DNO：103，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：295。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：127(克隆M16)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：127有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：261或SEQ IDNO：268。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：140(克隆M40)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：140有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：272或SEQ IDNO：278。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：141(克隆M37)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：141有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：160。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：148(克隆M3)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：148有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：170或SEQ ID NO：206。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：148在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：148有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：148或SEQ IDNO：170。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：167(克隆M27)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：167有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：231，SEQ IDNO：232，SEQ ID NO：271或SEQ ID NO：315。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：167在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：167有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：181或SEQ ID NO：315。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：167在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：167有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：181或SEQ IDNO：315。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：191(克隆M36)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：191有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：191。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：195(克隆M29)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：195有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：137，SEQ IDNO：150，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：278。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：195在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：195有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：108，SEQ IDNO：195或SEQ ID NO：278。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：195在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQID NO：195有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：195或SEQ ID NO：278。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：208(克隆M02)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：208有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：208。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：232(克隆M23)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：232有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：167，SEQ ID NO：231，SEQ ID NO：232，SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：232在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：232有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：232或SEQ ID NO：262。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：234(克隆M28)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：234有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：234，SEQ ID NO：278或SEQ ID NO：285。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：234在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：234有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：139，SEQID NO：234，SEQ ID NO：278或SEQ IDN O：285。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：234在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：234有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：234。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：258(克隆M8)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：258有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：258。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：260(克隆M07)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：260有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：44，SEQID NO：69，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：170，SEQ IDNO：184，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：207，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：228，SEQ ID NO：237，SEQ ID NO：247，SEQ IDNO：255，SEQ ID NO：257，SEQ ID NO：260，SEQ ID NO：276或SEQ IDNO：290。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ IDNO：260在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：260有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：207，SEQ ID NO：247，SEQ IDNO：255，SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：290。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：260在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：260有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：260。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：262(克隆M04)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：262有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：232，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ IDNO：250，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：262在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：262有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQID NO：232，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：250，SEQ IDNO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：266(克隆M05)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：266有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：229，SEQ ID NO：245，SEQ ID NO：266或SEQ ID NO：274。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：266在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：266有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：79，SEQID NO：90，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：229，SEQ ID NO：245，SEQ ID NO：266或SEQ ID NO：274。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：293(克隆M25)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：124有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：26，SEQID NO：29，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQID NO：293在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：293有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQID NO：49或SEQ ID NO：293。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：293在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQID NO：293有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：293。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：296(克隆M14)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：296有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：98，SEQ IDNO：103，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：151，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：202，SEQ ID NO：223，SEQ ID NO：244，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：288，SEQ ID NO：290，SEQ IDNO：295，SEQ ID NO：296，SEQ ID NO：309或SEQ ID NO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：296在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：296有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：103，SEQID NO：104，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：120，SEQ IDNO：124，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：295，SEQ ID NO：296，SEQ ID NO：309或SEQ IDNO：314。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ IDNO：296在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：296有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：184，SEQ IDNO：199，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：295，SEQ ID NO：296或SEQ IDNO：314。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：297(克隆M20)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：297有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ IDNO：250，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：297在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：297有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：216，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ IDNO：310或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：297在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQID NO：297有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：241，SEQ IDNO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：298(克隆M39)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：298有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：108，SEQ IDNO：118，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：227，SEQ ID NO：271，SEQ ID NO：292或SEQ ID NO：298。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：298在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：298有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ IDNO：102，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：298。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：298在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：298有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：102或SEQ IDNO：298。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：303(克隆M17)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：303有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：235，SEQ ID NO：256或SEQ ID NO：303。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：303在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：303有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：256或SEQ ID NO：303。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：303在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：303有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：256或SEQ ID NO：303。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：306(克隆M18)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：306有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：31，SEQID NO：36，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：205，SEQ IDNO：230，SEQ ID NO：306或SEQ ID NO：308。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：306在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：306有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：153，SEQ IDNO：166，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：205，SEQ ID NO：230，SEQ ID NO：306或SEQ ID NO：308。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：306在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：306有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：205，SEQ ID NO：230，SEQ ID NO：306或SEQ ID NO：308。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：310(克隆M24)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：310有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ IDNO：250，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：310在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：310有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：216，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ IDNO：310或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：310在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQID NO：310有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQ IDNO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。

本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：312(克隆M01)在0-8个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ IDNO：312有至少95％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：232，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ IDNO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ ID NO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：312在0-6个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：312有至少96％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：77，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ IDNO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。本发明还包括这样的分离或重组多肽，其包含与序列SEQ ID NO：312在0-3个氨基酸位置上不同的序列，即包含与序列SEQ ID NO：312有至少98％同一性、并且表现α-干扰素活性的序列；例如包含如下序列的多肽：SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：297，SEQ IDNO：304，SEQ ID NO：310或SEQ ID NO：312。

本发明多肽预期的其它修饰包括在下文描述的，该部分的标题为“α-干扰素偶联物”。

序列的变化形式

如上所述，本发明的多肽包括含有如下所述序列的多肽，该多肽与SEQID NO：1-SEQ ID NO：319之一的序列在0-16个氨基酸位置上不同。某些这样的多肽表现α-干扰素活性。

例如，本发明的一些多肽包括长度为大约151个氨基酸的序列，例如长度为大约151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164或165个氨基酸的序列，相当于相对亲本多肽序列(例如SEQ ID NOs：1-319之一)删除了1-15个氨基酸。在一些实例中，从C末端删除了1-11个氨基酸，例如1-10、1-7，如1-5、1-3个氨基酸，也就是说，多肽与亲本多肽序列(例如SEQID NOs：1-319之一)相比在C末端截短了1-11个氨基酸残基(例如截短了1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个氨基酸残基)，例如截短了1-10个、1-7个、例如1-5个、1-3个氨基酸残基。或者/此外，某些这样的多肽与亲本多肽序列(例如SEQ ID NOs：1-319之一)相比在N末端截短了1-4个氨基酸残基(例如截短了1，2，3或4个氨基酸残基)，例如从N末端除去1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸残基。某些这样的多肽进一步在N末端包括甲硫氨酸。某些这样的多肽显示α-干扰素活性。

作为另一个实例，本发明的某些多肽包含这样的序列：该序列相对于SEQ ID NO：1含有1-16个氨基酸替代(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸替代)，例如1-14个或1-12个或1-10个或1-8个或1-7个或1-6个或1-5个或1-4个或1-3个或1-2个氨基酸替代。可以根据例如替代组群(例如保守替代组群)，如下文所示的替代组群，在多肽序列中进行一个或多个氨基酸替代。或者/此外，可对多肽序列施加一个或多个额外的氨基酸替代来引入或删除含有非多肽部分连接基团的氨基酸残基。这样的例子包括引入或去除一个或多个N-糖基化位点，引入或去除一个或多个半胱氨酸残基或赖氨酸残基或组氨酸残基等。某些这样的多肽表现α-干扰素活性。

作为非限制性实例，本发明的多肽可具有与SEQ ID NO：1相比总计达16个位置不同的序列(其可以是氨基酸替代、删除和/或插入的组合，包括上述这些)。某些情况下，这些替代中没有一个是，或者有一些是，或者全部都是根据下面定义的替代组群的替代。

根据本发明的氨基酸替代可以包括，但不限于，一个或多个保守氨基酸替代。提供功能上相似的氨基酸的保守替代列表是本领域公知的。下表(表1)提供了一个例子，其提出了6个示例组群，其包含的氨基酸可认为彼此可“保守替代”。

表1

保守替代组群

1	丙氨酸(A) 甘氨酸(G) 丝氨酸(S) 苏氨酸(T)
1	丙氨酸(A) 甘氨酸(G) 丝氨酸(S) 苏氨酸(T)	2	天冬氨酸(D) 谷氨酸(E)
3	天冬酰胺(N) 谷氨酰胺(Q)	2	天冬氨酸(D) 谷氨酸(E)
3	天冬酰胺(N) 谷氨酰胺(Q)	4	精氨酸(R) 赖氨酸(K) 组氨酸(H)
5	异亮氨酸(I) 亮氨酸(L) 甲硫氨酸(M) 撷氨酸(V)	4	精氨酸(R) 赖氨酸(K) 组氨酸(H)
5	异亮氨酸(I) 亮氨酸(L) 甲硫氨酸(M) 撷氨酸(V)	6	苯丙氨酸(F) 酪氨酸(Y) 色氨酸(W)

可以预计其它的氨基酸替代基团。例如，可以根据相似的功能或化学结构或组成(例如酸、碱、脂肪族、芳香族、含硫)对氨基酸分组。例如，“脂肪族”可以包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。其它包含可认为彼此构成保守替代的氨基酸的组群有：“芳香族”：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；“含硫”：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；“碱性”：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；“酸性”：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。其它氨基酸组群另见Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company。将本文列举的多肽序列与上述替代组群相结合，提供了所有保守替代多肽序列的明确列表。

百分比序列同一性

在一个方面中，本发明提供了这样的分离或重组多肽，它们各自包含与SEQ ID NOs：1-319中的任一序列具有至少90％的序列同一性(例如至少大约91％，至少大约92％，至少大约93％，至少大约94％，至少大约95％，至少大约96％，至少大约97％，至少大约98％或至少大约99％的氨基酸序列同一性)。在一些情况中，所述多肽表现α-干扰素活性。

某一序列与另一个序列相似的程度可指示这两个序列结构和功能特性的相似性。因此，在本发明的背景下，与给定示例序列具有相似序列的序列是本发明的特征。特别地，具有如下定义的百分比序列同一性的序列是本发明的特征。

可以使用多种确定序列关系的方法，包括手工比对和计算机辅助序列比对和分析。用于执行序列比对的计算机程序有很多种，或者也可以由技术人员进行手工比对，如下文所述。

如上文所述，在主题发明中采用的多肽和核酸序列与本发明的相应多肽序列或核酸不必完全同一，而是可以基本上同一。例如，本发明的多肽可经历各种改变，例如一个或多个氨基酸的插入、删除和/或保守或非保守替代，包括在这样的情况下：例如，这些改变可能为这些多肽在其用途，例如治疗或预防用途或者给药或诊断应用中提供某些优势。本发明的核酸也可以经历各种改变，例如一个或多个密码子中的一个或多个核酸发生一个或多个替代而使得某个密码子编码相同或不同的氨基酸，结果或者是导致沉默变异(如本文定义的)或非沉默变异，或者是序列中一次或多次发生一个或多个核酸(或密码子)的删除。还可以修饰核酸使其包含一个或多个有助于在表达系统(例如细菌或哺乳动物)中最佳表达的密码子，同时，如果期望的话，所述一个或多个密码子仍然编码相同的氨基酸。这些核酸改变在治疗或预防用途或者施用或诊断应用中可以提供某些优势。核酸和多肽可以以多种方式修饰，只要它们包含与本发明相应核酸和多肽的序列基本上同一(如下文定义)的序列即可。

术语“同一”或称“一致”(“identical”)，或“同一性”或称“一致性”(identity)，就两个或多个核酸或多肽序列而言，是指：对两个或多个序列进行比较和比对以获得最大相似度(如下文描述的序列比较算法或用目测确定)时，所述两个或多个序列是相同的，或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。

主题序列与参照(即查询)序列的“百分比序列同一性”(“％同一性”)是指，主题序列与查询序列在整个比较长度上具有指定百分比的一致(即，对于多肽序列是氨基酸对氨基酸，对于核苷酸序列是核苷酸对核苷酸)程度。

主题序列与查询序列的百分比同一性的计算如下。首先，用具有特定比对参数的序列比较算法确定两个序列的最优对齐。最优对齐的确定可用计算机执行或者如下文所述加以人工计算。然后，在整个比较长度上比较最优对齐的两个序列，确定最优对齐条件下两个序列中出现相同残基的位置的数目，该数目提供了匹配位置的数目。然后用匹配位置的数目除以比较长度(除非另外指出，为查询序列的长度)的位置总数，结果乘以100，得到主题序列与查询序列的百分比序列同一性。

就多肽序列而言，通常将一个序列看作“查询序列”(例如，本发明的多肽序列)，将一个或多个其它序列即“主题序列”(例如序列数据库中存在的序列)与之比较。序列比较算法使用指定的比对参数确定查询序列与主题序列的最优对齐。当将查询序列与序列数据库例如

(GeneticSequence Data Bank；U.S.Department of Health and Human Services)或(Thomson Derwent；也可作为

在STN上访问)进行比较时，通常只将查询序列和比对参数输入到计算机中，返回查询序列与数据库中存在的每个主题序列的最佳对齐，通常至期望数目的主题序列为止。

当以给定的参数(即给定的氨基酸替代矩阵、缺口存在罚分(也称作缺口开放罚分)和缺口延伸罚分)对两个多肽序列加以比对，使这对序列获得可能的最高同一性得分时，两个多肽序列是“最优对齐的”。在多肽序列算法(例如下文描述的BLASTP)中，经常使用BLOSUM62矩阵(Henikoff andHenikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(22)：10915-10919)作为默认评分替代矩阵。针对被比对序列中单个氨基酸缺口的引入施加缺口存在罚分，针对缺口中的每一个残基位置施加缺口延伸罚分。除非另外说明，本文采用的比对参数如下：BLOSUM62评分矩阵，缺口存在罚分＝11，缺口延伸罚分＝1。对齐分数由每条序列上比对开始和结束(例如比对窗)的氨基酸位置来定义，任选地由为达到最高的可能相似性得分而向这一条或两条序列中插入的一个或多个缺口来定义。

尽管两个或多个序列之间的最优对齐可以人工确定(如下文所述)，但可以使用计算机实现的比对算法来帮助进行该过程，所述比对算法有例如

(National Library of Medicine)，例如用于多肽序列的BLASTP和用于核酸序列的BLASTN，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述，并已在多个来源对公众开放，例如美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))网站。当使用计算机化BLAST界面时，如果有“低复杂度过滤器”选项，该选项应当调节为关闭(即无过滤器)。

两条多肽序列之间的最优对齐还可以利用BLASTP算法，使用与上面确定的相同的参数(即矩阵＝BLOSUM62，缺口存在罚分＝11，缺口延伸罚分＝1)进行人工计算(即不需要计算机的帮助)来确定。开始时，通过目测对两条序列进行初始比对。然后如下计算初始对齐分数：根据BLOSUM62矩阵(图4)为序列对齐中每个单独位置(即对于每对对齐的残基)指定一个数值。序列对齐中为每一对残基所指定的数值之总和即是初始对齐分数。如果被比对的两条序列高度相似，初始对齐往往可提供最高的可能对齐分数。具有最高可能对齐分数的对齐是基于所用比对参数的最优对齐。图5A显示了计算两条序列对齐分数的实例，“查询”序列在本文中标识为SEQ ID NO：1的残基29-50(上)，“主题”序列在本文中标识为SEQ ID NO：312的残基30-52(下)。通过目测比对序列，根据BLOSUM62矩阵为每个对齐的氨基酸对指定的数值显示在序列对齐的各个位置的下面(为便于目测，序列对齐中每对同一的氨基酸用黑体字显示)。在该实例中，初始对齐提供了最高的可能对齐分数(每个对齐位置下面显示的数值的总和)；这两条序列的任何其它对齐，无论有或没有缺口，都将产生较之为低的对齐分数。

在一些情况下，在序列对齐中引入一个或多个缺口可获得更高的对齐分数。每当向对齐引入缺口时，即施加缺口开放罚分；此外，对缺口内的每一个残基位置施加缺口延伸罚分。这样，使用上述的比对参数(包括缺口开放罚分＝11和缺口延伸罚分＝1)时，序列对齐中一个残基的缺口相应的施加数值将为-(11+(1 x 1))＝-12，三个残基的缺口相应的施加数值为-(11+(3 x1))＝-14，以此类推。对每个引入到序列对齐中的新缺口重复该计算。图5B和5C显示了一个实例，它演示的是序列对齐中缺口的引入是如何在导致缺口罚分的同时仍产生更高的对齐分数的。图5B显示了目测完成的SEQ IDNO：312的残基29-50(上，查询序列)与SEQ ID NO：321的残基30-50(下，主题序列)的初始对齐，其初始对齐分数为70。图5C显示了在SEQ ID NO：321中引入一个残基的缺口对于对齐分数的影响；尽管缺口罚分为-12，但是两条序列的总体对齐分数增加到93。在该实例中，图5C所示的序列对齐提了最高的可能对齐分数，因此是这两条序列的最优对齐；这两条序列的任何其它对齐(无论有或没有缺口)都产生较之为低的对齐分数。

可以理解，上述使用相对较短序列的序列比对计算实例只是作为举例提供的；在实践中，所用的比对参数(BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分＝11，缺口延伸罚分＝1)一般用于85个氨基酸长或者更长的多肽序列。NCBI网站为其它长度的序列提供了如下的比对参数(其适用于计算机辅助以及人工比对计算，使用与上述相同的程序)。对于50-85个氨基酸长度的序列，最佳的参数为BLOSUM80矩阵(Henikoff and Henikoff，同上文)，缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝1。对于35-50个氨基酸长度的序列，最佳的参数为PAM70矩阵(Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.& Orcutt，B.C.(1978)＂A model of evolutionarychange in proteins.＂In Atlas of Protein Sequence and Structure，vol.5，suppl.3，M.O.Dayhoff(ed.)，pp.345-352，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC.)，缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝1。对于长度短于35个氨基酸的序列，最佳的参数为PAM30矩阵(Dayhoff，M.O.，同上文)，缺口开放罚分＝9，缺口延伸罚分＝1。

一旦序列被最优对齐，即按下述计算主题序列与查询序列的百分比同一性：计算最优对齐中包含相同残基对的位置数，除以比对长度中的残基数(除非另外说明，即为查询序列中残基的数目)，所得数字再乘以100。参照上文图5A-5C所示的实例，在每个实例中，指定为查询(上)序列的序列长度为22个氨基酸。在图5A的比对中，在查询序列(上)与主题序列(下)的最优对齐中有18对对齐的氨基酸残基(黑体显示)是同一的。因此，该主题序列与22个残基的查询序列的全长有(18/22) x 100＝81.8％的同一性；换言之，图5A的比对中主题序列与查询序列具有至少81％的氨基酸序列同一性。在图5C所示的比对中，最优对齐中有18对氨基酸残基(黑体显示)是同一的；因此该主题序列与22个残基的查询序列的全长有(18/22) x 100＝81.8％的同一性；换言之，图5C比对中主题序列与查询序列具有至少81％的氨基酸序列同一性。

用于多肽时，术语“基本同一性”或称“基本一致性”(或“基本同一”或称“基本一致”)通常意味着，当使用BLASTP算法(人工或借助计算机)采用上述合适参数将两条氨基酸序列(即查询序列和主题序列)最优对齐时，主题序列与查询序列具有至少大约60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的百分比氨基酸序列同一性。在一些情况下，在至少大约100个氨基酸残基的比较长度上，例如至少110，120，125，130，135，140，145，150，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165或166个氨基酸残基的比较长度上存在基本同一性。

类似地，在用于两条核酸序列的上下文时，术语“基本同一性”(或“基本同一”)意味着，当使用BLASTN算法(人工或借助计算机)采用下述合适参数将两条核酸序列(即查询序列和主题序列)最优对齐时，主题序列与查询序列具有至少大约60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的百分比核酸序列同一性。用于核酸序列比对的参数是：匹配赏分1，错配罚分-3，缺口存在罚分5，缺口延伸罚分2(BLASTN算法中不包括替代矩阵)。在一些情况下，在至少大约300个氨基酸残基的比较长度上，例如至少330，360，375，390，405，420，435，450，465，480，483，486，489，492，495或498个核苷酸残基的比较长度上存在基本同一性。

其它方面

本发明的任何多肽均可作为更长的多肽序列的一部分，例如融合蛋白的一部分而存在，例如出现在添加一个或多个用于稳定或检测或纯化多肽的域或子序列时。多肽纯化子序列可以包括，例如附加表位、FLAG标签、聚组氨酸序列、GST融合体或任何其它本领域已知的检测/纯化序列或“标签”。这些附加结构域或子序列对本发明多肽的活性具有几乎没有影响，或者可通过合成后处理步骤，例如蛋白酶处理、引入内含肽等加以除去。

本发明包括如下所述的融合蛋白，它包含本发明的多肽，例如本文所述的多肽，和与该多肽融合的Ig分子，例如人IgG Fc(“片段可结晶性”或片段互补结合性)铰链、CH2域和CH3域；本发明还包括编码这种融合蛋白的核苷酸序列。Fc是抗体中负责结合细胞抗原受体和补体C1q组分的部分。这些融合蛋白及其编码核酸可用作预防和/或治疗性药物，或者作为诊断工具(另见例如Challita-Eid，P.et al.(1998)J Immunol 160：3419-3426；Sturmhoefel，K.et al.(1999)Cancer Res 59：4964-4972)。本发明还包括如下所述的融合蛋白：它包含本发明的多肽以及与该多肽融合的白蛋白分子例如人血清白蛋白(HSA)，如美国专利No.5,876,969所述，以及编码该融合蛋白的核苷酸序列。Ig和白蛋白融合蛋白可表现更长的多肽血清半衰期和/或功能性体内半衰期，更低的多肽抗原性，更高的多肽保存稳定性，或更高的生物利用度，例如更高的AUC_sc，因此可用作预防和/或治疗药物。

任何本发明的多肽均还可以包括一个或多个经过修饰的氨基酸。修饰氨基酸可以是，例如，糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分偶联的氨基酸或与有机衍生化试剂偶联的氨基酸。修饰氨基酸的存在具有下述优点，例如(a)增加多肽血清半衰期和/或功能性体内半衰期，(b)降低多肽抗原性，(c)增加多肽保存稳定性，或(d)增加生物利用度，例如增加AUC_sc。氨基酸的修饰可在重组生产过程中以共翻译或翻译后的方式(例如在哺乳动物细胞内表达期间在N-X-S/T基序处发生N-连接糖基化)发生，或者通过合成方法进行氨基酸修饰。这个方面在本文标题为“α-干扰素偶联物”部分中有更详细的描述。

本发明还提供了一种组合物，它包含至少一种本发明的多肽，以及赋形剂或载体。该组合物可以是包含药用赋形剂或载体的组合物。组合物和赋形剂及载体的实例如下文所述。

多肽制备

本文描述了用于产生和分离本发明多肽的重组方法。除了重组产生之外，多肽还可以通过采用固相技术的直接肽合成方法产生(见例如Stewart etal.(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，San Francisco；Merrifield J.(1963)J Am Chem Soc 85：2149-2154)。肽合成可以用人工技术或自动进行。自动合成可以使用例如Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)根据制造商提供的使用说明来实现。例如，可以分别化学合成子序列，然后用化学方法加以组合而提供全长多肽或其片段。或者，这些序列可以从任何数目的专门生产多肽的公司订购。最经常的是，本发明的多肽可以通过表达编码核酸和回收多肽加以制造，例如下文所述。

本文还包括产生本发明多肽的方法。其中一种方法包括向细胞群体引入与调节序列可操作连接的任何本文所述的本发明核酸，在培养基中培养细胞以表达多肽，并从细胞或培养基分离多肽；其中上述调节序列对产生编码多肽有效。所用的核酸含量足以便于细胞摄取(转染)和/或多肽的表达。使用任何本文所述的方法将核酸引入该细胞中，包括例如注射、基因枪、被动摄取等。核酸可以是载体的一部分，例如重组表达载体，包括DNA质粒载体或任何其它本文所述的载体。包含本发明核酸的核酸或载体的制备和配制如上文所述。可以将这种核酸或载体体内引入到哺乳动物细胞群体中，或者可以将所选哺乳动物细胞(例如肿瘤细胞)从哺乳动物中移出，然后回体(ex vivo)地将核酸表达载体引入到该细胞群体中，引入的量足以造成编码多肽的摄取和表达。或者，在体外利用培养细胞产生包含本发明核酸的核酸或载体。在一个方面中，产生本发明多肽的方法包括向细胞群体引入包含任何本文所述的本发明核酸的重组表达载体，其含量和配方足以造成载体的摄取和编码多肽的表达；通过本文所述的任何引入/输送方式将表达载体施予哺乳动物；和从该哺乳动物或该哺乳动物的副产品中分离所述多肽。

抗体

在本发明的另一个方面中，使用本发明的多肽(或其抗原性片段)产生抗体，所述抗体具有例如诊断、治疗或预防用途，例如与多肽及其片段的活性、分布和表达有关的诊断、治疗或预防用途。本发明多肽的抗体可以通过本领域众所周知的方法生产。这些抗体包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段和由Fab表达文库产生的片段。抗体，例如阻断受体结合的抗体，特别优选用于治疗和/或预防用途。

用于诱导抗体的多肽不需要有生物学活性；然而，这些多肽或肽应当是抗原性的。用于诱导特异性抗体的肽可具有由至少大约10个氨基酸，优选至少大约15或20个氨基酸，或至少大约25或30个氨基酸构成的氨基酸序列。可以将短的多肽序列和另一种蛋白，例如匙孔

血蓝蛋白和针对嵌合分子产生的抗体融合。

产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员众所周知的，可用的抗体有多种，见例如Current Protocols in Immunology，John Colligan et al.，eds.，Vols.I-IV(John Wiley & Sons，Inc.，NY，1991and 2001 Supplement)；和Harlow and Lane(1989)Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring HarborPress，NY；Stites et al.(eds.)Basic and Clinical Immunology(4th ed.)LangeMedical Publications，Los Altos，CA，以及其引用的参考文献；和Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2d ed.)Academic Press，New York，NY；and Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495-497。其它用于制备抗体的合适的技术包括在噬菌体或类似载体中筛选重组抗体文库，见Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281；和Ward et al.(1989)Nature341：544-546。特异性的单克隆和多克隆抗体和抗血清通常以至少大约0.1μM、优选地至少大约0.01μM或更佳，最典型而优选地0.001μM或更佳的KD结合。

制备嵌合(人源化)抗体的详细方法可见美国专利5,482,856。关于人源化和其它抗体生产和工程改造技术的其它细节可以在下列文献中找到：Borrebaeck(ed.)(1995)Antibody Engineering，2^nd Edition Freeman andCompany，NY(Borrebaeck)；McCafferty et al.(1996)Antibody Engineering，APractical Approach IRL at Oxford Press，Oxford，England(McCafferty)，和Paul(1995)Antibody Engineering Protocols Humana Press，Towata，NJ(Paul)。

在一个方面中，本发明为针对本发明多肽或其片段的完全人源化抗体作了准备。人源化抗体特别适用于抗体作为人类患者体内治疗剂和/或预防剂的应用中。人抗体特征性地由人免疫球蛋白序列构成。本发明的人抗体可以用多种方法制造(综述可见Larrick et al.，U.S.Pat.No.5,001,065，和上文综述的Borrebaeck McCafferty and Paul)。在一个方面中，本发明的人抗体最初在三源杂交瘤(trioma)细胞中产生。然后在其它细胞中，例如在非人哺乳动物细胞中，克隆和表达编码抗体的基因。通过三源杂交瘤技术产生人抗体的一般方法如Ostberg et al.(1983)，Hybridoma 2：361-367，Ostberg，美国专利4,634,664和Engelman等人，美国专利4,634,666所述。通过该方法获得的产抗体细胞系称作三源杂交瘤，因为它们是三个细胞的后代——两个人细胞和一个小鼠细胞。已发现三源杂交瘤与从人类细胞制得的普通杂交瘤细胞相比可以产生更稳定的抗体。

说明书全文提供了本发明多肽的其它预期用途。

α-干扰素偶联物

在另一个方面中，本发明涉及一种偶联物，其包括表现α-干扰素活性的多肽和至少一个连接于所述多肽的非多肽部分，其中所述表现α-干扰素活性的多肽包含SEQ ID NO：1-319之一的氨基酸序列，所述连接于多肽的非多肽部分有诸如1-6个、1-5个、1-4个、1-3个，例如1或2个。可以理解，该偶联物也表现α-干扰素活性(例如抗病毒活性、T_H1分化活性和/或抗增殖活性)。某些这样的偶联物进一步包括一个或多个额外的氨基酸，例如添加在该多肽N末端的甲硫氨酸。

在另一个方面中，所述偶联物包括表现α-干扰素活性的多肽和至少一个连接于多肽的非多肽部分，所述表现α-干扰素活性的多肽包含与SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：319之一在0-16个氨基酸位置上有不同的氨基酸序列，所述连接于多肽的非多肽部分有诸如1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个。在一些实例中，氨基酸序列包含一个或多个引入或除去非多肽部分连接基团的替代(例如，用包含非多肽部分连接基团的其它氨基酸残基替代某个氨基酸残基，或者插入包含非多肽部分连接基团的额外氨基酸残基)。可以理解，该偶联物也显示α-干扰素活性(例如，抗病毒活性、T_H1分化活性和/或抗增殖活性)。某些这样的偶联物进一步包含一个或多个额外的氨基酸，例如添加在所述多肽N末端的甲硫氨酸。

术语“偶联物”(或者可互换地称为“多肽偶联物”或“偶联多肽”)意图表示这样一种异源(从复合的意义上说)分子，它是通过使一个或多个本发明多肽共价连接一个或多个非多肽部分而形成的。术语“共价连接”(covalentattachment)是指，多肽与非多肽部分或者彼此直接共价地连结在一起，或者通过一个或多个间隔部分，如桥(bridge)、间隔基团(spacer)或一个或多个连接部分，彼此间接地共价连接。优选地，偶联多肽在相关的浓度和条件下是可溶的，即可溶于生理液体，如血液。本发明偶联多肽的实例包括糖基化和/或聚乙二醇(PEG)化多肽。术语“非偶联多肽”可用于指代偶联多肽的多肽部分。

术语“非多肽部分”意图表示能够偶联于多肽的连接基团的分子。非多肽部分的优选实例包括聚合物分子、糖部分、亲脂性化合物或有机衍生化试剂，特别是聚合物分子或糖部分。可以理解，非多肽部分通过多肽的连接基团与多肽连接。除非明确指明连接于多肽的非多肽部分(例如聚合物分子)的数目，每次述及连接在多肽上的“非多肽部分”或其在本发明中以其它方式的使用时，都表示一个或多个连接在多肽上的非多肽部分。

术语“聚合物分子”定义为通过共价连接两个或多个单体而形成的分子，其中任何一个单体都不是氨基酸残基。术语“聚合物”可以和“聚合物分子”互换使用。

术语“糖部分”意图表示通过体内或体外糖基化，例如N-或O-糖基化，而连接上的碳水化合物分子。

“N-糖基化位点”具有N-X-S/T/C序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选的是丝氨酸或苏氨酸，最优选的是苏氨酸。

“O-糖基化位点”包含丝氨酸或苏氨酸残基的OH基团。

术语“连接基团”意图表示能够与相关非多肽部分(例如聚合物分子或糖部分)偶联的氨基酸残基基团。下面在表2中提供了有用连接基团的非限制性实例，以及一些相关的非多肽部分。

表2

有用的连接基团和相应的非多肽部分的实例

连接基团	氨基酸	非多肽部分实例	偶联方法/活化PEG实例	参考文献
连接基团	氨基酸	非多肽部分实例	偶联方法/活化PEG实例	参考文献	-NH2	N-末端，Lys	聚合物，如PEG	mPEG-SPAmPEG2-NHSmPEG2-丁醛	NektarInc.2003 Catalog
-COOH	C-末端，Asp，Glu	聚合物，如PEG，糖部分	mPEG-Hz体外偶联	Nektar Inc.2003Catalog	-NH2	N-末端，Lys	聚合物，如PEG	mPEG-SPAmPEG2-NHSmPEG2-丁醛	NektarInc.2003 Catalog
-COOH	C-末端，Asp，Glu	聚合物，如PEG，糖部分	mPEG-Hz体外偶联	Nektar Inc.2003Catalog	-SH	Cys	聚合物，如PEG，糖部分	mPEG-VSmPEG2-MAL体外偶联	Nektar Inc.2003 Catalog；Delgado et al，CriticalReviews in TherapeuticDrug Carrier Systems9(3，4)：249-304(1992)
-OH	Ser，Thr，OH-	糖部分	体内O-连接糖基化		-SH	Cys	聚合物，如PEG，糖部分	mPEG-VSmPEG2-MAL体外偶联
-OH	Ser，Thr，OH-	糖部分	体内O-连接糖基化		-CONH₂	作为N-糖基化位点一部分的Asn	糖部分	体内N-糖基化
芳香残基	Phe，Tyr，Trp	糖部分	体外偶联		-CONH₂	作为N-糖基化位点一部分的Asn	糖部分	体内N-糖基化
芳香残基	Phe，Tyr，Trp	糖部分	体外偶联		-CONH₂	Gln	糖部分	体外偶联	Yan and Wold，Biochemistry，1984，Jul31；23(16)：3759-65

连接基团	氨基酸	非多肽部分实例	偶联方法/活化PEG实例	参考文献
连接基团	氨基酸	非多肽部分实例	偶联方法/活化PEG实例	参考文献	醛酮	氧化的糖	聚合物例如PEG，PEG-酰肼	PEG	Andresz et al.，1978，Makromol.Chem.179：301；WO 92/16555，WO 00/23114
胍基	Arg	糖部分	体外偶联	Lundblad and Noyes，Chemical Reagents forProtein Modification，CRCPress Inc.Boca Raton，FI	醛酮	氧化的糖	聚合物例如PEG，PEG-酰肼	PEG
胍基	Arg	糖部分	体外偶联		咪唑环	His	糖部分	体外偶联	同胍基

对于体内N-糖基化，术语“连接基团”以非常规的方式使用，表示构成N糖基化位点的氨基酸残基(具有N-X-S/T/C的序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸任一个，优选的是丝氨酸或苏氨酸，最优选的是苏氨酸)。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是在糖基化中糖部分所连接的残基，但是只有在N糖基化位点的其它氨基酸残基存在的条件下这种连接才能实现。因此，若非多肽部分是糖部分，并且要偶联通过N-糖基化来实现，则术语“包含非多肽部分连接基团的氨基酸残基”与本发明多肽的氨基酸序列的改变相联用时，可以理解为构成N-糖基化位点的氨基酸残基中的一个、两个或全部将以如下方式改变：或者在氨基酸序列中引入，或者从所述序列除去功能N-糖基化位点，或者在氨基酸序列中保留功能性N-糖基化位点(例如，通过用苏氨酸残基替代已构成N糖基化位点一部分的丝氨酸残基，反之亦然)。

术语“引入”(也就是“引入的”氨基酸残基，氨基酸残基的“引入”)主要是指用另一个氨基酸残基替代现有氨基酸残基，但是也可以表示插入额外的氨基酸残基。

术语“除去”(也就是被“除去的”氨基酸残基，氨基酸残基的“除去”)主要是指用另一个氨基酸残基替代要除去的氨基酸残基，但是也可以表示删除(没有替代)要除去的氨基酸残基。

术语“包含非多肽部分连接基团的氨基酸残基”意图表示该氨基酸残基是可结合非多肽部分的残基(对引入的氨基酸残基而言)，或者曾经可结合非多肽部分的的残基(对被除去的氨基酸残基而言)。

术语“功能性体内半衰期”使用其通常意思，即多肽在身体/靶器官内仍然存在50％生物活性时的时间，或者多肽的活性是初始值50％时的时间。功能性体内半衰期可以在实验动物例如大鼠、小鼠、兔、狗或猴等中测定。优选地，功能性体内半衰期在非人灵长动物例如猴中测定。而且，可以为已经静脉内或皮下给药的样品测定功能性体内半衰期。

作为测定功能性体内半衰期之外的选择，可以测定“血清半衰期”，即有50％的多肽在被清除之前在血浆或血流中循环时的时间。测定血清半衰期经常比测定功能性体内半衰期更简单，并且血清半衰期的长短通常可以良好地指示功能性体内半衰期的长短。血清半衰期还可表示为“血浆半衰期”、“循环半衰期”、“血清清除率”、“血浆清除率”和“清除半衰期”。血清半衰期可以如上所述联系上文功能性体内半衰期的测定来加以测定。

术语“血清”使用其通常意思，即没有纤维蛋白原和其它凝血因子的血浆。

关于功能性体内半衰期或血清半衰期使用的术语“增加”用于表示本发明偶联物的相关半衰期相对于参照分子或相应的非偶联多肽相比统计学显著地增加，其中参照分子例如野生型α-干扰素，如人α-干扰素，如SEQ IDNO：320-SEQ ID NO：332中任一序列(或者在本文和/或上文Allen G.and DiazM.O.(1996)中描述的其它huIFN-α序列)。因此，本发明感兴趣的偶联物包括与上文提到的参照分子相比具有更高功能性体内半衰期或血清半衰期的偶联物。

术语“AUC_sc”或“皮下给药时的曲线下面积”使用其通常的意思，即当偶联分子已经皮下给予实验动物时，在血清中α-干扰素活性-时间曲线下的面积。一旦确定实验α-干扰素活性时间点，即可通过计算机程序，例如GraphPadPrism 3.01.，方便地计算AUC_sc。

关于AUC_sc使用的术语“增加”是指：在相似的测定条件下，本发明偶联物皮下施用后的曲线下面积与参照分子或相应的非偶联多肽相比有统计学显著的增加，其中参照分子例如野生型α-干扰素，如人α-干扰素，如SEQ IDNO：320-SEQ ID NO：332中任一个(或者在本文和/或上文Allen G.and DiazM.O.(1996)中描述的其它huIFN-α序列)。显然，对本发明的偶联物和参照分子而言应该施用相同量的α-干扰素活性。因此，为了在不同α-干扰素分子之间进行直接比较，AUC_sc数值通常应当归一化，即用AUC_sc/施用剂量表示。

术语“T_max，sc”用于表示在血清α-干扰素活性-时间曲线中观察到血清中最高α-干扰素活性的时间点。

可以理解，尽管在本文中一般地就SEQ ID NO：1序列提供了本发明多肽的实例和修饰，但是所公开的修饰可以在上述本发明任何其它多肽的等同氨基酸位置处进行(包括SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：319，及其变化形式)。

通过除去和/或引入包含非多肽部分连接基团的氨基酸残基，有可能对多肽进行特定的改造，使得该分子更易于偶联所选的非多肽部分，以优化偶联模式(例如，保证非多肽部分在α-干扰素分子表面上的最佳分布，从而例如有效地屏蔽多肽的表位和其它表面部分，而不会显著破坏其功能)。例如，通过引入连接基团，α-干扰素多肽中结合相应非多肽部分的特定氨基酸残基的含量发生改变，借此获得更有效、特异和/或广泛的偶联。通过除去一个或多个连接基团，可以避免非多肽部分偶联到多肽中不宜于偶联的部分，例如偶联到位于多肽功能位点处或其附近处的氨基酸残基上(因为在这类位点处偶联会使最终偶联物由于受体识别受阻而丧失或降低α-干扰素活性)。而且，除去位于另一个连接基团附近的连接基团可能是有利的。

可以理解，包含非多肽部分连接基团的氨基酸残基，无论是被除去的还是引入的，都是根据非多肽部分的性质，在某些情况下还根据待使用的偶联方法来加以选择的。例如，当非多肽部分是聚合物分子，例如聚乙二醇或聚亚烷基氧化物衍生分子时，能够起连接基团作用的氨基酸残基可以从下组中选择：半胱氨酸、赖氨酸(和/或多肽的N末端氨基酸基团)、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和精氨酸。当非多肽部分是糖部分时，连接基团是体内或体外N-或O-糖基化位点，优选N-糖基化位点。

在一些情况下，当向α-干扰素多肽引入或除去非多肽部分连接基团时，待修饰α-干扰素多肽的位置可以酌情如下地加以选择：

待修饰的位置可以位于α-干扰素多肽的表面，例如由如下所述的氨基酸残基占据的位置：该氨基酸残基有超过25％的侧链暴露于溶剂，例如其超过50％的侧链暴露于溶剂。这些位置已根据本文“材料和方法”部分描述的人α-干扰素2a分子的3D结构分析得到了鉴定。

为了确定连接基团的最佳分布，根据α-干扰素分子的3D结构计算α-干扰素分子表面上氨基酸残基之间的距离。更具体地讲，测定包含此类连接基团的氨基酸残基的CB之间的距离，或者一个氨基酸的功能基团(赖氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)与另一个包含连接基团的氨基酸残基的CB之间的距离。对甘氨酸而言，使用CA而非CB。在本发明偶联物的α-干扰素多肽部分中，任何所述距离均可超过8

，例如超过10

，以避免或减少不均一的偶联，并提供均匀分布的连接基团，例如出于屏蔽表位的目的。

而且，在本发明偶联物的α-干扰素多肽部分中，在一些情况下，将位于α-干扰素的受体结合位点或其附近的连接基团除去，例如通过替换包含这种基团的氨基酸残基。在一些情况下，往往不将包含非多肽部分连接基团的氨基酸残基(例如半胱氨酸或赖氨酸)引入到α-干扰素分子受体结合位点或其附近。

另一种修饰α-干扰素多肽的方法是通过与非多肽部分偶联来屏蔽，藉此修饰或破坏或者失活存在于亲本α-干扰素中的表位。α-干扰素多肽的表位可以使用本领域已知的方法加以鉴定，也称作表位作图(epitope mapping)，参见例如Romagnoli et al.，J.Biol Chem.，1999，380(5)：553-9，DeLisser HM，Methods Mol Biol，1999，96：11-20，Van de Water et al.，Clin ImmunolImmunopathol，1997，85(3)：229-35，Saint-Remy JM，Toxicology，1997，119(1)：77-81，和Lane DP and Stephen CW，Curr Opin Immunol，1993，5(2)：268-71。一种方法是建立表达随机寡肽(例如9个氨基酸残基的随机寡肽)的噬菌体展示文库。通过免疫沉淀从抗人α-干扰素的特异性抗血清中纯化IgG1抗体，并通过免疫印迹鉴定反应性噬菌体。对纯化的反应性噬菌体的DNA进行测序，可以确定寡肽的序列而后将该序列在α-干扰素3D结构上定位。或者，表位可以根据美国专利5,041,376中描述的方法加以确定。由上述方法在结构上鉴定的区域构成表位，该表位进而可以选择作为引入非多肽部分连接基团的靶区域。优选地，根据本发明，α-干扰素的至少1个表位，例如2、3或4个表位被非多肽部分屏蔽。因此，在一个方面中，本发明的偶联物与野生型人α-干扰素，包括任何可商购的α-干扰素相比，具有至少一个被屏蔽的表位。这可以通过将非多肽部分连接基团引入到给定表位附近的位置(即在一级序列中的4个氨基酸残基内，或者在三级序列中的大约10

内)来实现。

距离是在CB(在甘氨酸中是CA)之间测量的。这种具体的引入在下面部分中有说明。

当除去连接基团时，对于包含该基团且占据上面定义的位置的相关氨基酸残基，可以用不包含所述非多肽部分连接基团的其它氨基酸残基来替代之，或者删除之。N-糖基化基团的除去也可以通过在N-X-S/T/C基序内插入或除去氨基酸残基来实现。

当引入连接基团时，包含所述基团的氨基酸残基引入到该位置，例如通过取代占据该位置的氨基酸残基。

存在于α-干扰素多肽内可供偶联的连接基团的确切数目，取决于期望通过偶联实现的效果。要获得的效果取决于，例如，偶联的性质和程度(例如非多肽部分的身份，偶联于多肽的非多肽部分的期望数目或可能数目，它们应偶联的位置，或应避免偶联的位置等)。例如，如果期望降低免疫原性，则连接基团的数目(和位置)应足以屏蔽大多数或全部表位。当较大部分的α-干扰素多肽被屏蔽时，该目的通常可以实现。当可供偶联的连接基团的总数在1-6个连接基团的范围内，例如1-5个，例如1-3个，如1、2或3个连接基团时，通常可实现表位的有效屏蔽。

功能性体内半衰期典型地取决于偶联物的分子量和提供更长半衰期所需的连接基团的数目，因此取决于所述非多肽部分的分子量。某些这样的偶联物包含1-6个，例如1-5个，例如1-3个，例如1、2或3个非多肽部分，其中每个非多肽部分的MW大约为2-40kDa，例如大约2kDa、大约5kDa、大约12kDa、大约15kDa、大约20kDa、大约30kDa或者大约40kDa。

在本发明的偶联物中，一些、大多数或者基本上全部可偶联的连接基团被相关非多肽部分占据。

本发明的偶联物可以显示一种或多种如下改进性质：

例如，偶联物与相应的非偶联多肽相比可显示更低的免疫原性，例如与非偶联多肽相比，减少至少10％，例如减少至少25％，例如减少至少50％，例如减少至少75％。

在另一个方面中，偶联物可显示与经过人α-干扰素(例如本文中定义为SEQ ID NO：320-SEQ ID NO：332的任何多肽，或者本文和/或在Allen G.andDiaz M.O.(1996)中描述的任何其它huIFN-α)治疗的患者的中和抗体有更低的反应或者不与之反应，或者与相应的非偶联多肽相比，例如减少至少10％的中和，例如至少25％，例如至少50％，例如至少75％。

在本发明的另一个方面中，偶联物与参照分子相比可显示更高的功能性体内半衰期和/或更高的血清半衰期，其中参照分子例如人α-干扰素(如本文中定义为SEQ ID NO：320-332的任何多肽，或本文和/或上文Allen G.andDiaz M.O.(1996)中描述的任何其它huIFN-α)，或者偶联的参照α-干扰素(例如偶联的人IFN-α 2a或偶联的人IFN-α 2b)，或者相应的非偶联多肽。特别优选的偶联物是如下的偶联物，其中所述偶联物的功能性体内半衰期(或血清半衰期)与所述参照分子的功能性体内半衰期(或血清半衰期)的比值至少为1.25，例如至少1.50，例如至少1.75，例如至少2，例如至少3，例如至少4，例如至少5，例如至少6，例如至少7，例如至少8。如上所述，半衰期可以在实验动物例如大鼠或猴中方便地确定，并可以基于静脉内施用或皮下施用。

在进一步的方面中，偶联物与参照分子相比可显示更高的生物利用度，其中参照分子例如人α-干扰素(如本文定义为SEQ ID NO：320-332的任何多肽，或本文和/或上文Allen G.and Diaz M.O.(1996)中描述的任何其它huIFN-α)，或者偶联的参照α-干扰素(例如偶联的人IFN-α 2a或偶联的人IFN-α 2b)，或者相应的非偶联多肽。例如偶联物与参照分子相比可显示更高的AUC_sc。因此，偶联物实例是这样的偶联物，其中当皮下给药时，尤其是在实验动物例如大鼠或猴中皮下给药时，特别是，所述偶联物的AUCsc与所述参照分子的AUC_sc之间的比值至少为1.25，例如至少1.5，例如至少2，例如至少3，例如至少4，例如至少5或至少6，例如至少7，例如至少8，例如至少9或者至少10，例如至少12，例如至少14，例如至少16，例如至少18或者至少20。类似地，本发明的一些偶联物是这样的偶联物，其中当皮下给药，尤其是在实验动物例如大鼠或猴中皮下内给药时，所述偶联物的T_max与所述参照分子(例如人α-干扰素或其偶联物或相应的未偶联多肽)的T_max之间的比值至少为1.2，例如至少1.4，例如至少1.6，例如至少1.8，例如至少2，例如至少2.5，例如至少3，例如至少4，例如至少5，例如至少6，例如至少7，例如至少8，例如至少9，例如至少10。

在一些实例中，本发明偶联物的抗病毒活性的大小，相对于人α-干扰素(如本文定义为SEQ ID NO：320-332的任何多肽，或本文和/或上文Allen G.and Diaz M.O.(1996)中描述的任何其它huIFN-α)或者相应的非偶联多肽的抗病毒活性的大小，可以有所减少(例如减少至少大约75％，至少大约50％，至少大约25％，至少大约10％)，或者有所增加(例如增加至少大约10％)，或者大致相等(例如在大约+/-10％或大约+/-5％之内)。在一些情况下，本发明偶联物的抗病毒活性与抗增殖活性的比值可以改变，从而高于、低于或大约等于人α-干扰素或相应非偶联多肽的比值。

非多肽部分与赖氨酸残基或N-端氨基连接的本发明偶联物

在本发明的一个方面中，本发明涉及如下的偶联物：其表现α-干扰素活性，并且包含至少一个非多肽部分，该非多肽部分偶联于包含选自SEQ IDNOs：1-319的序列的至少一个赖氨酸残基和/或N末端氨基基团。

在另一个方面中，本发明涉及如下的偶联物：其表现α-干扰素活性，并且包含至少一个非多肽部分，该非多肽部分偶联于α-干扰素多肽的至少一个赖氨酸残基和/或N末端氨基基团，该α-干扰素多肽包含如下所述的序列，该序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：319之一的序列在1-16个氨基酸位置上不同(例如在1-15个氨基酸位置上，在1-14个氨基酸位置上，在1-13个氨基酸位置上，在1-12个氨基酸位置上，在1-11个氨基酸位置上，在1-10个氨基酸位置上，在1-9个氨基酸位置上，在1-8个氨基酸位置上，在1-7个氨基酸位置上，在1-6个氨基酸位置上，在1-5个氨基酸位置上，在1-4个氨基酸位置上，在1-3个氨基酸位置上，或在1-2个氨基酸位置上不同)。根据这一方面的某些偶联物包含至少一个已被除去的赖氨酸残基，和/或至少一个已被除去的组氨酸残基，和/或至少一个被引入的赖氨酸残基。

本发明此方面预期的非多肽部分包括聚合物分子，例如在标题为“与聚合物分子偶联”的部分中提到的任何分子，例如PEG或mPEG。含赖氨酸多肽与聚合物分子之间的偶联可通过任何合适的方式实现，例如在标题为“与聚合物分子偶联”的部分中描述的，例如使用参照所述部分的一步法或逐步的方式。将α-干扰素多肽PEG化的示例方法是用赖氨酸反应性PEG将PEG共价连接于赖氨酸残基。多种高特异性赖氨酸反应性PEG(例如琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和醛(例如丁醛))和不同大小线性或分枝PEG(例如2-40kDa，如2kDa，5kDa，12kDa，15kDa，20kDa，30kDa或40kDa)可以从例如Therapeutics Inc.，Huntsville，AL，USA或SunBio，Anyang City，South Korea商购。

非多肽部分与半胱氨酸残基结合的本发明偶联物

在一个方面中，本发明涉及这样的偶联物，其表现α-干扰素活性，并且包含至少一个非多肽部分，该非多肽部分偶联于α-干扰素多肽的至少一个半胱氨酸残基，所述α-干扰素多肽包含如下序列：该序列与SEQ ID NO：1-SEQID NO：319之一在1-16个氨基酸位置上不同(例如在1-15个氨基酸位置上，1-14个氨基酸位置上，1-13个氨基酸位置上，1-12个氨基酸位置上，1-11个氨基酸位置上，1-10个氨基酸位置上，1-9个氨基酸位置上，1-8个氨基酸位置上，1-7个氨基酸位置上，1-6个氨基酸位置上，1-5个氨基酸位置上，1-4个氨基酸位置上，1-3个氨基酸位置上，或1-2个氨基酸位置上不同)。根据这一方面的一些偶联物包含至少一个引入的半胱氨酸残基。

在一些情况下，只引入单个半胱氨酸残基，以避免在两个或多个引入的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。

在α-干扰素中，1/99和29/139位的半胱氨酸之间形成二硫键。二硫键29/139对于生物活性至关重要，而1/99键可被还原而不显著影响生物活性(Beilharz M.W.et al.(1986)J.Interferon Res.6(6)：677-685)。因此，在本发明的另一个方面中，将C1或C99其中之一除去，优选通过替代例如C1S或C99S除去，而留下另一个半胱氨酸残基用来偶联非多肽部分。

本发明此方面预期的非多肽部分包括聚合物分子，例如在标题为“与聚合物分子偶联”的部分中提到的任何分子，例如PEG或mPEG。含半胱氨酸多肽与聚合物分子之间的偶联可通过任何合适的方式实现，例如在标题为“与聚合物分子偶联”的部分中描述的，例如使用所述部分提到的一步法或逐步的方式。将α-干扰素多肽PEG化的示例方法是用半胱氨酸反应性PEG将PEG共价连接于半胱氨酸残基。多种具有不同基团(例如邻吡啶二硫(OPSS)、顺丁烯二酰亚胺(MAL)和乙烯基砜(vinylsulfone，VS))和不同大小的线性或分枝PEG(例如2-40kDa，如2kDa，5kDa，12kDa，15kDa，20kDa，30kDa或40kDa)的高特异性半胱氨酸反应性的PEG可以从例如Nektar Therapeutics Inc.，Huntsville，AL，USA或SunBio，Anyang City，South Korea商购。

本发明偶联物的非多肽部分

如上所述，本发明偶联物的非多肽部分一般从下组中选择：聚合物分子、亲脂性化合物、糖部分(例如通过体内N-糖基化)和有机衍生化剂。所有这些试剂可以向偶联物的多肽部分授予期望的性质，例如更低的免疫原性、更长的功能性体内半衰期、更长的血清半衰期、更高的生物利用度和/或更高的AUCsc。偶联物的多肽部分经常只与一种类型的非多肽部分偶联，但是也可以和两种或多种类型的非多肽部分偶联，例如与聚合物分子和糖部分偶联等。与两种或多种不同非多肽部分的偶联可以同时或顺次实现。非多肽部分的选择主要取决于想通过偶联实现的效果。例如，已发现糖部分特别有用于降低免疫原性，而聚合物如PEG特别有用于增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期。使用聚合物分子和糖部分的组合，可以促进免疫原性的降低和功能性体内半衰期或血清半衰期的增加。

在如下部分中，“与亲脂性化合物偶联”、“与聚合物分子偶联”、“与糖部分偶联”和“与有机衍生化剂偶联”，描述了与具体的非多肽部分类型的偶联。

与亲脂性化合物偶联

为了与亲脂性化合物偶联，如下的多肽基团可以起连接基团的作用：多肽的N末端或C末端，Ser，Thr或Tyr氨基酸残基的羟基，Lys的ε-氨基，Cys的SH基团，或者Asp和Glu的羧基。多肽和亲脂性化合物彼此可以直接或通过使用接头间接偶联在一起。亲脂性化合物可以是天然化合物，例如饱和或不饱和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯、前列腺素、维生素、类胡萝卜素或类固醇，或者是合成化合物，例如具有一个或多个烷基、芳香基、烯基或其它多不饱和化合物的碳氢酸、醇、胺和磺酸。多肽与亲脂性化合物的偶联，任选通过接头，可以根据本领域已知的方法实现，例如在Bodanszky inPeptide Synthesis，John Wiley，New York，1976和WO96/12505中说明的。

与聚合物分子偶联

用于偶联多肽的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，例如天然或合成的均聚物或杂聚物，典型的分子量范围是大约300-100,000Da，例如大约1000-50,000Da，例如大约1000-40,000Da。更具体地，聚合物分子，例如PEG，特别是mPEG，具有的典型分子量为大约2，5，10，12，15，20，30，40或50kDa，尤其是大约5kDa、大约10kDa、大约12kDa、大约15kDa、大约20kDa、大约30kDa或者大约40kDa。PEG分子可以是分枝的(例如mPEG2)，或者可以是非分枝的(即线性的)。

当用于本文的聚合物分子时，词汇“大约”表示近似的平均分子量，它反映给定的聚合物制品中通常存在一定的分子量分布这一事实。

均聚物的实例包括多元醇(即多-OH)、多胺(即多-NH₂)和多聚羧酸(即多-COOH)。杂聚物是包含一种或多种不同的偶联基团(例如羟基和胺基)的聚合物。

合适聚合物分子的实例包括选自下组的聚合物分子：聚环氧烷烃(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，诸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分枝PEG(PEG2)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚乙烯马来酸酐共聚物，聚苯乙烯马来酸酐共聚物，葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖，或者任何其它适用于降低免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期的生物聚合物。一般地，聚亚烷基二醇衍生聚合物是生物相容性、无毒、无抗原性、无免疫原性的，具有不同的水溶性质，且容易从活体生物体分泌。

PEG是优选的可用聚合物分子，因为它与例如多糖如葡聚糖相比，仅有很少的能够交联的反应性基团。特别值得关注的是单功能PEG，例如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因为其偶联化学相对简单(只有一个反应基团可用于和多肽上的连接基团偶联)。因此，消除了发生交联的风险，最终的多肽偶联物更加均匀，更容易控制聚合物分子与多肽的反应。

为了实现聚合物分子与多肽的共价连接，聚合物分子的羟基端基团必须以活性形式提供，即具有反应性官能团(其例子包括一级氨基基团、酰肼(HZ)、硫醇、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺(SSA)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺羧甲基酯(succinimidyl carboxymethylate，SCM)、苯并三唑羧酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子是可以商购的，例如可以从NektarTherapeutics，Inc.，Huntsville，AL，USA；PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK；或SunBio Corporation，Anyang City，South Korea商购。或者，可以通过本领域已知的常规方法来活化聚合物分子，例如在WO 90/13540中公开的。适用于本发明的已活化线性或分枝聚合物分子的具体实例在Nektar Therapeutics，Inc.2003 Catalog(“Nektar Molecule Engineering：Polyethylene Glycol andDerivatives for Advanced Pegylation，Catalog 2003”)中有说明，本文引证其内容。已活化的聚合物分子的具体实例包括下列线性PEG：NHS-PEG，SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，SCM-PEG，NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，OPSS-PEG，IODO-PEG，和MAL-PEG；以及分枝PEG，诸如PEG2-NHS，PEG2-MAL，以及在US 5,932,462和US 5,643,575中公开的那些分枝PEG，本文引证这两篇文献的内容。而且，在本文引证的如下出版物中公布了有用的聚合物分子和/或PEG化化学作用：US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO95/00162，WO 95/11924，WO 95/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439 508，WO97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，US 5,736,625，WO98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316。

多肽与已活化的聚合物的偶联通过使用任何常规的方法执行，例如在如下参考文献中说明的(其还说明了用于激活聚合物分子的合适方法)：Harris and Zalipsky，eds.，Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications，AZC，Washington；R.F.Taylor，(1991)，＂Protein immobilisation.Fundamental and applications＂，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，＂Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking＂，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson et al.，(1993)，＂Immobilized Affinity Ligand Techniques＂，Academic Press，N.Y.。

为了半胱氨酸残基的PEG化，通常在PEG化之前用还原剂例如双硫腙(DDT)对多肽进行处理。随后通过任何常规的方法，例如通过脱盐，除去还原剂。PEG与半胱氨酸残基的偶联通常在合适的缓冲液中于pH6-9、温度4℃-25℃的条件下发生，持续时间可达约16小时。用于偶联半胱氨酸残基的已活化PEG聚合物的实例包括如下的线性和分枝PEG：乙烯基砜-PEG(PEG-VS)，例如乙烯基砜-mPEG(mPEG-VS)；邻吡啶-二硫-PEG(PEG-OPSS)，例如邻吡啶-二硫-mPEG(mPEG-OPSS)；和马来酰亚胺-PEG(PEG-MAL)，例如马来酰亚胺-mPEG(mPEG-MAL)和分枝马来酰亚胺-mPEG2(mPEG2-MAL)。

赖氨酸的PEG化经常采用PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(例如mPEG-NHS或mPEG2-NHS)，或酯，例如PEG琥珀酰亚胺丙酸酯(例如mPEG-SPA)或PEG琥珀酰亚胺丁酸酯(例如mPEG-SBA)。如果混合大约等摩尔量的PEG和蛋白质，在pH8-9.5、室温下，在30分钟内可以有1个或多个PEG连接到蛋白质上。当PEG与蛋白质氨基基团的摩尔比为1-5比1时，通常是足够的。pH增加则提高反应速度，而pH降低则降低反应速度。这些高反应活性的酯可以在生理pH下偶联，但反应性较差的衍生物通常需要更高的pH。如果使用不稳定蛋白质，则也可以采用低温。在低温条件下，可使用较长的反应时间。

N末端氨基酸α-氨基的pKa值(～7.6-8.0)与赖氨酸ε-氨基pKa值(～10)之间的差异使得N末端的PEG化可以更容易地进行。N末端氨基的PEG化经常采用PEG-醛(例如mPEG-丙醛或mPEG-丁醛)，其对胺更具选择性，因此与组氨酸的咪唑基反应的可能性更小；此外，用于赖氨酸偶联的PEG试剂(例如mPEG-SPA，mPEG-SBA或mPEG-NHS)还可用于N末端氨基的偶联。PEG-醛与N末端氨基的偶联通常在合适的缓冲液(例如含20mM氰基硼氰化钠的100mM乙酸钠或100mM磷酸二氢钠缓冲液)中，pH～5.0，大约4℃至25℃不等的温度下过夜。有用的N末端PEG化方法和化学作用在美国专利5,985,265和美国专利6,077,939中也有描述，本文引证这两篇文献。

典型地，线性PEG或mPEG聚合物的分子量将为大约5kDa、大约10kDa、大约12kDa、大约15kDa、大约20kDa，或者大约30kDa。分枝PEG(PEG2或mPEG2)聚合物典型地具有大约10kDa，大约20kDa或者大约40kDa的分子量。在一些情况下，可以使用具有更高分子量的分枝PEG2试剂，例如20kDa或40kDa的PEG2，包括例如用于赖氨酸PEG化的mPEG2-NHS，用于半胱氨酸PEG化的mPEG2-MAL，或者用于N末端PEG化的MPEG2-醛(均可从NektarTherapeutics，Inc，Huntsville AL获得)。PEG2化合物的分枝结构造成相对大的分子体积，因此连接较少的分子(或者一个连接的分子)即可赋予PEG化分子的期望特征。

技术人员会意识到，要使用的活化方法和/或偶联化学取决于α-干扰素的连接基团以及聚合物的官能团(例如氨基、羟基、羧基、醛基或巯基)。PEG化可针对多肽上所有可用的连接基团(即这种连接基团暴露在多肽的表面)的偶联，或者可针对特定的连接基团，例如半胱氨酸残基、赖氨酸残基或者N末端氨基。而且，偶联可以以一步或者以逐步的方式实现(例如在WO99/55377中说明的)。

在一些情况下，聚合物偶联在这样的条件下进行，所述条件旨在使尽可能多的现有聚合物连接基团与聚合物分子发生反应。这是通过使聚合物摩尔量相对于多肽适当过量的方式来实现的。活化聚合物分子与多肽的典型摩尔比可达大约1000-1，例如可达大约200-1，或达大约100-1。在一些情况下，比值可以稍低一些，例如达大约50-1，10-1或5-1。也可以使用等摩尔比。

根据本发明，还设想通过接头将聚合物分子与多肽偶联。合适的接头是技术人员所熟知的。优选的实例是氰尿酰氯(Abuchowski et al.，(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US 4,179,337；Shafer et al.，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。

偶联之后，根据本领域已知的方法将残余的活化聚合物分子封闭，例如通过向反应混合物添加一级胺，并通过合适的方法将由此失活的聚合物分子除去。

糖部分与α-干扰素氨基酸残基的共价体内偶联可用于修饰或增加糖取代基的数目或分布(profile)。根据所用的偶联方式，糖类可以连接a)精氨酸和组氨酸(Lundblad and Noyes，Chemical Reagents for Protein Modification，CRC Press Inc.Boca Raton，FI)，b)游离羧基(例如C末端氨基酸残基、天冬酰胺或谷氨酰胺)，c)游离巯基，例如半胱氨酸巯基，d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，e)芳香族残基，例如苯丙氨酸和色氨酸的残基，或者f)谷氨酰胺的酰胺基。这些氨基酸残基构成可以引入α-干扰素多肽和/或从α-干扰素多肽除去的糖部分连接基团的实例。合适的体外偶联方法在WO87/05330和Aplin et al.，CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中有说明。糖部分或PEG还可以通过转谷氨酰胺酶(TGases)与蛋白质结合Gln残基和肽结合Gln残基体外偶联，例如在Sato et al.，1996 Biochemistry 35，13072-13080或EP 725145中说明的。

与糖部分偶联

为了实现引入了一个或多个糖基化位点的修饰α-干扰素多肽的体内糖基化，在具有糖基化性质的真核表达宿主中插入编码偶联物多肽部分的核苷酸序列。表达宿主细胞可以从真菌(丝状真菌或酵母)、昆虫、哺乳动物细胞、转基因植物细胞或转基因动物中选择。而且，当在基因治疗中使用编码本发明偶联物多肽部分或本发明多肽的核苷酸序列时，可以在人体内实现糖基化。在一个方面中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞、COS细胞、BHK或HEK细胞如HEK293，或者昆虫细胞，例如SF9细胞，或者酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或任何其它合适的具有糖基化性质的宿主，如下文进一步描述的。任选地，对于通过体内糖基化与α-干扰素多肽连接的糖部分，可进一步用糖基转移酶加以修饰，例如使用Neose，Horsham，PA，USA推出的GlycoAdvance^TM技术。这样，有可能例如在CHO细胞表达和体内糖基化后提高糖基化α-干扰素多肽的唾液酸化。

与有机衍生化剂偶联

α-干扰素多肽的共价修饰可通过使多肽的连接基团与有机衍生化剂反应来实现。合适的衍生化剂和衍生化方法在本领域是众所周知的。例如，半胱氨酰残基最通常与α-卤代乙酸(盐或酯)(α-haloacetates)(及相应的胺)，例如氯代乙酸或氯代乙酰胺反应，产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴代三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸(α-bromo-β-(4-imidozoyl)propionic acid)、氯乙酰磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫、甲基2-吡啶二硫、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚，或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应进行衍生化。组氨酰残基通过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应进行衍生化，因为该试剂对组氨酰侧链相对特异。对溴苯酰甲基溴也是有用的；该反应优选地在0.1M卡可酸钠pH6.0下进行。赖氨酰和氨基端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有反转赖氨酸残基电荷的效果。其它用于衍生化含α-氨基的残基的合适试剂包括亚氨酸酯如吡啶甲酰亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)；吡哆醛磷酸；吡哆醛；氯硼酸酐(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸(盐或酯)的反应。精氨酰残基通过与一种或多种常规的试剂反应进行修饰，包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为胍基官能团具有高pKa。而且，这些试剂可以和赖氨酰基团以及精氨酸胍基反应。羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰或C末端氨基酸残基)可通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应选择性加以修饰，其中R和R’是不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，天冬氨酰或谷氨酰残基可通过与铵离子反应转化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

封闭功能位点

因为过多的聚合物偶联可导致与聚合物偶联的α-干扰素多肽的活性损失，所以在偶联之前除去位于功能位点的连接基团或封闭功能位点可能是有利的。后一种策略构成了本发明进一步的方面(第一种策略在上文有进一步的例证，例如除去可能位于功能位点附近的赖氨酸残基)。更具体地讲，根据第二种策略，α-干扰素多肽与非多肽部分之间的偶联在这样的条件下进行：在此条件下多肽的功能位点被能够结合多肽功能位点的辅助分子所封闭。优选地，辅助分子是特异性识别多肽功能位点的分子，例如受体，特别是I型干扰素受体。或者，辅助分子可以是抗体，特别是识别α-干扰素多肽的单克隆抗体。特别地，辅助分子可以是中和性单克隆抗体。

在进行偶联之前，使多肽与辅助分子相互作用。这保证多肽的功能位点被屏蔽或保护，从而不能被非多肽部分例如聚合物所衍生化。在从辅助分子中洗脱(elution)之后，可以回收带有至少部分被保护的功能位点的非多肽部分与多肽之间的偶联物。

随后按照通常的方法，例如在上文标题为“与......偶联”部分中描述的方法，使具有封闭功能位点的多肽与聚合物、亲脂性化合物、有机衍生化剂或任何其它化合物偶联。

不管用于屏蔽多肽功能位点免于偶联的辅助分子的性质如何，理想的是，辅助分子在某些部分中不含有或只含有少数所选非多肽部分的连接基团，如果这些部分中与所述连接基团的偶联会妨碍偶联多肽与辅助分子解吸的话。借此，可实现与多肽的非屏蔽部分中的连接基团的选择性偶联，并且可能将辅助分子重复用于反复的偶联循环。例如，如果非多肽部分是聚合物分子，例如PEG，以其具有赖氨酸的ε-氨基或N末端氨基酸残基作为连接基团，那么辅助分子最好基本上没有可偶联的ε-氨基，优选地没有任何ε-氨基。因此，在一些情况下，辅助分子是能够与多肽功能位点结合的蛋白质或肽，该蛋白质或肽没有任何可供偶联所选非多肽部分的连接基团。

在进一步的方面中，首先将辅助分子共价连接于固相，例如柱填料如Sephadex或琼脂糖珠，或表面，例如反应器。随后，将多肽加载到携带辅助分子的柱材料上，并根据本领域已知的方法进行偶联，例如在上文标题为“与......偶联”部分中描述的。该程序可以通过洗脱使多肽偶联物与辅助分子分离。在不导致多肽偶联物大量降解的理化条件下通过常规技术对多肽偶联物进行洗脱。将含有多肽偶联物的液相与固相分离，而辅助分子依然共价连接于固相。这种分离可以用其它方法实现：例如辅助分子可以用能够被特异性结合物(例如链霉抗生物素蛋白)识别的第二分子(例如生物素)衍生化。可以将特异性结合物连接到固相上，这样就可以利用第二辅助物-固相柱将多肽偶联物与辅助分子-第二分子复合物分离：使多肽偶联物与辅助分子-第二分子复合物通过第二辅助物-固相柱，在随后的洗脱中，该柱子会保留辅助分子-第二分子复合物，而不保留多肽偶联物。多肽偶联物可以用任何合适的方式从辅助分子释放。提供适于辅助分子与其所结合的α-干扰素功能位点分离的条件来实现去保护。例如，通过调节pH到酸或碱性pH，可以使偶联聚合物的抗体与抗独特型抗体之间形成的复合物解离开来。

带标签α-干扰素多肽的偶联

在另一个方面中，α-干扰素多肽表达为带标签的融合蛋白，所述标签也就是由典型地1-30个(例如1-20个或1-15个或1-10个或1-5个)氨基酸残基构成的、例如添加到多肽N末端或C末端的氨基酸序列或肽。标签不但使快捷简便的纯化成为可能，而且是实现带标签多肽与非多肽部分偶联的方便工具。特别地，在微量滴定板，或其它可通过标签来固定化带标签多肽的载体，例如顺磁珠子中，可以使用标签来实现偶联。在例如微量滴定板中与带标签多肽偶联具有如下优点，即可以直接从培养液中将带标签多肽固定到微量滴定板中(理论上不经过任何纯化)并进行偶联。藉此，能够减少处理步骤的总数(从表达到偶联)。而且，标签还可以发挥间隔分子的功能，确保待偶联的固定多肽具有更高的可及性(accessibility)。带标签多肽可以用于偶联本文公开的任何非多肽部分，例如聚合物分子，诸如PEG。

要使用的具体标签的身份并非至关重要，只要该标签能够与多肽一起表达，并能够固定在合适的表面或载体材料上即可。有许多合适的标签可以商购，例如从Unizyme Laboratories，Denmark。针对这种标签的抗体可以从例如ADI，Aves Lab and Research Diagnostics商购。

本发明的多核苷酸

本发明提供了分离的或重组的核酸(本文也称作多核苷酸)，统称为“本发明的核酸(或多核苷酸)”，其编码本发明的多肽。本发明的多核苷酸可用于多种用途。如上文讨论的，多核苷酸可用于产生本发明的多肽。此外，本发明的多核苷酸可以整合到用于基因治疗、DNA疫苗接种和免疫治疗的表达载体内，在下文有更详细的说明。

在一个方面中，本发明提供了分离的或重组的多核苷酸，其各自包含编码多肽的核酸序列或其互补核酸序列，其中所述多肽包含选自SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：319的氨基酸序列。

本发明还提供了分离的或重组的多核苷酸，其各自包含编码多肽的核酸序列或其互补核酸序列，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列：该序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：319之一的氨基酸序列在1-16个氨基酸位置上不同(例如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸位置上，例如在0-15个氨基酸位置上，0-14个氨基酸位置上，0-13个氨基酸位置上，0-12个氨基酸位置上，0-11个氨基酸位置上，0-10个氨基酸位置上，0-9个氨基酸位置上，0-8个氨基酸位置上，0-7个氨基酸位置上，0-6个氨基酸位置上，0-5个氨基酸位置上，0-4个氨基酸位置上，0-3个氨基酸位置上，0-2个氨基酸位置上，或0-1个氨基酸位置上不同)。一些由本发明多核苷酸编码的多肽进一步包括一个或多个额外的氨基酸，例如添加到N末端的甲硫氨酸。在一些实例中，被编码的多肽显示α-干扰素活性。

本发明还提供了分离的或重组的多核苷酸，其分别包含编码多肽的核酸序列或其互补核酸序列，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列：该序列与SEQ ID NO：1-319中任一序列具有至少90％的序列同一性(例如至少大约91％，至少大约92％，至少大约93％，至少大约94％，至少大约95％，至少大约96％，至少大约97％，至少大约98％，或至少大约99％的氨基酸序列同一性)。一些由本发明多核苷酸编码的多肽进一步包括一个或多个额外的氨基酸，例如添加到N末端的甲硫氨酸。在一些实例中，被编码的多肽显示α-干扰素活性。

其它方面

本发明的任何多核苷酸(包括上述的多核苷酸)可以编码包含至少一个额外氨基酸序列的融合蛋白，所述额外氨基酸序列例如分泌/定位序列，用于多肽的可溶化或固定化(例如用于细胞表面展示)的序列，用于检测和/或纯化多肽的序列(例如多肽纯化子序列，如附加表位、多组氨酸序列等)，或者用于稳定或延长所述蛋白质(例如Ig融合物或白蛋白融合物)体内半衰期的序列。

在另一个方面中，本发明提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的细胞。这种细胞可以表达一种或多种由本发明多核苷酸所编码的多肽。

本发明还提供了包含任何本发明多核苷酸的载体。这样的载体可以包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒或病毒片段。这样的载体可以包括表达载体，并且如果期望的话，所述核酸可操作地连接于启动子，包括本文和下文讨论的那些。而且，在另一个方面中，本发明提供了组合物，它们包含赋形剂或载体，以及下述至少一项：任何本发明的多核苷酸，或包含这些核酸的载体、细胞或宿主。这种组合物可以是药用组合物，赋形剂或载体可以是药用赋形剂或载体。

本发明还包括这样的组合物，它们包括两种或更多种本发明的核酸或其片段(例如作为用于重组的底物)。所述组合物可包含重组核酸文库，其中该文库含有至少2种，至少3种，至少5种，至少10种，至少20种，至少50种，或至少100种或更多的上述核酸。任选将所述核酸克隆到表达载体中，从而提供表达文库。

本发明的多核苷酸或其片段，以及包含这类多核苷酸的载体，可与合适的载体(例如药用载体)相组合，用于治疗或预防用途。这类组合物包含治疗和/或预防有效量的化合物，以及药用载体或赋形剂。这类载体或赋形剂包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和其组合。制剂应适合于施用模式。施用核酸、多肽和蛋白质的模式在本领域是众所周知的，在下文有进一步的讨论。

本发明还包括通过用限制性内切酶、RNA酶或DNA酶消化一种或多种本发明的任何核酸(例如在上述的某些重组模式中进行的那样)而产生的组合物；和通过机械方法(例如超声波降解、涡旋混合等)将本发明的一种或多种核酸片段化或剪切而产生的组合物，在本文所述方法中，这些组合物也可用来提供重组的底物。本发明还提供了通过切割至少一种本发明的任意核酸产生的组合物。切割可以包括机械、化学或酶促切割，酶促切割可以包括用限制性内切酶、RNA酶或DNA酶切割。

本发明还包括通过包括在核糖核苷酸或脱氧核苷酸三磷酸和核酸聚合酶的存在下温育一种或多种片段化的本发明核酸的过程而产生的组合物。所产生的组合物形成用于许多上述重组模式的重组混合物。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶、DNA聚合酶或RNA指导的DNA聚合酶(例如“反转录酶”)；聚合酶可以是例如热稳定的DNA聚合酶(例如VENT、TAQ等)。

类似地，如下所述的组合物可以用作重组底物：它们包含寡核苷酸的集合，其中所述寡核苷酸相应于多于一种本发明核酸；而且，这些组合物是本发明的特征。为方便起见，将这些经过片段化的、经过剪切的或寡核苷酸合成的混合物称为片段化核酸集合。

本发明还提供这样的分离或重组核酸，它编码显示α-干扰素活性的多肽，并且是通过突变或重组至少一种本发明核酸而产生的。

制备多核苷酸

本发明的多核苷酸、寡核苷酸和核酸片段可以通过常规的固相方法根据已知的合成方法制备。典型地，单独合成长达大约100个碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法，或者聚合酶介导的重组方法)形成基本上任何期望的连续序列。例如，本发明的多核苷酸和寡核苷酸可以通过化学合成制备，使用例如Beaucage et al.(1981)Tetrahedron Letters 22：1859-1869中描述的经典亚磷酰胺方法，或者Matthes et al.(1984)EMBO J3：801-805中描述的方法，例如典型地在自动合成方法中应用的。根据亚磷酰胺法，寡核苷酸在例如自动DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接并克隆到合适的载体中。

此外，基本上任何多核苷酸均可以从各种商业资源定购，例如OperonBiotechnologies Inc.(Huntsville，AL)以及许多其它公司。相似地，肽和抗体也可以从各种商业来源订购，例如AnaSpec，Inc.(San Jose，CA)。

本发明的某些多核苷酸还可以通过用寡核苷酸探针筛选cDNA文库(例如通过重组同源核酸产生的文库，如典型的循环序列重组方法中产生的文库)而获得，其中寡核苷酸探针能够与编码α-干扰素多肽和这些多肽的片段的多核苷酸杂交或PCR扩增它们。筛选和分离cDNA克隆的程序对于本领域技术人员而言是众所周知的。这些技术在例如Berger and Kimmel，Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymol.Vol.152，Acad.Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)；Sambrook(见前文)，和Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel(见前文)中有说明。本发明的一些多核苷酸可通过改变天然存在的序列而获得，例如通过诱变、循环重组(例如改组)或寡核苷酸重组。在其它实例中，这些多核苷酸可以in silico制备，或者通过本文引用参考文献中描述的寡核苷酸重组方法制备。

如本文将更详细说明的，本发明的多核苷酸包括：编码本发明多肽的多核苷酸；与这些多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，和在至少严格条件下与本文定义的序列杂交的多核苷酸。编码序列是指编码特定多肽或编码所述多肽的域、区域或片段的多核苷酸序列。编码序列可以编码如上文所述的表现α-干扰素活性的本发明多肽。本发明的多核苷酸可为RNA或DNA的形式，包括mRNA，cRNA，合成RNA和DNA、以及cDNA。多核苷酸可以是双链或单链，若是单链，则可以是编码链或非编码(反义，互补)链。本发明的多核苷酸包括本发明多肽的编码序列，所述编码序列(i)是分离的，(ii)与一种或多种额外编码序列组合从而编码例如融合蛋白、前体蛋白、前体原蛋白等等，(iii)与非编码序列组合，非编码序列例如内含子、控制元件如启动子(例如天然存在或重组或改组的启动子)、终止子元件或可用于在合适宿主内有效表达编码序列的5′和/或3′非翻译区，和/或(iv)处于载体、细胞或宿主环境中，其中该编码序列在该载体、细胞或宿主环境中是异源基因。

本发明的多核苷酸还可与核酸的典型组合制剂组合，包括在载体、缓冲剂、佐剂、赋形剂等存在的条件下，这是本领域的普通技术人员已知的。多核苷酸片段典型地包括至少大约200个核苷酸碱基，例如至少大约250、300、350、400、450、460、470或更多个碱基。本发明多核苷酸的核苷酸片段可以在高度严格条件下与本文所述的多核苷酸序列杂交，和/或编码具有至少一种本文所述本发明多肽性质的氨基酸序列。

经修饰的编码序列

本领域普通技术人员可以理解，对编码序列进行修饰以提高其在特定宿主内的表达是有利的。遗传密码子是冗余的，有64个可能的密码子，但是大多数生物体优先使用这些密码子的子集。人们将某个物种中最经常使用的密码子看作最佳密码子，而将不经常使用的密码子归为稀有或低使用率密码子(见例如Zhang，S.P.et al.(1991)Gene 105：61-72)。可对密码子进行替换以体现宿主的优选密码子用法，这个过程有时称为“密码子优化”或者“物种密码子偏好控制”。

例如，可以制备包含特定原核或真核宿主优选的密码子(见例如Murray，E.et al.(1989)Nuc Acids Res 17：477-508；Griswold et al.，(2003)Protein Expr.Purif.27(1)：134-42)的修饰编码序列，来提高翻译速度或者产生与非优化序列产生的转录本相比具有期望的性质(例如半衰期更长)的重组RNA转录本。也可以修饰转录终止子以反映宿主偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物细胞的优选终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的优选终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌(E.coli)优先使用UAA作为终止密码子(Dalphin，M.E.et al.(1996)Nucl.Acids Res.24：216-218)。

为了多种原因，包括但不限于修饰基因产物的克隆、处理和/或表达，可以对本发明的多核苷酸序列工程化来改变本发明的编码序列。例如，可使用本领域众所周知的技术(例如定点诱变)引入改变，来达到插入新的限制位点、改变糖基化模式、引入或除去连接基团(例如用于PEG化或其它偶联)，改变密码子偏好，引入剪接位点等目的。

沉默变异形式

由于遗传密码子的简并性，任一给定的多肽均由多种功能相同的核酸所编码。例如，从下面的密码子表(表3)可见，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU都编码氨基酸精氨酸。因此，在核酸序列中每一处被密码子指定为精氨酸的位置，密码子可以改变成任何上述的相应密码子，而不会改变编码的多肽。这些核酸变化是“沉默变异”。可以理解，RNA序列中的U相应于DNA序列中的T。

表3

密码子表

氨基酸	密码子
氨基酸	密码子	丙氨酸 Ala A半胱氨酸 Cys C天冬氨酸 Asp D谷氨酸 Glu E苯丙氨酸 Phe F甘氨酸 Gly G组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I赖氨酸 Lys K亮氨酸 Leu L甲硫氨酸 Met M天冬酰胺 Asn N脯氨酸 Pro P谷氨酰胺 Gln Q精氨酸 Arg R丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T撷氨酸 Val V色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr	GCA GCC GCG GCUUGC UGUGAC GAUGAA GAGUUC UUUGGA GGC GGG GGUCAC CAUAUA AUC AUUAAA AAGUUA UUG CUA CUC CUG CUUAUGAAC AAUCCA CCC CCG CCUCAA CAGAGA AGG CGA CGC CGG CGUAGC AGU UCA UCC UCG UCUACA ACC ACG ACUGUA GUC GUG GUUUGGUAC UAU

因此，本领域技术人员会意识到，由于遗传密码子的简并性，可产生多种编码本发明多肽的核酸序列，其中一些可能与本文明文公开的核酸序列有最小的序列同一性。本领域的普通技术人员会承认，核酸中的每一个密码子(除了AUG和UGC，它们通常分别只是甲硫氨酸和色氨酸的密码子)均可用标准技术加以修饰而编码功能上一致的多肽。因此，在任何描述序列中均隐含编码多肽的核酸的每一种沉默变化形式。本发明还提供了可以通过选择基于可能的密码子选项的组合而得到的、编码本发明多肽的核酸序列的每一种可能的变化形式。这些组合是根据标准的三联体(密码子)遗传密码(见表5所列的)得到的，该遗传密码适用于编码本发明多肽的核酸序列。通过将序列和遗传密码结合起来考虑，本文具体提供和描述了每一个核酸的所有此类变化形式。本领域技术人员完全能够产生本文列举序列的任何沉默变化形式。

多核苷酸的用途

本发明的多核苷酸具有多种用途，例如，用于重组生产(即表达)本发明多肽，典型地通过表达包含编码该多肽或其片段的质粒表达载体；用作治疗药；用作预防药；用作诊断工具；用作免疫原；用作佐剂；用作诊断探针，检测互补或部分互补核酸的存在(包括检测野生型α-干扰素核酸)；作为底物用于进一步的反应，例如循环序列重组反应或突变反应，以产生新和/或改进的变化形式等。

载体、启动子和表达系统

本发明还包括包含一种或多种上文广义说明的核酸序列的重组构建体。该构建体包括载体，例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等，其中正向或反向插入了本发明的核酸序列。在一些情况下，构建体进一步包括调控序列，包括例如可操作地连接于核酸序列的启动子。许多合适的载体和启动子对于本领域的技术人员而言是已知的，并且可以商购。

描述本文可用的分子生物学技术，包括载体和启动子的使用，以及许多其它相关主题的一般教科书包括Berger(上文)；Sambrook(1989)(上文)和Ausubel(上文)。在下面所列的文献中可以找到示例性的技术，足以指导本领域技术人员使用体外扩增方法，包括聚合酶链式反应(RCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)，用于例如产生本发明的同源核酸：Berger，Sambrook和Ausubel(均见上文)以及Mullis等(1987)美国专利4,683,202；PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications(Innis et al.，eds.)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(“Innis”)；Arnheim & Levinson(October 1，1990)C & EN 36-47；The Journal OfNIH Research(1991)3：81-94；(Kwoh et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA86：1173-1177；Guatelli et al.(1990)Proc Natl Acad Sci USA87：1874-1878；Lomeli et al.(1989)J Clin Chem 35：1826-1831；Landegren et al.(1988)Science241：1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology8：291-294；Wu and Wallace(1989)Gene 4：560-569；Barringer et al.(1990)Gene 89：117-122和Sooknananand Malek(1995)Biotechnology 13：563-564。克隆体外扩增核酸的改进方法在Wallace et al.，美国专利5,426,039中有描述。在Cheng et al.(1994)Nature369：684-685和其中的参考文献中总结了通过PCR扩增大核酸的改进方法，其中可产生高达40千碱基(kb)的PCR扩增子。技术人员会认识到，使用反转录酶和聚合酶，基本上任何RNA均可转变成适合于限制性消化、PCR扩增和测序的双链DNA。见Ausubel，Sambrook和Berger(均见上文)。

本发明还提供了用本发明载体转导的宿主细胞，以及本发明多肽通过重组技术的生产。宿主细胞用本发明的载体进行基因工程化(例如转导、转化或转染)，载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可以经过调整适合于活化启动子、选择转化体或扩增基因的常规营养培养基中培养。培养条件，如温度、pH等与先前表达所选用宿主细胞的条件相同，对于本领域的技术人员而言是显而易见的，且在本文引用的参考文献中可见，例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，third edition，Wiley-Liss，New York及其引用的参考文献。

本发明的多肽还能够在非动物细胞，例如植物、酵母、真菌、细菌等中产生。除了Sambrook，Berger和Ausubel之外，关于细胞培养的细节在如下文献中可见，例如Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in LiquidSystems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg and Phillips(eds.)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods SpringerLab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NY)；Atlas & Parks(eds.)；TheHandbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。

本发明的多核苷酸及其片段可以包含在多种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。这类载体包括染色体DNA、非染色体DNA和合成DNA序列，例如SV40衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA组合的载体，病毒DNA例如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和许多其它种类。可以使用任何如下所述的载体：其可将遗传材料转导到细胞内，并且如果期望复制，则可以复制并可在相关宿主中存活。

表达载体中的核酸与合适的转录控制序列(启动子)可操作地连接，指导mRNA合成。这类启动子的实例包括：LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子、CMV启动子和其它已知可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选地包括合适的用于扩大表达的序列，例如增强子。此外，表达载体任选地包括一个或多个选择标记基因，以提供筛选被转化地宿主细胞的表型特征，例如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者例如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

可以用含有合适的编码本发明多肽的DNA序列以及合适启动子或控制序列的载体转化合适的宿主，从而使该宿主能够表达该多肽。合适的表达宿主的实例包括：细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；昆虫细胞，例如果蝇和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；哺乳动物细胞，例如CHO、COS、BHK、HEK293或黑色素瘤；植物细胞等。可以理解，不是所有的细胞或细胞系都需要能够产生具有完全功能的本发明多肽或其片段；例如在细菌或其它表达系统中可以产生多肽的抗原性片段。本发明不受所用宿主细胞的限制。

在细菌系统中，可根据多肽或其片段的预期用途选择多种表达载体。例如，当需要大量多肽或其片段用于诱发抗体时，理想地使用可指导纯化容易的融合蛋白高水平表达的载体。合适的载体包括，但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如：BLUESCRIPT(Stratagene)，其中核苷酸编码序列可以连接到载体中并使其与氨基末端Met和随后的7个β-半乳糖苷酶残基共阅读框，从而产生杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke & Schuster(1989)J Biol Chem 264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison WI)等。

相似地，在酿酒酵母这种酵母中，有多种含有组成性或诱导性启动子，例如α因子、醇氧化酶和PGH的载体可用于生产本发明的多肽。综述可见Ausubel(上文)、Berger(上文)和Grant et al.(1987)Methods in Enzymology153：516-544。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用多种表达系统，例如基于病毒的系统。在使用腺病毒作为表达载体时，任选地将编码序列连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体中。插入在病毒基因组的非必要E1或E3区可产生多种能够在被感染的宿主细胞内表达本发明多肽的活病毒(Logan and Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：3655-3659)。此外，使用转录增强子，例如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子，来提高在哺乳动物宿主细胞中的表达。宿主细胞、培养基、表达系统和生产方法包括已知用于克隆和表达各种哺乳动物α-干扰素(例如人α-干扰素)的那些。

其它表达元件

特异的起始信号能够帮助高效翻译本发明的多核苷酸编码序列和/或其片段。这些序列可包括，例如，ATG起始密码子和相邻序列。当编码序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体时，可不需要额外的翻译控制信号。然而，当只插入编码序列(例如成熟蛋白编码序列)或其一部分时，必须提供包括ATG起始密码子在内的外源核酸转录控制信号。而且，起始密码子必须在正确的阅读框内，以保证整个插入序列的转录。外源转录元件和起始密码子可以是各种来源，天然或合成均可。通过引入适合于所用细胞系统的增强子，可以提高表达的效率(见例如Scharf D.et al.(1994)Results Probl Cell Differ 20：125-62；and Bittner et al.(1987)Methods inEnzymol 153：516-544)。

分泌/定位序列

编码本发明多肽的多核苷酸也可以例如与编码分泌/定位序列的核酸共阅读框地融合，以使多肽的表达靶向期望的细胞区室、膜或细胞器，或者指导多肽分泌到细胞周质间隙或者细胞培养基中。这类序列对于本领域技术人员是已知的，包括分泌前导序列或信号肽、细胞器靶向序列(例如核定位序列、ER保留信号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚定序列(例如终止转运序列、GPI锚定序列)等。

表达宿主

在进一步的方面中，本发明涉及包含任何上述本发明核酸、载体或其它构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞、酵母细胞或植物细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。构建体向宿主细胞的引入可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、基因或疫苗枪、注射或其它用于体内、离体或体外方法的通用技术实现(见例如Davis，L.，Dibner，M.，and Battey，I.(1986)Basic Methods inMolecular Biology)。

任选地，可根据其调节插入序列表达或以期望的方式加工被表达蛋白的能力来对宿主细胞株加以选择。此类蛋白修饰包括，但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白质的“前体”或“前体原”形式的翻译后加工对于正确插入、折叠和/或发挥功能也可能是重要的。不同的宿主细胞，例如大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、酵母或哺乳动物细胞如CHO、HeLa、BHK、MDCK、HEK293、WI38等，具有这些翻译后活性的特定细胞体系和特征机制，可选用它们以保证所引入的外源蛋白的正确修饰和加工。

稳定表达可用于长期、高产量生产重组蛋白质。例如，用包含病毒复制起点或内源表达元件以及选择标记基因的表达载体转导稳定表达本发明多肽的细胞系。在载体导入之后，让细胞在富含营养的培养基中生长1-2天，再将细胞转移到选择培养基。选择标记的目的是赋予针对选择的抗性，它的存在使成功表达了引入序列的细胞的生长和回收成为可能。例如，稳定转化细胞的抗性群可以用适合于该细胞类型的组织培养技术加以扩增。

用编码本发明多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞任选地在适合于被编码蛋白的表达及从细胞培养物中回收的条件下培养。重组细胞产生的多肽可以是分泌的、膜结合的或包含在细胞内的，这取决于所用的序列和/或载体。本领域的技术人员会理解，含有编码本发明多肽的多核苷酸的表达载体可以设计为具有指导成熟多肽通过原核或真核细胞膜分泌的信号序列。

其它序列

本发明的多核苷酸任选地包括与标记序列共阅读框融合的编码序列，标记序列可例如帮助纯化和/或检测所编码的多肽。这些纯化子序列包括，但不限于，金属螯合性肽，例如组氨酸-色氨酸模块，其提供在固定化金属上进行纯化的可能；结合谷胱甘肽(例如GST)的序列；血凝素(HA)标签(对应于衍生自流感血凝素蛋白的一种表位；Wilson，I.et al.(1984)Cell 37：767)；麦芽糖结合蛋白序列；FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的FLAG表位等。在纯化域和多肽序列之间引入蛋白酶可切割的肽接头序列可便于纯化。

例如，一种可能用于本文所述组合物和方法的表达载体可用来表达这样的融合蛋白：其包含本发明的多肽，该多肽隔着肠激酶切割位点与聚组氨酸区融合。组氨酸残基帮助在IMIAC(固定化金属离子亲和色谱，如Porathet al.(1992)Protein Expression and Purification 3：263-281中所述)上纯化，而肠激酶切割位点提供了将期望多肽与多聚组氨酸区分离的方法。pGEX载体(Promega；Madison，WI)可任选地用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，这样的融合蛋白是可溶的，通过配体-琼脂糖珠子的吸附(例如在GST融合体的情况下为谷胱甘肽-琼脂糖)，随后在游离配体存在下进行洗脱，可以容易地将它从裂解细胞中纯化。

本文所述组合物和方法中的另一种构建体可用来实现这样的蛋白质，及其编码核酸，所述蛋白质包括融合于Ig分子例如人IgG Fc(“片段可结晶”或片段互补结合)铰链、CH2域和CH3域(以及编码它们的核苷酸序列)的本发明的多肽(或者其一个或多个片段)。Fc是抗体中负责结合细胞上的受体和补体C1q组分的部分。这些融合蛋白或其片段和其编码核酸可任选地用作预防和/或治疗药物，或者用作诊断工具(另见例如Challita-Eid，P.et al.(1998)JImmunol 160：3419-3426；Sturmhoefel，K.et al.(1999)Cancer Res59：4964-4972)。

多肽生产和回收

在转导合适的宿主株并使宿主株生长到合适的细胞密度之后，通过合适的方法(例如温度变化或化学诱导)诱导所选启动子，并再培养细胞一段时间。通常地，离心收集细胞，通过物理或化学方法使之破裂，并保留所得的粗提物用于进一步的纯化。所述蛋白表达中使用的真核或微生物细胞可以用任何便利的方法加以破裂，包括冻融循环、超声波、机械破裂或使用细胞裂解剂，或本领域技术人员公知的其它方法。

如前所述，关于包括细菌、植物、动物(特别是哺乳动物)和古细菌来源的细胞在内的多种细胞的培养和生产的参考文献为数众多。见例如Sambrook，Ausubel和Berger(均见上文)，以及Freshney(1994)Culture ofAnimal Cells，a Manual of Basic Technique，third edition，Wiley-Liss，New York及其中引用的参考文献；Doyle and Griffiths(1997)Mammalian Cell Culture：Essential Techniques John Wiley and Sons，NY；Humason(1979)Animal TissueTechniques，fourth edition W.H.Freeman and Company；和Ricciardelli et al.(1989)Invitro Cell Dev Biol 25：1016-1024。关于植物细胞的培养和再生可见例如Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems JohnWiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg and Phillips(eds.)(1995)PlantCell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)及Plant Molecular Biology(1993)R.R.D.Croy(ed.)Bios Scientific Publishers，Oxford，U.K.ISBN 0 12 198370 6。在Atlas and Parks(eds.)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRCPress，Boca Raton，FL中概括性地描述了细胞培养基。其它关于细胞培养的信息在可商购文献中找到，例如Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的the LifeScience Research Cell Culture Catalogue(“Sigma-LSRCCC”)和例如同样来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的the Plant Culture Catalogue andsupplement(“Sigma-PCCS”)。

本发明的多肽可多种本领域众所周知的方法中的任何方法从重组细胞培养物中回收和纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱(例如使用本文所述的任何标签系统)、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。根据期望，可以使用蛋白重折叠步骤完成成熟蛋白质或其片段的构型。最后，在最终纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)。除了上文所述参考文献之外，多种纯化方法在本领域是众所周知的，包括例如在如下文献中提出的方法：Sandana(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；Bollag et al.(1996)Protein Methods，2^nd Edition Wiley-Liss，NY；Walker(1996)The ProteinProtocols Handbook Humana Press，NJ；Harris and Angal(1990)ProteinPurification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris and Angal Protein Purification Methods：A Practical ApproachIRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice 3^rd Edition Springer Verlag，NY；Janson and Ryden(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methods andApplications，Second Edition Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)ProteinProtocols on CD-ROM Humana Press，NJ.。

体外表达系统

还可以采用无细胞转录/翻译系统利用本发明的多核苷酸产生本发明的多肽。有多种这样的系统可以商购。在Tymms(1995)In vitro Transcription andTranslation Protocols：Methods in Molecular Biology Volume 37，GarlandPublishing，NY中可以找到体外转录和翻译方案的一般指导。

体内用途和应用

编码本发明多肽的多核苷酸或多核苷酸的互补体(包括例如反义或核酶分子)可任选地施于细胞，以实现治疗上有用的过程或表达治疗上有用的产物。这些体内应用，包括基因治疗，包括众多可以改变细胞内基因表达的技术。这些方法包括，例如，引入表达例如治疗和/或预防上有用的多肽(例如本发明多肽)的基因。

体内多肽表达

编码本发明多肽的多核苷酸特别有用于使用本领域技术人员公知的技术的体内治疗应用。例如，在离体条件下，用编码例如至少一种抗原、细胞因子、其它共刺激分子、佐剂等的至少一种本发明多核苷酸(DNA或RNA)和/或其它核苷酸序列对培养细胞进行工程化，然后将工程化的细胞返回患者体内。细胞还可以在体内进行工程化，用于在体内表达一种或多种多肽，包括本发明的多肽和/或抗原性肽。

已知有多种适合于体内生物体转导和表达的病毒载体。这些载体包括逆转录病毒载体(见例如Miller，Curr Top Microbiol Immunol(1992)158：1-24；Salmons and Gunzburg(1993)Human Gene Therapy 4：129-141；Miller et al.(1994)Methods in Enzymology 217：581-599)和腺伴随载体(综述见Carter(1992)Curr Opinion Biotech 3：533-539；Muzcyzka(1992)Curr Top MicrobiolImmunol.158：97-129)。其它可用的病毒载体包括腺病毒载体、疱疹病毒载体和辛德毕斯病毒载体，在如下文献中有一般的说明：Jolly(1994)CancerGene Therapy1：51-64；Latchman(1994)Molec Biotechnol 2：179-195；andJohanning et al.(1995)Nucl Acids Res 23：1495-1501。

在一个方面中，可使用痘病毒载体。痘病毒载体与编码本发明多肽(例如eIL-2多肽)的多核苷酸序列一起转染，可用于期望提高免疫应答，例如提高或改进T细胞增殖的预防、治疗和诊断应用。参见如下文献中讨论的病毒载体：例如Berencsi et al.，J Infect Dis(2001)183(8)：1171-9；Rosenwirth et al.，Vaccine 2001 Feb 8；19(13-14)：1661-70；Kittlesen et al.，J Immunol(2000)164(8)：4204-11；Brown et al.Gene Ther 20007(19)：1680-9；Kanesa-thasan et al.，Vaccine(2000)19(4-5)：483-91；Sten(2000)Drug 60(2)：249-71。包含这些载体的组合物和可接受的赋形剂也是本发明的特征。

基因治疗和基因疫苗提供了对抗慢性传染病(例如HIV感染、病毒性肝炎)，以及非传染性疾病包括癌症，和某些形式的先天性缺陷，例如酶缺陷的方法，这些方法可与本发明的多核苷酸包括例如包含这些多核苷酸的载体和细胞一起使用。已经使用了若干用于在体内、离体和体外将核酸和载体引入细胞的方法，这些方法可以与本发明的多核苷酸以及包含这些多核苷酸的载体一起使用。这些方法包括基于脂质体的基因递送(Debs and Zhu(1993)WO 93/24640和美国专利No.5,641,662；Mannino and Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；Rose，美国专利No.5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner et al.(1987)Proc Natl Acad Sci USA84：7413-7414；Brigham et al.(1989)Am J Med Sci 298：278-281；Nabel et al.(1990)Science 249：1285-1288；Hazinski et al.(1991)Am J Resp Cell MolecBiol 4：206-209；和Wang and Huang(1987)Proc Natl Acad Sci USA84：7851-7855)；腺病毒介导的基因递送，例如用于治疗癌症(见例如Chen et al.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：3054-3057；Tong et al.(1996)GynecolOncol 61：175-179；Clayman et al.(1995)Cancer Res.5：1-6；O’Malley et al.(1995)Cancer Res 55：1080-1085；Hwang et al.(1995)Am J Respir Cell MolBiol 13：7-16；Haddada et al.(1995)Curr Top Microbiol Immunol.1995(Pt.3)：297-306；Addison et al.(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92：8522-8526；Colaket al.(1995)Brain Res 691：76-82；Crystal(1995)Science 270：404-410；Elshamiet al.(1996)Human Gene Ther 7：141-148；Vincent et al.(1996)J Neurosurg85：648-654)，以及其它方法。人们还使用了含有治疗性多核苷酸序列作为逆转录病毒基因组一部分的复制缺陷型逆转录病毒载体，特别是关于简单MuLV载体。参见例如Miller et al.(1990)Mol Cell Biol 10：4239(1990)；Kolberg(1992)J NIH Res 4：43，和Cornetta et al.(1991)Hum Gene Ther 2：215)。还可使用与配体特异的基于阳离子的转运系统偶联的核酸转运(Wu and Wu(1988)J Biol Chem，263：14621-14624)。关于裸DNA表达载体也有描述(Nabelet al.(1990)，上文)；Wolffet al.(1990)Science，247：1465-1468)。一般而言，通过将编码本发明多肽的核酸整合到合适的载体上，可将这些方法适用于本发明。

包括例如Robbins(1996)Gene Therapy Protocols，Humana Press，NJ，和Joyner(1993)Gene Targeting：A Practical Approach，IRL Press，Oxford，England在内的通用教科书描述了基因治疗方案，通过将本发明的核酸导入到患者体内可以将这些方法适用于本发明。

反义技术

除了表达本发明的核酸作为基因置换核酸之外，这些核酸还可用于有义和反义表达抑制，例如一旦或者当不再希望本发明核酸在细胞中表达时，下调该核酸的表达。类似地，本发明的核酸或其子序列或反义序列还可用于阻止天然存在的同源核酸的表达。本领域已知有多种有义和反义技术，如在下列参考文献中提出的：Lichtenstein and Nellen(1997)AntisenseTechnology：A Practical Approach IRL Press at Oxford University，Oxford，England，Agrawal(1996)Antisense Therapeutics Humana Press，NJ，及其引用的参考文献。

用作探针

还预期了使用如下所述的多核苷酸，其在本文中也称作寡核苷酸：它典型地具有至少12个碱基，优选地至少15个，更优选地至少20个，至少30个或者至少50个或更多的碱基，在高度严格的条件下可与本发明的多核苷酸或其片段杂交。根据上文所述的方法，这些多核苷酸可以用作探针、引物、有义和反义物等。

治疗用途

已有多种α-干扰素多肽和α-干扰素偶联物获得批准或者正在临床开发用于治疗各种病症，例如慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、毛细胞白血病、恶性黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、AIDS相关卡波西肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性粒细胞白血病、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、类癌、膀胱癌、克劳恩氏病、皮肤T细胞淋巴瘤、肾细胞癌、多发性硬化、和AIDS。因此，本发明包括治疗可响应α-干扰素的病症，例如上述病症的方法，包括向患有该病症的受试者施用包含本发明多肽或本发明偶联物的组合物，其用量可有效改善与该病症相关的症状。本发明还包括包含本发明多肽或本发明偶联物的组合物(即“本发明的组合物”)用于治疗可响应α-干扰素的病症，例如上述病症，或者任何其它可响应本发明多肽或本发明偶联物的病症的用途。

治疗病毒感染和与病毒感染有关的病症

在一个方面中，本发明提供了用于治疗被病毒感染的受试者的方法，包括向受试者施用本发明的组合物，其用量可有效降低受试者体内病毒的水平，和/或减轻与病毒感染有关的症状或病症。预期用于本发明治疗方法的病毒感染实例包括，但不限于，黄病毒科病毒感染，例如丙型肝炎病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒或者牛病毒性腹泻病毒；嗜肝病毒科病毒感染，例如乙型肝炎病毒；微小核糖核酸病毒科病毒感染，例如脑心肌炎病毒、人鼻病毒或甲型肝炎病毒；逆转录科病毒感染，例如人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、人亲T-淋巴细胞病毒、或劳氏肉瘤病毒；冠状病毒科病毒感染，例如SARS冠状病毒；弹状病毒科病毒感染，例如狂犬病病毒或水泡性口炎病毒；副粘病毒科病毒感染，例如呼吸道合胞病毒或副流感病毒；乳头瘤病毒科病毒感染，例如人乳突瘤病毒；和疱疹病毒科病毒感染，例如单纯疱疹病毒。

下面提供了使用本发明的多肽和偶联物治疗示例性病毒感染和与这些病毒感染相关的疾病和病症的非限制性实例，包括本发明多肽和偶联物的推荐剂量给药方案和监视这些治疗的效力的方法。本领域的技术人员能够确定用于治疗其它病毒感染和与病毒感染有关疾病和病症的本发明多肽和偶联物的剂量给药方案和监视这些治疗的效力的方法。

丙型肝炎病毒

本发明在一个方面中提供了用于治疗被丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者的方法，包括向患者施用有效量的本发明组合物，其包括一种或多种本发明多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗受HCV感染的患者的组合物，其包括一种或多种本发明多肽或偶联物和药用载体或赋形剂。被诊断为受HCV感染的患者包括血液中显示HCV RNA和/或在血清中显示抗HCV抗体的患者。

一般地，包含本发明多肽的组合物的施用量和施用频率与使用临床批准的α-干扰素多肽，例如

-A(α-干扰素-2a，重组体；Hoffmann-LaRoche Inc.)、

A(α-干扰素-2b，重组体；Schering Corporation)和

(α-干扰素-1；InterMune，Inc.)的HCV治疗方案中所用的相似。用于治疗慢性HCV的ROFERON或INTRON A的推荐剂量给药方案实例是3百万IU(大约15微克(mcg))，每周3次，皮下注射例如24-48周。用于治疗慢性HCV的INFERGEN的推荐剂量给药方案实例是9mcg，每周3次，皮下注射例如24-48周。根据多种因素(包括但不限于，本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的身材和健康状况)，可以用比上述更低的剂量(例如大约2，3，4，5，6，7或8mcg)和/或更低的频率(例如每周一次或每周两次)施用多肽。

同样，包含本发明偶联物的组合物，一般而言，施用的剂量和频率与使用临床批准的α-干扰素偶联物，例如

(PEGα-干扰素-2a，Hoffmann-La Roche Inc.)或

(PEGα-干扰素-2b；ScheringCorporation)的HCV治疗方法相似。用于治疗慢性HCV的PEGASYS的推荐剂量给药方案实例是180mcg，每周一次，皮下注射例如24-48周。根据多种因素(包括但不限于，本发明偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的身材和健康状况)，可以用比上述更低的量(例如大约25，50，75，100，125或150mcg)和/或更低的频率(例如每10天一次或每两周一次)施用偶联物。

在一些情况下，将本发明的多肽或偶联物与一种或多种额外的治疗剂联合施用。例如，本发明的多肽或偶联物可以和小分子抗病毒药物联合施用，所述小分子药物例如利巴韦林，其商品名为

(Hoffmann-LaRoche，Inc)和

(Schering Corporation)。作为小分子抗病毒药物的替代或补充，本发明的多肽或偶联物可以和一种或多种额外的细胞因子联合施用，所述细胞因子例如：γ干扰素，其商品名为

(γ-1b干扰素；InterMune，Inc.)；IL-2，其商品名为

IL-2(阿地白介素(aldesleukin)重组人白细胞介素-2(rhIL-2)；Chiron Corp.)或IL-12(白细胞介素-12)。

本发明多肽或偶联物的确切施用量和频率取决于多种因素，例如多肽或偶联物的具体活性和药代动力学性质，以及要治疗病症的性质(例如所治疗的丙型肝炎病毒的基因型)，及本领域技术人员已知的其它因素。通常，剂量应当能够防止或者减轻治疗适应征的严重程度或扩散。这样的剂量可称作“有效”或“治疗有效”剂量。本领域的技术人员可以显见，本发明多肽、偶联物或组合物的有效量依赖于所治疗的病症、剂量、施用方案、多肽或偶联物或组合物是单独施用还是与其它治疗剂组合施用、血清半衰期和多肽或偶联物或组合物的其它药代动力学性质、以及患者的身材、年龄和一般健康状况，以及其它因素。本领域的技术人员利用已知的技术可以确定施用的剂量和频率。

治疗的有效性可通过测量病毒载量加以确定，例如通过使用本领域已知方法确定血清或血浆中病毒的滴度或水平；所述本领域已知方法例如利用基于定量PCR的测定，如COBAS AMPLICOR

HCV Test，v2.0或COBASAMPLICOR HCV MONITOR

Test v2.0(均来自Roche Diagnostics)，来监测病毒RNA水平。在一些情况下，本发明组合物的有效量是指使病毒载量在治疗期间内与治疗前的病毒载量(对于慢性HCV患者，其一般范围是10⁵-10⁷个HCV RNA拷贝/ml)相比降低至少2个对数单位，至少3个对数单位，至少4个对数单位，至少5个对数单位，至少6个对数单位，或至少7个对数单位的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将病毒载量降低到基本上检测不到的水平的量，例如将病毒载量降低少于大约500个拷贝/ml血清或少于大约100个拷贝/ml血清的量。本发明包括降低感染了HCV的患者的血清中HCV RNA水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前的HCV RNA水平相比，所施用的量可有效降低HCV RNA的水平。

或者/另外，治疗的有效性可以通过测量指示与HCV感染有关病症的参数，例如肝损伤，来加以确定。例如，可利用标准测定方法测量血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平。一般地，低于大约50国际单位/ml(IU/ml)血清的ALT水平认为是正常的。更高的ALT水平可能指示正在发生的肝损伤。在一些情况下，本发明组合物的有效量是可以有效地将具有高于正常ALT水平的HCV感染患者体内的ALT水平降低到小于大约50IU/ml血清的量。因此，本发明包括降低显示高于50IU/ml的初始ALT水平的HCV感染患者体内血清ALT水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，所施用的量可有效地将ALT水平降低到小于大约50IU/ml。

人免疫缺陷病毒

在本发明的另一个方面中，提供了用于治疗感染了人免疫缺陷病毒(HIV)(例如HIV-1或HIV-2)，或者患有HIV感染相关疾病或病症(例如AIDS相关卡波西肉瘤)的患者的方法，包括向患者施用有效量的本发明组合物，其中该组合物包括一种或多种本发明多肽或偶联物，并任选地与下文所述的其它抗病毒治疗剂联用。本发明还提供了用于治疗感染了HIV的患者或患有HIV感染相关疾病或病症的患者的组合物，其包括一种或多种本发明多肽或偶联物和药用载体或赋形剂。被诊断为感染了HIV的患者包括血液中显示可检测水平的HIV RNA或前病毒DNA和/或在血清中显示可检测水平的p24抗原或抗HIV抗体的患者。

一般地，包含本发明多肽的组合物的施用剂量和施用频率将与使用α-干扰素多肽的HIV治疗方案中所用的相似，所述α-干扰素多肽例如ROFERON

-A(α-干扰素-2a，重组体；Hoffmann-La Roche Inc.)、INTRON

A(α-干扰素-2b，重组体；Schering Corporation)和INFERGEN

(干扰素alphacon-1；InterMune，Inc.)。如上所述，用于治疗慢性HCV的ROFERON或INTRON A的推荐剂量给药方案实例是3百万IU(大约15微克(mcg))，每周3次，皮下注射例如24-48周；用于治疗慢性HCV的INFERGEN的推荐剂量给药方案实例是9mcg，每周3次，皮下注射例如24-48周。用于治疗AIDS相关卡波西肉瘤的ROFERON推荐剂量给药方案实例是每天36百万单位，10-12周，然后36百万单位，每周3次。用于治疗AIDS相关卡波西肉瘤的INTRON的推荐剂量给药方案实例是30百万IU/m2，每周3次，皮下施用。这些剂量给药方案提供了本发明多肽用于治疗HIV或与HIV感染相关疾病或病症的剂量的有用范围。根据多种因素(包括但不限于，本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的身材、年龄和健康状况)，本发明多肽的施用的量和频率可以是比上述更低的量和/或更低的频率。

同样，一般而言，包含本发明偶联物的组合物的施用剂量和施用频率与使用α-干扰素偶联物的HIV治疗方案所用的相似，所述α-干扰素偶联物例如

(PEGα-干扰素-2a，Hoffmann-La RocheInc.)或

(PEGα-干扰素-2b；Schering Corporation)。用于治疗HIV的PEG-INTRON的剂量给药方案实例是大约1.0mcg/kg/周-3.0mcg/kg/周，皮下注射例如24-48周。这些剂量给药方案提供了用于治疗HIV的本发明偶联物的剂量的有用范围。取决于多种因素(包括但不限于，本发明偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的身材、年龄和健康状况)，可以用比上述更低的剂量(例如大约0.1，0.25，0.50或0.75mcg/kg/周)和/或更低的频率(例如每10天一次或每两周一次)施用偶联物。

在一些情况下，将本发明的多肽或偶联物与一种或多种额外的治疗剂联合施用。目前人类HIV-1感染的临床治疗包括多药物组合疗法，一般称作高效抗逆转录病毒疗法(“HAART”)。因此本发明的多肽或偶联物可以与HAART或其它抗病毒治疗化合物联合施用。在例如A.M.Vandamme et al.(1998)Antiviral Chemistry & Chemotherapy，9：187-203；《The Medical Letter》第39卷(第1015期)1997年12月5日，第111-116页的《Drugs for HIV Infection》；和已公布的美国专利申请US20020182179 A1中，均描述了HAART的典型组分，其包括各种组合的核苷逆转录酶抑制剂(“NRTI”)、非核苷逆转录酶抑制剂(“NNRTI”)和HIV蛋白酶抑制剂(“PI”)；本文引用上述每一文献的内容作为参考。如果HIV感染患者还感染了HCV，则本发明的多肽或偶联物可以和抗病毒药物(例如利巴韦林，其商品名为COPEGUS

(Hoffmann-La Roche，Inc)和REBETOL

(Schering Corporation))组合，并与HAART一起施用。

本发明多肽或偶联物的确切施用量和频率，以及额外治疗剂如HAART和/或利巴韦林的施用，将取决于多种因素，例如多肽或偶联物的具体活性和药代动力学性质，以及待治疗的病症的性质(例如存在其它病毒感染，例如HCV)，以及本领域技术人员已知的其它因素。通常，剂量应当能够防止或者减轻受治适应证的严重程度或扩散。这种剂量称作“有效”或“治疗有效”量。本领域的技术人员可以显见，本发明多肽、偶联物或组合的有效量依赖于所治疗的病症、剂量、施用方案、多肽或偶联物或组合物是单独施用还是与其它治疗剂联合施用、多肽或偶联物或组合物的血清半衰期和其它药代动力学性质、以及患者的身材、年龄和一般健康状况，以及其它因素。本领域的技术人员利用已知的技术可以确定施用的剂量和频率。

除了上述的一般用途之外，本发明的多肽或偶联物还可用于如下亚类的HIV感染患者：作为辅助疗法，例如上述HAART的辅助疗法；作为病毒载量一般较高的早期患者的单独疗法或联合疗法；作为用于正在经历结构性治疗间歇(STI)或“用药假期”的患者的组合抗病毒和免疫调节剂；作为HAART选项有限的患者的补救治疗；作为抗病毒治疗方法，遏制病毒载量而不启动HAART治疗，以便延迟HAART抗性病毒的出现。

治疗的有效性可通过测量病毒载量加以确定，例如通过使用本领域已知的方法确定血清或血浆中病毒的滴度或水平，所述本领域已知的方法例如利用基于定量RT-PCR的测试如AMPLICOR

Test v1.5(Roche Diagnostics)来监测HIV-1病毒RNA水平。在一些情况下，本发明组合物的有效量是指在治疗期间内足以实现病毒载量与治疗之前的病毒载量相比降低至少0.5个对数单位，至少1个对数单位，至少2个对数单位，至少3个对数单位，至少4个对数单位，至少5个对数单位，至少6个对数单位，或至少7个对数单位的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将病毒载量降低到基本上检测不到的水平的量，例如将病毒载量降低少于大约50-100个拷贝的HIV-1RNA/ml血清的量。本发明包括降低感染了HCV的患者的血清中HIV RNA水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前的HIV RNA水平相比，所施用的量可有效降低HIV RNA的水平。

或者/另外，治疗的有效性可以通过测量指示HIV复制的血清标记，例如血液中HIV p24抗原的存在，来加以确定。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血液中p24抗原的水平降低到开始治疗之前存在水平的大约50％、25％、10％或5％的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将p24抗原的水平降低到基本上检测不到的水平的量。本发明包括降低感染了HIV的患者的血清中p24抗原水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前的p24抗原水平相比，所施用的量可有效降低p24抗原的水平。

乙型肝炎病毒

在另一个方面中，本发明提供用于治疗感染了乙型肝炎病毒(HBV)的患者的方法，包括向患者施用有效量的本发明组合物，该组合物包括一种或多种本发明多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗HBV感染患者的组合物，其包括一种或多种本发明多肽或偶联物和药用载体或赋形剂。

被诊断为受HBV感染的患者在血清中显示可检测的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。慢性HBV感染可进一步归类为“复制性”或“非复制性”。在复制性感染中，患者通常具有相当高血清浓度的病毒DNA和可检测的HBeAg——一种在高病毒复制条件下合成的、HBV前核心基因的选择性加工蛋白。然而，在具有前核心基因突变的HBV稀有病毒株中，可在没有可检测的血清HBeAg的条件下发生复制性感染。具有慢性乙型肝炎病毒且复制性感染的患者，与没有HBeAg的患者相比，预后通常更差，发展为硬化和/或肝细胞癌的机率更大。在非复制性感染中，肝中病毒复制的速度较低，血清HBVDNA浓度一般较低，不会检测到乙型肝炎e抗原(HBeAg)。

一般地，包含本发明多肽的组合物的施用量和施用频率与使用临床批准的α-干扰素多肽的HBV治疗方案所用的相似，所述α-干扰素多肽例如INTRON

A(α-干扰素-2b，重组体；Schering Corporation)。用于治疗成体中慢性HBV的INTRON A的推荐剂量给药方案实例是每周30-35百万IU，皮下或肌肉内注射，5个百万IU每天(qd)或者10个百万IU每周3次(tiw)，16周。取决于多种因素(包括但不限于，本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的身材和健康状况)，可以用比上述更低的剂量(例如大约5，10，15，20或25百万IU/周)和/或更低的频率(例如每周一次或每周两次)施用本发明的多肽。

同样，一般而言，包含本发明偶联物的组合物的施用剂量和施用频率与使用正在进行临床试验的α-干扰素偶联物例如PEGASYS

(PEGα-干扰素-2a，Hoffmann-La Roche Inc.)的HBV治疗方案所用的相似。用于治疗慢性HBV的PEGASYS的推荐剂量给药方案实例是90mcg-270mcg，每周注射一次，总共24周。取决于多种因素(包括但不限于，本发明偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的身材和健康状况)，偶联物可以以比上述更低的剂量(例如大约25，50，75，100，125，150或200mcg)和/或更低的频率(例如每10天一次或每两周一次)施用。

在一些情况下，将本发明的多肽或偶联物与一种或多种额外的治疗剂联合施用。例如，本发明的多肽或偶联物可以和抗病毒药物，例如拉米夫定(lamivudine)(也称作3TC)，其商品名为

(GlaxoSmithKline)，或者阿德福韦二匹伏酯(adefovir dipivoxil)，其商品名为

(GileadSciences)联合施用。

本发明多肽或偶联物的确切施用量和频率取决于多种因素，例如多肽或偶联物的具体活性和药代动力学性质，以及治疗病症的性质(例如在慢性HBV感染情况下，感染是复制性的还是非复制性的)，以及本领域技术人员已知的其它因素。通常，剂量应当能够防止或者减轻受治适应证的严重程度或扩散。这种剂量称作“有效”或“治疗有效”量。本领域的技术人员可以显见，本发明多肽、偶联物或组合的有效量依赖于所治疗的病症、剂量、施用方案、多肽或偶联物或组合物是单独施用还是与其它治疗剂组合施用、血清半衰期和多肽或偶联物或组合物的其它药代动力学性质、以及患者的身材、年龄和一般健康状况，以及其它因素。本领域的技术人员利用已知的技术可以确定施用的剂量和频率。

治疗的有效性可通过，例如，使用本领域已知的方法测量病毒载量，例如血清或血浆中病毒DNA的水平，来加以确定。用于监测HBV DNA水平的方法包括基于定量PCR的测定，例如COBAS AMPLICOR HBVMONITOR

Test，v2.0或AMPLICOR HBV MONITOR

Test，v2.0(均来自Roche Diagnostics)。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以使病毒DNA降低到例如少于大约500,000个拷贝/ml血清，或少于大约100,000个拷贝/ml血清，或少于大约10,000个拷贝/ml血清，或者降低到基本上检测不到到的水平(例如少于大约1000个拷贝/ml血清，少于大约500个拷贝/ml血清，或少于大约200个拷贝/ml血清)的量。本发明包括降低感染了HBV的患者的血清中HBV DNA水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前的HBV DNA水平相比，所施用的量可有效降低HBV DNA的水平。

或者/并且，治疗的有效性可以通过测量其它HBV复制的血清标记例如HBeAg加以确定。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中HBeAg水平降低到开始治疗之前存在水平的50％，25％，10％或5％的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中HBeAg水平降低至无法检测到水平的量。本发明包括降低HBV感染患者血清中HBeAg水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前的HBeAg水平相比，施用的量可有效降低HBeAg的水平。

如上文讨论的，可指示HBV感染的另一种血清标记是HBsAg。因此，治疗的效力可以选择地或另外地通过测量血清中HBsAg的水平加以确定。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中HBsAg水平降低到开始治疗之前存在水平的50％，25％，10％或5％的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中HBsAg水平降低至基本上无法检测到的水平的量。本发明包括降低HBV感染的患者血清中HBsAg水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前的HBsAg水平相比，所施用的量可有效降低HBsAg的水平。

或者/另外，治疗的有效性可以通过测量可指示与HBV感染相关的病症(例如肝损伤)的参数加以确定。例如，可以利用标准测定方法测量血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平。一般地，低于大约50国际单位/ml(IU/ml)血清的ALT水平认为是正常的。更高的ALT水平可能指示正在发生的肝损伤。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将具有高于正常ALT水平的患者体内的ALT水平降低到小于大约50IU/ml血清的量。因此，本发明包括降低显示高于50IU/ml的初始ALT水平的HBV感染患者中的血清ALT水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，所施用的量可有效地将ALT水平降低到小于大约50IU/ml。

人亲T-淋巴细胞1型病毒

在另一个方面中，本发明提供了用于治疗被人亲T-淋巴细胞1型病毒(HTLV-1)感染的、或者患有HTLV-1感染相关疾病或病症的患者的方法，所述HTLV-1感染相关疾病或病症例如成体T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关骨髓病(HAM)、热带痉挛性轻截瘫(Tropical Spastic Paraparesis，TSP)、葡萄膜炎或关节病。该方法包括向患者施用有效量的本发明组合物，该组合物包括一种或多种本发明多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗感染了HTLV-1的、或者患有HTLV-1感染相关疾病或病症的患者的组合物，该组合物包括一种或多种本发明多肽或偶联物和药用载体或赋形剂。诊断为感染了HTLV-1的患者包括血液中显示有HTLV-1前病毒DNA和/或血清中显示有针对HTLV-1抗原的抗体的患者。

一般而言，包含本发明多肽的组合物的施用量和施用频率与使用临床批准的α-干扰素多肽的HCV或肿瘤学治疗方案所用的相似，其中所述α-干扰素多肽例如ROFERON

-A(α-干扰素-2a，重组体；Hoffmann-La Roche Inc.)和INTRON

A(α-干扰素-2b，重组体；Schering Corporation)。用于治疗慢性HCV的ROFERON或INTRON A的推荐剂量给药方案实例是3百万IU(大约15微克(mcg))，每周3次，皮下注射，例如24到48周。用于治疗毛细胞白血病的推荐ROFERON剂量给药方案实例是每天3-5百万单位皮下注射16到24周，然后以3百万单位每周3次用于维持。用于治疗毛细胞白血病的INTRONA的推荐剂量给药方案实例是2百万IU/m²(平方米体表)，皮下施用，每周3次，6个月。这些剂量给药方案为本发明多肽用于治疗HTLV-1感染或与HTLV-1感染相关的疾病或病症，例如成体T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关骨髓病(HAM)或热带痉挛性轻截瘫(TSP)提供了有用的剂量范围。取决于多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的身材和健康状况)，可以用比上述更低的剂量和/或更低的频率施用多肽。

同样，一般而言，包含本发明偶联物的组合物的施用量和施用频率将与使用临床批准的α-干扰素偶联物的HCV治疗或肿瘤学治疗方案所用的相似，所述α-干扰素偶联物例如PEGASYS

(PEGα-干扰素-2a；Hoffmann-LaRoche，Inc.)或PEG-INTRON

(PEGα-干扰素-2b；Schering Corporation)。用于治疗慢性HCV的PEGASYS的推荐剂量给药方案实例是180mcg，每周1次，皮下注射例如24-48周。用于治疗慢性骨髓性白血病的PEG-INTRON的推荐剂量给药方案实例是6mcg/kg体重，每周1次皮下注射例如52周。这些剂量给药方案为本发明偶联物提供用于治疗HTLV-1感染或与HTLV-1感染相关的疾病或病症，例如成体T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关骨髓病(HAM)或热带痉挛性轻截瘫(TSP)的有用的剂量范围。取决于多种因素(包括但不限于，本发明偶联物的分子量、活性和药代动力学以及患者的身材、年龄和健康状况)，可以用比上述更低的剂量和/或更低的频率施用偶联物。

在一些情况下，将本发明的多肽或偶联物与一种或多种额外的治疗剂联合施用。例如，本发明的多肽或偶联物可以和抗逆转录病毒药物例如齐多夫定(zidovudine)(AZT)和/或拉米夫定(3TC)联合施用。还可以和外周血液干细胞移植、常规化疗、或高剂量化疗并行自体或异基因骨髓移植联合施用。或者，本发明的多肽或偶联物可以和其它免疫疗法组合，例如与抗白细胞介素-2受体的单克隆抗体或针对病毒抗原的细胞毒T细胞的注射组合。

本发明多肽或偶联物的确切施用量和频率取决于多种因素，例如多肽或偶联物的具体活性和药代动力学性质，以及所治疗的病症的性质，以及本领域技术人员已知的其它因素。通常，剂量应当能够防止或者减轻所治疗的适应证的严重程度或扩散。这样的剂量可称作“有效”或“治疗有效”量。本领域的技术人员可以显见，本发明多肽、偶联物或组合物的有效量依赖于所治疗的病症、剂量、施用方案、多肽或偶联物或组合物是单独施用还是与其它治疗剂组合施用、血清半衰期和多肽或偶联物或组合物的其它药代动力学性质、以及患者的身材、年龄和一般健康状况，以及其它因素。本领域的技术人员利用已知的技术可以确定施用的剂量和频率。

确定治疗的有效性可通过例如测量HTLV-1病毒载量，例如使用本领域已知的方法测量血液中HTLV-1前病毒DNA的水平，例如通过在Saitoetal.，(2004)J.Infect Dis.189(1)：29-40中描述的定量PCR。在一些情况下，本发明组合物的有效量是使病毒载量在治疗期间内与治疗前的病毒载量相比降低至少0.5个对数单位，例如至少1个对数单位，至少2个对数单位，至少3个对数单位，至少4个对数单位，至少5个对数单位，至少6个对数单位或至少7个对数单位的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将病毒载量降低到基本上检测不到的水平的量。本发明包括降低感染了HTLV-1的患者血液中HTLV-1前病毒DNA水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与治疗开始前相比，施用的量可有效降低HTLV-1前病毒DNA的水平。

或者/另外，治疗的有效性可以通过测量血清中抗HTLV-1的抗体的滴度来确定，所述测量使用本领域已知的方法，例如利用可商购的测定系统，诸如INNO-LIA^TM HTLV I/II(Innogenetics；Gent Belgium)和AbbottHTLV-I/HTLV-II EIA(Abbott Laboratories；Abbott Park，IL)。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中抗HTLV-1抗体的滴度降低到开始治疗前的滴度的50％、25％、10％或5％的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将血清中抗HTLV-1抗体的滴度降低至基本上无法检测到的量。本发明包括降低感染了HTLV-1的患者的血清中抗HTLV-1抗体滴度的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗前相比，施用的量可有效降低HTLV-1抗体的滴度。

人乳头瘤病毒

在另一个方面中，本发明提供了用于治疗感染了人乳头瘤病毒(HPV)或者患有与HPV感染相关疾病或病症的患者的方法，所述与HPV感染相关疾病或病症例如手足疣和口腔、肛门和生殖腔黏膜损害。尽管许多类型的HPV是相对无害的，但是许多其它类型会通过性接触传播，引起生殖器疣或性传播疣(称作尖锐湿疣)，它们可能会引发宫颈癌和其它生殖器癌。所述方法包括向被HPV感染的患者施用有效量的本发明组合物，其包括一种或多种本发明多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗感染HPV的或者患有与HPV感染相关疾病或病症的患者的组合物，该组合物包括一种或多种本发明多肽或偶联物和药用载体或赋形剂。诊断为感染了HPV的患者包括生殖器组织活体检查显示有HPV病毒DNA，且有时(但不总是)在生殖器组织上显示可见损害的患者。

一般地，包含本发明多肽的组合物的施用量和施用频率与使用临床批准的α-干扰素多肽例如INTRON

A(α-干扰素-2b，重组体；ScheringCorporation)的HPV治疗方案所用的相似。用于治疗尖锐湿疣的INTRON

A的推荐剂量给药方案是用结核菌素注射器或类似的注射器和25-30号针头向每个损害注射1.0百万IU，可注射多达5个损害，每周3次，隔天进行，持续3周。具有6-10个湿疣的患者可以按照上述的剂量给药方案接受第二个(后续)疗程，每个疗程治疗最多5个新的湿疣。具有超过10个湿疣的患者可以接受额外的续期，根据存在的湿疣的数目多少而定。或者/并且，可局部施用干扰素，例如以乳霜或软膏的形式(如Stentella et al.(1996)Clin.Exp.Obstet.Gynecol.23(1)：29-36所述)。这些剂量给药方案为本发明多肽治疗HPV感染或与HPV感染相关的疾病或病症例如尖锐湿疣提供了有用的剂量范围。根据多种因素(包括但不限于，本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的身材、年龄和健康状况)，可以用比上述更低的剂量和/或更低的频率施用多肽。同样，一般可施用包含本发明偶联物的组合物，例如施用于损害内或表面施用，其施用量可有效降低受影响的组织中HPV病毒DNA的数量，或减小受感染个体中生殖器损害的大小或数目。

在一些情况下，本发明的多肽或偶联物与一种或多种额外的治疗剂联合施用。例如，本发明的多肽或偶联物可以和抗HPV药物，例如普达非洛(Podofilox)(Condylox)和/或鬼臼树脂(Podophyllin)(Pododerm，Podocon-25)，联合施用。

本发明多肽或偶联物的确切施用量和施用频率取决于多种因素，例如多肽或偶联物的具体活性和药代动力学性质，以及要治疗的病症的性质，以及本领域技术人员已知的其它因素。通常，剂量应当能够防止或者减轻受治适应证的严重程度或扩散。这种剂量称作“有效”或“治疗有效”量。本领域的技术人员可以显见，本发明多肽、偶联物或组合的有效量依赖于所治疗的病症、剂量、施用方案、多肽或偶联物或组合物是单独施用还是与其它治疗剂组合施用、血清半衰期和多肽或偶联物或组合物的其它药代动力学性质、以及患者的身材、年龄和一般健康状况，以及其它因素。本领域的技术人员利用已知的技术可以确定施用的剂量和频率。

治疗的有效性可通过例如测量HPV病毒载量加以确定，例如测量活体检查组织中HPV病毒DNA的水平。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以使病毒载量在治疗期间内与治疗前的病毒载量相比降低至少0.5个对数单位，例如至少1个对数单位，至少2个对数单位，至少3个对数单位，至少4个对数单位，至少5个对数单位，至少6个对数单位或至少7个对数单位的量。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以将病毒载量降低到基本上检测不到的水平的量。本发明包括降低HPV感染患者的组织中HPV病毒DNA水平的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前相比，施用量可有效降低HPV病毒DNA的水平。

或者/并且，治疗的有效性可以通过观察感染个体中生殖器损害(湿疣)的大小或数目加以确定。在一些情况下，本发明组合物的有效量是足以减少感染个体中湿疣的大小或数目的量。本发明包括减小HPV感染患者中湿疣的大小和/或数目的方法，包括向患者施用本发明的组合物，与开始治疗之前相比，施用量可有效减小患者中湿疣的大小和/或数目。

制剂和施用途径

本发明多肽或偶联物的治疗用制剂典型地在包含一种或多种药用载体或赋形剂的组合物中施用。这种药用组合物可以用本领域本身自明的方式加以制备，产生具有足够储藏稳定性并适合施用于人或动物的多肽药品。

药物形式

本发明的多肽或偶联物可以“原型”使用和/或以其盐的形式使用。合适的盐包括，但不限于，与碱金属或碱土金属，例如钠、钾、钙和镁所成的盐，以及例如锌盐。这些盐或络合物可以以晶体和/或无定形结构存在。

赋形剂

“药用”，意思是在所用剂量和浓度下不会在施用者体内造成任何不利效果的载体或赋形剂。这些药用载体和赋形剂是本领域众所周知的(见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishing Company(1990)；Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides and Proteins，S.Frokjaer and L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。

药物混合物

本发明的组合物可以单独施用或者与其它药剂联合施用。例如利巴韦林经常与IFN-α共施用，并显示可提高抗病毒治疗例如HCV治疗的效力。人们正在开发多种针对抗病毒靶标(病毒蛋白酶、病毒聚合酶、病毒复制复合体组装体)和宿主靶标(病毒加工所需的宿主蛋白酶、病毒靶标磷酸化所需的宿主激酶如NS5A和高效利用病毒IRES所需的宿主因子抑制剂)的小分子。可以共同施用其它的细胞因子，例如IL-2，IL-12，IL-23，IL-27或IFN-γ。这些药剂可以整合为同一药用组合物的一部分，或者可以与本发明多肽或偶联物分开施用，或者与之同时施用，或者根据另一治疗方案施用。此外，本发明的多肽、偶联物或组合物可以用作其它疗法的辅剂。

患者

用于本发明目的的“患者”包括人类和其它哺乳动物。因此，本方法可同时用于人类治疗和兽医应用。

组合物类型和施用途径

包含本发明多肽或偶联物的药用组合物可以配制成多种形式，例如作为液体、凝胶、冻干的或压缩的固体。优选的形式根据所治疗的具体适应症而定，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。

本发明制剂的施用可以通过多种方法执行，包括但不限于，口服、皮下、静脉内、脑内、鼻内、透皮、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道、直肠、眼内或任何其它可以接受的方式。制剂可以用本领域众所周知的技术，例如泵(如皮下渗透泵)或移植，连续灌注施用，当然也可以接受弹丸注射。

非消化道用药物(parenterals)

药用组合物的一个例子是设计用于非消化道施用的溶液。尽管在许多情况下药物溶液制剂是以适于直接使用的液体形式提供的，但这些药物制剂也可以冷冻或冻干的形式提供。在前一种情况下，组合物在使用之前必须解冻。后一种形式经常用于提高组合物中所含活性化合物在多种多样的存储条件下的稳定性，因为本领域的技术人员公认冻干制品一般比其液体对应物更加稳定。这些冻干制品可以在使用之前通过添加一种或多种药用稀释剂例如注射用无菌水或无菌生理盐溶液来复原。

非消化道用药物可以配制为供贮存的冻干制剂或水溶液，方法为适当混合具有期望纯度的多肽和一种或多种本领域通常采用的药用载体、赋形剂或稳定剂(它们统称为“赋形剂”)，例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去垢剂、抗氧化剂和/或其它各种杂类添加剂。

缓冲剂有助于将pH维持在近似生理条件的范围。它们典型的浓度范围是大约2mM-大约5mM。用于本发明的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸、乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它的可能有磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐，例如Tris。

添加防腐剂以延缓微生物的生长，典型的添加量是大约0.2％-1％(w/v)。可用于本发明的合适防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲苯酚、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄基铵、卤化苯甲烷铵(例如氯化苯甲烷铵、溴化苯甲烷铵或碘化苯甲烷铵)、氯化己烷双胺、对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

添加等渗剂以保证液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高的糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的存在量是0.1％-25重量％，典型地1％-5％，考虑其它组分的相对含量。

稳定剂是指一大类可具有不同功能的赋形剂：从膨胀剂到溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(如上列举)；氨基酸例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油(glycerol)等，包括环多醇例如环己六醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白质例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖例如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖例如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖例如棉子糖，和多糖例如葡聚糖。稳定剂典型地基于活性蛋白质重量以按重量计从0.1份至10,000份的范围存在。

可以存在非离子表面活性剂或去垢剂(也称为“润湿剂”)来帮助溶解治疗剂并保护治疗用多肽免于搅拌所诱发的聚集，其还使得所述制剂能够经受剪切表面应力(shear surface stress)而不引起多肽的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamers(184、188等)、Pluronic

多元醇、聚氧化乙烯山梨聚糖单醚(Tween

-20、Tween

-80等)。

其它可添加的杂类赋形剂包括膨胀剂或填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。

活性成分还可以包埋到微囊中，例如通过凝聚技术(coacervationtechinique)或界面聚合制备的微囊例如羟甲基纤维素、明胶或聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或大乳状液(macroemulsion)中。这些技术在上文的Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中有公开。

将用于体内施用的非消化道用制剂必须是无菌的。这点通过本领域熟知的方法轻易地实现，例如，通过经无菌过滤膜的过滤。

持续释放制剂

持续释放制剂的合适实例包括含有多肽或偶联物的半透性固体疏水聚合物基质，该基质具有合适的形式，例如薄膜或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease technology或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物例如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸能够实现分子的长期释放，例如长达或者超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质的期间较短。当装入胶囊的多肽在体内长期保持时，它们会由于暴露于37℃的湿气而变性或者聚集，导致生物活性损失和可能的免疫原性变化。可以根据所涉及的机制设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制湿气含量、使用合适的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物实现稳定化。

口服施用

为了口服施用，药用组合物可以是固体或液体形式，例如呈胶囊、片剂、悬液、乳液或溶液的形式。药用组合物优选地制成含有给定量的活性组分的剂量单位的形式。对于人和其它哺乳动物而言，根据患者的病症和其它因素，合适的每日剂量可以有很大不同，但是本领域的技术人员能够使用常规方法加以确定。

口服施用的固体剂型可以包括胶囊、片剂、栓剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉一起混合。按常规做法，这些剂型还可以包括额外的物质，例如润滑剂，如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂实例中，剂型还可以包含缓冲剂。片剂和丸剂可额外地制备有肠衣。

多肽或偶联物可以和辅料(adjuvants)掺合，并且压片或包囊，用于常规施用；所述辅料例如乳糖、蔗糖、淀粉粉末、烷酸纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐及钙盐、阿拉伯胶、明胶、藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷和/或聚乙烯醇。或者，它们可以溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、油(例如玉米油、花生油、棉子油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液内。其它的辅料和给药模式在制药领域中是众所周知的。载体或稀释剂可以包含延时材料(time delay material)例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，延时材料可单独存在或与蜡一起存在；或其它本领域熟知的材料。

药用组合物可经过常规的制药操作，例如灭菌，和/或可以包含常规的辅料，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等，例如本文所公开的那些。

口服施用的液体剂型可以包括药用乳液、溶液、悬液、糖浆和酏剂，其包含本领域通用的惰性稀释剂，例如水。这些组合物还可以包含辅料，例如润湿剂、增甜剂、调味剂和香料。

肺部递送

适合于喷雾器(喷射喷雾器或者超声喷雾器)使用的制剂典型地包括溶解在水中的多肽或偶联物，其浓度为例如大约每毫升溶液0.01-25mg偶联物，优选地大约0.1-10mg/mL偶联物。制剂还可以包括缓冲剂和单糖(例如用于稳定蛋白质和调节渗透压)，和/或人血清白蛋白，浓度范围为0.1-10mg/ml。可使用的缓冲剂的实例是乙酸钠、柠檬酸盐和甘氨酸。优选地，缓冲剂具有适合于将溶液pH调节到3-9的组成和摩尔浓度。一般地，1mM-50mM的缓冲剂摩尔浓度适合于此目的。可使用的糖的实例是乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖和木糖，通常的含量范围是制剂重量的1％-10％。

喷雾器制剂还可以包含表面活性剂，用于降低或防止在形成气溶胶时溶液雾化而导致的表面诱发性蛋白质聚集。可以采用多种常规的表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯。用量的范围一般为制剂重量的0.001％-4％。特别优选用于本发明此目的的表面活性剂是聚乙二醇山梨聚糖单油酸酯。

在下列文献中描述了具体的制剂和用于生产合适的本发明液体颗粒分散体系的方法：WO 94/20069，US 5,915,378，US 5,960,792，US 5,957,124，US5,934,272，US 5,915,378，US 5,855,564，US 5,826,570和US 5,522,385，本文引用它们的内容作为参考。

用定量剂量吸入器(dose inhaler)使用的制剂一般地包括细碎的粉末。该粉末可通过冻干随后粉碎液体偶联物制剂产生，并也可以包含稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)。典型地，添加超过0.5％(w/w)的HSA。此外，如果需要，可向制剂中添加一种或多种糖或糖醇。实例包括乳糖麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、山梨糖、海藻糖、木糖醇和木糖。添加到制剂中的量的范围是大约为偶联物存在量的0.01-200％(w/w)，优选地大约1-50％。然后将这类制剂冻干并粉碎到期望的粒度。

然后，在表面活性剂的帮助下，将粒度合适的颗粒悬浮在推进剂中。推进剂可以是任何可用于此目的的常规材料，例如含氯氟烃、氢氯氟烷(hydrochlorofluorocarbon)、氢氟烷，或者碳氢化合物，包括三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。合适的表面活性剂包括去水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。然后将该混合物加载到递送装置内。适用于本发明应用的可商购的定量剂量吸入器实例是Ventolin定量剂量吸入器，Glaxo公司制造，ResearchTriangle Park，NC，USA。

用于粉末吸入器的制剂将包括含有偶联物的细碎干粉，还可以包括膨胀剂，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇，其含量便于粉末从器件分散，例如制剂重量的50％-90％。粉末的颗粒在肺内应该具有与中值直径小于10微米，优选0.5-5微米，最优选1.5-3.5微米，且密度大约1g/cm²的颗粒相对应的空气动力学性质。适合于根据本文的教导使用的粉末吸入器的实例是Spinhaler粉末吸入器，Fisons Corp，Bedford，MA，USA制造。

用于这些设备的粉末可以通过下文公开的方法生产和/或递送：US5,997,848，US 5,993,783，US 5,985,248，US 5,976574，US 5,922,354，US5,785,049和US 5,654,007。

设计用于肺部递送治疗产品的机械设备包括，但不限于，喷雾器、定量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟悉的。可商购的用于本发明实践的具体实例是Ultravent吸入器，Mallinckrodt Inc.制造，St.Louis，MO，USA；Acorn II吸入器，Marquest Medical Products，Englewood，CO，USA制造；Ventolin定量剂量吸入器，Glaxo Inc.，ResearchTriangle Park，NC，USA制造；Spinhaler粉末吸入器，Fisons Corp.制造，Bedford，MA，USA；Nektar Therapeutics Inc.，San Carlos，CA，USA的“驻云(standing cloud)”器；Alkermes，Cambridge，MA，USA制造的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，Hayward，CA，USA制造的AERx肺部药物递送系统。

试剂盒

本发明还提供了试剂盒，它们包括本发明的多肽、偶联物、多核苷酸、表达载体、细胞、方法、组合物和系统，以及装置。本发明的试剂盒任选地包括本发明的至少如下一项：(1)本文所述的装置、系统、系统组件、或装置组件；(2)至少一种试剂盒组分，其包括本发明的多肽或偶联物或多核苷酸；编码本发明多肽的质粒表达载体；表达本发明多肽的细胞；或包含至少一种这类组分的组合物；(3)用于实施本文所述任何方法，包括治疗或预防方法的指导；用于使用(2)中提及的任何组分或任何这类组分的任何组合物的指导；和/或用于操作本文所述任何装置、系统或组件的指导；(4)用于容纳所述至少一种这类组分或组合物的容器；和(5)包装材料。

在进一步的方面中，本发明规定了：上文和本处描述的任何装置、组分、组合物或试剂盒；本文中描述的任何方法和测定法；和/或任何装置、组分、组合物或试剂盒用于实施本文说明的任何测定法或方法的用途。

实施例

提供下面的实施例用于例证本发明，但在任何方面均不对本发明的精神或范围具有限制。

材料和方法

I.确定表面可及的残基

可及表面积(Accessible Surface Area，ASA)

使用计算机程序Access(B.Lee and F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))version 2(1983 Yale University)计算结构中单个原子的可及表面积(ASA)。该方法典型地使用1.4

的探针尺寸，可及表面积(ASA)定义为由探针中心形成的面积。在该计算之前，应从坐标系除去全部的水分子和全部的氢原子，以及不与蛋白质直接相关的其它原子。

侧链的分ASA

用侧链中原子的ASA之总和除以如下所述的数值，计算侧链原子的分ASA：该数值代表在延伸的ALA-x-ALA三肽中所述残基类型的侧链原子的ASA。见Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。对于本实施例，CA原子看作甘氨酸残基而非其它残基侧链的一部分。如下的数值用作侧链的标准100％ ASA(表6)：

结构中未检测到的残基定义为具有100％暴露，因为它们被认为位于柔性区。在分析NMR结构系综(ensemble)时，使用系综的平均ASA值。在不可获得三维结构时确定表面暴露残基：

当不可获得三维结构，或者结构尚未详细到足以用于确定表面可及性(例如只有CA原子的位置已知)时，表面可及性可通过如下生成的序列比对推知：

A：如果结构已知，但尚未详细到足以确定表面可及性：

将低详细度的结构引入与序列家族已知结构的基于结构的序列比对中，使用可从Molecular Simulations Inc.获得的MODELER程序。

B：如果结构未知：

将该序列与预先定义的序列对齐进行比对，该序列对齐包含序列家族中已知结构的序列，并可用ClustalW程序的“profile/structure alignment”选项来准备(Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Research 22：4673-4680)。

从A或B获得的序列对齐中，将待分析序列中如下所述的位置上的残基定义为“暴露的”：这些位置等同于至少一个具有已知结构的其它序列中暴露的残基。暴露的程度取其它序列中等同残基的最大值。当待分析序列位于插入位置(即在其它序列中没有等同残基)时，该残基定义为“完全暴露的”，因为它最可能位于转角/环区域。当存在低详细度结构时，结构中没有观察到的残基定义为完全暴露，因为它们被认为处于柔性区域。确定原子间的距离：

利用分子图形软件，例如Molecular Simulations，Inc.的InsightII

98.0，可以容易地确定原子间的距离。

II.蛋白表达和纯化

利用Herculase(Stratagene)或Phusion(Finnzyme)聚合酶PCR扩增改组的α-干扰素多肽编码序列，在侧翼区引入NdeI和NotI限制位点。用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，用NdeI和NotI酶(NEB)进行消化，在1％琼脂糖凝胶上分离。切下合适的条带(～520bp)，用Qiagen凝胶提取试剂盒提取DNA。将这样获得的插入DNA连接到pCMV-Mkan载体衍生物(Punnonen J.et al.，PCT Publication WO 2004/007664)中，该载体衍生物含有：驱动干扰素表达的CMV启动子；位于插入序列N末端的IFNα5样信号序列；位于插入序列C末端的E-tag(GAPVPYPDPLEPR；SEQ ID NO：334)和S-tag(KETAAAKFERQHMDS；SEQ ID NO：335)；以及用于在大肠杆菌中进行选择的卡那霉素标记。最终的连接物用Qiagen PCR纯化试剂盒脱盐，重悬在10mM Tris pH8.0缓冲液中，并根据提供商的详细说明将1-2μl电穿孔进入XL1-Blue电穿孔感受态细胞(Stratagene)。

转染前一天，5-8 x 10⁶ COS-7细胞接种于盛有35ml添加了抗生素和10％胎牛血清(FBS；Hyclone)的DMEM的T175瓶中。即将转染前，吸出培养基，用10ml OptiMEM清洗一次之后，加入35ml添加了抗生素的OptiMEM(Gibco/Invitrogen)。对于每个T175瓶，转染混合物的制备如下：1ml OptiMEM+50μl Fugene6转染试剂(Roche Diagnostics)在室温孵育5min，期间添加10μg无内毒素DNA(Qiagen无内毒素大提，根据制造商提供的规程制备)，将混合物在室温再孵育30min，然后添加到细胞中。在24h时收集粗制上清液，1000rpm离心10min使之澄清，保存在-80℃。

用AKTA Explorer HPLC系统(Amersham)从粗制上清液纯化干扰素多肽。在用PBS平衡的E-tag柱(RPAS纯化模块，Amersham 71-5000-87)上加载大约140ml(四个T175瓶的上清液)。首先用4倍柱体积的PBS pH7.4冲洗柱子，随后用3倍柱体积的缓冲液B1(20mM NaOAc，150mM NaCl，1mM EDTA，pH5.0)冲洗。用低pH缓冲液B2(30mM柠檬酸，150mM NaCl，1mM EDTA，pH3.0)以3倍柱体积分步洗脱蛋白质。将主UV吸收峰(大约6ml)收集在700μl 1M Tris pH8.0中，以中和pH，4℃保存。蛋白质样品通过用10kDa MWCOPierce渗透透析盒/载片透析，将缓冲液交换为含20mM Tris pH8.0的冲洗用无菌水(WFI；B.Braun Medical Inc.)，随后使用Amicon装置(10kDa MWCO)在4℃ 3500rpm离心15min加以浓缩。用BCA蛋白测定试剂盒以BSA(Pierce批号23210)作为标准测量蛋白质浓度，随后配制在5％ BSA/PBS pH6.5中，并分成等份保存在-80℃。

III.活性测定

IFNAR结合测定

α-干扰素多肽与人α-干扰素受体(IFNAR)的结合可以通过流式细胞术竞争结合测定加以确定，其中以人淋巴瘤细胞系(Daudi)作为IFNAR表达细胞源，以生物素化IFN-α参照多肽作为示踪物，以及用于检测的藻红蛋白偶联的链霉抗生物素蛋白(SA-PE)。

简而言之，在存在等于其K_D的固定浓度的生物素化IFN-α参照多肽(“示踪物”多肽)的条件下，将Daudi细胞与不同浓度的未标记待测多肽(“竞争物”多肽)孵育大约4小时。然后通过SA-PE染色和流式细胞术评估，确定在竞争物多肽的各个浓度下保持与IFNAR结合的示踪物多肽的量。将示踪物结合降低50％的竞争物多肽的浓度(EC₅₀值)与竞争物多肽对α-干扰素受体的固有结合亲和力直接相关。

Daudi人B细胞淋巴瘤细胞系可以从美国典型培养物保藏中心获得(ATCC#CCL-213)。竞争结合测定是对保持培养不到30天的Daudi细胞进行的。Daudi细胞培养在完全RPMI1640培养基(Bio Whittaker #BE12-702F/U1)中，其中含有10％胎牛血清(Hyclone，#SH30071.03)、葡萄糖4.5g/L(Sigma#G8769，450g/L)、丙酮酸钠1mM(Gibco，#11360-039，100mM)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)。细胞保持在5％ CO₂的37℃加湿培养箱内，细胞密度为0.5 x 10⁶-2 x 10⁶细胞/ml，每周添加2-3次新鲜培养基，且每周替换一次培养基。

用EZ-Link

NHS-PEO固相生物素化试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc.，product#21450)按照制造商提供的规程将IFN-α参照多肽(例如IFN-α 2a)生物素化，制备示踪物多肽。用EZ生物素定量试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc.，产品号28005)按照制造商提供的规程定量每摩尔示踪物多肽的生物素摩尔数。用不同量的示踪物多肽孵育Daudi细胞，并用SA-PE(可得自BDPharmingen，产品号554061或Dako，产品号R0438)处理细胞，确定示踪物多肽结合Daudi细胞的K_D。针对特定示踪物浓度的平均荧光强度(MFI)代表了每个细胞结合配体的量。从所得MFI值中减去单用SA-PE检测到的背景，然后用这些值对示踪物浓度作图，生成饱和-结合曲线，从该曲线用非线性回归、单位点(one-site)曲线拟合计算出K_D。在随后的竞争结合测定中使用该K_D作为示踪物的浓度。

对于竞争结合测定，将Daudi细胞铺在96孔圆底测定板(诸如VWR#29442-066)中，密度为200,000个细胞/50μl/孔，置于磷酸盐缓冲盐水(PBS)加2％胎牛血清(FBS)中。制备竞争物多肽的8-12个两倍稀释物，例如从4μM至1pM不等。将100微升稀释的2X竞争物制备物转移到细胞板上，使每孔中最终竞争物的浓度为例如2μM-0.5pM。向150μl细胞加竞争物中添加50微升4X K_D(如上所述)的生物素化示踪物多肽，使示踪物多肽在测定体系中的最终浓度为1X K_D。将平板在轨道振荡器上间歇振荡下4℃孵育4小时。然后用加有2％ FBS的PBS洗涤细胞，再用50μl SA-PE(25倍稀释的BDPharmingen #554061或40倍稀释的Dako #R0438)在黑暗中于冰上染色30分钟。随后用加有2％ FBS的PBS洗涤细胞两次，再通过流式细胞术(FacsCalibur，BD Bioscience)进行采集，其中使用多孔自动上样器(BD Bioscience)、CellQuestPro软件(BD Bioscience)和多孔平板操控软件MPM ver3.1(AMSCytek or BD Bioscience)。

从每个竞争物浓度下产生的MFI中减去背景MFI(定义为在没有示踪物或竞争物时用SA-PE染色的细胞的MFI)。将所得数值作为竞争物浓度的函数作图，并用非线性回归单位点竞争结合分析方程式确定EC₅₀值。

HeLa-EMCV抗病毒测定

下面提供了本发明α-干扰素多肽和偶联物抗病毒活性的测定法实例。该测定是基于细胞的剂量响应测定，用于估计药物的抗病毒潜力，有时称作“防御致细胞病变效应”(protection from cytopathic effect，或PCPE)测定，也称为抑制致细胞病变效应(CPE)测定。简而言之，将细胞与药物孵育并暴露于病毒。当不存在药物时，暴露于病毒的细胞死亡。随着药物浓度的增加，存活细胞的比例增加。存活细胞的数目可以直接测量(例如通过目测计数)或通过估计代谢速度间接地测量。例如，代谢染料(metabolic dyes)，例如MTT或WST-1，可用作细胞存活的间接量度。活细胞代谢这些染料，形成可通过分光光度术(光密度)定量的代谢产物。

材料和试剂：

HeLa细胞：人子宫颈癌细胞系(ATCC#CCL-2)。HeLa细胞系源自于35岁女性的子宫颈腺癌。HeLa细胞据报道含有人乳头瘤病毒(HPV-18)序列。该细胞系得自于ATCC，传代数为107。

L-929细胞：鼠成纤维细胞系(ATCC#CCL-1)。L-929细胞系是1948年从亲代株系Strain L的第95世代分离的单细胞克隆。Strain L是从正常100日龄雄性C[3]H/An小鼠的皮下网形和脂肪组织分离的。

脑心肌炎病毒(EMCV)：组织培养适应株系(ATCC#VR-129B)。脑心肌炎病毒(EMCV)的组织培养适应株系从ATCC(#VR-129B)购得。为了进行HeLa抗病毒测定，在L929细胞中产生了高滴度的EMCV储备物。根据L929细胞上空斑测定的结果，L929所产病毒储备物的病毒滴度为4.0 X 10⁸PFU/ml。

完全MEM：

Minimal Essential Media(MEM，Gibco批号10370-021)

10％胎牛血清(FBS，Hyclone批号SH30071.03)

1x青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG，Gibco批号10378-016)

1mM丙酮酸钠(Gibco批号#11360-070)

减血清MEM：

Minimal Essential Media(MEM，Gibco批号10370-021)

2％胎牛血清(FBS，Hyclone批号SH30071.03)

1x青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG，Gibco批号10378-016)

1mM丙酮酸钠(Gibco批号#11360-070)

胰蛋白酶/EDTA(Gibco批号25300-054)

WST-1(Roche；批号1644807)

HeL细胞保持在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱内的完全MEM中。当细胞在T175瓶中汇合至2-4 x 10⁶个细胞/25ml的终浓度时，用胰蛋白酶收集细胞并分瓶，每周两次。测定前一天，用胰蛋白酶消化细胞，并接种在新的T175瓶内，密度为6 x 10⁶个细胞/25ml，以保证细胞在测定之前处于对数期。HeLa-EMCV抗病毒测定程序：

测定当天，用胰蛋白酶收集对数期HeLa细胞，重悬浮在减血清MEM中，离心浓缩。将相当于5个T175瓶细胞的细胞沉淀重新悬浮在10ml减血清MEM中，通过40微米尼龙细胞滤网过滤，用计数器计数。通过用血球计数计进行锥虫蓝排除试验确定细胞活力。将细胞重悬在减血清MEM中至终浓度1 x 10⁵个细胞/ml。向96孔测定板的各个孔内加入100微升稀释过的细胞(1 x 10⁴个细胞/孔)，将平板在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中孵育24小时。

通过剂量响应分析确定“参照”α-干扰素和本发明α-干扰素多肽(也称作“测试样品”)的效力。一般地，每个平板有9种测试样品和1种参照IFN-α。每次测定中将每种样品在一式二份的平板上作为单独的曲线加以测定。每次测定测试4种不同的参照，其中2种按一式二份测试，1种按一式六份测试，以确保一致的测定质量和性能。每周由两个不同的操作人员进行两个测定，测定总共执行2周，总共4个单独的测定。每周，两个测定在每个平板上有不同的样品和参照布局，以控制任何由于样品位置造成的影响。参照IFN-α的剂量响应曲线一般由8个5倍稀释物组成，其中取决于参照，初始稀释度为100ng/ml-1ng/ml不等。从而最终的稀释度为0.0013ng/ml到0.00001ng/ml不等。对于IFN-α测试样品，5倍稀释度为1ng/ml-0.00001ng/ml。对8个孔的细胞用病毒而不用IFN处理，每个平板有8个仅含细胞的孔作为对照。

IFN-α稀释物用减血清MEM制备。将100微升稀释过的IFN-α制备物转移到测定平板。将测定平板在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中孵育16小时。

第3天，用EMC病毒攻击细胞。从测定板的每个孔吸出培养基。将EMCV储备物在MEM+2％ FBS中以1:167稀释。向每个孔添加100微升稀释过的病毒，相当于3 X 10⁵个病毒颗粒。将细胞与病毒在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中孵育24小时。

第4天，利用WST-1确定每个孔中存活细胞的数目。将WST-1试剂在减血清MEM中1:2.3稀释，将13μl稀释过的WST-1试剂添加到含有100μl培养基加病毒或仅培养基的孔中，最终稀释度为1:20。将平板在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中孵育60分钟。通过在读板器上测量450nm的OD确定每孔存活细胞的数目。

分析：

IFN-α参照和测试样品的抗病毒效力用如下的等式计算：

抗病毒效力＝(存活细胞_C+I+V-存活细胞_C+V)/(存活细胞_C+I-存活细胞_C+V)*100％

其中C+V＝细胞+EMCV，C+I＝细胞+IFN-α，C+I+V＝细胞+IFN-α+EMCV

剂量响应曲线用GraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc.)通过非线性回归进行分析。使用如下的方程用于曲线拟合：

“底值”是底平台的Y值；“顶值”是顶平台的Y值，LogEC50是响应为底值和顶值之间一半时的X值。使用Levenberg-Marquardt方法作为最优化算法。

T_H1分化测定

下面提供了本发明α-干扰素多肽和偶联物T_H1分化活性的测定法实例。

测定程序：

在测定开始日(测定日前一天)，从斯坦福血库(Stanford Blood Bank)收集从500ml血液制备的、含有白细胞和红细胞的人血沉棕黄层(25-30ml)，室温保存过夜。将每个血沉棕黄层小心转移到T75瓶中，用PBS稀释成100ml。对于每个血沉棕黄层，将13ml Histopaque/Ficoll(Sigma H8889)移液到4个50ml离心管中，将25ml稀释血液样品小心覆盖在Histopaque/Ficoll上面，不要破坏界面。然后将管离心(20℃，2500rpm)20分钟。用3ml塑料移液器，将含有PBMC的单核细胞层转移到2个50ml圆锥试管中(来自2个Histopaque/Ficoll/血沉棕黄层的细胞并在1个管内)。然后用PBS将PBMC稀释到50ml/管，离心(20℃，1000rpm)10分钟除去血小板。在除去PBS之后，将PBMC和剩余的PBC混合以防止聚集。添加10毫升RBC裂解缓冲液(氯化铵缓冲液)，并将两管细胞合并成一管。将这样含有从一个供体分离的总PBMC和RBC的管分别在室温孵育10min。通过用细胞滤网(70μm，Falcon批号2350)过滤细胞除去潜在的血细胞凝块。添加PBS到总体积为50ml，随后离心(20℃，1000rpm)10min。最后用血球计数计计数细胞数目。

接着，对每个PBMC制备物的一部分进行预染和FACS分析以选择幼稚TH0细胞百分比超过15％的PBMC制备物。将300微升PBMC用20μl FITC偶联的抗人CD45RA(Pharmigen，批号555488)、20μl Cy-铬偶联抗人CD4(Pharmigen，批号555348)，5μl PE偶联抗人CD8(Pharmigen，批号555367)，5μl PE-偶联抗人CD14(Pharmigen，批号555398)和5μl PE-偶联抗人CD20(Pharmigen，批号555623)染色，并在冰上孵育45分钟。用PBS清洗细胞，重悬在1ml PBS中，用40μm细胞滤网(Falcon，批号2340)过滤。利用FACS确定T_H0细胞(CD4和CD45RA阳性，CD8、CD14、CD20阴性)的百分比，选择幼稚T_H0细胞多于15％的PBMC制备物用于测定。

将所选PBMC制备物用500μl FITC偶联的抗人CD45RA、500μl Cy-铬偶联的抗人CD4、200μl PE偶联的抗人CD8、50μl PE偶联的抗人CD14和50μlPE偶联的抗人CD20进行染色，并在冰上孵育60分钟。用PBS清洗细胞，添加PI，用10ml PBS稀释细胞，随后用40μm细胞滤网过滤。FACS分选细胞后，用MOFLO将1 x 10⁴个幼稚T_H0细胞(CD4和CD45RA阳性，CD8、CD14、CD20阴性)转移到96孔圆底平板的每个孔中，其中每个孔含有160μlDMEM+青霉素-链霉素+2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清(Hyclone批号SH30071.03)。

向每个孔添加1.7微升Dynabeads CD3/CD28T细胞扩增物(Dynal，批号111.32)。在实验之前对Dynabeads的刺激效应进行校准，以避免批次之间的变差。接着，向测定板添加20μl/孔蛋白样品。一般地，IL-4和IL-12标准(得自于R&D Systems)的浓度范围是0.04pg/ml-10ng/ml，IFN-α测试样品和IFN-α参照样品的浓度范围是0.76pg/ml-200ng/ml。

将细胞在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中孵育6天。收集每孔的上清液，用标准ELISA(R&D Systems，Cat.#DIF50)测定IFN-γ的含量来确定T_H1分化的程度。

分析：

响应＝IFN-γ浓度(pg/ml)

使用如下方程进行曲线拟合：

变量“底值”是底部平台的Y值；“顶值”是顶部平台的Y值，LogEC50是响应达到底值和顶值之间一半时的X值。使用Levenberg-Marquardt方法作为最优化算法。

Daudi抗增殖测定

下面提供了本发明α-干扰素多肽和偶联物抗增殖活性的测定法实例。

材料：

Daudi细胞：人Burkitt’s淋巴瘤细胞(ATCC号：CCL-213)。

完全RPMI：

RPMI 1640(RPMI，Gibco批号11875-143)

10％胎牛血清(FBS，Hyclone批号SH30071.03)

1x青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG，Gibco批号10378-01)

悬浮生长的Daudi Burkitt’s淋巴瘤细胞保持在37℃，5％ CO₂加湿培养箱中含有50ml完全RPMI的T175组织培养瓶中。当细胞汇合时以1:10分瓶。

测定程序：

将Daudi细胞离心沉降，并用1xPBS清洗。将细胞数目调节到10⁵个细胞/ml。向96孔圆底测定板的每个孔中添加80μl培养基，随后向每个孔转移100μl细胞(10⁴个细胞/孔)。

用培养基在稀释板内制备IFN-α参照材料和IFN-α测试样品的11个稀释物，范围为200ng/ml-0.2pg/ml(4倍稀释)。然后，将20μl稀释的IFN-α制备物转移到测定板上。

细胞在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱孵育。48小时后，向每个孔添加1μCi的甲基-³H胸腺嘧啶(Amersham Pharmacia，批号TRK758)，随后在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中孵育24小时。次日收集细胞，并确定胸腺嘧啶的摄取。

或者，Daudi抗增殖测定可以通过测量有活力的、代谢活性的Daudi细胞的数目来进行，其中所述测量是基于干扰素处理后培养孔内ATP存在的量。在这一程序中，将8000个Daudi细胞以50μl体积铺在96孔圆底测定板上。在将细胞在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中孵育2小时，然后添加干扰素稀释物。将干扰素稀释6倍(9个点)，一般从5-10ng/ml开始稀释。添加干扰素之后，将细胞在37℃，5％ CO₂的加湿培养箱中孵育72小时。然后通过添加100μlCellTiter-Glo^TM(Promega，批号G7572)确定每个孔中活细胞的数目。将细胞+CellTiter-Glo^TM试剂混合2分钟，并在室温于黑暗中孵育30-60分钟。用Analyst HT仪确定每孔中发光信号的量。

分析：

用如下方程计算IFN-α参照和样品的EC₅₀：

其中“底值”是底部平台的Y值；“顶值”是顶部平台的Y值，LogEC50是响应达到底值和顶值之间一半时的X值。使用Levenberg-Marquardt方法作为最优化算法。

实施例1：α-干扰素的表面可及残基的确定

人干扰素-α2a残基的表面暴露：

根据Klaus et al.，J.Mol.Biol.，274：661-675(1997)报道的24个人α-干扰素2a的NMR结构，计算侧链的分ASA。下面使用的序列编号是基于人α-干扰素2a蛋白的成熟序列(本文中标识为SEQ ID NO：322)。需要指出，该结构包含两个二硫桥，分别涉及Cys1-Cys98和Cys29-Cys138。通过计算ASA和分ASA并取24个结构的平均值，集中关注侧链ASA，可以确定下列残基具有超过25％的分ASA：D2，L3，P4，Q5，T6，H7，S8，L9，G10，R12，R13，M16，A19，Q20，R22，K23，I24，S25，L26，F27，S28，L30，K31，R33，H34，D35，G37，Q40，E41，E42，G44，N45，Q46，Q48，K49，A50，E51，E58，Q61，Q62，N65，S68，T69，K70，D71，S73，A74，D77，E78，T79，L80，D82，K83，T86，Y89，Q90，N93，D94，E96，A97，V99，I100，Q101，G102，V103，G104，T106，E107，T108，P109，L110，M111，K112，E113，D114，L117，R120，K121，Q124，R125，T127，L128，K131，E132，K133，K134，Y135，S136，P137，C138，A145，M148，R149，S152，L153，N156，Q158，E159，S160，L161，R162，S163，K164和E165，其中位置编号对应于本文标识为SEQ ID NO：322的α-干扰素2a序列的位置编号。

确定下列残基具有平均超过50％的侧链分ASA：D2，L3，P4，Q5，T6，H7，S8，L9，R12，R13，M16，A19，S25，F27，S28，K31，R33，H34，D35，G37，E41，G44，N45，Q46，Q48，K49，N65，K70，A74，D77，E78，T79，D82，K83，T86，Y89，Q90，N93，D94，I100，Q101，G102，G104，T106，E107，T108，P109，L110，E113，D114，L117，R120，K121，Q124，R125，L128，K131，E132，K134，P137，R149，E159，L161，R162，S163，K164和E165，其中位置编号对应于本文标识为SEQID NO：322的α-干扰素2a序列的位置编号。

相应于SEQ ID NO：1的残基的表面暴露：

由于在包括所有已知的人α-干扰素序列(除IFN-α2亚型之外)和某些本发明的多肽在内的许多α-干扰素序列中，在人α-干扰素2亚型——例如α-干扰素2b(SEQ ID NO：321)和α-干扰素2a(SEQ ID NO：322)——的44位之后插入了一个氨基酸，因此，例如在图1比对所示的序列中，相对于hIFNα2b(SEQID NO：321)所指代的序列的编号，位置编码44之后的表面暴露残基的位置编号将移动一个残基。

根据上述分析，相对于SEQ ID NO：1编号的下列位置被认为包含具有超过25％的侧链分ASA的氨基酸残基：位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，16，19，20，22，23，24，25，26，27，28，30，31，33，34，35，37，40，41，42，44，46，47，49，50，51，52，59，62，63，66，69，70，71，72，74，75，78，79，80，81，83，84，87，90，91，94，95，97，98，100，101，102，103，104，105，107，108，109，110，111，112，113，114，115，118，121，122，125，126，128，129，132，133，134，135，136，137，138，139，146，149，150，153，154，157，159，160，161，162，163，164，165和166。

类似地，同样相对于SEQ ID NO：1编号的下列位置被认为包含具有平均超过50％的分ASA的氨基酸残基：位置2，3，4，5，6，7，8，9，12，13，16，19，25，27，28，31，33，34，35，37，41，44，46，47，49，50，66，71，75，78，79，80，83，84，87，90，91，94，95，101，102，103，105，107，108，109，110，111，114，115，118，121，122，125，126，129，132，133，135，138，150，160，162，163，164，165和166。

实施例2：α-干扰素多肽的抗病毒活性

HCV的主要技术挑战在于病毒不能体外生长，只在最近才在驯化(tractable)动物模型中培养。然而，有些可体外复制的病毒被认为是HCV病毒复制的有用替代物。认为可预测体内HCV抗病毒活性的体外替代测定法包括在上面“材料和方法”部分中描述的测定法，它们在人子宫颈癌衍生的HeLa细胞系中使用脑心肌炎病毒(EMCV)测量测试分子保护细胞免于病毒感染所致细胞病变效应(CPE)的能力。

图3显示了下列本发明多肽在HeLa/EMCV测定中与参照α-干扰素多肽huIFNα-2a(SEQ ID NO：322)和huIFNα-2b(SEQ ID NO：321)相比较的抗病毒活性，用EC₅₀(ng/ml)表示：M04(SEQ ID NO：262)；M05(SEQ ID NO：266)；M23(SEQ ID NO：232)；M45(SEQ ID NO：88)；M01(SEQ ID NO：312)；M20(SEQ ID NO：297)；M27(SEQ ID NO：167)；M09(SEQ ID NO：107)；M02(SEQID NO：208)；M33(SEQ ID NO：94)；M37(SEQ ID NO：141)；M30(SEQ IDNO：46)；M22(SEQ ID NO：171)；M24(SEQ ID NO：310)；M44(SEQ IDNO：176)；M31(SEQ ID NO：26)；M10(SEQ ID NO：89)；M14(SEQ ID NO：296)；M03(SEQ ID NO：148)；M46(SEQ ID NO：18)；M26(SEQ ID NO：10)；M21(SEQ ID NO：87)；M38(SEQ ID NO：103)；M28(SEQ ID NO：234)；M19(SEQID NO：30)；M11(SEQ ID NO：179)；M34(SEQ ID NO：2)；M07(SEQ IDNO：260)；M18(SEQ ID NO：306)；M40(SEQ ID NO：140)；M16(SEQ IDNO：127)；M25(SEQ ID NO：293)；M29(SEQ ID NO：195)；M36(SEQ IDNO：191)；M06(SEQ ID NO：263)；M32(SEQ ID NO：1)；M39(SEQ ID NO：298)；M42(SEQ ID NO：24)；M08(SEQ ID NO：258)；M35(SEQ ID NO：124)；M41(SEQ ID NO：7)；M12(SEQ ID NO：9)；M17(SEQ ID NO：303)；和M43(SEQID NO：6)。

实施例3：α-干扰素多肽的PEG化

下面提供了制备本发明偶联物的程序实例。

Cys-PEG化

含有游离半胱氨酸的本发明多肽可以如下所述进行半胱氨酸-PEG化。首先，在4℃、50mM MES，100mM NaCl，pH6.0中将所述多肽用等摩尔浓度的TCEP(三羧基乙基膦)部分还原30min。然后，在4℃、相同条件下，将还原的多肽与4倍摩尔过量的mPEG-MAL试剂(具有PEG部分，例如20kDa或30kDa线性mPEG，或40kDa的分枝mPEG2)反应1h。将PEG化的反应混合物加载到用50mM MES，pH6.0，100mM NaCl平衡的SP-Sepharose HP柱上。在10CV(柱体积)的冲洗步骤之后，施加从0到600mM的NaCl梯度来分级PEG化和未PEG化的级分。收集级分并用SDS-PAGE对等分试样进行分析。合并含有单PEG化物质的级分，并配制用于如上所述的α-干扰素活性测定。N末端PEG化

使用mPEG-丁醛(具有PEG部分，例如20kDa或30kDa线性mPEG或40kDa分枝mPEG2)的N-端PEG化，可以在如下条件下进行：4℃；使用5倍摩尔过量的PEG试剂：多肽；在50mM MES pH5.5、100mM NaCl和20mM氰基硼氢化钠中，或50mM乙酸钠pH5.5、100mM NaCl和20mM氰基硼氢化钠中反应4-8h。偶联物用SP-SepharoseHP柱色谱分离，其中柱子用50mM MESpH5.5，100mM NaCl平衡，使用50mM MES pH5.5中从100到600mM的NaCl梯度。含有单PEG化物的级分经合并后配制用于如上所述的α-干扰素活性测定，并可通过例如分析HPLC、氨基酸分析和/或MALDI-TOF质谱加以进一步表征。

赖氨酸PEG化

赖氨酸PEG化可以使用根据Foser et al.(2003)Protein Expression &Purification 30：78-87描述的程序来实现。简而言之，将多肽与mPEG-NHS试剂(例如20kDa或30kDa的线性mPEG，或40kDa的分枝mPEG2)以多肽：PEG1:3的摩尔比在50mM硼酸盐缓冲液，pH9.0中于4℃反应2h。用SP-SepharoseHP阳离子交换色谱分离偶联物。含有单PEG化物的级分可经合并后配制用于如上所述的α-干扰素活性测定，并可通过氨基酸分析和/或MALDI-TOF质谱加以进一步表征。

实施例4：体内测定

测量本发明多肽或偶联物的药代动力学(PK)和药效学(PD)特征

生物或血清半衰期的测量可以用文献中描述的多种方法进行。例如，可以使用ELISA方法检测α-干扰素在例如皮下或肌肉内施用后的血清水平，来确定生物半衰期。使用ELISA方法测定皮下施用的α-干扰素的药代动力学在例如Rostaing et al.(1998)，J.Am.Soc.Nephrol.9(12)：2344-48中有说明。Merimsky et al.(1991)，Cancer Chemother.Pharmacol.27(5)；406-8描述了肌肉内施用的α-干扰素的血清水平的测定。

例如，可以根据如下程序在食蟹猴(Macaca fascicularis)体内研究本发明偶联物的药代动力学(PK)和药效学(PD)特征。本研究使用平均体重5-6kg的3-4岁雌性动物。动物在到达和开始处理之间适应最少6周时间，其中适应实验居住条件最少3周时间。使它们独居于不锈钢网笼(至少540 x 810 x 760mm)中，并饲以一种膨化的完全商业灵长动物膳食(100克/动物/天)，该膳食经分析无化学剂和细菌污染。此外，每天给予动物水果(苹果或香蕉)。在所有需要麻醉的程序之前，对动物禁食。

在距研究开始前3天及研究开始当天给予化合物之前，从所有动物收集血液样品。在整个研究中，血液样品(1ml全血)是从非麻醉的、人工固定的动物的股或头/隐静脉血管抽取的。在收集期间保持正常的饲养制度。样品收集在无抗凝剂的试管内，随后4℃ 3000rpm(大约1760g)离心10分钟。然后将血清样品分离成两等份(每份大约200μl)，-20℃保存。

在开始研究之前，将本发明的偶联物配制在20mM乙酸钠(pH6.0)和140mM氯化钠中。研究开始时，在用乙醇水溶液局部消毒之后用灭菌注射器和针头向每只动物皮下施用一次偶联物，剂量为30mcg偶联物/kg动物体重(4只动物)或300mcg/kg(4只动物)。在施用偶联物后的如下时间点收集血液样品：4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、144小时、240小时、336小时、456小时、552小时、600小时、624小时、648小时、672小时、696小时、720小时和744小时(或者其它合适的时间点)。

每天观察动物以检测的任何临床体征或针对处理的反应。每天对注射位点进行目测评估以评价局部耐受。在开始处理之前和研究结束时进行详细的临床检查。

在研究完成后通过ELISA测定确定分离的血清样品中偶联物的浓度。然后根据规定的时间点上化合物的血清浓度确定偶联物在食蟹猴体内的半衰期。

分别使用可商购的RIA(Eiken Chemical Co.，Tokyo)和可商购的ELISA(IBL Immuno Biological Laboratories，Hamburg.)测量每个血清样品中2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶和新喋呤(neopterin)的水平，来评估食蟹猴对本发明偶联物处理的药效学响应。根据血清样品中这两种干扰素活性生物标志测得的浓度，确定曲线下面积(AUC)，以对每种化合物在两种剂量下各自的体内活性加以定量。

确定体外免疫原性

本发明多肽或偶联物相对于参照分子的免疫原性的降低可以通过ELISA方法来测定，其中利用该ELISA方法测量所述分子相对于参照分子或制品，通常是已知的α-干扰素蛋白的免疫原性。该ELISA方法基于来自用参照蛋白处理过的患者的抗体。当本发明多肽或偶联物在测定中具有的响应统计学显著地低于参照分子或制品时，认为免疫原性有所降低。

尽管出于清楚和便于理解的目的，前文对本发明进行了比较详细的说明，但是本领域技术人员通过阅读本公开可以显见，在不背离本发明真实范围的前提下，可实现各种形式和细节的改变。可以理解，本文描述的实施例和实施方案只是出于例证的目的，本领域的技术人员在考虑它们之后可以获得各种修改或改变的提示，这些修改或改变当包含在本专利申请的精神和范围内，并落入所附权利要求的范围内。例如，上文描述的所有技术和装置可以按照各种组合加以使用。本文在此引证本申请所引用的全部出版物、专利、专利申请和/或其它文献的全部内容，其范围相当于个别引证每一个出版物、专利、专利申请和/或其它文献的全部内容。

序列表

<110>马克西根公司(Maxygen，Inc.)

<120>改进的α-干扰素多肽

<130>0284.210WO

<150>US 60/682,769

<151>2005-05-18

<160>335

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

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<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>225

<210>226

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>226

<210>227

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>227

<210>228

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>228

<210>229

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>229

<210>230

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>230

<210>231

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>231

<210>232

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>232

<210>233

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>233

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>234

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>235

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>236

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<400>237

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

400>238

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>239

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>240

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>241

<210>242

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>242

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>243

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>244

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>245

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<400>246

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>247

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>249

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>250

<210>251

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>251

<210>252

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>252

<210>253

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>253

<210>254

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>254

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>255

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>256

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>257

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>258

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<400>259

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<400>260

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<400>261

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>262

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>263

<210>264

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>264

<210>265

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>265

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>267

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>268

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>269

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>270

<210>271

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>271

<210>272

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>272

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>273

<210>274

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>274

<210>275

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>275

<210>276

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>276

<210>277

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>277

<210>278

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>278

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>279

<210>280

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>280

<210>281

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>281

<210>282

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>282

<210>283

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>283

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>284

<210>285

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>285

<210>286

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>286

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>287

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>288

<210>289

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>289

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>290

<210>291

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>291

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>292

<210>293

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>293

<210>294

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>294

<210>295

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>295

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>296

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>297

<210>298

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>298

<210>299

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>299

<210>300

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>300

<210>301

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>301

<210>302

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>302

<210>303

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>303

<210>304

<211>166

<212>PRT

<1213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>304

<210>305

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>305

<210>306

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>306

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<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>307

<210>308

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>308

<210>309

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>309

<210>310

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>310

<210>311

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>311

<210>312

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>312

<210>313

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>313

<210>314

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>314

<210>315

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>315

<210>316

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>316

<210>317

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>317

<210>318

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>318

<210>319

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成α干扰素多肽

<400>319

<210>320

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>320

<210>321

<211>165

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>321

<210>322

<211>165

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>322

<210>323

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>323

<210>324

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>324

<210>325

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>325

<210>326

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>326

<210>327

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>327

<210>328

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>328

<210>329

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>329

<210>330

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>330

<210>331

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>331

<210>332

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>332

<210>333

<211>167

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽α干扰素Con1

<400>333

<210>334

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽E-标签

<400>334

<210>335

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽S-标签

<400>335

Claims

1.一种分离或重组的多肽，该多肽包含与选自下组的序列在0-8个氨基酸位置上不同的序列，且该多肽表现抗病毒活性：SEQ ID NO：312；SEQ IDNO：262；SEQ ID NO：266；SEQ ID NO：232；SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：297；SEQ ID NO：167；SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：208；SEQ ID NO：94；SEQ IDNO：141；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：171；SEQ ID NO：310；SEQ ID NO：176；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：296；SEQ ID NO：148；SEQ IDNO：18；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：87；SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：234；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：179；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：260；SEQ IDNO：306；SEQ ID NO：140；SEQ ID NO：127；SEQ ID NO：293；SEQ ID NO：195；SEQ ID NO：191；SEQ ID NO：263；SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：298；SEQ IDNO：24；SEQ ID NO：258；SEQ ID NO：124；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQID NO：303；和SEQ ID NO：6。

2.权利要求1的多肽，其包括与选自下组的序列在0-6个氨基酸位置上不同的序列：SEQ ID NO：312；SEQ ID NO：262；SEQ ID NO：266；SEQ IDNO：232；SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：297；SEQ ID NO：167；SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：208；SEQ ID NO：94；SEQ ID NO：141；SEQ ID NO：46；SEQ IDNO：171；SEQ ID NO：310；SEQ ID NO：176；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：296；SEQ ID NO：148；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：10；SEQ IDNO：87；SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：234；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：179；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：260；SEQ ID NO：306；SEQ ID NO：140；SEQ IDNO：127；SEQ ID NO：293；SEQ ID NO：195；SEQ ID NO：191；SEQ IDNO：263；SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：298；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：258；SEQID NO：124；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：303；和SEQ ID NO：6。

3.权利要求2的多肽，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO：312；SEQID NO：262；SEQ ID NO：266；SEQ ID NO：232；SEQ ID NO：88；SEQ IDNO：297；SEQ ID NO：167；SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：208；SEQ ID NO：94；SEQ ID NO：141；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：171；SEQ ID NO：310；SEQ IDNO：176；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：296；SEQ ID NO：148；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：87；SEQ ID NO：103；SEQ IDNO：234；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：179；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：260；SEQ ID NO：306；SEQ ID NO：140；SEQ ID NO：127；SEQ ID NO：293；SEQ IDNO：195；SEQ ID NO：191；SEQ ID NO：263；SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：298；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：258；SEQ ID NO：124；SEQ ID NO：7；SEQ IDNO：9；SEQ ID NO：303；和SEQ ID NO：6。

4.权利要求1的多肽，其中该多肽在HeLa/EMCV抗病毒测定中的抗病毒活性比huIFN-α2b或huIFN-α2a的抗病毒活性高至少2倍。

5.一种偶联物，其包括

(a)权利要求1的多肽；和

(b)共价连接于该多肽的非多肽部分。

6.权利要求5的偶联物，其包括至少2个非多肽部分。

7.权利要求5的偶联物，其包括共价连接于半胱氨酸残基的非多肽部分。

8.权利要求5的偶联物，其包括共价连接于赖氨酸残基或N末端氨基的非多肽部分。

9.权利要求5的偶联物，其包括共价连接于赖氨酸残基的非多肽部分。

10.根据权利要求5的偶联物，其包括连接于N末端氨基的非多肽部分。

11.根据权利要求5的偶联物，其中非多肽部分是聚乙二醇。

12.根据权利要求5的偶联物，其中非多肽部分是糖。

13.根据权利要求5的偶联物，其中糖连接于多肽的N-糖基化位点。

14.一种组合物，其包含权利要求1的多肽和药用赋形剂。

15.一种组合物，其包含权利要求5的偶联物和药用赋形剂。

16.一种分离或重组的多核苷酸，其包含编码权利要求1的多肽的核酸序列。

17.包含权利要求16的多核苷酸的宿主细胞。

18.包含权利要求16的多核苷酸的载体。

19.权利要求18的载体，其是包含与启动子可操作连接的所述多核苷酸的表达载体。

20.包含权利要求18的载体的宿主细胞。

21.一种组合物，其包含权利要求16的多核苷酸和药用赋形剂。

22.一种制备权利要求1的多肽的方法，该方法包括：

提供包含宿主细胞的培养物，该宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，该多核苷酸包含编码该多肽的核酸序列，

在允许所述多肽表达的条件下培养该培养物，并回收所述多肽。

23.根据权利要求22的方法，其中宿主细胞是真核宿主细胞。

24.根据权利要求22的方法，其中宿主细胞是细菌宿主细胞。

25.一种制备偶联物的方法，该方法包括

(i)提供权利要求1的多肽，和

(ii)使至少一个非多肽部分与该多肽连接，其中所得的偶联物表现抗病毒活性。

26.根据权利要求25的方法，其中提供多肽的步骤包括：

在允许多肽表达的条件下培养培养物，并回收多肽。

27.根据权利要求26的方法，其中该宿主细胞是真核宿主细胞或细菌宿主细胞。

28.一种抑制感染病毒的细胞中所述病毒的复制的方法，该方法包括：以可有效抑制细胞中所述病毒的复制的量向细胞施用权利要求1的多肽或权利要求5的偶联物，从而抑制所述细胞中所述病毒的复制。

29.一种减少感染病毒的细胞中所述病毒的拷贝数的方法，该方法包括：以可有效减少细胞中所述病毒的拷贝数的量向细胞施加根据权利要求1的多肽或根据权利要求5的偶联物，从而减少所述细胞中所述病毒的拷贝数。

30.一种降低感染了HCV的患者的血清中HCV RNA水平的方法，包括向患者施用根据权利要求1的多肽或根据权利要求5的偶联物，与开始治疗之前存在的HCVRNA水平相比，所施用的量可有效降低HCV RNA的水平。

31.一种用于降低感染了HBV的患者的血清中HBV DNA水平的方法，包括向患者施用根据权利要求1的多肽或根据权利要求5的偶联物，与开始治疗之前存在的HBV DNA水平相比，所施用的量可以有效降低HBVDNA的水平。

32.一种降低感染了HIV的患者的血清中HIV RNA水平的方法，包括向患者施用权利要求1的多肽或权利要求5的偶联物，与开始治疗之前存在的HIV RNA水平相比，所施用的量可有效降低HIV RNA的水平。

33.用作药物的权利要求1的多肽或权利要求5的偶联物。

34.权利要求1的多肽或权利要求5的偶联物在制备用于抑制感染病毒的细胞中所述病毒的复制的药物中的用途。

35.权利要求1的多肽或权利要求5的偶联物在制备用于减少感染病毒的细胞中所述病毒的拷贝数的药物中的用途。

36.权利要求1的多肽或权利要求5的偶联物在制备用于减少感染病毒的患者血清中所述病毒的水平的药物中的用途。

37.权利要求34-36中任一项的用途，其中所述病毒是HCV、HBV或HIV。