KR20050086498A - 인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체 - Google Patents

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KR20050086498A
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필립 에이 패튼
스리드하르 고빈다라잔
스리드하르 비스와나탄
토벤 로우에스가드 니센
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맥시겐, 인크.
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Abstract

본 발명은 인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체, 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 이들 폴리펩티드, 접합체 및 핵산을 포함하는 조성물; 폴리펩티드, 접합체 및 핵산을 포함하거나 발현하는 세포; 폴리펩티드, 접합체 및 핵산의 제조 방법; 및 폴리펩티드, 접합체 및 핵산의 이용 방법을 포함한다.

Description

인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체{INTERFERON-ALPHA POLYPEPTIDES AND CONJUGATES}
본 발명은 일반적으로 폴리뉴클레오티드 및 그것으로부터 코딩되는 폴리펩티드, 폴리펩티드의 접합체, 및 벡터, 세포, 항체, 및 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 접합체의 이용 및 생산 방법에 관한 것이다.
인터페론-알파는 사이토킨 유전자의 다양한 나선형-다발 상과(superfamily)의 원이다 (Sprang, S.R. 등 (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:815-827). 인간 인터페론-알파는 아미노산 수준에서 85-98% 서열 동일성을 가지는, 20개 초과의 직렬 복제된 식으로 비대립유전자 유전자 및 의사유전자의 한 부류에 의해 코딩된다 (Henco, K. 등 (1985) J. Mol. Biol. 185: 227-260). 활성 인터페론-알파 단백질을 발현하는 유전자는 유전자 자리에 따라 13개 부류로 분류되었다. 공지된 발현 인간 인터페론-알파 단백질 및 그것의 대립유전자 변이가 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996) J. Interferon 및 Cytokine Res. 16: 181-184]에 표로 나와 있다.
인터페론-알파는 각종 유형의 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났고, 특별하게는 암, 특히 백혈병과 같은 혈액종양과 종종 연관되는 다양한 세포 증식 장애들의 치료에 유용하다. 이 단백질은 다발성 골수종, 만성 림프성 백혈병, 저등급 림프종, 카포시 육종, 만성 골수성 백혈병, 신장-세포 암종, 방광 종양 및 난소 암에 대항하는 증식억제 활성을 나타냈다 (Bonnem, E.M. 등 (1984) J. Biol. Reaction Modifiers 3:580; Oldham, R.K. (1985) Hospital Practice 20:71).
인터페론-알파는 또한 각종 유형의 바이러스성 감염들에 대해서도 유용하다 (Finter, N.B. 등 (1991) Drugs 42(5):749). 인터페론-알파는 유두종 감염, B형 간염, 및 C형 간염 감염에 대해서 활성을 가진다 (Finter, N.B. 등, 1991, 이하 상기와 동일함; Kashima, H. 등 (1988) Laryngoscope 98:334; Dusheiko, G.M. 등 (1986) J. Hematology 3 (별책 2):S199; Davis, GL 등 (1989) N. England J. Med. 321: 1501). 특정 자동면역 및 염증성 질병의 병인(pathogenesis)에 있어서의 인터페론 및 인터페론 수용체의 역할이 또한 조사되었다 (Benoit, P. 등 (1993) J. Immunol. 150(3):707).
이 단백질은 수많은 질병들의 치료에 있어 치료적 가치를 가지나, 그것은 의약으로 사용하기에 최적화되지 않았다. 예를 들어, 투약량-제한적 독성, 수용체 교차-반응성 및 짧은 혈청 반감기는 이 사이토킨의 임상적 유용성을 상당히 감소시킨다 (Dusheiko, G. (1997) Hepatology 26:112S-121S; Vial, T. 및 Descotes, J. (1994) Drug Experience 10:115-150; Funke, I. 등 (1994) Ann. Hematol. 68:49-52; Schomburg, A. 등 (1993) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 119:745-755). 인터페론 투여에 동반되는 다양하고 중한 부작용 프로파일은 독감같은 증상, 피곤, 환각, 고열, 간 효소 상승, 및 백혈구감소증을 포함한다 (Pontzer, C.H. 등 (1991) Cancer Res. 51:5304; Oldham, 1985, 이하 상기와 동일함).
C형 간염 바이러스(HCV)는 매우 높은 복제율을 갖는 비숙주 통합 RNA 바이러스이고, 이에 따라 큰 유전적 다양도와 관련된다. 6가지 이상의 유전자형 및 30가지 초과의 서브유형의 HCV RNA가 동정되었다. HCV 유전자형은 IFN-알파 치료에 대한 반응의 예측자인 것으로 나타났다. HCV 유전자형 2 및 3으로 감염된 환자는 일반적으로 인터페론 치료에 잘 반응하는 것으로 나타났다. 유전자형 4, 5 및 6에 감염된 환자는 덜 잘 반응하는 경향이 있다. HCV 유전자형 1에 감염된 환자는 인터페론 치료에 매우 열악하게 반응하는 경향이 있고, 유전자형 1 환자 중 약 50%는 IFN-알파 치료에 대해 "무반응자"인 것으로 분류된다. 유전자형 1은 현재 가장 우세적인 형태의 C형 간염이고, 미국 환자들 중 대략 70%가 감염되어 있으며, 유럽 환자들 중 50%가 감염되어 있다. 명백히, 특히 유전자형 1 변화의 HCV 감염에 대해 더욱 효과적인 치료법이 매우 요망된다.
유전자형 1 HCV (및 기타 서브유형)는 dsRNA-활성화 세린/트레오닌 단백질 키나제 PKR과 같은 핵심 IFN 반응성 단백질을 억제함으로써 IFN-알파 신호전달 경로를 활성적으로 약화시킨다는 유전적 및 생화학적 증거가 있다 (Katze M.G. 등 (2002) Nat. Rev. Immunol. 2(9):675-687). 항바이러스성 반응의 활성 억제 및 상기 유전적 다양성의 가능한 한 결과로서, HCV (특히 유전자형 1)는 숙주의 면역 감시를 피하는 능력을 가지고, 이에 따라 만성 감염율이 높게 된다. HCV의 심한 유전적 이질성은 임상적 코스의 변화, 백신 개발의 어려움 및 치료에 대한 반응 결여를 가능히 초래할 수 있는 중요한 진단 및 임상적 관련을 가진다.
본 발명은 증진된 항바이러스성 및/또는 면역조절 효능을 나타내는 인터페론-알파 분자의 필요를 주장한다. 본 발명은 신규 인터페론-알파 폴리펩티드 및 폴리펩티드 접합체, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 그러한 분자의 이용 방법을 제공한다. 그러한 분자는 예컨대, 치료적 및 예방적 치료, 특히 HCV와 같은 바이러스성 감염에 대한 치료적 및 예방적 치료를 포함하는 각종 용도들에서 이로운 유용성을 가진다. 본 발명은 상기 필요 및 기타 필요를 충족한다.
발명의 개요
본 발명은 변이체 및 융합 폴리펩티드를 포함하는 신규 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기에 공유결합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드들 중 임의의 것을 코딩하는 핵산, 및 그러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포를 제공한다. 부가적으로, 본 발명은 그러한 폴리펩티드, 접합체 및 핵산의 생산 및 이용 방법, 및 추가적 고찰 시에 분명해지는 다른 특성들을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 것들 중 하나로서 동정되는 서열을 포함하는 단리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다: 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103 및 서열번호 104).
본 발명은 또한 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나, 예컨대 예를 들어 서열번호 1-15, 47 또는 53 중 하나 (예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53)로부터, 0-16 아미노산 위치 (예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 0-14 아미노산 위치, 0-12 아미노산 위치, 0-10 아미노산 위치, 0-8 아미노산 위치, 0-6 아미노산 위치, 0-5 아미노산 위치, 0-4 아미노산 위치, 0-3 아미노산 위치, 0-2 아미노산 위치 또는 0-1 아미노산 위치에서 상이한 서열을 각기 포함하는 단리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 예들에서, 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성 (예컨대, 항바이러스 활성, TH1 분화 활성, 및/또는 증식억제 활성)을 나타낸다. 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 서열번호 1-15, 47 또는 33 중 하나, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나에 대해, 위치 47, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 64, 69, 71, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161, 및 162 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다. 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 하기 것들 중 하나 이상을 포함한다: 위치 47에서의 His 또는 Gln; 위치 51에서의 Val, Ala 또는 Thr; 위치 52에서의 Gln, Pro 또는 Glu; 위치 53에서의 Ala 또는 Thr; 위치 55에서의 Phe, Ser, 또는 Pro; 위치 56에서의 Leu, Val 또는 Ala; 위치 57에서의 Phe 또는 Leu; 위치 58에서의 Tyr 또는 His; 위치 60에서의 Met, Leu 또는 Val; 위치 61에서의 Met 또는 Ile; 위치 64에서의 Thr 또는 Ile; 위치 69에서의 Ser 또는 Thr; 위치 71에서의 Lys 또는 Glu; 위치 72에서의 Asn 또는 Asp; 위치 75에서의 Ala 또는 Val; 위치 76에서의 Ala 또는 Thr; 위치 77에서의 Trp 또는 Leu; 위치 78에서의 Asp 또는 Glu; 위치 79에서의 Glu 또는 Gln; 위치 80에서의 Thr, Asp, Ser, 또는 Arg; 위치 83에서의 Glu 또는 Asp; 위치 84에서의 Lys 또는 Glu; 위치 85에서의 Phe 또는 Leu; 위치 86에서의 Tyr, Cys 또는 Ser; 위치 87에서의 Ile 또는 Thr; 위치 90에서의 Phe, Tyr, Asp 또는 Asn; 위치 93에서의 Met 또는 Leu; 위치 133에서의 Lys 또는 Glu; 위치 140에서의 Ser 또는 Ala; 위치 154에서의 Phe 또는 Leu; 위치 160에서의 Lys 또는 Glu; 위치 161에서의 Arg 또는 Ser; 및 위치 162에서의 Arg 또는 Ser (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 하기 것들 중 하나 이상을 포함한다: His47, Val51, Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133, 및 Ser140 (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 그러한 폴리펩티드는 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104를 포함한다. 본 발명은 또한 이 폴리펩티드들 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 그러한 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 하기 것들로부터 선택되는 치환을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 치환을 포함한다: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, L30C, K31C, R33C, H34C, D35C, R37C, Q40C, E41C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71C, N72C, S74C, A75C, D78C, E79C, T80C, L81C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, E97C, A98C, V100C, M101C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, M112C, N113C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, Q125C, R126C, T128C, L129C, T132C, K133C, K134C, K135C, Y136C, S137C, P138C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161C, L162C, R163C, R164C, K165C 및 E166C (또는 서열번호 1에 대해 동등한 위치), 및 이의 조합.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 하기 것들로부터 선택되는 치환을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 치환을 포함한다: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G1OK, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, L30K, R33K, H34K, D35K, R37K, Q40K, E41K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, D78K, E79K, T80K, L81K, E83K, I87K, F90K, Q91K, N94K, D95K, E97K, A98K, V100K, M101K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, M112K, N113K, V114K, D115K, L118K, R121K, Q125K, R126K, T128K, L129K, T132K, Y136K, S137K, P138K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161K, L162K, R163K, R164K, 및 E166K (또는 서열번호 1에 대해 동등한 위치), 및 이의 조합.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드들 중 임의의 것, 예를 들어 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53)로부터 하나 이상의 리신, 예컨대 K31, K50, K71, K84, K122, K133, K134, K135, K160, 및/또는 K165 (서열번호 1을 기준으로 함)을 제거하는, 한 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 하나 이상의 치환 또는 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실을 포함한다. 제거되는 하나 이상의 리신 잔기(들)는 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, Arg(R) 또는 Gln(Q)로 치환되거나, 결실될 수 있다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드들 중 임의의 것, 예를 들어 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)로부터 하나 이상의 히스티딘, 예컨대 H7, H11, H34, 및/또는 H47 (서열번호 1을 기준으로 함)을 제거하는 한 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 하나 이상의 치환 또는 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실을 포함한다. 제거되는 하나 이상의 히스티딘 잔기(들)는 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, Arg(R) 또는 Gln(Q)로 치환되거나, 결실될 수 있다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 하기 것들로부터 선택되는 치환을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 치환을 포함한다: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N,T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G1OS/T, L9N+H11S/T, G1ON+R12S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21S/T, Q20N+R22S/T, R22N+I24S/T, R23N, R23N+S25T, I24N+L26S/T, S25N+F27S/T, L26N, L26N+S28T, S28N+L30S/T, L30N+D32S/T, K31N+R33S/T, R33N+D35S/T, H34N+F36S/T, D35N+R37S/T, R37N+P39S/T, Q40N+E42S/T, E41N+F43S/T, E42N+D44S/T, D44N+N46S/T,F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51S/T, K50N+Q52S/T, V51N+A53S/T, Q52N+I54S/T, E59N+M61S/T, Q62N, Q62N+T64S, Q63N+F65S/T, F68S/T, S69N+K71S/T, T70N+N72S/T, K71N, K71N+S73T, S74T, S74N+A76S/T, A75N+W77S/T, D78N, D78N+T80S, E79N+L81S/T, T80N+L82S/T, L81N+E83S/T, E83N+F85S/T, K84N+Y86S/T, I87N+L89S/T, F90N+Q92S/T, Q91N+M93S/T, L96S/T, D95N+E97S/T, E97N+C99S/T, A98N+V100S/T, V100N+Q102S/T, M1OlN+E103S/T, Q102N+V104S/T, E103N+G105S/T, V104N+V106S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P110S/T, L111N+N113S/T, M112N+V114S/T, N113N+D115S/T, V114N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L118N+V120S/T, R121N+Y123S/T, K122N+F124S/T, Q125N+I127S/T, R126N, R126N+T128S, T128N+Y130S/T, L129N+L131S/T, T132N+K134S/T, K133N+K135S/T, K134N+K136S/T, K135N, K135N+S137T, Y136N+P138S/T, P138N, P138N+S140T, A146N+I148S/T, M149N, M149N+S151T, R150N+F152S/T, S153N, S153N+S155T, F154N+F156S/T, Q159S/T, K160N+L162S/T, K161N+L163S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T 및 R164N+E166S/T (또는 서열번호 1에 대해 동등한 위치), 및 이의 조합.
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드, 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 복합체, 및 그러한 폴리펩티드의 제조 및 이용 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나, 예를 들어, 서열번호 1-15, 47, 및 53 중 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)에 대해, 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 각기 포함하는 단리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성 (예컨대, 항바이러스 활성, TH1 분화 활성, 및/또는 증식억제 활성)을 나타낸다. 일부 예에서, 서열은 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)에 대해 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97%이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 동일성을 가진다. 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 예컨대, 서열번호 1-15 중 하나를 기준으로 한 위치 47, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 64, 69, 71, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161, 및 162 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다. 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 하기 것들 중 하나 이상을 포함한다: 위치 47에서의 His 또는 Gln; 위치 51에서의 Val, Ala 또는 Thr; 위치 52에서의 Gln, Pro 또는 Glu; 위치 53에서의 Ala 또는 Thr; 위치 55에서의 Phe, Ser 또는 Pro; 위치 56에서의 Leu, Val 또는 Ala; 위치 57에서의 Phe 또는 Leu; 위치 58에서의 Tyr 또는 His; 위치 60에서의 Met, Leu 또는 Val; 위치 61에서의 Met 또는 Ile; 위치 64에서의 Thr 또는 Ile; 위치 69에서의 Ser 또는 Thr; 위치 71에서의 Lys 또는 Glu; 위치 72에서의 Asn 또는 Asp; 위치 75에서의 Ala 또는 Val; 위치 76에서의 Ala 또는 Thr; 위치 77에서의 Trp 또는 Leu; 위치 78에서의 Asp 또는 Glu; 위치 79에서의 Glu 또는 Gln; 위치 80에서의 Thr, Asp, Ser, 또는 Arg; 위치 83에서의 Glu 또는 Asp; 위치 84에서의 Lys 또는 Glu; 위치 85에서의 Phe 또는 Leu; 위치 86에서의 Tyr, Cys 또는 Ser; 위치 87에서의 Ile 또는 Thr; 위치 90에서의 Phe, Tyr, Asp 또는 Asn; 위치 93에서의 Met 또는 Leu; 위치 133에서의 Lys 또는 Glu; 위치 140에서의 Ser 또는 Ala; 위치 154에서의 Phe 또는 Leu; 위치 160에서의 Lys 또는 Glu; 위치 161에서의 Arg 또는 Ser; 및 위치 162에서의 Arg 또는 Ser (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 하기 것들 중 하나 이상을 포함한다: His47, Val51, Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133, 및 Ser140 Ser (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 폴리펩티드는 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104로부터 선택되는 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드들 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 그러한 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 모 폴리펩티드의 변이체로서, 모 폴리펩티드 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 위치에서 모 폴리펩티드 서열과 상이한 변형 서열을 각기 갖는 변이체인 단리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 여기에서 모 폴리펩티드 서열은 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나, 예를 들어 서열번호 1-15, 47, 및 53 중 하나, 예컨대 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53이다. 일부 예에서, 변이체는 인터페론-알파 활성 (예컨대, 항바이러스 활성, TH1 분화 활성, 및/또는 증식억제 활성)을 나타낸다. 일부 예에서, 변형 서열은 1-16 아미노산 위치 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 1-14 아미노산 위치, 1-12 아미노산 위치, 1-10 아미노산 위치, 1-8 아미노산 위치, 1-6 아미노산 위치, 1-5 아미노산 위치, 1-4 아미노산 위치, 1-3 아미노산 위치, 또는 1-2 아미노산 위치에서의 모 폴리펩티드 서열과 상이하다. 일부 예에서, 변형 서열은 서열번호 1-15 중 하나에 대해, 위치 47, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 64, 69, 71, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161, 및 162 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다. 일부 예에서, 변형 서열은 하기 것들 중 하나 이상을 포함한다: 위치 47에서의 His 또는 Gln; 위치 51에서의 Val, Ala 또는 Thr; 위치 52에서의 Gln, Pro 또는 Glu; 위치 53에서의 Ala 또는 Thr; 위치 55에서의 Phe, Ser, 또는 Pro; 위치 56에서의 Leu, Val 또는 Ala; 위치 57에서의 Phe 또는 Leu; 위치 58에서의 Tyr 또는 His; 위치 60에서의 Met, Leu 또는 Val; 위치 61에서의 Met 또는 Ile; 위치 64에서의 Thr 또는 Ile; 위치 69에서의 Ser 또는 Thr; 위치 71에서의 Lys 또는 Glu; 위치 72에서의 Asn 또는 Asp; 위치 75에서의 Ala 또는 Val; 위치 76에서의 Ala 또는 Thr; 위치 77에서의 Trp 또는 Leu; 위치 78에서의 Asp 또는 Glu; 위치 79에서의 Glu 또는 Gln; 위치 80에서의 Thr, Asp, Ser, 또는 Arg; 위치 83에서의 Glu 또는 Asp; 위치 84에서의 Lys 또는 Glu; 위치 85에서의 Phe 또는 Leu; 위치 86에서의 Tyr, Cys 또는 Ser; 위치 87에서의 Ile 또는 Thr; 위치 90에서의 Phe, Tyr, Asp 또는 Asn; 위치 93에서의 Met 또는 Leu; 위치 133에서의 Lys 또는 Glu; 위치 140에서의 Ser 또는 Ala; 위치 154에서의 Phe 또는 Leu; 위치 160에서의 Lys 또는 Glu; 위치 161에서의 Arg 또는 Ser; 및 위치 162에서의 Arg 또는 Ser(위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 변형 서열은 하기 것들 중 하나 이상을 포함한다: His47, Val51, Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133, 및 Ser140, (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 그러한 변이체는 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104로부터 선택되는 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 이 변이체들 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 이 변이체들 중 임의의 것을 코딩하는 핵산, 및 그러한 변이체의 생산 방법을 제공한다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 모 인터페론-알파 폴리펩티드의 변이체로서, 각기 서열 하나 이상의 아미노산 위치에서의 모 인터페론-알파 폴리펩티드와 상이한 변형 서열을 포함하는 변이체인 단리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 여기에서 변형 서열은 하기 것들 중 하나 이상을 포함한다: His47, Val51, Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133, 및 Ser140 (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 모 인터페론-알파 폴리펩티드 서열은 자연 발생 인간 인터페론-알파, 예컨대 서열번호 31 내지 서열번호 42 또는 서열번호 32+R23K, 또는 비자연 발생 (즉, 합성) 인터페론-알파, 예컨대 서열번호 43의 서열이다. 일부 예에서, 변형 서열은 1-16 아미노산 위치 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 1-14 아미노산 위치, 1-12 아미노산 위치, 1-10 아미노산 위치, 1-8 아미노산 위치, 1-6 아미노산 위치, 1-5 아미노산 위치, 1-4 아미노산 위치, 1-3 아미노산 위치, 또는 1-2 아미노산 위치에서의 모 인터페론-알파 폴리펩티드 서열과 상이하다. 일부 예에서, 변이체는 인터페론-알파 활성 (예컨대, 항바이러스 활성, TH1 분화 활성, 및/또는 증식억제 활성)을 나타낸다. 본 발명은 또한 이 변이체들 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 및 그러한 변이체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 상기 기재된 (변이체를 포함하는) 본 발명의 폴리펩티드들 중 임의의 것, 및 그 폴리펩티드의 결합기에 결합된 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체로서, 인터페론-알파 활성을 나타내는 접합체를 제공한다. 일부 예에서, 비폴리펩티드 부분기는 중합체 (예컨대, PEG 또는 mPEG), 또는 당 부분기이다. 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기는 시스테인, 리신, 폴리펩티드의 N-말단 아미노기, 폴리펩티드의 생체내 글리코실화 부위에 결합될 수 있다. 본 발명은 또한 그러한 접합체의 생산 및 이용 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 (변이체를 포함하는) 폴리펩티드들 중 임의의 것을 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 바이러스-감염된 세포에서의 바이러스 복제의 억제 방법으로서, 바이러스-감염된 세포를 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 바이러스-감염된 세포에서의 바이러스의 복사체의 수를 감소시키는 방법으로서, 바이러스-감염된 세포를 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 기타 목적들 및 특성들은 첨부 도면들과 함께 하기 발명의 상세한 설명을 통해 더욱 충분히 분명해질 것이다.
도 1A 및 1B는 IFN-알파 처리에 따른 HCV-감염된 세포로부터의 바이러스 제거율에 대한 이상(biphasic) 경시 과정을 나타낸다 (A. 무반응자 동력학적 성질; B. 반응자 동력학적 성질).
도 2는 하기 인간 인터페론-알파 폴리펩티드 서열과의 본 발명의 폴리펩티드 서열 (서열번호 1)의 배열을 나타낸다: huIFN-알파 1a (서열번호 31), huIFN-알파 2b (서열번호 32), huIFN-알파 4b (서열번호 33), huIFN-알파 5 (서열번호 34), huIFN-알파 6 (서열번호 35), huIFN-알파 7 (서열번호 36), huIFN-알파 8b (서열번호 37), huIFN-알파 1Oa (서열번호 38), huIFN-알파 14a (서열번호 39), huIFN-알파 16 (서열번호 40), huIFN-알파 17b (서열번호 41) 및 huIFN-알파 21b (서열번호 42). huIFN-알파 서열에 대한 네이밍 약정은 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996) J. Interferon 및 Cytokine Res. 16: 181-184]에 따른다. 화살표는 서열번호 31 내지 서열번호 42 중 어느 곳에도 존재하지 않는, 서열번호 1의 잔기 His47, Val51, Phe55, Leu56, Tyr58, Lys133, 및 Ser140을 가리킨다. 서열번호 1과 일치하는 서열번호 31-42에서의 아미노산 잔기 위치는 마침표(.)로 표시되고, 서열 내의 갭은 대쉬(-)로 표시된다.
도 3은 BLOSUM62 행렬, 갭 개방 패널티 11, 갭 신장 패널티 1의 변수들을 이용하는, huIFN-알파 14a (서열번호 39)과의 본 발명의 폴리펩티드의 서열 (서열번호 3)의 배열을 나타낸다 (LeIF H; Goeddel 등 (1981) Nature 290: 20-26). 서열번호 3과 일치하는 서열번호 39에서의 아미노산 위치는 마침표(.)로 표시된다.
도 4는 인간 인터페론-알파 폴리펩티드 서열, 서열번호 31 내지 서열번호 42과의 본 발명의 폴리펩티드의 서열 (서열번호 8)의 배열을 나타낸다. 서열번호 8과 일치하는 서열번호 31-42에서의 아미노산 잔기 위치는 마침표(.)로 표시되고, 서열에서의 갭은 대쉬(-)로 표시된다.
도 5는 하기 변수들을 이용하여, huIFN-알파 14a (서열번호 39)과의 본 발명의 폴리펩티드의 서열 (서열번호 12)의 배열을 나타낸다 (LeIF H; Goeddel 등 (1981) Nature 290: 20-26): BLOSUM62 행렬, 갭 개방 패널티 11, 갭 신장 패널티 1. 서열번호 12와 일치하는 서열번호 39에서의 아미노산 위치는 마침표(.)로 표시된다.
도 6은 BLOSUM62 치환 행렬을 나타낸다.
도 7A, 7B 및 7C는 하기 변수들을 이용하는, 최적 서열 배열을 결정하기 위한 배열 스코어의 계산예들을 나타낸다: BLOSUM62 행렬, 갭 개방 패널티 = 11, 및 갭 신장 패널티 = 1.
여기에서, 또는 명세서 나머지에 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가(당업자)가 통상 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.
"폴리펩티드 서열" (예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 등)은 관련 부문에 따라서, 자연 발생 아미노산 또는 인공 아미노산 동족체를 포함하는 아미노산의 중합체, 또는 아미노산 중합체를 나타내는 문자열이다. 유전 코드의 퇴화가 생기면, 특이적 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 그것의 상보적 핵산은 폴리펩티드 서열로부터 결정될 수 있다.
"폴리뉴클레오티드 서열" (예컨대, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 등)은 관련 부문에 따라서, 뉴클레오티드 A, C, T, U, G, 또는 다른 자연 발생 뉴클레오티드 또는 인공 뉴클레오티드 동족체를 포함하는 뉴클레오티드의 중합체, 또는 핵산을 나타내는 문자열이다. 주어진 핵산 또는 상보적 핵산은 임의의 특정된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 결정될 수 있다.
주어진 아미노산 중합체 또는 핵산 중합체의 넘버링은, 임의의 주어진 중합체 성분 (예컨대, "잔기"라는 용어로도 칭해지는 아미노산, 뉴클레오티드)의 위치가 주어진 중합체에서의 성분의 실제적 수적인 위치가 아닌, 선택된 아미노산 또는 핵산 중합체에서의 동일 또는 동등한 위치에 대해 표시될 때, 선택된 아미노산 중합체 또는 핵산 중합체의 넘버링에 대해 "상응하거나" 또는 "그것을 기준으로 하게 된다". 이에 따라, 예를 들어, 주어진 폴리펩티드 서열에서의 주어진 아미노산 위치의 넘버링은 기준 서열로 사용된 선택된 폴리펩티드 서열에서의 동일하거나 동등한 아미노산 위치에 상응한다.
"동등한 위치" (예를 들어, "동등한 아미노산 위치 " 또는 "동등한 잔기 위치")는 본원에서 본원에 기재된 배열 알고리즘을 이용하여, 기준 폴리펩티드 서열의 상응하는 위치와 배열된 시험 폴리펩티드 배열의 위치 (예컨대, 아미노산 위치 또는 잔기 위치)로서 정의된다. 시험 폴리펩티드 서열의 동등한 아미노산 위치는 시험 폴리펩티드의 상응하는 위치와 동일한 수적인 위치 번호를 가질 필요는 없다. 한 예로서, 도 2는 각종 공지된 인간 인터페론-알파 폴리펩티드 서열과 함께 배열된 본 발명의 폴리펩티드 서열 (서열번호 1)을 나타낸다. 이 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 번호 47는 서열번호 32의 아미노산 번호 46과 같이 배열되기 때문에, 서열번호 32 (huIFN-알파2b)의 아미노산 위치 번호 46의 동등한 위치에 대한 (즉,"그와 동등한") 아미노산 위치인 것으로 간주된다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 위치 47은 서열번호 32의 아미노산 위치 46에 상응한다. 마찬가지로, 서열번호 1에서의 잔기 H47은 서열번호 5에서의 잔기 Q47에 상응하는 것으로 이해되며, 이에 따라 예를 들어, 서열번호 1에 대한 치환 H47C은 예컨대, 서열번호 5에서의 치환 Q47C에 상응하는 것 등으로 이해될 것이다.
아미노산 위치 및 아미노산 치환을 확인하는데 사용되는 용어는 하기와 같이 설명된다: H47은 기준 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 1에서의 히스티딘(His) 잔기가 차지하는 위치 번호 47을 가리킨다. H47Q는 위치 47의 히스티딘 잔기가 글루타민(Gln) 잔기로 치환되었음을 가리킨다. 대안적 치환은 "/"로 표시되고, 예컨대 H47S/T는 위치 47에서의 히스티딘 잔기가 세린 또는 트레오닌 잔기로 치환된 아미노산 서열을 의미한다. 다수 치환은 "+"로 표시되며, 예컨대 "H47Q+V51S/T"는 위치 47에서의 히스티딘 잔기가 글루타민 잔기로 치환되고, 위치 51에서의 발린 잔기가 세린 또는 트레오닌 잔기로 치환된 아미노산 서열을 의미한다. 결실은 *로 표시된다. 예를 들어, H47*는 위치 47에서의 히스티딘 잔기가 결실되었음을 가리킨다. 2개 이상의 연속적 아미노산의 결실은 다음과 같이 표시될 수 있다: 예컨대, R161*-E166*는 잔기 R161-E166 (경계치 포함(inclusive))의 결실 (즉, 잔기 161, 162, 163, 164, 164, 및 166이 결실됨)을 가리킨다. 삽입은 하기 방식으로 표시된다: 위치 47에 위치한 히스티딘 잔기 다음의 부가적 세린 잔기의 삽입은 H47HS로 표시된다. 조합된 치환 및 삽입은 하기 방식으로 표시된다: 위치 47에서의 히스티딘 잔기의 세린 잔기로의 치환, 및 위치 47 아미노산 잔기 다음의 알라닌 잔기의 삽입은 H47SA로 표시된다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 인용되는 아미노산 잔기의 위치 넘버링은 아미노산 서열 서열번호 1을 기준으로 한다. 모 폴리펩티드의 예 및 변형은 일반적으로 서열 서열번호 1을 기준으로 (또는 또 다른 특정된 서열을 기준으로) 하여 본원에 제공되며, 예들은 본 발명의 다른 폴리펩티드에 속하고, 본원에 기재된 변형은 본원에 기재된 다른 폴리펩티드들 중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에서 이루어질 수 있음을 이해하도록 한다. 이에 따라, 한 예로서, 서열번호 1을 기준으로 한 치환 H47C은 서열번호 5에서의 치환 Q47C 등에 상응하는 것으로 이해하도록 한다.
용어 "인터페론-알파 활성을 나타냄 (또는 가짐)"은, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체가 기준 인터페론-알파 폴리펩티드 (예컨대, 예를 들어, 인간 인터페론-알파 폴리펩티드, 예컨대 본원에 서열번호 32로 동정된 huIFN-알파 2b, 본원에 서열번호 32+R23K로 동정된 huIFN-알파 2a, 본원에 서열번호 37로 동정된 hIFN-알파8b, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 인간 인터페론 알파 폴리펩티드, 예를 들어 본원에서 도 2 및 4에 나와 있는 것들, 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 열거된 것들)에 의해 나타내어지는 하나 이상의 활성을 가진다는 것을 가리키도록 의도된다. 그러한 활성은 예를 들어 하기 것들 중 하나 이상에 의해 증명되는 바와 같이, 인터페론-알파 수용체를 통해 신호전달하는 능력을 포함한다: 바이러스-감염된 세포에서의 바이러스 복제의 억제 ("항바이러스 활성"); 미분화 T-세포의 TH1 표현형으로의 분화의 증진, 및/또는 미분화 T-세포의 TH2 표현형으로의 분화의 억제 ("TH1 분화 활성"); 또는 세포 증식의 억제 ("증식억제 활성"). 하나 이상의 인터페론-알파 활성은 당업계에 공지되고/되거나 실시예들에 기재된 검정법을 이용하여 검정된다.
인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 접합체는, 측정가능한 활성, 예컨대 (예컨대, 당업계에 공지되고/되거나 실시예들에 기재된 검정법에 의해 결정되는) 측정가능한 항바이러스 활성, 증식억제 활성, 또는 TH1 분화 활성을 나타낼 때, 그러한 활성을 가지는 것으로 간주된다. 당업자는 측정가능한 활성을 구성하는 것이, 취해지는 검정법의 성질에 의해 부분적으로 의존하나, 일반적 지침으로서 측정가능한 활성은, 시험 화합물 (예컨대, 본 발명의 폴리펩티드)의 존재 하에서 생성된 검정 신호전달은 시험 화합물의 부재 하에서 생성된 검정 신호전달과 정량가능하게 상이한 활성임을 인식한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 특별한 기준 인터페론-알파의 공지된 모든 활성들을 나타낼 필요는 없거나, 기준 인터페론-알파와 동일한 정도로 상기 활성을 나타냄을 이해하도록 한다. 일부 예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체에 의해 나타내어지는 활성은, (예컨대, EC50, 특이적 활성, 또는 활성과 관련된 기타 값들에 의해 증명된 바와 같이) 기준 인터페론-알파에 의해 나타내어지는 특별한 활성에서보다 대략 동등, 미만 또는 초과할 수 있다.
"변이체"는 모 폴리펩티드 서열의 경우에서와 하나 이상의 아미노산 위치(들)가 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 변이체는 모 폴리펩티드 서열의 잔기들의 총수의 10% 이하, 예컨대 잔기들의 8% 이하, 예컨대 모 폴리펩티드 서열의 잔기들의 총수의 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1 % 이하로, 모 폴리펩티드 서열과 상이한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 변이체는 1-16 아미노산 위치 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 1-15 아미노산 위치, 1-14 아미노산 위치, 1-13 아미노산 위치, 1-12 아미노산 위치, 1-11 아미노산 위치, 1-10 아미노산 위치, 1-9 아미노산 위치, 1-8 아미노산 위치, 1-7 아미노산 위치, 1-6 아미노산 위치, 1-5 아미노산 위치, 1-4 아미노산 위치, 1-3 아미노산 위치, 또는 1-2 아미노산 위치에서의 서열번호 1과 상이한 서열을 포함할 수 있다.
용어 "모 폴리펩티드" 또는 "모 인터페론-알파"는 본 발명에 따라 변형되는 폴리펩티드 서열을 가리키도록 의도된다. 모 폴리펩티드 서열은 자연 발생 IFN-알파 (예컨대, 포유동물의 IFN-알파, 예를 들어 영장류 IFN-알파, 예컨대 인간 IFN-알파, 예컨대 서열번호 31-42, 서열번호 32+R23K로서 본원에서 동정된 huIFN-알파 폴리펩티드, 또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 다른 huIFN-알파 서열의 것)일 수 있다. 모 폴리펩티드 서열은 비자연 발생 (즉,"합성") 인터페론-알파, 예컨대 IFN-알파 Conl (서열번호 43)의 것일 수 있다. 일부 예들에서, 변형되는 모 폴리펩티드는 그 자체가 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나일 수 있다.
대상에 대해 적용되는 "자연 발생"은, 그 대상이 인간에 의해 인공적으로 생산되는 것과는 구별되는 자연적으로 발견될 수 있다는 사실을 가리킨다. 예를 들어, 자연적 원으로부터 단리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 (바이러스, 세균류, 원생동물문, 곤충류, 식물류 또는 포유동물의 조직을 포함하는) 유기체 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적이다. 대상에 대해 적용되는 "비자연 발생" (또한 "합성" 또는 "인공"으로도 일컬어짐)은, 그 대상이 자연 발생적이지 않음, 즉 대상이 인간에 의해 인공적으로 생산되는 것과는 구별되는 자연적으로 발견될 수 없음을 의미한다.
"단편" 또는 "하위서열"은 전체 서열을 포함하지 않는, 전체 서열의 임의의 부분이다. 이에 따라, 단편 또는 하위서열은 아미노산 (예컨대, 폴리펩티드) 또는 핵산 (예컨대, 폴리뉴클레오티드)의 보다 긴 서열의 일부분을 포함하는 아미노산 또는 핵산의 서열을 가리킨다.
본 발명의 의해 고찰되는 한 유형의 단편은 아미노산 잔기가 모 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 (또는 양자 모두)로부터 제거된 단편이고; 그러한 폴리펩티드는 각기 "N-말단으로 끊긴" 또는 "C-말단으로 끊긴" 것으로 간주된다. N-말단으로부터의 적어도 첫 번째 4개의 아미노산의 결실이 인터페론-알파 활성에 상당히 영향을 주지 않음이 공지되어 있다 (Lydon, N.B. 등 (1985) Biochemistry 24: 4131-41). 또한, 7과 11 사이의 아미노산이 C-말단으로부터 결실된, 인터페론-알파 활성을 보유한 변이체가 기재되었다 (Cheetham B.F. 등 (1991) Antiviral Res. 15(1): 27-39; Chang N.T. 등 (1983) Arch. Biochem Biophys. 221 (2): 585-589; Franke A.E. 등 (1982) DNA 1 (3): 223-230).
"수용체" 예컨대, ("I형 인터페론 수용체"로도 공지된) "인터페론-알파 수용체"는, 인터페론-알파에 의해 세포에서 활성화되는 수용체, 예를 들어 인터페론-알파에 결합하여, 세포내 신호전달을 개시하는 수용체, 예컨대 수용체 하위단위 IFNAR-2 및 IFNAR-1을 포함하는 I형 인터페론 수용체이다 (Domanski 등 (1998) J. Biol. Chem. 273(6):3144-3147; Mogensen 등, (1999) Journal of Interferon 및 Cytokine Research, 19:1069-1098). 본 발명의 관련 부문에서, 수용체는 또한 절단된 형태의 전장 수용체 분자, 예를 들어 막-결합 부분이 결여된 수용체 분자, 예컨대 인터페론-알파에 결합하나 막에 반드시 결합하고/하거나 세포내 신호전달을 개시할 필요가 없을 수 있는 세포외 결합 도메인을 포함하는 ("가용성 수용체"로도 알려진) 가용성 형태의 수용체 분자를 포함하는 의미를 가진다.
2개의 분자들 간, 예컨대 리간드 및 수용체 간의 "특이적 결합 친화성"은 분자들의 혼합물에서 한 분자의 또 다른 한 분자에 대한 우세적 결합을 의미한다. 분자의 결합은 전형적으로, 결합 친화성이 약 1×104 M-1 내지 약 1×109 M-1 또는 그 이상일 경우 (즉, 약 10-4 내지 10-9 M 또는 그 이하의 KD) 에 특이적으로 간주된다. 리간드 및 수용체의 결합 친화성은 당업자에게 공지된 표준 기술들에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 공지된 기술들의 비제한적 예는 바이어코어 테크놀로지(Biacore technology) (Biacore AB, 스웨덴 소재), 등온 적정 마이크로칼로리측량 (마이크로칼(MicroCal) LLC, 미국 메사추세츠주 노쓰앰튼 소재), ELISA, 및 FACS를 포함한다. 예를 들어, FACS 또는 다른 분류 방법들이 연관 결합 쌍 원(예를 들어, 가용성 수용체와 같은 수용체)에 특이적으로 결합하는 분자의 집단 (예컨대, 세포 표면-발현 리간드)을 위해 선택하는데 사용될 수 있다. 리간드-수용체 착체는 예컨대, 형광법에 의해 (예컨대, 착체를 인식하는 형광 항체와 착체를 반응시킴으로써) 검출 및 분류될 수 있다. 연관된 결합 쌍 원 (예컨대, 수용체)에 결합하는 관심 분자는 낮은 농도의 수용체의 존재 하에서 풀링 및 재분류된다. 증가하는 농도의 수용체 (예시적 농도 범위는 리간드-수용체 상호작용의 성질에 따라, 약 10-6 M 내지 10-9 M, 즉 1 마이크로몰 농도 (μM) 내지 1 나노몰 농도 (nM), 또는 그 이하임)의 존재 하에서 다수 회의 분류를 수행함으로써, 수용체에 대해 특이적 결합 친화성을 나타내는 관심 분자의 집단을 단리할 수 있다.
폴리펩티드, 핵산, 또는 다른 성분은, 그것이 정상적으로 연합된 성분 (다른 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 (착체, 예컨대 네이티브 서열을 동반할 수 있는 리보솜 및 폴리머라제를 포함함), 핵산, 세포, 합성 시약, 세포 오염물질, 세포 성분 등)으로부터, 예컨대 본래 유도 기원이 되는 세포에서 정상적으로 연관되는 다른 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리될 때, "단리된다". 폴리펩티드, 핵산 또는 다른 성분은, 그것이 성분들의 조성물, 혼합물, 또는 집합물에 존재하는 우세적 종들이도록 하는 (즉, 몰 기준으로 하여, 조성물 내의 다른 임의의 성분들보다 더욱 많도록 하는) 자연 환경의 다른 성분들로부터 부분적으로 또는 완전히 회수 또는 분리될 때, 단리된다. 일부 예에서, 제제는 약 60% 초과, 70% 초과 또는 75% 초과, 전형적으로 약 80% 초과, 또는 바람직하게는 약 90% 초과의 단리된 종들로 구성된다.
"실질적으로 순수한" 또는 "단리된" 핵산 (예컨대, RNA 또는 DNA), 폴리펩티드, 단백질, 또는 조성물은 또한 대상 종 (예컨대, 핵산 또는 폴리펩티드)이 존재하는 모든 거대분자 종들의 약 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 또는 70 중량% 이상 (몰 기준)을 구성함을 의미한다. 실질적으로 순수하거나 단리된 조성물은 또한 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종들의 약 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 또는 95 중량% 이상을 구성할 수 있다. 단리된 대상 종은 또한 본질적으로 동질이도록 정제될 수 있고 (오염 종은 통상적 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음), 여기에서 조성물이 단일 거대분자 종의 유도체로 본질적으로 구성된다. 용어 "정제된"은 일반적으로 핵산, 폴리펩티드, 또는 단백질은 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성시킴을 의미한다. 그것은 전형적으로 핵산, 폴리펩티드, 또는 단백질이 약 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 순도를 가짐을 의미한다.
용어 "단리된 핵산"은 본 발명의 핵산의 유도 기원이 되는 유기체의 자연 발생 게놈에서 즉시적으로 인접하는 코딩 서열의 양자 모두 (즉, 5' 말단에 하나, 또한 3' 말단에 하나)와 즉시적으로 인접하지 않는 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA)을 가리킬 수 있다. 이에 따라, 이 용어는 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성되는 예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA 단편을 포함하며, 이 때 그러한 cDNA 또는 게놈 DNA 단편이 예컨대, 벡터에 혼입되거나, 본래 유도되거나, 부가적 코딩 서열에 연결되어 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 혼성화 유전자를 형성하거나, 임의의 다른 DNA 서열에 대해 독립적인 바이러스를 포함하는 유기종과 동일하거나 상이한 종의 게놈에 통합되는지의 여부는 무관하다. DNA는 이중 나선 또는 단일 나선, 센스 또는 안티센스일 수 있다.
"재조합 폴리뉴클레오티드" 또는 "재조합 폴리펩티드"는 하나 초과의 소스 핵산 또는 폴리펩티드로부터의 핵산 또는 아미노산 서열을 각기 포함할 수 있는 비자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이고, 상기 소스 핵산 또는 폴리펩티드는 자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드이거나, 그 자체가 변이발생 또는 다른 유형의 변형이 가해진 것일 수 있다. 핵산 또는 폴리펩티드는, 그것이 합성 또는 인공적이거나 공학처리될 때, 또는 합성 또는 인공적이거나 공학처리된 폴리펩티드 또는 핵산으로부터 유도될 때, "재조합"으로 간주될 수 있다. 재조합 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA)은, 전형적으로 함께 포함되지 않거나, 전형적으로 상호 연합되지 않거나, 그와 다르게는 전형적으로 상호 분리된 서열의 2개 이상의 세그먼트의 조합 (예컨대, 인공 조합)에 의해 생산될 수 있다. 재조합 핵산은 상이한 소스로부터의 핵산 세그먼트의 조합들 및 그것의 조합을 결합시킴으로써 형성되고/되거나 인공적으로 합성된 핵산 분자를 포함할 수 있다. "재조합 폴리펩티드"는 종종 클로닝 또는 재조합 핵산으로부터 얻어지는 폴리펩티드를 가리킨다. 상이한 핵산 또는 아미노산 서열의 유도 기원이 되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 경우에 따라 동질성이고 (즉, 동일하거나 유사한 구조 및/또는 기능을 코딩하는 폴리펩티드를 가지거나 코딩하고), 종종 유기체의 상이한 단리물질, 혈청형, 균주로부터, 또는 예를 들어 상이한 질병 상태로부터 생긴다.
예컨대, 세포, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 단백질, 또는 폴리펩티드에 대해 사용되는 용어 "재조합"은 전형적으로 세포, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터가 이질성 (또는 외래성) 핵산의 도입, 또는 네이티브 핵산의 변경에 의해 변형되거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드가 이질성 아미노산의 도입에 의해 변형되거나, 또는 세포가 그와 같이 변형된 세포로부터 유도됨을 가리킨다. 재조합 세포는 네이티브 (비재조합) 형태의 세포에서 발견되지 않는 핵산 서열을 발현하거나, 그와 다르게는 비정상적으로 발현되거나, 미비하게 발현되거나, 전혀 발현되지 않은 네이티브 핵산 서열을 발현한다. 세포와 관련하여 사용되는 용어 "재조합"은 세포가 이질성 핵산을 복제하거나, 이질성 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현함을 가리킨다. 재조합 세포는 네이티브 (비재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 재조합 세포는 또한 네이티브 형태의 세포에서 발견되는 코딩 서열을 포함할 수 있고, 여기에서 코딩 서열은 인공 수단에 의해 변형되거나 세포로 재도입된다. 그 용어는 또한 세포로부터 핵산을 제거하지 않으면서 변형된 세포에 대해 내인성인 핵산을 포함하는 세포를 포괄하며; 그러한 변형은 유전자 치환, 부위-특이적 변이, 재조합 및 관련 기술에 의해 수득되는 것들을 포함한다.
용어 "재조합 생산된"은 화학적 합성 수단, 핵산 세그먼트의 재발 서열 재조합 또는 뉴클레오티드의 다른 다양성 형성 방법 (예컨대, 셔플링), 또는 핵산의 단리된 세그먼트의 조작, 예컨대 당업자에게 공지된 유전공학 기술에 의해 주로 달성되는 인공 조합을 가리킨다. "재조합 발현된"은 전형적으로 그것이 발현되거나 퍼지게 될 수 있는 경우, 생체외 재조합 핵산의 생산, 및 재조합 핵산의 생체내, 생체외 또는 세포외 세포로의 전달을 위한 기술을 가리킨다.
"재조합 발현 카세트", 또는 간단히 "발현 카세트"는, 상기 서열과 상용성을 갖는 구조적 유전자의 발현을 수행할 수 있는 핵산 요소와 재조합 또는 합성 형성된 핵산 구축물을 가리킨다. 발현 카세트는 적어도 프로모터, 및 임의적으로는 전사 종결 시그널을 포함한다. 전형적으로, 재조합 발현 카세트는 피전사 핵산 (예컨대, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산), 및 프로모터를 포함한다. 발현을 수행하는데 필요하거나 도움이 되는 부가적 인자들이 또한 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 또한 숙주 세포로부터의 발현된 단백질의 배출을 지시하는 시그널 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유전자 발현에 영향을 주는 전사 종결 시그널, 인핸서, 및 다른 핵산 서열이 또한 발현 카세트에 포함될 수 있다.
"면역원"은 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 가리키고, 이는 예컨대 항원, 자동면역 질병의 유도에서 역할을 하는 자동항원, 및 암 세포에 대해 발현된 종양-관련 항원을 포함한다. 면역 반응은 일반적으로 항원 또는 그것의 단편과 같은 제제, 또는 그러한 제제를 코딩하는 핵산에 대한 세포 또는 항체-매개 반응의 전개를 가리킨다. 일부 예에서, 그러한 반응은 CTL, B 세포, 또는 관심 항원을 발현하는 항원-제시 세포에 대해 특이적인 각종 부류의 T 세포 중 하나 이상, 또는 그것들의 조합의 생산을 포함한다.
"항원"은 숙주에서의 항체 형성, 또는 본 물질에 대해 반응성을 갖는 백혈구세포의 특이적 집단을 형성하도록 할 수 있는 물질을 가리킨다. 항원은 전형적으로 숙주에 대해 외래성을 갖는 거대분자 (예컨대, 단백질 및 다당류)이다.
"보조제"는 약물의 항원의 면역 자극 성질 또는 약물학적 효과(들)를 증진시키는 물질을 가리킨다. 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 비특이적으로 증진시킬 수 있다. "프로인트 완전(Freund's Complete) 보조제"는 예를 들어, 면역원, 유화제 및 미코박테리아를 포함하는 오일 및 물의 에멀션이다. 또 다른 예인 "프로인트 불완전 보조제"는 그와 동일하나, 단 미코박테리아는 없다.
벡터는 선택된 핵산에 의한 세포 형질도입 또는 트랜스펙션, 또는 세포에서의 핵산의 발현을 촉진하기 위한 성분 또는 조성물이다. 벡터는 예컨대, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, YAC, 세균, 폴리-리신 등을 포함한다. "발현 벡터"는 숙주 세포 내에서의 특별한 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특이적 핵산 요소로서, 재조합 또는 합성 형성된 핵산 구축물 또는 서열이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 핵산 단편의 부분일 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 프로모터에 작동가능하게 연결된 피전사 핵산을 포함한다. 피전사 핵산은 전형적으로 프로모터의 지시 또는 조절을 받는다.
"실질적으로 전체 길이의 폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "실질적으로 전체 길이의 폴리펩티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 길이의 50% 이상, 일반적으로는 약 60% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 주로는 약 80% 이상, 또는 전형적으로 약 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 가리킨다.
용어 "면역검정법"은 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항체 또는 면역원을 사용하는 검정법을 포함한다. 면역검정법은 전형적으로 항원을 단리, 표적화 및/또는 정량화하기 위해 특별한 항체의 특이적 결합 성질을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본원에 사용되는 용어 "대상"은 비제한적으로 유기체; 예컨대 인간, 비인간 영장류 (예컨대, 비비, 오랑우탄, 원숭이), 마우스, 돼지, 소, 염소, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 말, 원숭이, 양 또는 다른 비인간 포유동물을 포함하는 포유동물; 예컨대 조류 (예컨대, 닭 또는 오리) 또는 어류와 같은 비포유동물의 척추동물문 및 비포유동물의 비척추동물문 을 포함하는 비포유동물을 포함한다.
용어 "약제학적 조성물"은 동물 또는 인간을 포함하는 대상에게 약학적으로 사용하기에 적당한 조성물을 의미한다. 약제학적 조성물은 일반적으로 유효량의 활성제, 및 예컨대 약학적으로 허용가능한 담체를 비롯한 담체를 포함한다.
용어 "유효량"은 원하는 결과를 얻기 위해 충분한 투약량 또는 양을 의미한다. 원하는 결과는 투약량 또는 양의 수령자에 있어 객관적 또는 주관적 향상을 포함할 수 있다.
"예방적 처리"는 질병, 병리, 또는 의료 장애의 징후 또는 증세를 나타내지 않거나, 질병, 병리 또는 장애의 단지 초기 징후 또는 증세만을 나타내는 대상에 대해 적용되는 처리로서, 그러한 처리는 질병, 병리, 또는 의료 장애가 전개될 위험을 감소, 예방 또는 저하시킬 목적으로 적용된다. 예방적 처리는 질병 또는 장애로부터 예방하기 위한 처리로서 작용한다. "예방적 활성"은, 병리, 질병 또는 장애의 징후 또는 증세를 나타내지 않거나, 병리, 질병, 또는 장애의 단지 초기 징후 또는 증세만을 나타내는 대상에게 투여 시에, 대상에 대해 병리, 질병, 또는 장애가 전개될 위험을 감소, 방지 또는 저하시키는, 핵산, 벡터, 유전자, 폴리펩티드, 단백질, 물질, 또는 그것의 조성물과 같은 제제의 활성이다. "예방적으로 유용한" 제제 또는 화합물 (예컨대, 핵산 또는 폴리펩티드)은 병리, 질병 또는 장애의 전개를 감소, 예방, 처리 또는 저하시키는데 유용한 제제 또는 화합물을 가리킨다.
"치료적 처리"는 병리, 질병, 또는 장애의 증세 또는 징후를 나타내는 대상에게 적용되는 처리로서, 그 처리는 병리, 질병, 또는 장애의 상기 징후 또는 증세를 감소 또는 제거하기 위한 목적으로 대상에게 적용된다. "치료적 활성"은 병리, 질병 또는 장애의 징후 또는 증세가 있는 대상에게 투여 시에, 상기 징후 또는 증세를 제거 또는 감소시키는 핵산, 벡터, 유전자, 폴리펩티드, 단백질, 물질, 또는 그것의 조성물과 같은 제제의 활성이다. "치료적으로 유용한" 제제 또는 화합물 (예컨대, 핵산 또는 폴리펩티드)은 병리, 질병 또는 장애의 상기 징후 또는 증세를 감소, 치료 또는 제거하는데 유용한 제제 또는 화합물을 가리킨다.
용어 "유전자"는 광범위하게, 생물학적 기능과 연관된 DNA의 임의의 세그먼트를 가리킨다. 유전자는 그것의 발현에 필요한 코딩 서열 및/또는 조절 서열을 포함한다. 유전자는 또한 예컨대, 다른 단백질 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 조절 영역)에 대한 인식 서열을 형성하는 비발현 DNA 핵산 세그먼트를 포함한다. 유전자는 관심 소스로부터의 클로닝 또는 공지되거나 예측되는 서열로부터 합성하는 것을 포함하는 다양한 소스로부터 수득될 수 있고, 원하는 변수를 갖도록 고안된 서열을 포함할 수 있다.
일반적으로, 이후 사용되는 명명법 및, 이후 기술되는 세포 배양, 분자 유전학, 분자 생물학, 핵산 화학 및 단백질 화학에서의 실험실 절차는 공지되어 있으며, 당업자에게 의해 통상 이용되는 것들이다. [Sambrook 등, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (제2판), 제1-3권, Cold Spring Harbor Laboratory, 미국 뉴욕주 콜드 스프링 하버 소재, 1989] (이후 "Sambrook"라고 함) 및 [Current Protocol in Molecular Biology, F. M. Ausubel 등 편저, Current Protocol, Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc.의 합작 사업 (1994년, 1999년까지 보완)] (이후 "Ausubel")에 기재된 기술과 같은 표준 기술은, 재조합 핵산 방법, 핵산 합성, 세포 배양 방법, 및 전이유전자 혼입, 예컨대 전기충격, 주입, 유전자 총, 피부 인각 및 지질트랜스팩션에 사용된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성 및 정제 단계는 명세서에 따라 수행된다. 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 통상적인 방법, 및 본 문헌 전반에 걸쳐 제공되는 일반적 참고문헌들에 따라 수행된다. 거기에서의 절차는 당업자에게 공지된 것으로 판단되며, 독자의 편의를 위해 제공된다.
본원에 사용되는 "항체"는 면역글로불린 유전자의 면역글로불린 유전자 또는 단편에 의해 실질적으로 또는 부분적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 가리킨다. 용어 항체는 전체 항체 및 그것의 결합 단편을 의미하도록 사용된다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변 부위 유전자, 및 무수한 면역글로불린 가변 부위 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 이는 다시 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE을 각기 정의한다. 전형적인 면역글로불린 (예컨대, 항체) 구조 단위는 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 2개의 동일 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 그 각 쌍은 하나의 "경" (약 25 KDa) 및 하나의 "중" 사슬 (약 50-70 KDa)을 가진다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 초래하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 부위를 한정한다. 용어 "가변성 경쇄(VL) 및 가변성 중쇄(VH)"는 경 및 중쇄를 각기 가리킨다.
항체는 또한 단일 암 복합 단클론성 항체, 가변성 중 및 가변성 경쇄가 (직접적으로 또는 펩티드 연결기를 통해) 함께 결합되어 연속 폴리펩티드를 형성하는 단일 사슬 Fv (sFv) 항체를 포함하는 단일 사슬 항체, 및 이항체, 삼항체 및 사항체를 포함한다 (Pack 등 (1995) J Mol Biol 246: 28; Biotechnol 11:1271; 및 Biochemistry 31: 1579). 항체는 예컨대, 다클론성, 단클론성, 키메라, 인간화된 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편 등이다.
용어 "에피토프"는 항체에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면기로 주로 구성되며, 주로 특이적 3차원적 구조적 특성, 또한 특이적 전하 특성을 가진다. 입체적 및 비입체적 에피토프는, 후자에 대해서는 결합하지 않으나, 전자에 대해 결합하는 것이 변성화 용매의 존재 하에서 소실된다는 점에서 구별된다.
항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 항체의 펩티드 또는 폴리펩티드 단편이다. 항원-결합 부위는 항원의 결합에 기여하거나, 그것과 관련되거나, 그것에 영향을 주는 아미노산들에 의해 형성된다. 이에 대해, [Scott, T.A. 및 Mercer, E.I., Concise Encyclopedia: Biochemistry and Molecular Biology (de Gruyter, 제3판, 1997), 및 Watson, J.D. 등, Recombinant DNA (제2판, 1992)] [이후,"와트슨(Watson) 재조합 DNA"라고 함]을 참고하며, 그 각 문헌의 내용은 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참고 인용된다.
용어 "선별(screening)"은 일반적으로 본 발명의 최적 분자, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드 및, 그것을 포함하는 관련 융합 폴리펩티드, 및 그러한 모든 분자들을 코딩하는 핵산을 동정하는 공정을 가리킨다. 개별적 분자의 수가지 성질들은 선택 및 선별에 사용될 수 있으며, 그러한 성질은 예를 들어 리간드 결합 또는 수용체에 대한 결합, 또는 세포 증식 억제, 바이러스-감염된 세포에서의 바이러스 복제의 억제, 세포내 사이토킨 생산의 유도 또는 억제, 면역 반응의 변경, 예컨대 시험계 또는 생체외, 세포외 또는 생체내 적용에서의 원하는 면역 반응의 유도 또는 억제의 개별적 분자의 능력이다. 항원의 경우, 항원 발현, 폴딩, 안정성, 면역원성 및 수가지 관련 항원으로부터 에피토프의 존재를 포함하여, 항원의 수가지 성질들은 선택 및 선별에 사용될 수 있다.
"선택"은 예컨대 일부 유전적 환경 하에서, 마커를 발현하는 세포는 생존시키나 다른 세포는 사멸시키는 (또는, 그 역) 선택 마커의 발현에 의해, 동정 및 물리적 분리가 동시에 달성되는 형태의 선별이다. 선별 마커는 예를 들어, 루시페라제, 베타-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질 등을 포함한다. 선택 마커는 약물 및 내독소 유전자 등을 포함한다. 또 다른 방식의 선택은 리간드의 수용체에 대한 결합, 기질의 효소와의 반응, 또는 검출가능한 시그널을 직접적으로 (예컨대, 발색성 기질 또는 리간드를 이용함으로써) 또는 간접적으로 (예컨대, 발색성 2차 항체와 반응시킴으로써) 형성시킬 수 있는 임의의 다른 물리적 방법과 같은 검출가능한 이벤트를 기초로 한 물리적 분류를 포함한다. 물리적 분류에 의한 선택은 전체 세포 또는 미세소적 형식에서의 FACS에 의한 것과 같은 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용되는 "외인성" 핵산, "외인성 DNA 세그먼트", "이질성 서열" 또는 "이질성 핵산"은 특별한 숙주 세포에 대해 외래성인 소스로부터 기원하는 것, 또는 동일한 소스로부터 기원하는 경우에는 그것의 본래의 형태로부터 변형된 것이다. 이에 따라, 숙주 세포에서의 이질성 유전자는 특별한 숙주 세포에 대해 내인성이나, 변형된 유전자를 포함한다. 본원에 기재된 용도들에서의 이질성 서열의 변형은 전형적으로 재발성 서열 재조합을 사용함에 따라 일어난다. 그 용어들은 세포에 대해 외래성 또는 이질성이거나, 세포와 동종성이나, 요소가 본래 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내에서의 위치에 있는 DNA 세그먼트를 가리킨다. 외인성 DNA 세그먼트는 발현되어, 외인성 폴리펩티드를 생성시킨다.
용어 "핵산"은 단일 또는 이중 나선 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그것의 중합체를 가리킨다. 특별히 제한되지 않는 한, 그 용어는 기준 핵산과 동일한 결합 성질을 가지고, 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 동족체를 포함하는 핵산을 포괄한다. 달리 지시되지 않는 한, 특별한 핵산 서열은 또한 함축적으로 그것의 보존적으로 변형된 변이체 (예컨대, 퇴화 코돈 치환) 및 상보적 서열, 및 명백히 나타내어지는 서열을 포괄한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다 (Batzer 등 (1991) Nucleic Acid Res 19: 5081; Ohtsuka 등 (1985) J Biol Chem 260: 2605-2608; Cassol 등 (1992); Rossolini 등 (1994) Mol Cell Probes 8: 91-98). 용어 핵산은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 코딩되는 mRNA와 상용된다.
"유전자로부터 유도된 핵산"은 궁극적으로 주형으로 사용된 유전자 또는 그것의 하위서열로 합성되는 핵산을 가리킨다. 이에 따라, mRNA, mRNA로부터 역전사된 cDNA, 그 cDNA로부터 전사된 RNA, cDNA로부터 증폭된 DNA, 그 증폭된 DNA로부터 전사된 RNA 등은 모두 유전자로부터 유도되며, 그러한 유도 생성물의 검출이 샘플 내에서의 원래의 유전자 및/또는 유전자 전사체의 존재 및/또는 풍부함의 척도가 된다. 핵산은, 그것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이게 될 때, "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는, 그것이 코딩 서열의 전사를 증가시킬 때, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된다는 것은, 연결되어 있는 DNA 서열이 전형적으로 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결할 필요가 있는 경우에는 인접하고 해독 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 일반적으로 수개의 킬로염기들에 의해 프로모터로부터 분리될 때 기능하고, 인트론 서열이 가변성 길이를 가질 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결되나 인접할 수 있다.
용어 "사이토킨"은, 예를 들어, 인터류킨, 인터페론, 케모킨, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자 및 전환 성장 인자를 포함한다. 일반적으로 이것들은 면역계 세포의 성숙, 활성화, 증식 및 분화를 조절하는 저분자량 단백질이다.
본 명세서 및 청구범위에서, 하나의(a) 성분, 예컨대 비폴리펩티드 부분기, 아미노산 잔기, 치환, 완충액, 양이온 등의 관련 부문에서의 성분에 관한 임의의 언급은, 달리 지시되지 않거나, 특별한 관련 부문으로부터 그 경우가 아니라는 것이 명백하지 않는 한, 그러한 성분들 중 하나 이상(복수)을 가리키도록 의도된다. 예를 들어, 표현 "A, B 및 C로 구성되는 군으로부터 선택되는 성분"은 A, B 및 C의 모든 조합들, 예컨대 A, B, C, A+B, A+C, B+C 또는 A+B+C를 포함하는 것으로 의도된다.
각종 부가적 용어들은 본원에서 정의되거나 달리 특정된다.
본 발명의 분자 및 방법
만성 HCV에 감염된 환자는 치료 이전에, 전형적으로 HCV RNA/ml의 혈청의 104-107개 복사체 범위의 바이러스 부하를 가진다. IFN-알파 치료 시에, 이 환자에서의 바이러스 부하는 특징적으로 2개의 독특한 로그-선형 상태의 기울기를 가진다 (도 1B; Neumann A.U. 등 (1998) Science 282:103-107). IFN-알파 치료의 첫 번째 2일 내에 일어나는 바이러스 부하의 초기 급속 하락은, 감염된 간 세포에서의 바이러스 생성의 인터페론-알파 매개 감소 및 감염에 대한 미분화 세포의 동시 보호에 기인하는 것으로 판단된다. 바이러스 생성율은 약 2일째에 새로운 정상기(steady state)에 도달하며, 이 때 2번째 덜 급속한 로그-선형 상태의 바이러스 제거율이 관찰된다. 이 두 번째 상태의 바이러스 제거율은 감염된 간 세포의 일반적으로 T-세포 매개 사멸로 부분적으로 기인하는 것으로 판단된다 (Neumann 등, 이하 상기와 동일함). IFN-알파는 항원 TH1 세포로 분화시키기 위한 특이적 T 세포의 자극을 통한 상기 생물학적 반응에서 핵심적 역할을 하는 것으로 판단된다. 또한, 리바비린(Ribavirin)의 작용 방식은 TH1 반응의 강화에 기인하는 것으로 판단되며, IFN-알파를 이용하는 조합 치료에서 그 효능의 기계작용적 기초가 되는 것으로 사료된다. 현재 사용되고 있는 인터페론-알파 치료법에 비반응성인 HCV-감염 환자 (일반적으로 "무반응자"라고 함)는 더욱 얕은 바이러스 부하 제거율 프로파일을 나타낸다 (도 1A).
본 발명이 기본적 메커니즘의 특별한 이론에 의해 국한되도록 의도되지 않으나, 대용 검정계 (예컨대, 이후에 더욱 상세하게 설명되는 것들)에서의 항바이러스 활성은, 예를 들어 바이러스 제거율의 첫 번째 상태에서, 인터페론-알파 효능의 예측자가 될 수 있음이 제안된다. 실시예 단락에서 기술되는 예시적 항바이러스 검정법은, 인간 간 세포에서 HCV 복제를 위한 대용계로서, HuH7 인간 간-유도 세포에서 EMCV (RNA 바이러스)의 복제를 억제함에 있어서의 IFN-알파의 효과를 모니터링한다. 부가적인 유용한 항바이러스 검정계는 WISH 세포에서의 EMCV, 및 WISH 세포에서의 VSV를 포함한다. 감염된 간세포에서의 HCV 복제를 위한 다른 대용 검정계는, 예를 들어 [Lohmann V. 등, (1999) Science 285(5424):285-3; Randall G. 및 Rice C.M. (2001) Curr Opin Infect Dis 14(6):743-7; 및 Bartenschlager, R. (2002) Nature Reviews/Drug Discovery 1:911]에 기재된 바와 같은 HCV 레플리콘계를 포함한다. HCV 항바이러스성 효능을 모니터링하기 위해 유용한 생체내 시스템의 한 예는 [Mercer 등 (2001) Nature Medicine 7 (8): 927-933]에 기재된 바와 같은 키메라 인간 간 SCID 마우스이다.
또한, 이론에 의해 국한되지 않으나, IFN-알파에 의한 TH2 분화의 억제 및/또는 TH1 분화의 증진은 예를 들어, 바이러스 제거율의 두 번째 상태에서, 인터페론-알파 효능에 기여하는 인자일 수 있음이 제안된다. 이 이론에 따르면, 이 생물학적 활성 (즉, TH1 분화의 증진 및/또는 TH2 분화의 억제)에서의 증가된 잠재능을 갖는 진화 IFN-알파는, 예를 들어 동일한 투약량으로 투여되는, 현재 승인된 치료적 인터페론-알파 분자에 대한 효능을 증가시키는 것으로 예측될 것이다. 본원의 실시예 단락에 기재된 한 예시적 검정은, ELISA 또는 세포내 염색 및 FACS 분류를 통해, TH1-표현형 (예컨대, IFN-감마) 및/또는 TH2-표현형 (예컨대, IL-5, IL4)과 연관된 사이토킨의 생성을 측정함으로써, 미분화 THO 세포에 대한 IFN-알파에 의한 TH2 분화의 억제 및/또는 TH1 분화의 증진을 모니터링한다.
IFN-알파 분자의 치료적 효능은 예컨대, 혈소판감소증 및 호중구감소증과 같이, 투약량-제한적 독성에 적어도 기인하여 감소되는 경향이 있다. 본 발명은 기본적 메커니즘의 특별한 이론에 의해 제한되지 않도록 의도되나, 그러한 독성은 혈소판 및 호중구 전구체에 대한 IFN-알파의 증식억제효과와 관련될 수 있음과, 대용 검정계 (예컨대, 본원에 기재된 것들)에서의 증식억제 활성은 인터페론-알파 분자의 상대적 독성의 예측자가 될 수 있음이 제안된다. 이에 따라, IFN-알파 치료와 연관된 투약량-제한적 독성은 예를 들어, 현재 승인된 치료적 인터페론-알파 분자, 예컨대 로페론(ROFERON)-A (인터페론 알파-2a, 재조합; 호프만-라 로쉐 인코포레이티드(Hoffmann-La Roche Inc.)), 인트론 A (인터페론 알파-2b, 재조합; 쉐링 코포레이션(Schering Corporation)), 및 인페르겐(INFERGEN) (인터페론 알파콘-1; 인터뮨 인코포레이티드(InterMune, Inc.))에 대한 감소된 증식억제 활성을 나타내는 IFN-알파 분자에서 감소될 수 있다. 본원의 실시예 단락에서 기재된 한 예시적 증식억제 활성 검정은 인간 인체임파종양 세포의 증식에 대한 IFN-알파의 영향을 모니터링한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 투약량-제한적 독성은 더욱 많은 치료적으로 활성 분자를 투여하는 결과로서 감소될 수 있고, 이는 현재 승인된 분자보다 낮은 농도 또는 더 낮은 빈도로 투약하는 것을 허용한다.
본 발명의 한 목적은, 신규 인터페론-알파 폴리펩티드, 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다. 본 발명의 일부 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성, 예를 들어 항바이러스 활성, 증식억제 활성, 및/또는 TH1 분화 활성을 나타낸다. 본 발명의 일부 폴리펩티드는 하기 성질들 중 하나 이상을 나타낸다: 표준 IFN-알파 폴리펩티드에 비해 증가 또는 감소된 항바이러스 활성; 표준 IFN-알파 폴리펩티드에 비해 증가 또는 감소된 TH1 분화 활성; 표준 IFN-알파 폴리펩티드에 비해 증가 또는 감소된 증식억제 활성. 표준 IFN-알파 폴리펩티드는 비자연 발생 인터페론-알파의 서열, 예컨대 IFN-알파 Conl (서열번호 43)를 포함할 수 있고, 또는 자연 발생 (즉, 야생형) 인터페론-알파 폴리펩티드의 서열을 포함할 수 있다. 자연 발생 인터페론-알파 폴리펩티드의 서열의 예는 인간 IFN-알파 폴리펩티드의 서열, 예를 들어, huIFN-알파 2b (서열번호 32), huIFN-알파 2a (위치 23 = Lys인 서열번호 32), huIFN-알파 2c (위치 34 = Arg인 서열번호 32), huIFN-알파 8b (서열번호 33), huIFN-알파 8a (위치 98 = Val, 99 = Leu, 100 = Cys, 및 101 = Asp인 서열번호 33), huIFN-알파 8c (위치 161 = Asp, 및 위치 162-166의 아미노산이 결실된 서열번호 33), huIFN-알파 14a (서열번호 39), huIFN-알파 14c (위치 152 = Leu인 서열번호 39), 또는 임의의 다른 자연 발생 인간 인터페론 알파 폴리펩티드의 서열, 예컨대 본원 도 2 및 4에 기재된 서열 (서열번호 31-42) 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 열거된 서열을 포함한다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 기준 인터페론-알파 분자, 예컨대 치료제 (예컨대, 예를 들어, 로페론-A, 인트론 A, 또는 인페그렌으로 현재 이용되고 있는 것들에 비해, 감염된 세포로부터 HCV를 소거하는 증진된 효능을 나타내는 인터페론-알파 폴리펩티드를 제공한다. 그러한 증진된 효능은 기준 분자에 비해, 증진된 항바이러스 활성, 증진된 TH1-분화 활성, 또는 양자 모두로부터 생길 수 있다. 본 발명의 일부 인터페론-알파 폴리펩티드는 현재 사용되고 있는 인터페론-알파 분자, 균주, 예컨대 유전자형 1 HCV를 이용한 치료에 대해 불량한 반응을 나타내는 HCV의 균주를 소거하는데 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 표준 IFN-알파 분자 대비의 증가된 비율 (항바이러스 활성/증식억제 활성), 및/또는 표준 IFN-알파 분자에 대비의 증가된 비율 (TH1 분화 활성/증식억제 활성)을 나타낸다. 그러한 성질을 나타내는 폴리펩티드는 바이러스성 감염, 예컨대 HCV 감염의 치료에 특히 유용할 수 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는 예를 들어, 이상 바이러스 제거율 프로파일의 하나의 상태 또는 양자 모두의 상태에서 HCV의 치료에 있어 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비해 증진된 치료적 효능을 제공할 수 있고/있거나, 감소된 독성을 나타낼 수 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는 유전자형 1 HCV의 치료에 있어 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비해 증진된 치료적 효능을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 인터페론-알파 활성 (예컨대, 상기 열거된 활성들 중 하나 이상)을 나타내고, 비접합 폴리펩티드에 비해 다른 바람직한 성질들, 예컨대 증가된 혈청 반감기 및/또는 기능적 생체내 반감기, 및/또는 감소된 항원성을 임의적으로 나타내는, 본 발명의 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체를 제공하는 것이다. 일부 그러한 접합체는 기준 인터페론-알파 분자, 예컨대 치료제 (예컨대, 예를 들어, 페가시스(PEGASYS) (페그인터페론 알파-2a; 호프만-라 로쉐 인코포레이티드) 또는 PEG-인트론 (페그인터페론 알파-2b; 쉐링 코포레이션)로서 현재 이용되고 있는 인터페론-알파 접합체에 비해, 감염된 세포로부터의 HCV 소거에 있어 증진된 효능을 나타낸다. 그러한 증진된 효능은 기준 분자에 비해 증진된 항바이러스 활성, 증진된 TH1-분화 활성, 또는 양자 모두로부터 생길 수 있다. 본 발명의 일부 인터페론-알파 접합체는 현재 사용되고 있는 인터페론-알파 분자, 균주, 예컨대 유전자형 1 HCV를 이용한 치료에 대해 불량 반응을 나타내는 HCV의 균주를 소거하는데 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 일부 접합체는 표준 IFN-알파 분자 대비의 증가된 비율 (항바이러스 활성/증식억제 활성), 및/또는 표준 IFN-알파 분자 대비의 증가된 비율 (TH1 분화 활성/증식억제 활성)을 나타낸다. 그러한 성질을 나타내는 폴리펩티드는 바이러스성 감염, 예컨대 HCV 감염의 치료에 특히 유용할 수 있다. 일부 그러한 접합체는 예를 들어, 이상 바이러스 제거율 프로파일의 하나의 상태 또는 양자 모두의 상태에서 HCV의 치료에 있어 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비해 증진된 치료적 효능을 제공할 수 있고/있거나, 감소된 독성을 나타낼 수 있다. 일부 그러한 접합체는 유전자형 1 HCV의 치료에 있어 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비해 증진된 치료적 효능을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바이러스-감염된 세포에서의 바이러스 복제를 억제하는 방법으로서, 본 발명의 바이러스-감염된 세포 폴리펩티드 또는 접합체를 상기 세포에서 바이러스 복제에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 바이러스-감염된 세포에서의 바이러스의 복사체 수를 감소시키는 방법으로서, 본 발명의 바이러스-감염된 세포 폴리펩티드 또는 접합체를 상기 세포에서의 바이러스의 복사체 수를 감소시키기 위해 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바이러스는 예를 들어, RNA 바이러스, 예컨대 HCV, 또는 DNA 바이러스, 예컨대 HBV일 수 있다. 세포는 배양되거나, 그와 다르게는 포유동물 (즉, 생체외 또는 세포외)로부터 단리될 수 있거나, 생체내, 예컨대 포유동물 (예컨대, [Mercer 등 (2001) Nature Medicine. 7 (8): 927-933]에 기재된 바와 같은 SCID 마우스 모델), 영장류, 또는 인간 내일 수 있다.
본 발명은 또한 THO 세포의 TH1 분화를 증진시키는 방법으로서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를, 상기 집단에서 TH1-표현형 (예컨대, IFN-감마)과 연관된 사이토킨의 생성을 증가시키고/시키거나 TH2-표현형 (예컨대, IL-4 또는 IL-5)과 연관된 사이토킨의 생성을 감소시키기 위해 유효한 양으로, THO 세포를 포함하는 집단에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 세포는 배양되거나, 그와 다르게는 포유동물 (즉, 생체외 또는 세포외)로부터 단리될 수 있거나, 생체내, 예컨대 포유동물, 영장류, 또는 인간 내의 것일 수 있다.
본 발명은 또한 세포 집단의 증식을 억제하는 방법으로서, 세포 집단을 세포 집단의 증식을 감소시키기 위해 유효한 양의 본 발명의 폴리펩티드, 변이체, 또는 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 세포 집단은 배양되거나, 그와 다르게는 포유동물 (즉, 생체외 또는 세포외)로부터 단리될 수 있거나, 생체내, 예컨대 포유동물, 영장류, 또는 인간 내일 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적들은 이하에 더욱 상세하게 설명된다.
본 발명의 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 "본 발명의 폴리펩티드"로 집합적으로 칭해지는 신규 인터페론-알파 폴리펩티드를 제공한다. 용어 "본 발명의 폴리펩티드(들)"는 본원에 개시된 폴리펩티드 서열의 변이체를 총체적으로 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 및 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 포함하는 융합 단백질도 본 발명에 포함된다.
각종 인터페론-알파 코딩 서열의 단편들은 재발적으로 재조합되어, 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리를 형성하고, 그 라이브러리로부터 본 발명의 일부 폴리펩티드가 발견된다. 재조합 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 수득하고/하거나, 재발성 서열 재조합을 위한 기질로서 사용되는 핵산에서의 다양성을 수득하기 위한 방법도 또한 이하에 기술된다.
본 발명의 예시적 폴리펩티드는, 서열번호 1-15, 예컨대 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로서 본원에서 동정되는 서열을 가지고, 서열번호 16-30, 예컨대 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로서 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 서열번호 44-104, 예컨대 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 및 서열번호 104로서 본원에서 동정되는 서열을 갖는 것들을 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 N-말단에 첨가된 메티오닌과 같은 부가적 아미노산을 추가적으로 포함한다. 본 발명은 또한 이 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나, 예컨대 서열번호 1-15, 47, 및 53 중 하나 (예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)를 기준으로 하여, 0-16 아미노산 위치 (예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 0-16 위치, 0-15 위치, 0-14 위치, 0-13 위치, 0-12 위치, 0-11 위치, 0-10 위치, 0-9 위치, 0-8 위치, 0-7 위치, 0-6 위치, 0-5 위치, 0-4 위치, 0-3 위치, 0-2 위치, 또는 0-1 위치에서 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성 (예컨대, 항바이러스 활성, TH1 분화 활성, 및/또는 증식억제 활성)을 나타낸다. 일부 그러한 폴리펩티드는 N-말단에 첨가된 메티오닌과 같은 부가적 아미노산을 추가적으로 포함한다. 본 발명은 또한 이 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
일부 예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 서열은 서열번호 1-15, 47, 및 53 중 임의의 하나, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53을 기준으로 하여, 비제한적으로, 위치 47, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 64, 69, 71, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161 및 162를 포함하는 하나 이상의 위치에서의 아미노산이 상이한 아미노산으로의 치환을 포함한다. 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 위치 47에서의 His 또는 Gln; 위치 51에서의 Val, Ala 또는 Thr; 위치 52에서의 Gln, Pro 또는 Glu; 위치 53에서의 Ala 또는 Thr; 위치 55에서의 Phe, Ser, 또는 Pro; 위치 56에서의 Leu, Val 또는 Ala; 위치 57에서의 Phe 또는 Leu; 위치 58에서의 Tyr 또는 His; 위치 60에서의 Met, Leu 또는 Val; 위치 61에서의 Met 또는 Ile; 위치 64에서의 Thr 또는 Ile; 위치 69에서의 Ser 또는 Thr; 위치 71에서의 Lys 또는 Glu; 위치 72에서의 Asn 또는 Asp; 위치 75에서의 Ala 또는 Val; 위치 76에서의 Ala 또는 Thr; 위치 77에서의 Trp 또는 Leu; 위치 78에서의 Asp 또는 Glu; 위치 79에서의 Glu 또는 Gln; 위치 80에서의 Thr, Asp, Ser, 또는 Arg; 위치 83에서의 Glu 또는 Asp; 위치 84에서의 Lys 또는 Glu; 위치 85에서의 Phe 또는 Leu; 위치 86에서의 Tyr, Cys 또는 Ser; 위치 87에서의 Ile 또는 Thr; 위치 90에서의 Phe, Tyr, Asp 또는 Asn; 위치 93에서의 Met 또는 Leu; 위치 133에서의 Lys 또는 Glu; 위치 140에서의 Ser 또는 Ala; 위치 154에서의 Phe 또는 Leu; 위치 160에서의 Lys 또는 Glu; 위치 161에서의 Arg 또는 Ser; 및 위치 162에서의 Arg 또는 Ser (위치넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함) 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명은 또한 이 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는, 모 분자가 예컨대 표면에 노출된 측쇄들의 25% 이상, 예컨대 50% 이상을 가지는 것으로 계산되는, 분자의 표면에 노출된 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 예측되는 위치에서의 치환을 포함한다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는, 25% 초과의 접근가능 표면적 (ASA) 분율을 갖는 아미노산 잔기를 갖는 하기 위치를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 위치에서의 아미노산의 상이한 아미노산으로의 치환을 포함한다: 서열번호 1-15, 47, 및 53 중 임의의 하나 (예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)를 기준으로 한, 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 40, 41, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 59, 62, 63, 66, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 128, 129, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 146, 149, 150, 153, 154, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 및 166. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는 50% 초과의 접근가능 표면적 분율을 갖는 아미노산 잔기를 갖는 하기 위치를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 위치에서의 아미노산의 상이한 아미노산으로의 치환을 포함한다: 서열번호 1-15, 47, 및 53 중 임의의 하나 (예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)를 기준으로 한, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 25, 27, 28, 31, 33, 34, 35, 37, 41, 44, 46, 47, 49, 50, 66, 71, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 95, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 129, 132, 133, 135, 138, 150, 160, 162, 163, 164, 165, 및 166.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 25% 초과의 분율 ASA를 갖는 위치로 시스테인 잔기를 도입하는 하기 치환들 중 하나 이상을 포함한다: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G1OC, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, L30C, K31C, R33C, H34C, D35C, R37C, Q40C, E41C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71C, N72C, S74C, A75C, D78C, E79C, T80C, L81C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, E97C, A98C, V100C, M101C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, Ml12C, N113C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, Q125C, R126C, T128C, L129C, T132C, K133C, K134C, K135C, Y136C, S137C, P138C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161C, L162C, R163C, R164C, K165C 및 E166C (상기 아미노산 잔기 위치는 서열번호 1을 기준으로 함).
본 발명의 일부 폴리펩티드는 (25% 초과의 ASA 분율을 갖는 위치로 라이신 잔기를 도입하는 하기 치환들 중 하나 이상을 포함한다: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G1OK, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, L30K, R33K, H34K, D35K, R37K, Q40K, E41K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, D78K, E79K, T80K, L81K, E83K, I87K, F90K, Q91K, N94K, D95K, E97K, A98K, V100K, M101K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, M112K, N113K, V114K, D115K, L118K, R121K, Q125K, R126K, T128K, L129K, T132K, Y136K, S137K, P138K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161K, L162K, R163K, R164K, 및 E166K (또는 서열번호 1에 대해 동등한 위치), 및 이의 조합.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드들 중 임의의 것, 예를 들어 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나, 예컨대 서열번호 1-15, 47 및 53 중 하나 (예를 들어, 서열 번호: 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53)로부터 하나 이상의 리신, 예컨대 K31, K50, K71, K84, K122, K133, K134, K135, K160 및/또는 K165 (서열번호 1을 기준으로 함)을 제거하는, 한 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 하나 이상의 치환 또는 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실을 포함한다. 제거되는 하나 이상의 리신 잔기(들)는 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, Arg(R) 또는 Gln(Q)로 치환되거나, 결실될 수 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는 치환 K31R+K122R; K31R+K133R; K122R+K133R; 또는 K31R+K122R+K133R을 포함한다. 다른 예시적 치환은 K71E; K84E; K133E/G; 및 K160E을 포함한다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드들 중 임의의 것, 예를 들어 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나, 예컨대 서열번호 1-15, 47 및 53 중 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)로부터 하나 이상의 히스티딘, 예컨대 H7, H11, H34, 및/또는 H47 (서열번호 1을 기준으로 함)을 제거하는, 한 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 하나 이상의 치환 또는 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실을 포함한다. 제거되는 하나 이상의 히스티딘 잔기(들)는 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, Arg(R) 또는 Gln(Q)로 치환되거나, 결실될 수 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는 치환 H34Q; H47Q; 또는 H34Q+H47Q를 포함한다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는, N-연결 글리코실화 부위 N72 S73 S74 (서열번호 1을 기준으로 함)의 공간 배치를 제거하거나, 그와 달리 붕괴하는 아미노산의 상이한 아미노산으로의 치환, 아미노산의 결실, 또는 아미노산의 삽입을 포함한다. 이 부위의 제거는 수많은 방식들에 의해, 예를 들어 N72의 결실, 또는 N72의 상이한 아미노산으로의 치환, Ser73의 Pro로의 치환, Ser74의 Ser, Thr, 또는 Cys 이외의 아미노산으로의 치환, 위치 73과 74 사이에서의 Ser, Thr, 또는 Cys 이외의 아미노산 잔기의 삽입에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 그러한 폴리펩티드는 치환 N72D를 포함한다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 예를 들어, 잠재성 프로테아제-감성 부위의 존재를 최소화하기 위한, 혹은 아민-반응성 접합 (예컨대, PEG화) 시약에 대해 잠재적으로 반응성인 부위를 제거하기 위한, 하나 이상의 염기성 잔기, 또는 염기성 잔기의 하나 이상의 쌍 (예컨대, Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Lys-Lys)을 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 예를 들어, C-말단 부근에서의 이염기 서열의 제거는 Lys160, Arg16l, Arg163, Arg164, 및 Lys165 (서열번호 1을 기준으로 함) 중 하나 이상을 제거함으로써 달성될 수 있다. 제거되는 하나 이상의 Lys 또는 Arg는 예를 들어, 결실되거나, Lys 또는 Arg 이외의 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는 Lys160, Arg161, 및 Arg164 중 하나 이상의 Lys 또는 Arg 이외의 아미노산으로의 치환, 예를 들어 치환 Lys160Glu; Arg161Ser/Cys; 및 Arg164Ser/Cys 중 하나 이상을 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 대안적으로 또는 부가적으로, 개별적 결실 (예컨대, K165*) 또는 C-말단 절단을 통한 방식을 포함하는 하나 초과의 군집 결실의 형태 (예컨대, K165*-E166*)일 수 있는 Lys160, Arg161, Arg163, Arg164, 및 Lys165 중 하나 이상의 결실을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해 고찰되는 다른 변형은 하기 및 제목 "인터페론-알파 접합체"의 단락에서 기재되는 것들을 포함한다.
모 폴리펩티드의 예 및 그것의 변형은 일반적으로 서열번호 1을 기준으로 하여 (또는 일부 다른 특정화 서열을 기준으로 하여) 본원에 제공되며, 개시된 변형은 또한 (서열번호 2-15 및 서열번호 44-104 및 그것의 변이체를 포함하여) 본원에 개시된 본 발명의 다른 폴리펩티드들 중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에서 이루어질 수 있다는 것을 이해하도록 한다. 이에 따라, 한 예로는, 서열번호 1을 기준으로 한 치환 H47C는 서열번호 5에서의 Q47C에 상응하는 등이 있다.
하기 표는 본 발명의 일부 인터페론-알파 폴리펩티드의 서열을 제공한다. 명료하게, 서열은 서열번호 3(표 1) 또는 서열번호 12(표 2)를 기준으로 나와 있다. 일부 그러한 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성, 예컨대 항바이러스 활성, TH1 분화 활성, 및/또는 증식억제 활성을 나타낸다.
변이체
다른 한 측면에서, 본 발명은 모 인터페론-알파 폴리펩티드의 변이체로서, 하나 이상의 아미노산 위치에서 모 폴리펩티드 서열과 상이한 서열을 포함하는 변이체의 단리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 여기에서 변형 서열은 위치 47에서의 His, 위치51에의 Val, 위치 55에서의 Phe, 위치 56에서의 Leu, 위치 58에서의 Tyr, 위치 133에서의 Lys, 위치 140에서의 Ser (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 예에서, 모 인터페론-알파 폴리펩티드 서열은 자연 발생 인간 인터페론-알파의 서열 (예컨대, 예를 들어, huIFN-알파 2b (서열번호 32), huIFN-알파 2a (위치 23 = Lys의 서열번호 32), huIFN-알파 2c (위치 34 = Arg의 서열번호 32), huIFN-알파 8b (서열번호 33), huIFN-알파 8a (위치 98 = Val, 99 = Leu, 100 = Cys, 및 101 = Asp의 서열번호 33), huIFN-알파 8c (위치 161 = Asp 및 위치 162-166의 아미노산이 결실된 서열번호 33), huIFN-알파 14a (서열번호 39), huIFN-알파 14c (위치 152 = Leu의 서열번호 39), 또는 임의의 다른 자연 발생 인간 인터페론 알파 폴리펩티드의 서열, 예컨대 본원의 도 2 및 4 (서열번호 31-42)에 나와 있고/있거나 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 열거된 것들이다. 일부 예에서, 모 인터페론-알파 폴리펩티드 서열은 비자연 발생 (즉, 합성) 인터페론-알파의 서열, 예컨대 IFN-알파 Conl (서열번호 43)이다. 일부 예에서, 변형되는 모 폴리펩티드는 그 자체가 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나일 수 있다. 일부 예에서, 변형 서열은 1-16 아미노산 위치 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 1-14 아미노산 위치, 1-12 아미노산 위치, 1-10 아미노산 위치, 1-8 아미노산 위치, 1-6 아미노산 위치, 1-5 아미노산 위치, 1-4 아미노산 위치, 1-3 아미노산 위치, 또는 1-2 아미노산 위치에서의 모 폴리펩티드 서열과 상이하다. 일부 그러한 변이체는 인터페론-알파 활성을 나타낸다. 본 발명은 또한 이 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 접합체, 및 이 변이체를 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
서열 변이체
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 0-16 아미노산 위치 (예컨대, 0,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12,13, 14,15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 0-16 위치, 0-15 위치, 0-14 위치, 0-13 위치, 0-12 위치, 0-11 위치, 0-10 위치, 0-9 위치, 0-8 위치, 0-7 0 위치, 0-6 위치, 0-5 위치, 0-4 위치, 0-3 위치, 0-2 위치, 또는 0-1 위치에서, 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나, 예컨대 서열번호 1-15, 47, 및 53의 하나 (예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)와 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
예를 들어, 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는 모 폴리펩티드 서열을 기준으로 1 내지 16 아미노산의 결실 (예컨대, 예를 들어, 서열번호 1-15 중 하나)에 상응하는 약 150 아미노산, 예컨대 약 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 또는 165 아미노산의 길이를 갖는 서열을 포함한다. 일부 예에서, 1 내지 11, 예컨대 1 내지 10, 1 내지 7, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 1 내지 3 아미노산이 C-말단으로부터 결실되며, 즉 폴리펩티드는 아미노산 잔기 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 아미노산 잔기)에 의해, 예를 들어 1-10, 1-7, 예컨대 1-5 또는 1-3 아미노산 잔기에 의해, 모 폴리펩티드 서열 (예컨대, 예를 들어, 서열번호 1-15, 47, 또는 53 중 하나)과 대비하여, C-말단으로 끊긴다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 그러한 폴리펩티드는 1-4 아미노산 잔기 (예컨대, 1, 2, 3, 또는 4 아미노산 잔기)에 의해, 모 폴리펩티드 서열 (예컨대, 서열번호 1-15, 47, 또는 53 중 하나)과 대비하여, N-말단으로 끊기며, 예컨대 1-4, 1-3, 1-2 또는 1 아미노산 잔기(들)가 N-말단으로부터 제거된다. 일부 그러한 폴리펩티드는 N-말단에 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
또 다른 한 예로서, 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는 서열번호 1-15, 47, 또는 53 중 하나에 대한 0 내지 16 아미노산 치환 (예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 치환), 예컨대 0-14 또는 0-12 또는 0-10 또는 0-8 또는 0-6 또는 0-5 또는 0-4 또는 0-3 또는 0-2 또는 0-1 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함한다. 일부 예에서, 아미노산 치환의 하나 이상은 예를 들어, 이하 기술되는 것과 같은 치환기 (예컨대, 보존적 치환기)에 따라 이루어진다. 일부 그러한 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 (예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53), 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 치환, 예컨대 0-14 또는 0-12 또는 0-10 또는 0-8 또는 0-6 또는 0-5 또는 0-4 또는 0-3 또는 0-2 또는 0-1 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함하며, 여기에서 상기 치환(들) 중 하나 이상은 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기를 도입한다. 그 예는, 상기 및 제목 "인터페론-알파 접합체"의 단락에서 기재된 바와 같이, 하나 이상의 N-글리코실화 부위(들)의 도입, 또는 하나 이상의 시스테인 잔기(들) 또는 리신 잔기(들)의 도입을 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
본 발명의 일부 폴리펩티드는 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나 (예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)를 기준으로 하여, 0 내지 16 아미노산 치환 또는 결실 또는 삽입, 예컨대 0-14 또는 0-12 또는 0-10 또는 0-8 또는 0-6 또는 0-5 또는 0-4 또는 0-3 또는 0-2 또는 0-1 아미노산 치환 결실 또는 삽입 (또는 이들의 조합)을 갖는 서열을 포함하며, 여기에서, 상기 치환 또는 결실 중 하나 이상은, 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하거나, 아미노산 삽입의 경우에는 그러한 결합기에 필요한 잔기의 공간 배치를 붕괴하는 모 폴리펩티드 서열로부터 아미노산을 제거한다 (예컨대, N-글리코실화 N-X-S/T 모티프를 붕괴시키는 아미노산의 삽입). 그 예는 상기 및 제목 "인터페론-알파 접합체" 단락에 기재된 바와 같은, 모 폴리펩티드 서열로부터의 N-글리코실화 부위의 제거, 또는 리신, 히스티딘 또는 시스테인 잔기의 제거를 포함한다. 일부 그러한 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
한 비제한적 예로서, 본 발명의 폴리펩티드는, (상기 기재된 것을 포함하여, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입의 조합일 수 있는) 총 16개 이하의 위치들에서 서열 서열번호 3 또는 서열번호 3과 상이한 서열을 가질 수 있다. 일부 예에서, 치환의 무(none), 일부 또는 전부는, 이하 정의되는 치환 군에 따른 치환이다.
본 발명에 따른 아미노산 치환은 비제한적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업계에 공지되어 있다. 한 예가 상호 "보존적 치환"으로 간주될 수 있는 아미노산을 함유하는 6개의 예시적 군을 설명하는 하기 표 (표 3)에 나와 있다.
보존적 치환 군
1 알라닌(A), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T)
2 아스파르트산(D), 글루탐산(E)
3 아스파라긴(N), 글루타민(Q)
4 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H)
5 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V)
6 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)
아미노산의 다른 치환 군이 구상될 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 기능 또는 화학적 구조 또는 조성물 (예컨대, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 황-함유)에 의해 각 군으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 지방족에 따른 군 분류는 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I)을 포함할 수 있다. 상호 보존적 치환으로 간주되는 아미노산을 함유하는 다른 군에는 방향족: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 황-함유: 메티오닌(M), 시스테인(C); 염기성: 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q)을 포함한다. 또한, 아미노산의 부가적 군 분류에 대해, [Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]을 참고한다. 상기 치환기들과 함께, 본원에서의 폴리펩티드 서열목록은, 모든 보존적으로 치환된 폴리펩티드 서열의 표시 목록을 제공한다.
퍼센트 서열 동일성
한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나, 예를 들어, 서열번호 1-15, 47, 및 53 중 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53)에 대해, 90% 이상의 서열 동일성 (예컨대, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성)을 갖는 서열을 각기 포함하는 단리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 예에서 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다. 일부 예에서, 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 아미노산 위치, 예컨대 16 이하 위치 (예컨대, 1-16 위치, 1-15 위치, 1-14 위치, 1-13 위치, 1-12 위치, 1-11 위치, 1-10 위치, 1-9 위치, 1-8 위치, 1-7 위치, 1-6 위치, 1-5 위치, 1-4 위치, 1-3 위치, 또는 1-2 위치)에서 서열번호 1-15 및 44-104 중 임의의 하나, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53과 상이하다. 한 예로서, 본 발명에 따른 또 다른 한 아미노산으로 치환될 수 있는 일부 위치는, 서열번호 1-15 및 44-104 중 하나를 기준으로 한, 위치 47, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 64, 69, 71, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 93, 133, 140, 154, 160, 161, 및 162 중 하나 이상을 비제한적으로 포함한다. 일부 예에서, 서열은 위치 47에서의 His 또는 Gln; 위치 51에서의 Val, Ala 또는 Thr; 위치 52에서의 Gln, Pro 또는 Glu; 위치 53에서의 Ala 또는 Thr; 위치 55에서의 Phe, Ser, 또는 Pro; 위치 56에서의 Leu, Val 또는 Ala; 위치 57에서의 Phe 또는 Leu; 위치 58에서의 Tyr 또는 His; 위치 60에서의 Met, Leu 또는 Val; 위치 61에서의 Met 또는 Ile; 위치 64에서의 Thr 또는 Ile; 위치 69에서의 Ser 또는 Thr; 위치 71에서의 Lys 또는 Glu; 위치 72에서의 Asn 또는 Asp; 위치 75에서의 Ala 또는 Val; 위치 76에서의 Ala 또는 Thr; 위치 77에서의 Trp 또는 Leu; 위치 78에서의 Asp 또는 Glu; 위치 79에서의 Glu 또는 Gln; 위치 80에서의 Thr, Asp, Ser, 또는 Arg; 위치 83에서의 Glu 또는 Asp; 위치 84에서의 Lys 또는 Glu; 위치 85에서의 Phe 또는 Leu; 위치 86에서의 Tyr, Cys 또는 Ser; 위치 87에서의 Ile 또는 Thr; 위치 90에서의 Phe, Tyr, Asp 또는 Asn; 위치 93에서의 Met 또는 Leu; 위치 133에서의 Lys 또는 Glu; 위치 140에서의 Ser 또는 Ala; 위치 154에서의 Phe 또는 Leu; 위치 160에서의 Lys 또는 Glu; 위치161에서의 Arg 또는 Ser; 및 위치 162에서의 Arg 또는 Ser(위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함) 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 서열에서 고찰되는 다른 치환이 상기 및 제목 "인터페론-알파 접합체" 단락에 기재되어 있다. 본 발명은 또한 그러한 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 그러한 폴리펩티드를 포함하는 접합체, 및 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 서열번호 16-30 중 하나 이상에 대해 약 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산을 제공한다. 일부 그러한 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩한다.
한 서열 (폴리펩티드 또는 핵산)이 다른 한 서열에 대해 유사한 정도는 2개 서열에 대한 유사한 구조적 및 기능적 성질들을 나타내는 것이다. 따라서, 본 발명의 관련 부문에서, 임의의 주어진 예시적 서열과 유사한 서열을 갖는 서열은 본 발명의 특성이다. 특히, 이하 정의되는 서열 동일성 (%)을 갖는 서열은 본 발명의 한 특성이다.
수동적 배열 및 컴퓨터 이용 서열 배열 및 분석을 비롯한, 서열 관계를 결정하는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 서열 배열을 허용하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하거나, 당업자에 의해 생성될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 주제 발명에 이용된 핵산 및 폴리펩티드의 서열은 동일할 필요는 없으나, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산의 상응하는 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 각종 변화, 예컨대 보존적 또는 비보존적인, 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실, 및/또는 치환이 가해질 수 있고, 여기에서 예컨대 그러한 변화는 그것의 용도, 예컨대 치료적 또는 예방적 용도 또는 투여 또는 진단용 용도에 있어 특정 이점들을 제공할 수 있다. 본 발명의 핵산은 각종 변화, 예컨대 특별한 코돈이 동일하거나 상이한 아미노산을 코딩하여, (상기 정의된 바와 같이) 침묵 변이 또는 비침묵 변이를 초래하도록 하는 하나 이상의 코돈에서의 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 치환, 또는 서열에서의 하나 이상의 핵산 (또는 코돈)의 하나 이상의 결실이 가해질 수 있다. 핵산은 또한 (예컨대, 세균 또는 포유동물의) 발현계에서 최적 발현을 제공하는 하나 이상의 코돈을 포함하도록 변형될 수도 있으나, 원하는 경우, 상기 하나 이상의 코돈은 여전히 동일한 아미노산(들)을 코딩한다. 그러한 핵산 변화는 치료적 또는 예방적 용도 또는 투여, 또는 진단용 용도에서 특정 이점을 제공할 수 있다. 핵산 및 폴리펩티드는 본 발명의 각각의 핵산 또는 폴리펩티드의 서열과 (이하 정의되는 바와 같이) 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 한, 수많은 방식으로 변형될 수 있다.
2개 이상 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 관련 부문에서, 용어 "일치하는" 또는 "동일성"은 이하 기재되는 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 시각적 조사에 의해 결정시에, 최대 유사성을 위해 비교 및 배열될 때, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정화 퍼센티지를 갖는 2개 이상 서열을 가리킨다.
기준 (즉 질의) 서열에 대한 대상 서열의 "퍼센트 서열 동일성"("% 동일성")은 대상 서열이 비교 길이에 걸쳐 질의 서열의 특정된 퍼센티지에 의해 일치하는 (즉, 폴리펩티드 서열에 대한 아미노산별로, 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 뉴클레오티드별로) 것을 의미한다.
질의 서열에 대한 대상 서열의 퍼센트 서열 동일성을 하기와 같이 계산한다. 먼저, 2개 서열의 최적 배열을 특이적 배열 변수들과 함께 서열 비교 알고리즘을 이용하여 결정한다. 최적 배열의 결정을 컴퓨터를 이용하여 수행할 수 있거나, 하기 기재된 바와 같이 수동적으로 계산할 수 있다. 이어서, 2개의 최적 배열된 서열을 비교 길이에 걸쳐 비교하고, 일치하는 잔기가 양 서열 모두에서 일어나는 최적 배열에서의 위치 수를 결정하고, 이는 매칭된 위치의 수를 제공한다. 이어서, 매칭된 위치의 수를 비교 길이 (이는 달리 특정되지 않는 한, 질의 서열의 길이임)의 위치의 총 수로 나눈 후, 그 결과를 100으로 곱하여, 질의 서열에 대한 대상 서열의 퍼센트 서열 동일성을 산출한다.
폴리펩티드 서열에 있어서, 전형적으로 하나의 서열은, 하나 이상의 다른 서열, 즉, "대상 서열(들)" (예를 들어, 서열 데이터베이스에 존재하는 서열)과 비교되는 "질의 서열" (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 서열)로 간주된다. 서열 비교 알고리즘은 지정 배열 변수를 사용하여, 질의 서열 및 대상 서열(들) 간의 최적 배열을 결정한다. 서열 데이터베이스, 예컨대 GENBANK (유전 서열 데이터 뱅크(Data Bank); 미국 보건 및 인간봉사성(U.S. Department of Health and Human Services) 또는 GENESEQ (톰슨 더웬트(Thomson Derwent); DGENE (STN)으로도 이용가능함)에 대해 질의 서열을 비교할 때, 주로 단지 질의 서열 및 배열 변수만을 컴퓨터에 입력하고; 질의 서열 및 각 대상 서열 간의 최적 배열을 특정된 수의 대상 서열에 답한다.
2개의 폴리펩티드 서열은 정해진 변수, 즉 그 쌍의 서열에 대해 가능한 최고의 유사성 점수에 도달하기 위해 정의된 아미노산 치환 행렬, 갭 존재 패널티 (갭 개방 패널티라고도 함), 및 갭 신장 패널티를 이용하여 배열될 때, "최적으로 배열된" 것이다. BLOSUM62 행렬 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (22): 10915-10919)은 종종 폴리펩티드 서열 배열 알고리즘에서 디폴트 측정 치환 행렬로 사용된다 (예컨대, 이하 기재되는 BLASTP). 갭 존재 패널티는 배열된 서열들 중 하나에서의 단일 아미노산 갭의 도입을 위해 부과되고, 갭 신장 패널티는 갭에서 각 잔기 위치에 대해 부과된다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 이용되는 배열 변수는 BLOSUM62 스코어링 행렬, 갭 존재 패널티 = 11, 및 갭 신장 패널티 = 1이다. 배열 점수는 최고의 가능한 유사성 점수에 도달하기 위해, 배열이 시작되고 끝나는 (예컨대, 배열 창) 각 서열의 아미노산 위치에 의해, 또한 하나의 서열 또는 양자 모두의 서열로 하나의 갭 또는 다수의 갭의 삽입에 의해 정해진다.
2개 이상 서열 간의 최적 배열은 (하기 기재되는 바와 같이) 수동적으로 결정될 수 있으나, 그 공정은 컴퓨터-수행 배열 알고리즘, 예를 들어 BLAST (미국 의약 라이브러리), 예컨대 폴리펩티드 서열을 위한 BLASTP 및 핵산 서열을 위한 BLASTN ([Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재되고, 각종 출처, 예컨대 미국생명공학정보센터 (NCBI) 웹사이트를 통해 공중에 입수가능해짐)을 이용함으로써 용이해진다. 컴퓨터 처리된 BLAST 인터페이스를 이용할 때, "저복잡성 필터"를 사용하는 선택안이 존재할 경우, 이 선택은 중지되어야 한다 (즉, 무 필터).
도 3은 GENBANK, 및 BLOSUM62 행렬, 갭 개방 패널티 11, 갭 신장 패널티 1을 이용하는 GENESEQ 데이터베이스에 대해 질의 서열 서열번호 3의 BLASTP 조사에서 찾아진 가장 밀접히 관련된 서열인 인간IFN-알파 14a (LeIF H로도 알려짐, Goeddel 등 (1981) Nature 290: 20-26; 서열번호 39)와 함께 본 발명의 폴리펩티드의 서열 (B9x14, 서열번호 3)을 나타낸다. 이 2개의 서열은 166 아미노산의 길이 상에 18 아미노산 위치에서 상이하다 (즉, 18 아미노산 위치에서 서열번호 39는 서열번호 3과 상이함); 또한 [(166-18)/166)×100 = 89]이기 때문에, 서열번호 39는 서열번호 3과 89% 일치한다.
도 5는 GENBANK, 및 상기 특정된 변수를 이용하는 GENESEQ 데이터베이스에 대해 질의 서열 서열번호 12의 BLASTP 조사에서 찾아진 가장 밀접히 관련된 서열인 인간 IFN-알파 14a (서열번호 39)와 함께, 본 발명의 또 다른 한 폴리펩티드의 배열 (B9x25, 서열번호 12)을 나타낸다. 서열번호 39는 166 아미노산의 길이 상에 20 아미노산 위치에서 서열번호 12와 상이하며; 또한, [(166-20)/166)×100 = 88]이기 때문에, 서열번호 39는 서열번호 3과 88% 일치한다.
2개의 폴리펩티드 서열 간의 최적 배열은 또한 상기 특정된 동일한 배열 변수 (행렬 = BLOSUM62, 갭 개방 패널티= 11, 및 갭 신장 패널티= 1)를 이용하여, BLASTP 알고리즘의 수동적 계산에 의해 (즉, 컴퓨터의 도움 없이) 결정될 수도 있다. 우선, 2개의 서열은 시각적 조사에 의해 초기에 배열한다. 이어서, 초기 배열 점수를 하기와 같이 계산한다: 배열의 각 개별적 위치에 대해 (즉, 각 쌍의 배열된 잔기에 대해), 수치는 BLOSUM62 행렬에 따라 정해진 것이다 (도 6). 배열에서 각 쌍의 잔기에 대해 정해진 값들의 합은 초기 배열 점수이다. 배열된 2개의 서열이 매우 유사한 경우, 이 초기 배열은 종종 최고의 가능한 배열 점수를 제공한다. 최고의 가능한 배열 점수를 갖는 배열은 이용된 배열 변수에 기초하는 최적 배열이다. 도 7A는 2개의 서열, 즉 서열번호 3 (상부)의 잔기 29-50로서 본원에 동정된 "질의" 서열, 및 본원에 서열번호 5 (하부)의 잔기 30-52로서 동정되는 "대상" 서열에 대한 배열 점수의 한 계산예를 나타낸다. 서열은 시각적 조사에 의해 배열되며, 각기 정해진 쌍의 아미노산에 대해 BLOSUM62 행렬에 의해 정해진 수치가 배열에서 각 위치 아래에 나와 있다 (시각화를 보조하기 위해, 배열에서 각기 일치하는 쌍의 아미노산이 굵은 체로 나와 있다). 이 예에서, 이 초기 배열은 최고의 가능한 배열 점수 (각 배열된 위치 아래에 나와 있는 값들의 합)를 제공하였고; 갭이 있거나 없는, 이 2개의 서열의 임의의 다른 배열은 보다 낮은 배열 점수를 초래하게 된다.
일부 예에서, 보다 높은 배열 점수는 하나 이상의 갭을 배열에 도입함으로써 수득될 수 있다. 갭이 배열에 도입될 때마다, 갭 개방 패널티가 정해지고, 부가적으로 갭 신장 패널티가 그 갭 내에서 각 잔기 위치에 대해 평가된다. 그러므로, (갭 개방 패널티= 11 및 갭 신장 패널티= 1를 포함하는) 상기 배열 변수, 배열에서의 하나의 잔기의 갭으로 갭에 대해 정해진 [-(11 + (1×1)) = -12]의 값에 상응하고; 3개의 잔기의 갭은 그 갭에 정해진 [-(11 + (3×1)) = -14]의 값에 상응한다. 이 계산은 배열에 도입된 각 갭에 대해 반복한다. 도 7B 및 7C는 배열로의 갭이 도입이 갭 패널티에도 불구하고, 어떻게 보다 높은 배열 점수를 초래할 수 있는지를 보여주는 예를 나타낸다. 도 7B는 초기 배열 점수 67을 초래하는, 시각적 조사에 의해 이루어진, 서열번호 3 (상부, 질의)의 잔기 29-50 및 서열번호 32 (하부, 대상) 의 초기 배열을 나타낸다. 도 7C는 서열번호 32에서의 하나의 잔기 갭의 영향을 보여주며; -12의 갭 패널티에도 불구하고, 2개의 서열의 전체 배열 점수는 88로 증가한다. 이 예에서, 도 7C에 나와 있는 배열은 최고의 가능한 배열 점수, 및 이에 따라 이 2개의 서열의 최적 배열을 제공하고; (갭이 존재 또는 부재하는) 이 2개의 서열의 임의의 다른 배열은 보다 낮은 배열 점수를 초래하게 된다.
비교적 짧은 서열을 이용하는 상기 기재된 서열 배열 계산의 예들은 단지 설명하기 위한 목적으로 제공되며; 실제적으로 이용된 배열 변수 (BLOSUM62 행렬, 갭 개방 패널티 =11, 및 갭 신장 패널티 = 1)는 85 아미노산 또는 그 보다 긴 아미노산의 폴리펩티드 서열에 최적임을 이해하도록 한다. NCBI 웹사이트는 (상기 기재된 바와 동일한 절차를 이용하여, 수동적 배열 계산 및 컴퓨터-이용 배열 계산에 적당한) 다른 길이의 서열에 대한 하기 배열 변수들을 제공한다. 길이가 50-85 아미노산인 서열의 경우, 최적 변수는 BLOSUM80 행렬 (Henikoff and Henikoff, 이하 상기와 동일함), 갭 개방 패널티= 10, 및 갭 신장 패널티 = 1이다. 길이가 35-50 아미노산인 서열의 경우, 최적 변수는 PAM70 행렬 (Dayhoff, M.O., Schwartz, R. M. & Orcutt, B. C. (1978) "단백질의 진화적 변화의 모델(A model of evolutionary change in protein)", Atlas of Protein Sequence and Structure, 제5권, 별책 3, M.O. Dayhoff (편저), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., 미국 워싱턴 DC. 소재), 갭 개방 패널티 = 10, 및 갭 신장 패널티 = 1이다. 길이가 35 아미노산 미만인 서열의 경우, 최적 변수는 PAM30 행렬 (Dayhoff, M.O., 이하 상기와 동일함), 갭 개방 패널티 = 9, 및 갭 신장 패널티 = 1이다.
일단 서열이 최적으로 배열되면, 질의 서열에 대한 대상 서열의 퍼센트 동일성은 일치하는 잔기 쌍을 포함하는 최적 배열에서의 위치의 수를 계수하고, 그것을 비교 길이에서의 잔기의 수 (달리 특정되지 않는 한, 질의 서열에서의 잔기의 수)로 나누며, 결과 값을 100으로 곱함으로써 계산된다. 다시 도 7에 나와 있는 예를 참고하건대, 각 예에서, 질의 서열로 표시되는 서열은 길이가 22 아미노산이다. 도 7A의 배열과 관련하여, 20 쌍의 배열된 아미노산 잔기 (굵은 체로 나타냄)는 질의 서열 (상부)의 최적 배열이 대상 서열(하부)과 일치한다. 이에 따라, 이 특별한 대상 서열은 질의 서열에 대해 (20/22)×100= 91.1% 동일성을 가진다. 도 7C에 나와 있는 배열에서, 최적 배열에서 18 쌍의 아미노산 잔기 (굵은 체로 나타냄)가 일치하고; 이에 따라 이 특별한 대상 서열은 질의 서열에 대해 (18/22)×100 = 81.8% 동일성을 가진다.
폴리펩티드에 대해 적용되는 용어 "실질적인 동일성" (또는 "실질적으로 동일한")는 전형적으로 2개의 아미노산 서열 (즉, 질의 서열 및 대상 서열)이 상기 기재된 적당한 변수를 (수동적으로 또는 컴퓨터를 통한) 이용하는 BLASTP 알고리즘를 이용하여 최적으로 배열될 때, 대상 서열이 질의 서열에 대해 약 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 그 이상의 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 가짐을 의미한다. 일부 예에서, 약 100개 이상 아미노산 잔기, 예컨대 적어도 약 110개 이상, 120개 이상, 125개 이상, 130개 이상, 135개 이상, 140개 이상, 145개 이상, 150개 이상, 155개 이상, 156개 이상, 157개 이상, 158개 이상, 159개 이상, 160개 이상, 161개 이상, 162개 이상, 163개 이상, 164개 이상, 165개 이상, 또는 166개 이상의 아미노산 잔기의 비교 길이 상에서 실질적인 동일성이 존재한다.
마찬가지로, 2개의 핵산 서열의 관련 부문에서 적용되는 용어 실질적인 동일성 (또는 실질적으로 동일한)는 상기 기재된 적당한 변수를 (수동적으로 또는 컴퓨터를 통한) 이용하는 BLASTN 알고리즘를 이용하여 최적으로 배열될 때, 대상 서열이 질의 서열에 대해 약 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 그 이상의 퍼센트 핵산 서열 동일성을 가짐을 의미한다. 핵산 서열 배열에 사용된 변수는 매치 보상 1, 미스매치 패널티-3, 갭 존재 패널티 5, 갭 신장 패널티 2이다 (치환 행렬은 BLASTN 알고리즘에서 사용되지 않음). 일부 예에서, 약 300개 이상 뉴클레오티드 잔기, 예컨대 약 330개 이상, 360개 이상, 375개 이상, 390개 이상, 405개 이상, 420개 이상, 435개 이상, 450개 이상, 465개 이상, 480개 이상, 483개 이상, 486개 이상, 489개 이상, 492개 이상, 495개 이상, 또는 498개 이상 뉴클레오티드의 비교 길이 상에서 실질적인 동일성이 존재한다.
부가적 측면
본 발명의 임의의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 안정화 또는 검출 또는 정제를 위한 하나 이상의 도메인 또는 하위서열의 첨가 시에 일어나는 것과 같은, 융합 단백질과 같은 보다 큰 폴리펩티드 서열의 부분으로서 존재할 수 있다. 폴리펩티드 정제 하위서열은 예컨대, 에피토프 택, FLAG 택, 폴리히스티딘 서열, GST 융합, 또는 임의의 다른 검출/정제 하위서열 또는 당업계에 공지된 "택"을 포함할 수 있다. 이 부가적 도메인 또는 하위서열은 본 발명의 폴리펩티드의 활성에 대한 영향이 없거나 거의 없으며, 혹은 인테인 등을 비롯한, 프로테아제를 이용한 처리 등의 후합성 가공 단계들에 의해 제거될 수 있다.
본 발명의 임의의 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 아미노산은 예컨대 글리코실화 아미노산, PEG화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오티닐화 아미노산, 지질 부분기에 접합된 아미노산, 또는 유기 유도화제에 접합된 아미노산을 포함한다. 변형된 아미노산의 존재는 예를 들어, (a) 폴리펩티드 혈청 반감기 및/또는 기능적 생체내 반감기의 증가, (b) 폴리펩티드 항원성의 감소, (c) 폴리펩티드 저장 안정성의 증가, 또는 (d) 생체이용성의 증가, 예컨대 AUCsc의 증가의 측면에서 유리할 수 있다. 아미노산(들)은 재조합 생성 중에 예를 들어, 동시-번역 또는 후-번역으로 변형 (예컨대, 포유동물의 세포에서의 발현 중에 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결 글리코실화)되거나, 합성 수단에 의해 변형된다. 이 측면은 본원에서 제목 "인터페론-알파 접합체" 단락에서 더욱 상세하게 기술된다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 하나 (예컨대, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47, 또는 서열번호 53 중 하나)를 기준으로 하여, 0-16 아미노산 위치 (예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치)에서 상이한 아미노산 서열을 갖는 단리 또는 재조합 폴리펩티드, 및 담체 또는 부형제를 포함한다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물일 수 있다. 예시적 조성물 및 부형제 및 담체가 하기 기술된다.
폴리펩티드의 생산
본 발명의 폴리펩티드의 생산 및 단리를 위한 재조합 방법이 본원에 기재된다. 재조합 생산에 대해 부가적으로, 폴리펩티드는 고체상 기술을 이용하는 직접적 펩티드 합성에 의해 생산된다 (예컨대, [Stewart 등 (1969) 고체상 펩티드 합성(Solid-Phase Peptide Synthesis), WH Freeman Co., 미국 샌프란시스코 소재; Merrifield J. (1963) J Am Chem Soc 85: 2149-2154)]을 참고한다). 펩티드 합성은 수동적 기술을 이용하거나 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어, [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 431A 펩티드 합성기 (퍼어킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 캘리포니아주 포스터시 소재)]를 이용하여, 그 제조업자에 의해 제공되는 지시사항에 따라, 달성될 수 있다. 예를 들어, 하위서열은 전장 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 제공하기 위한 화학적 방법을 이용하여, 별도로 화학적으로 합성되어 조합될 수 있다. 대안적으로, 그러한 서열은 폴리펩티드의 생산을 전문으로 하는 임의의 수의 회사들로부터 주문될 수 있다. 가장 통상적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 예컨대 하기 기재된 바와 같이, 코딩 핵산을 발현하고, 폴리펩티드를 회수함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 방법도 또한 포함된다. 그러한 한 방법은 코딩된 폴리펩티드를 생산하기에 유효한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 본 발명의 임의의 핵산을 세포 집단 도입하고, 배양 배지에서 세포를 배양하여 폴리펩티드를 발현시키며, 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함한다. 세포의 섭취 (트랜스펙션) 및/또는 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하기 위해 충분한 양의 핵산을 이용한다. 예컨대 주입, 유전자 총, 패시브 섭취 등을 포함하는, 본원에 기재된 전달 방법에 의해 상기 세포에 핵산을 도입한다. 핵산은 DNA 플라스미드 벡터, 또는 본원에 기재된 임의의 벡터를 포함하는, 재조합 발현 벡터와 같은 벡터의 부분일 수 있다. 본원에서 상기에 기재된 바와 같이, 핵산 또는, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제조할 수 있다. 그러한 핵산 또는 발현 벡터를 포유동물 생체내의 세포의 집단에 도입할 수 있거나, 포유동물의 선택된 세포 (예컨대, 종양 세포)를 포유동물로부터 제거하고, 핵산 발현 벡터를, 코딩된 폴리펩티드의 섭취 및 발현이 초래되도록 하기 위해 충분한 양으로 상기 세포의 집단에 세포외 도입한다. 혹은, 핵산 또는, 본 발명의 핵산을 생체외 배양된 세포를 이용하여 생산한다. 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드의 생산 방법은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를, 코딩된 폴리펩티드의 섭취 및 발현이 초래되도록 하기 위해 충분한 양으로 상기 세포의 집단에 도입함; 본원에 기재된 임의의 도입/전달 형식으로 발현 벡터를 포유동물에 투여함; 및 포유동물 또는 포유동물의 부산물로부터 폴리펩티드를 단리함으로 포함한다.
항체
본 발명의 다른 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드 (또는 그것의 항원성 단편)는 폴리펩티드 및 그것의 단편의 활성, 분포 및 발현과 관련하여 예컨대 진단용, 치료적, 또는 예방적 용도를 가지는 항체를 생산하는데 사용된다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 그러한 항체는 비제한적으로 다클론성, 단클론성, 키메라, 인간화된, 단일 사슬, Fab 단편, 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성되는 단편을 포함할 수 있다. 항체, 예컨대 수용체 결합을 막는 항체들이 치료적 및/또는 예방적 용도를 위해 특히 바람직하다.
항체 유도를 위한 폴리펩티드는 생물학적 활성을 필요로 하지 않으나, 폴리펩티드 또는 펩티드는 항원성이어야 한다. 특이적 항체를 유도하는데 사용되는 펩티드는 약 10 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 15 또는 20 이상의 아미노산 또는 약 25 또는 30 이상의 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 짧은 신장의 폴리펩티드는 또 다른 한 단백질, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH; keyhole limpet hemocyanin), 및 키메라 분자에 대항하여 생산된 항체와 융합될 수 있다.
다클론성 및 단클론성 항체의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 많은 항체들이 이용가능하다. 예컨대, [Current Protocols in Immunology, John Colligan 등 편저, 제I-IV권 (John Wiley & Sons,Inc., 미국 뉴욕 소재, 1991 및 2001 별책); 및 Harlow 및 Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, 미국 뉴욕 소재; Stites 등 (편저) Basic and Clinical Immunology (제4판) Lange Medical Publications, 미국 캘리포니아주 로스알토스 소재, 및 그 문헌 내에 인용된 참고문헌들; 및 Goding (1986) Monoclonic Antibodies: Principles and Practice (제2판) Academic Press, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재; 및 Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256: 495-497]을 참고한다. 항체 제조를 위한 다른 적당한 기술은 파지 또는 유사 벡터에서 재조합 항체의 라이브러리의 선택을 포함한다. [Huse 등 (1989) Science 246:1275-1281; 및 Ward 등 (1989) Nature 341: 544-546]을 참고한다. 특정 단클론성 및 다클론성 항체 및 항혈청은 주로 약 0.1 μM 이상, 바람직하게는 약 0.01 μM 이상, 가장 전형적으로 또한 바람직하게는, 0.001 μM 이상의 KD로 결합한다.
키메라 (인간화) 항체의 상세한 제조 방법은 U.S. 특허 5,482,856에서 찾아볼 수 있다. 인간화 및 다른 항체 생산 및 공학처리 기술에 대한 부가적 상세 내용은 [Borrebaeck (편저) (1995) Antibody Engineering, 제2판 Freeman and Company, 미국 뉴욕 소재 (Borrebaeck); McCafferty 등 (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL, Oxford Press, 영국 옥스포드 소재 (McCafferty), 및 Paul (1995) Antibody Engineering Protocol humana Press, 미국 뉴저지주 토와타 소재 (Paul)]에서 찾아볼 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 단편에 대한 충분히 인간화된 항체를 제공한다. 인간화된 항체는 항체가 인간 환자에서 생체내 치료제 및/또는 예방제로서 사용되는 용도들에서 특히 바람직하다. 인간 항체는 특징적으로 인간 면역글로불린 서열로 구성된다. 본 발명의 인간 항체는 광범위하게 다양한 방법들을 이용하여 생산될 수 있다 (예컨대, [Larrick 등, U.S. 특허 제5,001,065호, 및 Borrebaeck McCafferty 및 Paul, 이하 상기와 동일함]을 참고한다). 한 측면에서, 본 발명의 인간 항체는 트리오마 세포에서 초기 생산된다. 이어서, 항체를 코딩하는 유전자가 다른 세포, 예컨대 비인간 포유동물의 세포에서 클로닝 및 발현된다. 트리오마 기술에 의한 인간 항체의 생산을 위한 일반적 방법이 [Ostberg 등 (1983), Hybridoma 2:361-367, Ostberg, U.S. 특허 제4,634,664호, 및 Engelman 등, U.S. 특허 제4,634,666호]에 기재되어 있다. 이 방법에 의해 수득된 항체-생산 세포주는 3개 세포-2개 인간 및 1개 마우스로부터 유래되기 때문에, 트리오마라고 불린다. 트리오마는 인간 세포로부터 제조된 일반적 하이브리도마보다 더욱 안정하게 항체를 생산한다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해 고찰되는 다른 용도들은 명세서 전반에 걸쳐 제공된다.
인터페론-알파 접합체
다른 한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드, 및 폴리펩티드의 결합기에 결합된 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기, 예컨대 폴리펩티드의 결합기에 결합된 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 예컨대 1 또는 2 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 접합체는 또한 인터페론-알파 활성 (예컨대, 항바이러스 활성, TH1 분화 활성, 및/또는 증식억제 활성)을 나타냄이 이해될 것이다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하는 접합체로서, 폴리펩티드가 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 도입되거나 제거된 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기에서, 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나 (예컨대, 서열번호 1-15, 47, 또는 53 중 하나)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 접합체에 관한 것이다. 이 측면에 따라 도입 및/또는 제거되는 아미노산 잔기의 예가 하기 단락에서 더욱 상세하게 기재된다. 접합체는 그 자체가 또한 인터페론-알파 활성을 나타냄이 이해될 것이다.
다른 한 측면에서, 접합체는 0-16 아미노산 위치 (예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 0-14 아미노산 위치, 0-12 아미노산 위치, 0-10 아미노산 위치, 0-8 아미노산 위치, 0-6 아미노산 위치, 0-5 아미노산 위치, 0-4 아미노산 위치, 0-3 아미노산 위치, 0-2 아미노산 위치, 또는 0-1 아미노산 위치에서, 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 것 (예컨대, 서열번호 1-15, 47, 또는 53 중 하나)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기가 (예컨대, 아미노산 잔기의 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 상이한 잔기로의 치환에 의해, 또는 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 부가적 아미노산 잔기의 삽입에 의해) 도입된다.
용어 "접합체" (또는 상호 교환적으로 "폴리펩티드 접합체" 또는 "접합 폴리펩티드")는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드의 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기로의 공유 결합에 의해 형성된 (복합물의 의미에서) 이종성인 분자를 가리키는 것으로 의도된다. 용어 "공유 결합"은 폴리펩티드 및 비폴리펩티드 부분기 는 상호 직접적으로 공유 결합되거나, 혹은 그와 달리 개입 부분기 또는 부분기들, 예컨대 연결기, 스페이서 또는 연결 부분기 또는 부분기들을 통해 상호 간접적으로 공유 결합됨을 의미한다. 바람직하게, 접합 폴리펩티드는 관련 농도 및 조건에서 가용성이며, 즉 혈액과 같은 생리학적 유체 내에서 가용성이다. 본 발명의 접합 폴리펩티드의 예는 글리코실화 및/또는 PEG화 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "비접합 폴리펩티드"는 접합 폴리펩티드의 폴리펩티드 부분을 가리키는데 사용될 수 있다.
용어 "비폴리펩티드 부분기"는 폴리펩티드의 부분기에 접합 결합될 수 있는 분자를 의미하도록 의도된다. 비폴리펩티드 부분기의 바람직한 예는 중합체 분자, 당 부분기, 친지성 화합물 또는 유기 유도화제, 특히 중합체 분자 또는 당 부분기를 포함한다. 비폴리펩티드 부분기가 폴리펩티드의 결합기를 통해 폴리펩티드에 연결됨이 이해될 것이다. 비폴리펩티드 부분기, 예컨대 폴리펩티드에 결합된 중합체 분자(들)의 수가 명시적으로 표시되는 경우를 제외하고는, 폴리펩티드에 부착되거나 그와 달리 본 발명에서 사용되는 "비폴리펩티드 부분기"에 관한 모든 참조는 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기를 참조하도록 한다.
용어 "중합체 분자"는 2개 이상의 단량체들의 공유 연결에 의해 형성되는 분자로 정의되며, 여기에서 단량체는 모두 아미노산 잔기가 아니다. 용어 "중합체"는 용어 "중합체 분자"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "당 부분기"는 생체내 또는 생체외 글리코실화, 예컨대 N- 또는 O-글리코실화에 의해 결합된 탄수화물 분자를 가리키도록 의도된다.
"N-글리코실화 부위"는 서열 N-X-S/T/C (여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, N은 아스파라긴이며, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌, 가장 바람직하게는 트레오닌임)를 가진다.
"O-글리코실화 부위"는 세린 또는 트레오닌 잔기의 OH-기를 포함한다.
용어 "결합기"는 관련 비폴리펩티드 부분기, 예컨대 중합체 분자 또는 당 부분기에 결합될 수 있는 아미노산 잔기를 가리키기 위한 것이다. 유용한 결합기 및 일부 상응하는 비폴리펩티드 부분기의 비제한적 예가 하기 표 4에 제공된다.
생체내 N-글리코실화에 관해, 용어 "결합기"는 [서열 N-X-S/T/C (여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, N은 아스파라긴이며, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌, 가장 바람직하게는 트레오닌임)를 가지는] N-글리코실화 부위를 구성하는 아미노산 잔기를 가리키는 것으로 비통상적인 방식으로 사용된다. N-글리코실화 부위의 아스파라긴 잔기가 글리코실화 중에 당 부분기가 결합되는 잔기이나, 그러한 결합은 N-글리코실화 부위의 다른 아미노산 잔기가 존재하지 않을 경우, 달성될 수 없다. 따라서, 비폴리펩티드 부분기가 당 부분기이고, 접합이 N-글리코실화에 의해 달성될 때, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변경과 연관되어 사용되는 용어 "비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기"는 N-글리코실화 부위를 구성하는 아미노산 잔기들 중 1개, 2개 또는 모두가 기능적 N-글리코실화 부위가 상기 서열로부터 제거된 아미노산 서열로 도입되거나, (예컨대, N-글리코실화 부위의 부분을 이미 구성하는 세린 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하고, 그 역으로 치환함으로써) 기능적 N-글리코실화 부위가 아미노산 서열에 보유되도록 하는 방식으로 변경되어지는 것으로 이해한다.
용어 "도입(하다)" (즉, "도입된" 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 "도입")은 주로 존재하는 아미노산 잔기의 또 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하도록 의도되어지나, 부가적 아미노산 잔기의 삽입을 또한 의미할 수도 있다.
용어 "제거(하다)" (즉, "제거된" 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 "제거") 는 또 다른 아미노산 잔기를 위해 제거되는 아미노산 잔기의 치환을 의미하는 것으로 주로 의도되나, 제거되는 아미노산 잔기의 결실 (무치환)을 의미할 수도 있다.
용어 "비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기"는 아미노산 잔기가 비폴리펩티드 부분기가 (도입된 아미노산 잔기의 경우에는) 결합하는 잔기, 또는 (제거된 아미노산 잔기의 경우에는) 결합된 잔기인 것을 가리키도록 의도된다.
용어 "기능적 생체내 반감기"는 정상적 의미로, 즉 폴리펩티드의 생물학적 활성의 50%가 여전히 생체/표적 기관에 여전히 존재하는 시간, 또는 폴리펩티드의 활성이 초기 값의 50%인 시간을 가리키도록 사용된다. 기능적 생체내 반감기는 실험적 동물, 예컨대 래트, 마우스, 토끼, 개 또는 원숭이에서 결정될 수 있다. 바람직하게, 기능적 생체내 반감기는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 결정된다. 또한, 기능적 생체내 반감기는 정맥내 또는 피하내 투여된 샘플에 대해 결정될 수 있다.
기능적 생체내 반감기를 결정하는 것의 대안으로서, "혈청 반감기", 즉 폴리펩티드의 50%가 소거되기 전에 혈장 또는 혈류에서 순환되는 시간이 결정될 수 있다. 혈청 반감기의 결정은 종종 기능적 생체내 반감기를 결정하는 것보다 더욱 간단하고, 혈청 반감기의 크기는 주로 기능적 생체내 반감기의 좋은 지시자이다. 대안적으로, 혈청 반감기에 대한 용어는 "혈장 반감기", "순환 반감기", "혈청제거율", "혈장 제거율" 및 "제거율 반감기"를 포함한다. 혈청 반감기는 기능적 생체내 반감기의 결정과 연관하여 상기 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 "혈청"은 정상적 의미로, 즉 피브리노겐 및 다른 응고 인자없이 혈액 혈장으로서 사용된다.
기능적 생체내 반감기 또는 혈청 반감기에 대해 사용되는 용어 "증가된"은 본 발명의 접합체의 관련 반감기가 상당히 증가된 서열번호 31 내지 서열번호 42 중 하나 (또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O.(1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 다른 huIFN-알파 서열), 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드임을 가리키도록 사용된다. 이에 따라, 본 발명의 유익 접합체는 상기 언급된 기준 분자에 비해 증가된 기능적 생체내 반감기 또는 증가된 혈청 반감기를 가지는 접합체들을 포함한다.
용어 "AUCsc" 또는 "피하 투여될 때 곡선 아래의 면적"은 정상적 의미로, 즉 혈청 내 인터페론-알파-활성 대(vs). 시간 곡선 아래의 면적으로서 사용되며, 여기에서 접합 분자가 실험적 동물에 피하 투여되었다. 일단 실험적 인터페론-알파 활성 시점이 결정되면, AUCsc는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 3.01에 의해 편리하게 계산될 수 있다.
AUCsc에 대해 사용되는 용어 "증가된"은 본 발명의 접합체에 대한 곡선 아래의 면적이, 피하 투여될 때,필적하는 조건 하에서 결정시에, 기준 분자, 예를 들어 야생형 인터페론-알파, 예컨대 인간 인터페론-알파, 예컨대 서열번호 31 내지 서열번호 42 중 하나 (또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O.(1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 다른 huIFN-알파 서열), 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드의 면적에 비해 통계학적으로 상당히 증가됨을 가리키도록 사용된다. 분명히, 동량의 인터페론-알파 활성이 본 발명의 접합체 및 기준 분자에 대해 투여되어야 한다. 결과적으로, 상이한 인터페론-알파 분자들 간의 직접적 비교를 행하기 위해, AUCsc 값은 전형적으로 정규화되어야, 즉 AUCsc/투여량으로 표시되어야 한다.
용어 "Tmax,sc"는 혈청 내 인터페론-알파-활성 대 시간 곡선에 있어 혈청 내 최고의 인터페론-알파 활성이 관찰되는 시점에 관해 사용된다.
모 폴리펩티드에 대한 예 및 변형은 일반적으로 서열 서열번호 1에 대해 본원에서 일반적으로 제공되며, 개시된 변형은 또한 상기 기재된 (서열번호 2-15 및 44-104 및 그것의 변이체를 포함하는) 본 발명의 다른 폴리펩티드들 중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에서 이루어질 수도 있음이 이해되어 진다.
비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기를 제거 및/또는 도입함으로써, 분자를 선택의 비폴리펩티드 부분기에 대한 접합이 더욱 쉽도록 하기 위해 폴리펩티드를 특별히 적응시켜, 접합 패턴을 최적화하는 (예컨대, 인터페론-알파 분자의 표면 상의 비폴리펩티드 부분기의 최적 분포를 확실히 하고, 이로써 예컨대, 폴리펩티드의 에피토프 및 다른 표면 부분을, 그 기능을 상당히 저해하지 않으면서 차폐하는) 것이 가능하다. 예를 들어, 결합기를 도입함으로써, 인터페론-알파 폴리펩티드는, 관련 비폴리펩티드 부분기가 결합함으로써, 더욱 효율적, 특이적 및/또는 광대한 접합이 달성되는 특이적 아미노산 잔기의 함량에서 변경된다. 하나 이상의 결합기의 제거에 의해, 그러한 접합이 불리한 폴리펩티드의 부분에서의 비폴리펩티드 부분기, 예컨대 폴리펩티드의 기능적 부위에서 또는 그 부근에 위치한 아미노산 잔기에 대한 접합을 피하는 것이 가능하다 (왜냐하면, 그러한 부위에서의 접합은 손상된 수용체 인식으로 인한 수득된 접합체의 볼활성화 또는 감소된 인터페론-알파 활성을 초래할 수 있기 때문이다). 또한, 다른 한 결합기에 근접하게 위치한 한 결합기를 제거하는 것이 유리할 수 있다.
비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기가, 그것의 제거 또는 도입 여부와 상관없이, 비폴리펩티드 부분기의 성질을 기초로, 또한 일부 예들에서는 사용되는 접합 방법을 기초로 하여 선택됨이 이해될 것이다. 예를 들어, 비폴리펩티드 부분기가 중합체 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥시드 유도 분자인 경우, 결합기로서 기능할 수 있는 아미노산 잔기는 시스테인, 리신 (및/또는 폴리펩티드의 N-말단 아미노기), 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 비폴리펩티드 부분기가 당 부분기인 경우, 결합기는 생체내 또는 생체외 N- 또는 O-글리코실화 부위, 바람직하게는 N-글리코실화 부위이다.
일부 예에서, 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기가 인터페론-알파 폴리펩티드로 도입되거나, 그로부터 제거되는 경우, 변형되는 인터페론-알파 폴리펩티드의 위치가 하기와 같이 편리하게 선택될 수 있다.
변형되는 위치는 인터페론-알파 폴리펩티드의 표면, 예컨대 용매에 노출된 측쇄의 25% 초과, 예컨대 용매에 노출된 측쇄의 50% 초과인 아미노산 잔기가 차지하는 위치에 위치할 수 있다. 그러한 위치는 본원의 "물질 및 방법"에 기재된 바와 같은 인간 인터페론-알파 2a 분자의 3D 구조의 분석을 기초로 확인되었다.
대안적으로 또는 부가적으로, 변형되는 위치는 (예컨대, 도 2 및 4에 나와 있는 배열에서 나타나는) 인터페론-알파 단백질 서열 부류의 분석을 기초로 확인될 수 있다. 하기 예를 목적으로, 도 2의 배열의 상단 라인에 나와 있는 서열번호 1은 변형되는 모 인터페론-알파로 간주될 수 있고, 배열의 나머지에서의 인간 인터페론-알파 서열은 그 부류의 다른 원들로 간주된다. 예를 들어, 모 서열에서 변형되는 위치는, 모 인터페론-알파 이외의 부류의 하나 이상의 원들에서, (그러한 아미노산 잔기가 모 서열에 도입되는 경우) 관련 결합기를 포함하는 아미노산 잔기가 차지하는 위치 (a), 또는 그 부류의 하나 이상의 다른 원들이 아닌 모 인터페론-알파에서, (그러한 아미노산 잔기가 모 서열로부터 제거되는 경우) 관련 결합기를 포함하는 아미노산 잔기가 차지하는 위치 (b)일 수 있다.
결합기의 최적 분포를 결정하기 위해, 인터페론-알파 분자의 표면에 위치한 아미노산 잔기들 간의 거리를 인터페론-알파 폴리펩티드의 3D 구조를 기초로 하여 계산하였다. 보다 구체적으로, 그러한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기의 CB들 간의 거리, 또는 하나의 아미노산 잔기의 관능기 (리신의 경우에는 NZ, 아스파르트산의 경우에는 CG, 글루탐산의 경우에는 CD, 시스테인의 경우에는 SG), 및 결합기를 포함하는 또 다른 아미노산 잔기의 CB 간의 거리를 결정하였다. 글리신의 경우, CA를 CB 대신에 사용하였다. 본 발명의 접합체의 인터페론-알파 폴리펩티드 부분에서, 상기 거리들 중 임의의 거리는, 이종성 접합을 피하거나 감소시키고, 예컨대 에피토프 차폐를 이용하여, 결합기의 균일한 분포를 제공하기 위해, 8 Å 초과, 예컨대 10 Å 초과일 수 있다.
또한, 본 발명의 접합체의 인터페론-알파 폴리펩티드 부분에서, 일부 예들에서 인터페론-알파의 수용체 결합 부위에 또는 그 부근에 시스테인 또는 리신과 같은 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하는 위치한 결합기가 예컨대, 그러한 기를 포함하는 아미노산 잔기의 제거에 의해 제거된다. 일부 예에서, 아미노산 잔기는 종종 인터페론-알파 분자의 수용체 결합 부위에 또는 그 부근에 도입되지 않는다.
인터페론-알파 폴리펩티드의 또 다른 변형 방법은, 비폴리펩티드 부분기에 대한 접합에 의해, 모 인터페론-알파에 존재하는 에피토프를 차폐함으로써 변형 또는 파괴하거나, 그와 달리 불활성화시키는 것이다. 인터페론-알파 폴리펩티드의 에피토프는 에피토프 매핑으로도 알려진 당업계에 공지된 방법을 이용함으로써 동정될 수 있고, 이에 대해 예컨대 [Romagnoli 등, J. Biol Chem., 1999, 380(5): 553-9, DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999,96: 11-20, Van de Water 등, Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85(3): 229-35, Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1):77-81, 및 Lane DP 및 Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268-71]을 참고한다. 한 방법은, 예컨대 9 아미노산 잔기의 무작위 올리고펩티드를 발현하는 파지 발현 라이브러리를 구축하는 것이다. 인간 인터페론-알파에 대한 특이적 항혈청으로부터의 IgG1 항체를 면역석출에 의해 정제하고, 반응성 파지를 면역블로팅에 의해 동정한다. 정제된 반응성 파지의 DNA를 시퀀싱함으로써, 올리고펩티드의 서열을 결정한 후, 인터페론-알파의 3D-구조 상의 서열의 국소화를 할 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 US 특허 제5,041,376호에 기재된 방법에 따라 동정될 수 있다. 이로써 동정된 구조 상의 영역은 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기의 도입을 위한 표적 영역으로서 이후 선택될 수 있는 에피토프를 구성한다. 바람직하게, 하나 이상의 에피토프, 예컨대 인터페론-알파의 2, 3 또는 4개의 에피토프는 본 발명에 따라서 비폴리펩티드 부분기에 의해 차폐된다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 접합체는 임의의 시중 입수가능한 인터페론-알파를 포함하는 야생형 인간 인터페론-알파에 비해, 하나 이상의 차폐된 에피토프를 가진다. 이는 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 주어진 에피토프의 부근 (즉, 1차 서열에서의 4 아미노산 잔기, 또는 3차 서열에서의 약 10 Å 이내)에 위치한 위치로 도입함으로써 행해질 수 있다. 10 Å 거리가 CB들 (글리신의 경우에는 CA들) 간에 측정된다. 그러한 특이적 도입은 하기 단락에 기술된다.
결합기의 제거의 경우에는, 그러한 기를 포함하고, 상기 정의된 바와 같은 위치를 차지하는 관련 아미노산 잔기는 관심 비폴리펩티드 부분기에 대한 결합기를 포함하지 않는 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있거나, 삭제될 수 있다. N-글리코실화 기의 제거는, 또한 모티프 N-X-S/T/C 내의 아미노산 잔기의 삽입 또는 제거에 의해 달성될 수도 있다.
결합기의 도입의 경우에, 그러한 기를 포함하는 아미노산 잔기는 그러한 위치를 차지하는 아미노산 잔기의 치환에 의해, 위치에 도입된다.
접합에 유용하고, 인터페론-알파 폴리펩티드에 존재하는 결합기의 정확한 수는, 접합에 의해 달성되는 원하는 효과에 의존한다. 얻어지는 효과는 예컨대, 접합의 성질 및 정도 (예컨대, 비폴리펩티드 부분기의 일치도, 폴리펩티드에 대한 접합이 바람직하거나 가능한 비폴리펩티드 부분기 (여기에서, 그것은 접합이거나, 접합이 피해져야 함, 기타)에 의존한다. 예를 들어, 감소된 면역원성이 요망되는 경우, 결합기의 수 (및 위치)는 에피토프들을 대부분 또는 모두 차폐하기에 충분해야 한다. 이는, 보다 큰 분율의 인터페론-알파 폴리펩티드가 차폐될 때, 정상적으로 수득된다. 에피토프의 효과적인 차폐는 접합에 유용한 결합기의 총수가 1-6개 결합기, 예를 들어 1-5개의 범위, 예컨대 1-3개의 범위, 예컨대 1, 2, 또는 3개 결합기일 때, 정상적으로 달성된다.
기능적 생체내 반감기는 증가된 반감기를 제공하는데 필요한 결합기의 수 및 접합체의 분자량에 의존하며, 이에 따라 관심 비폴리펩티드 부분기의 분자량에 의존한다. 일부 그러한 접합체는 각기 약 2-40 kDa, 예컨대 약 2 kDa, 약 5 kDa, 약 12 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa 또는 약 40 kDa의 MW를 갖는 1-6, 예컨대 1-5, 예를 들어 1-3, 예컨대 1, 2, 또는 3 비폴리펩티드 부분기를 포함한다.
본 발명의 접합체에서, 일부, 대부분 또는 실질적으로 모든 접합 결합기는 관련 비폴리펩티드 부분기가 차지한다.
본 발명의 접합체는 하기 향상된 성질들 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
예를 들어, 접합체는 인간 인터페론-알파 (예컨대, 서열번호 31-42, 서열번호 32+R23K로서 본원에 정의된 폴리펩티드들 중 임의의 것, 또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 임의의 다른 huIFN-알파)에 비해, 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드에 비해 감소된 면역원성, 예를 들어 비접합 폴리펩티드 또는 인간 인터페론-알파에 비해, 예컨대 10% 이상의 감소, 예를 들어 25% 이상의 감소, 예컨대 50% 이상의 감소, 예컨대 75% 이상의 감소를 나타낼 수 있다.
다른 한 측면에서, 접합체는 인간 인터페론-알파 (예컨대, 서열번호 31-42, 서열번호 32+R23K로서 본원에 정의된 폴리펩티드들 중 임의의 것, 또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 임의의 다른 huIFN-알파)로 처리된 환자로부터 중성화 항체와 감소된 반응 또는 무반응, 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드에 비해 감소된 반응 또는 무반응, 예컨대, 10% 이상, 예를 들어 25% 이상, 예컨대 50% 이상, 예를 들어 75% 이상의 중성화 감소를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 한 측면에서, 접합체는 인간 인터페론-알파 (예컨대, 서열번호 31-42, 서열번호 32+R23K로서 본원에 정의된 폴리펩티드들 중 임의의 것, 또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 임의의 다른 huIFN-알파)와 같은 기준 분자에 비해 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드에 비해 증가된 기능적 생체내 반감기 및/또는 증가된 혈청 반감기를 나타낼 수 있다. 특별한 바람직한 접합체는 상기 접합체의 기능적 생체내 반감기 (또는 혈청 반감기) 및 상기 기준 분자의 기능적 생체내 반감기 (또는 혈청 반감기) 간의 비가 1.25 이상, 예를 들어 1.50 이상, 예컨대 1.75 이상, 예컨대 2 이상, 예컨대 3 이상, 예컨대 4 이상, 예컨대 5 이상, 예컨대 6 이상, 예컨대 7 이상, 예컨대 8 이상이도록 하는 접합체이다. 상기 언급된 바와 같이, 반감기는 실험적 동물, 예컨대 래트 또는 원숭이에서 편리하게 결정되고, 정맥내 또는 피하 투여에 기초할 수 있다.
추가적 한 측면에서, 접합체는 (예컨대, 서열번호 31-42, 서열번호 32+R23K로서 본원에 정의된 폴리펩티드들 중 임의의 것, 또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 임의의 다른 huIFN-알파)와 같은 기준 분자에 비해 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드에 비해, 증가된 생체이용성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 접합체는 인간 인터페론-알파와 같은 기준 분자 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드에 비해 증가된 AUCse를 나타낼 수 있다. 이에 따라, 예시적 접합체는, 피하 투여될 때, 특히 실험적 동물, 예컨대 래트 또는 원숭이에 피하 투여될 때, 상기 접합체의 AUCse 및 상기 기준 분자의 AUCsc 간의 비가 1.25 이상, 예컨대 1.5 이상, 예컨대 2 이상, 예컨대 3 이상, 예컨대 4 이상, 예컨대 5 이상 또는 6 이상, 예컨대 7 이상, 예컨대 8 이상, 예컨대 9 이상 또는 10 이상, 예컨대 12 이상, 예컨대 14 이상, 예컨대 16 이상, 예컨대 18 이상 또는 20 이상이도록 하는 접합체이다. 유사하게, 본 발명의 일부 접합체는, 피하 투여될 때, 특히 실험적 동물, 예컨대 래트 또는 원숭이에 피하 투여될 때, 상기 접합체에 대한 Tmax 및 상기 기준 분자, 예컨대 인간 인터페론-알파 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드에 대한 Tmax 간의 비가 1.2 이상, 예컨대 1.4 이상, 예컨대 1.6 이상, 예컨대 1.8 이상, 예컨대 2 이상, 예컨대 2.5 이상, 예컨대 3 이상, 예컨대 4 이상, 예컨대 5 이상, 예컨대 6 이상, 예컨대 7 이상, 예컨대 8 이상, 예컨대 9 이상, 예컨대 10 이상이도록 하는 접합체이다.
일부 예에서, 본 발명의 접합체의 항바이러스 활성의 크기는 (예컨대, 약 75% 이상, 약 50% 이상, 약 25% 이상, 약 10% 이상) 감소되거나, (예컨대, 약 10% 이상) 증가될 수 있거나, 혹은 인간 인터페론-알파 (예컨대, 서열번호 31-42, 서열번호 32+R23K로서 본원에 정의된 폴리펩티드들 중 임의의 것, 또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 임의의 다른 huIFN-알파) 의 크기, 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드의 크기와 (예컨대, 약 +/-10% 또는 약 +/-5% 이내에서) 동일하다 . 일부 예에서, 본 발명의 접합체의 증식억제 활성 대비의 항바이러스 활성의 정도는 변화할 수 있고, 이에 따라 인간 인터페론-알파의 항바이러스 활성의 정도 또는 상응하는 비접합 폴리펩티드의 항바이러스 활성의 정도보다 높거나, 낮거나 대략 동일할 수 있다.
비폴리펩티드 부분기가 시스테인 잔기에 결합하는 본 발명의 접합체
다른 한 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내고 아미노산 서열이 0-16 아미노산 위치에서 모 인터페론-알파 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 것 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나)의 아미노산 서열을 포함하는 인터페론-알파 폴리펩티드의 경우와 상이한 접합체로서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 예컨대, 치환 또는 삽입에 의해 분자의 표면에 노출된 아미노산 잔기, 바람직하게는 표면에 노출된 측쇄들의 25% 이상, 예컨대 50% 이상을 가지는 것에 의해 모 인터페론-알파에 차지되는 위치로 도입되었음을 특징으로 한다. 전형적으로, 접합체는 1-16 아미노산 위치 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 1-14 아미노산 위치, 1-12 아미노산 위치, 1-10 아미노산 위치, 1-8 아미노산 위치, 1-6 아미노산 위치, 1-5 아미노산 위치, 1-4 아미노산 위치, 1-3 아미노산 위치, 또는 1-2 아미노산 위치에서 예컨대, 서열번호 1-15, 47 또는 53 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 접합체는 25% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되는 위치로 시스테인 잔기를 도입하는, 서열번호 1을 기준으로 한 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, L30C, K31C, R33C, H34C, D35C, R37C, Q40C, E41C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71C, N72C, S74C, A75C, D78C, E79C, T80C, L81C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, E97C, A98C, V100C, M101C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, M112C, N113C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, Q125C, R126C, T128C, L129C, T132C, K133C, K134C, K135C, Y136C, S137C, P138C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161C, L162C, R163C, R164C, K165C 및 E166C (상기 아미노산 잔기 위치는 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 상기 언급된 위치들 중에서, 위치 47, 51 및 133에서의 아미노산 잔기들 중 하나 이상은 시스테인으로 치환되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 일부 그러한 접합체는 50% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되는 위치로 시스테인 잔기를 도입하는, 서열번호 1을 기준으로 한 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다: D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, R12C, R13C, M16C, A19C, S25C, F27C, S28C, K31C, R33C, H34C, D35C, R37C, E41C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, N66C, K71C, A75C, D78C, E79C, T80C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, M101C, Q102C, E103C, G105C, E107C, E108C, T109C, PIlOC, L111C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, Q125C, R126C, L129C, T132C, K133C, K135C, P138C, R150C, K160C, L162C, R163C, R164C, K165C 및 E166C (상기 아미노산 잔기 위치는 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 위치 47 및 133에서의 아미노산 잔기들 중 하나 또는 양자 모두는 시스테인으로 치환되지 않는다.
상기 나타낸 바와 같이, 일부 예들에서, 시스테인 잔기를 인터페론-알파의 잠재성 수용체 결합 부위의 외부, 즉, 약 위치 29-40, 79-96, 및 124-141의 외부 (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함)에 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
이에 따라, 일부 예들에서, 하나 이상의 시스테인 치환은 하기 것들로 구성된 군으로부터 선택된다: 서열번호 1을 기준으로 한, D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, E41C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71C, N72C, S74C, A75C, E97C, A98C, V100C, M101C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, Ml12C, N113C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, K160C, R161C, L162C, R163C, R164C, K165C 및 E166C (25% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되고, 추정적 수용체 결합 부위의 일부가 아닌 위치). 일부 예에서, 위치 47 및 51 중 하나 또는 양자 모두는 시스테인으로 치환되지 않는다.
다른 측면들에서, 시스테인 치환은 하기 것들로 구성된 군으로부터 선택된다: 서열번호 1을 기준으로 한, D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, R12C, R13C, M16C, A19C, S25C, F27C, S28C, E41C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, N66C, K71C, A75C, M101C, Q102C, E103C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, R150C, K160C, L162C, R163C, R164C, K165C 및 E166C (50% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되고, 추정적 수용체 결합 부위의 일부가 아닌 위치). 일부 예에서, 위치 47은 시스테인으로 치환되지 않는다.
본 발명의 일부 그러한 접합체는 서열번호 1을 기준으로 하여, 치환 S25C, S28C, L30C, K31C, N46C, K71C, S74C, A75C, E79C, E107C, E108C, T132C, K133C, P138C, 및 K135C 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
다른 한 측면에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는, 치환 (서열번호 1을 기준으로 하여, 예를 들어, Q159C, K160C, R161C, L162C, R163C, R164C, K165C 또는 E166C)에 의해, 또는 삽입 (예를 들어, 167C로도 본원에서 칭해지는 E166EC)에 의해, C-말단에 또는 그 부근에 도입된다. 시스테인 잔기는 또한 본원에 기재된 인터페론-알파 분자의 C-말단으로 끊긴 단편에서 치환 또는 삽입에 의해 도입될 수도 있음이 이해될 것이다.
일부 예에서, 2개 이상 도입된 시스테인 잔기들 간의 디술피드의 연결기의 형성을 피하기 위해, 단지 하나의 시스테인 잔기만이 도입된다.
인터페론 알파에서, 디술피드 결합은 위치 1/99 및 29/139에 있는 시스테인 사이에 형성된다. 디술피드 결합 29/139는 생물학적 활성에 필수적이나, 1/99 결합은 생물학적 활성을 상당히 저해하지 않으면서 감소될 수 있다 (Beilharz M.W. 등 (1986) J. Interferon Res. 6(6):677-685). 이에 따라, 본 발명이 또 다른 한 측면에서, C1 또는 C99 중 하나가 바람직하게는 치환에 의해, 예컨대 C1S 또는 C99S에 의해 제거됨으로써, 비폴리펩티드 부분기의 접합에 유용한 다른 시스테인 잔기를 이탈시킨다.
본 발명의 이 측면에서 고찰되는 비폴리펩티드 부분기는 중합체 분자, 예를 들어 제목 "중합체 분자에 대한 접합"에 언급된 분자들 중 임의의 것, 예컨대 PEG 또는 mPEG를 포함한다. 시스테인-함유 폴리펩티드 및 중합체 분자 간의 접합은 임의의 적당한 방식으로, 예컨대 제목 "중합체 분자에 대한 접합"의 단락에 기재된 바대로, 예컨대 상기 단락에 언급된 단계별 방법 또는 단일 단계 방법으로, 달성될 수 있다. 인터페론-알파 폴리펩티드의 PEG화를 위한 한 예시적 방법은 시스테인-반응성 PEG를 이용하여 PEG를 시스테인 잔기에 공유 결합시키는 것이다. 상이한 기를 갖는 수많은 매우 특이적인, 시스테인-반응성 PEG (예컨대, 오르토피리딜-디술피드(OPSS), 말레이미드(MAL) 및 비닐술폰(VS)) 및 상이한 크기의 선형 또는 분지형 PEG (예컨대, 2-40 kDa, 예컨대 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 또는 40 kDa)가, 예컨대 [넥타르 테라퓨틱스 인코포레이티드(Nektar Therapeutics Inc.), 미국 알라바마주 헌츠빌 소재], 또는 [선바이오(SunBio), 대한민국 안양시 소재]로부터, 시중 입수가능하다.
모 폴리펩티드에 대한 변형의 예는 일반적으로 본원에서 서열 서열번호 1를 기준으로 (또는 일부 다른 특정된 서열을 기준으로) 제공되나, 개시된 변형은 또한 (서열번호 2-15 및 서열번호 44-104 및 그것의 변이체를 포함하는) 본 발명의 다른 폴리펩티드들 중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에서 이루어질 수도 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, 한 예로서, 서열번호 1을 기준으로 한 치환 H47C은 서열번호 5에서의 Q47C에 상응하는 것 등으로 이해된다.
비폴리펩티드 부분기가 리신 잔기에 결합하는 본 발명의 접합체
다른 한 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내고, 서열번호 1-15 및 44-104로부터 선택되는 서열, 또는 0-16 아미노산 위치 (예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 5, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 0-14 아미노산 위치, 0-12 아미노산 위치, 0-10 아미노산 위치, 0-8 아미노산 위치, 0-6 아미노산 위치, 0-5 아미노산 위치, 0-4 아미노산 위치, 0-3 아미노산 위치, 0-2 아미노산 위치 또는 0-1 아미노산 위치에서, 서열번호 1-15 및 44-104 중 임의의 것 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나)와 상이한 서열을 포함하는 인터페론-알파 폴리펩티드의 하나 이상의 리신 잔기, 및/또는 N-말단 아미노기에 접합된 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 이 측면에 따른 일부 접합체는 하나 이상의 제거된 리신 잔기 및/또는 하나 이상의 제거된 히스티딘 잔기, 및/또는 하나 이상의 도입된 리신 잔기를 포함한다.
본 발명의 일부 접합체는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나로부터, 하나 이상의 리신, 예컨대 K31, K50, K71, K84, K122, K133, K134, K135, K160, 및/또는 K165 (서열번호 1을 기준으로 함)를 제거하는, 아미노산 잔기의 상이한 아미노산 잔기로의 치환 또는 아미노산의 결실을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 제거되는 하나 이상의 리신 잔기(들)는 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, Arg(R) 또는 Gln(Q)으로 치환되거나, 결실될 수 있다. 일부 그러한 접합체는 치환 K31R+K122R; K31R+K133R; K122R+K133R; 또는 K31R+K122R+K133R을 포함한다. 다른 예시적 치환은 K71E; K84E; K133E/G; 및 K160E을 포함한다.
아민-반응성 접합 화학이 이용되는 경우, 예들에서, 히스티딘 잔기에 대한 접합 가능성을 피하거나 최소화시키는 것이 유리할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일부 접합체는 본 발명의 임의의 폴리펩티드 서열, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나로부터 하나 이상의 히스티딘, 예컨대 H7, H11, H34, 및/또는 H47 (서열번호 1을 기준으로 함)을 제거하는 치환 또는 결실을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 제거되는 하나 이상의 히스티딘 잔기(들)는 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나, Arg(R) 또는 Gln(Q)으로 치환되거나, 결실될 수 있다. 일부 그러한 접합체는 치환 H34Q; H47Q; 또는 H34Q+H47Q을 포함한다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 일부 접합체는 분자의 표면에 노출된 아미노산 잔기, 예컨대 표면에 노출된 측쇄의 25% 이상, 예컨대 50% 이상을 가지는 것들에 의해, 모 서열 (예컨대, 서열번호 1-15, 47, 또는 53 중 하나)에서 차지되는 위치로 리신을 도입하는 변형을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 그러한 접합체는 25% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되는 위치로 리신 잔기를 도입하는, 서열번호 1을 기준으로 한 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G10K, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, L30K, R33K, H34K, D35K, R37K, Q40K, E41K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, D78K, E79K, T80K, L81K, E83K, I87K, F90K, Q91K, N94K, D95K, E97K, A98K, V100K, M101K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, M112K, N113K, V114K, D115K, L118K, R121K, Q125K, R126K, T128K, L129K, T132K, Y136K, S137K, P138K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161K, L162K, R163K, R164K, 및 E166K (상기 아미노산 잔기 위치는 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 상기 언급된 위치들 중, 위치 47, 51, 52, 및 154에서의 아미노산들 중 하나 이상은 리신으로 치환되지 않는다.
본 발명의 일부 그러한 접합체는 50% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되는 위치로 리신 잔기를 도입하는, 서열번호 1을 기준으로 한 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다: D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, R12K, R13K, M16K, A19K, S25K, F27K, S28K, R33K, H34K, D35K, R37K, E41K, D44K, N46K, H47K, Q49K, N66K, A75K, D78K, E79K, T80K, E83K, I87K, F90K, Q91K, N94K, D95K, M101K, Q102K, E103K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, V114K, D115K, L118K, R121K, Q125K, R126K, L129K, T132K, P138K, R150K, L162K, R163K, R164K 및 E166K (상기 아미노산 잔기 위치는 서열번호 1을 기준으로 함). 일부 예에서, 상기 언급된 위치들 중, 위치 47은 리신으로 치환되지 않는다.
상기 나타낸 바와 같이, 일부 예들에서, 리신 잔기를 인터페론-알파의 잠재성 수용체 결합 부위의 외부, 즉, 약 위치 29-40, 79-96, 및 124-141의 외부 (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함)에 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 이에 따라, 일부 예들에서, 하나 이상의 리신 치환은 하기 것들로 구성된 군으로부터 선택된다: 서열번호 1을 기준으로 한, D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G10K, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, E41K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, N72K, S74K, A75K, E97K, A98K, V100K, M101K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, M112K, N113K, V114K, D115K, L118K, R121K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, R161K, L162K, R163K, R164K, 및 E166K (표면에 노출된 측쇄의 25% 초과를 가지고, 추정적 수용체 결합 부위의 부분을 형성하지 않는 잔기). 일부 예에서, 위치 47, 51, 및 154 중 하나 이상은 리신으로 치환되지 않는다.
일부 예에서, 하나 이상의 리신 치환은 하기 것들로 구성된 군으로부터 선택된다: 서열번호 1을 기준으로 한, D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, R12K, R13K, M16K, A19K, S25K, F27K, S28K, E41K, D44K, N46K, H47K, Q49K, N66K, A75K, M101K, Q102K, E103K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, V114K, D115K, L118K, R121K, R150K, L162K, R163K, R164K 및 E166K (표면에 노출된 측쇄의 50% 초과를 가지고, 추정적 수용체 결합 부위의 부분을 형성하지 않는 잔기). 일부 예에서, 위치 47는 리신으로 치환되지 않는다.
본 발명의 이 측면에 대해 고찰되는 비폴리펩티드 부분기는 중합체 분자, 예를 들어 제목 "중합체 분자에 대한 접합"에 언급된 분자들 중 임의의 것, 예컨대 PEG 또는 mPEG를 포함한다. 리신-함유 폴리펩티드 및 중합체 분자 간의 접합은 임의의 적당한 방식으로, 예컨대 제목 "중합체 분자에 대한 접합"의 단락에 기재된 바대로, 예컨대 상기 단락에 언급된 단계별 방법 또는 단일 단계 방법으로, 달성될 수 있다. 인터페론-알파 폴리펩티드의 PEG화를 위한 한 예시적 방법은 리신-반응성 PEG를 이용하여 PEG를 리신 잔기에 공유 결합시키는 것이다. 수많은 매우 특이적인, 리신-반응성 PEG (예컨대, 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA), 숙신이미딜 부타노에이트(SBA), N-히드록실숙신이미드(NHS), 및 알데히드 (예컨대, 부티르ALD)) 및 상이한 크기의 선형 또는 분지형 PEG (예컨대, 2-40 kDa, 예컨대 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 또는 40 kDa)가, 예컨대 [넥타르 테라퓨틱스 인코포레이티드, 미국 알라바마주 헌츠빌 소재], 또는 [선바이오, 대한민국 안양시 소재]로부터, 시중 입수가능하다.
모 폴리펩티드에 대한 변형의 예는 일반적으로 본원에서 서열 서열번호 1를 기준으로 (또는 일부 다른 특정된 서열을 기준으로) 제공되나, 개시된 변형은 또한 (서열번호 2-15 및 서열번호 44-104 및 그것의 변이체를 포함하는) 본 발명의 다른 폴리펩티드들 중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에서 이루어질 수도 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, 한 예로서, 서열번호 1을 기준으로 한 치환 H47K는 서열번호 5에서의 Q47K에 상응하는 것으로 이해된다.
비폴리펩티드 부분기가 당 부분기인 본 발명의 접합체
다른 한 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내고, 하나 이상의 글리코실화 부위, 바람직하게는 생체내 N-글리코실화 부위가, 분자의 표면에 노출된 아미노산 잔기, 예컨대 표면에 노출된 측쇄의 25% 이상, 예컨대 50% 이상을 가지는 것들에 의해 차지되는 위치로, 바람직하게 치환에 의해 도입된, 모 인터페론-알파 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나)와 상이한 아미노산 서열을 갖는 인터페론-알파 폴리펩티드에 접합된 하나 이상의 당 부분기를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 전형적으로, 접합체는 1-16 아미노산 위치 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 1-14 아미노산 위치, 1-12 아미노산 위치, 1-10 아미노산 위치, 1-8 아미노산 위치, 1-6 아미노산 위치, 1-5 아미노산 위치, 1-4 아미노산 위치, 1-3 아미노산 위치 또는 1-2 아미노산 위치에서, 예를 들어, 서열번호 1-15, 47, 또는 53 중 임의의 것의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
N-글리코실화 부위는 상기 부위의 N-잔기(Asn)가 지정 위치에 위치하도록 하는 방식으로 도입된다. 유사하게, O-글리코실화 부위는 그러한 부위를 구성하는 S(Ser) 또는 T(Thr) 잔기가 상기 위치에 위치하도록 도입된다. 용어 "표면에 노출된 측쇄의 25% (또는 50%) 이상"은 생체내 N-글리코실화 부위를 통한 도입과 연관되어 사용된다는 것을 이해하도록 한다. 이 용어는 당 부분기가 사실상 결합되는 위치에서 아미노산 측쇄의 표면 접근성을 가리킨다. 많은 경우들에서, 당 부분기가 사실상 결합되는 아스파라긴 잔기를 기준으로 한 위치 +2에서 세린 또는 트레오닌 잔기를 도입하는 것이 필요하며, 세린 또는 트레오닌 잔기가 도입되는 이 위치는 매립되도록, 즉 분자의 표면에 노출된 측쇄의 25% (또는 50%) 미만을 가지게 된다.
본 발명의 일부 접합체는 25% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되는 위치로 N-글리코실화 부위를 도입하는, 서열번호 1을 기준으로 하여, 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다: 서열번호 1을 기준으로 한, D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H11S/T, G1ON+R12S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21S/T, Q20N+R22S/T, R22N+I24S/T, R23N, R23N+S25T, I24N+L26S/T, S25N+F27S/T, L26N, L26N+S28T, S28N+L30S/T, L30N+D32S/T, K31N+R33S/T, R33N+D35S/T, H34N+F36S/T, D35N+R37S/T, R37N+P39S/T, Q40N+E42S/T, E41N+F43S/T, E42N+D44S/T, D44N+N46S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51S/T, K50N+Q52S/T, V51N+A53S/T, Q52N+I54S/T, E59N+M61S/T, Q62N, Q62N+T64S, Q63N+F65S/T, F68S/T, S69N+K71S/T, T70N+N72S/T, K71N, K71N+S73T, S74T, S74N+A76S/T, A75N+W77S/T, D78N, D78N+T80S, E79N+L81S/T, T80N+L82S/T, L81N+E83S/T, E83N+F85S/T, K84N+Y86S/T, I87N+L89S/T, F90N+Q92S/T, Q91N+M93S/T, L96S/T, D95N+E97S/T, E97N+C99S/T, A98N+V100S/T, V100N+Q102S/T, M101N+E103S/T, Q102N+V104S/T, E103N+G105S/T, V104N+V106S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P110S/T, L111N+N113S/T, M112N+V114S/T, N113N+D115S/T, V114N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L118N+V120S/T, R121N+Y123S/T, K122N+F124S/T, Q125N+I127S/T, R126N, R126N+T128S, T128N+Y130S/T, L129N+L131S/T, T132N+K134S/T, K133N+K135S/T, K134N+K136S/T, K135N, K135N+S137T, Y136N+P138S/T, P138N, P138N+S140T, A146N+I148S/T, M149N, M149N+S151T, R150N+F152S/T, S153N, S153N+S155T, F154N+F156S/T, Q159S/T, K160N+L162S/T, K161N+L163S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T 및 R164N+E166S/T. 일부 예에서, 상기 위치들 중, 위치 47, 51, 133 및 140 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기는 상기와 같이 변형되지 않는다. S/T는 세린 또는 트레오닌 잔기, 바람직하게는 트레오닌 잔기로의 치환을 가리킨다.
본 발명의 일부 접합체는 50% 초과의 ASA 분율로 분자의 표면에 노출될 것으로 예측되는 위치로 N-글리코실화 부위를 도입하는, 서열번호 1을 기준으로 한 하기 치환들 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H11S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21S/T, S25N+F27S/T, S28N+L30S/T, R33N+D35S/T, H34N+F36S/T, D35N+R37S/T, R37N+P39S/T, E41N+F43S/T, D44N+N46S/T,F48S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51S/T, K50N+Q52S/T, F68S/T, K71N, K71N+S73T, A75N+W77S/T, D78N, D78N+T80S, E79N+L81S/T, T80N+L82S/T, E83N+F85S/T, K84N+Y86S/T, I87N+L89S/T, F90N+Q92S/T, Q91N+M93S/T, L96S/T, D95N+E97S/T, M1OlN+E103S/T, Q102N+V104S/T, E103N+G105S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P110S/T, L111N+N113S/T, V114N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L118N+V120S/T, R121N+Y123S/T, K122N+F124S/T, Q125N+I127S/T, R126N, R126N+T128S, L129N+L131S/T, T132N+K134S/T, K133N+K135S/T, K135N, K135N+S137T, P138N, P138N+S140T, R150N+F152S/T, K160N+L162S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T 및 R164N+E166S/T. 일부 예에서, 상기 언급된 위치들 중, 위치 47, 51, 133 및 140 중 하나 이상에서의 아미노산 잔기는 상기 기재된 바대로 변형되지 않는다. S/T는 세린 또는 트레오닌 잔기, 바람직하게는 트레오닌 잔기로의 치환을 가리킨다.
일부 예에서, N-글리코실화 부위(들)를 인터페론-알파의 잠재성 수용체 결합 부위의 외부, 즉, 약 위치 29-40, 79-96, 및 124-141의 외부 (위치 넘버링은 서열번호 1을 기준으로 함)에 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 이에 따라, 하나 이상의 N-글리코실화 부위의 도입을 가져오는 치환(들)은 하기 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H11S/T, G10N+R12S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21S/T, Q20N+R22S/T, R22N+I24S/T, R23N, R23N+S25T, I24N+L26S/T, S25N+F27S/T, L26N, L26N+S28T, S28N+L30S/T, E41N+F43S/T, E42N+D44S/T, D44N+N46S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51S/T, K50N+Q52S/T, V51N+A53S/T, Q52N+I54S/T, E59N+M61S/T, Q62N, Q62N+T64S, Q63N+F65S/T, F68S/T, S69N+K71S/T, T70N+N72S/T, K71N, K71N+S73T, S74T, S74N+A76S/T, A75N+W77S/T, E97N+C99S/T, A98N+V100S/T, V100N+Q102S/T, M101N+E103S/T, Q102N+V104S/T, E103N+G105S/T, V104N+V106S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P110S/T, L111N+N113S/T, M112N+V114S/T, N113N+D115S/T, V114N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L118N+V120S/T, R121N+Y123S/T, K122N+F124S/T, A146N+I148S/T, M149N, M149N+S151T, R150N+F152S/T, S153N, S153N+S155T, A19N+M21S/T, S25N+F27S/T, S28N+L30S/T, E41N+F43S/T, D44N+N46S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51S/T, K50N+Q52S/T, F68S/T, K71N, K71N+S73T, A75N+W77S/T, M101N+E103S/T, Q102N+V104S/T, E103N+G105S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P110S/T, L111N+N113S/T, V114N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L118N+V120S/T, R121N+Y123S/T, K122N+F124S/T, F154N+F156S/T, Q159S/T, K160N+L162S/T, K161N+L163S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T 및 R164N+E166S/T (표면에 노출된 측쇄의 25% 초과를 가지고, 추정적 수용체 결합 부위의 부분을 형성하지 않는 잔기). 일부 예에서, 상기 위치들 중, 위치 47 및 51 중 하나 또는 양자 모두에서의 아미노산 잔기는 상기와 같이 변형되지 않는다. S/T는 세린 또는 트레오닌 잔기, 바람직하게는 트레오닌 잔기로의 치환을 가리킨다.
일부 예에서, 치환은 하기 것들로 구성된 군으로부터 선택된다: D2N+P4S/T, L3N+Q5S/T, P4Q, P4Q+T6S, Q5N+H7S/T, T6N, T6N+S8T, H7N+L9S/T, S8N+G10S/T, L9N+H11S/T, R12N, R12N+T14S, R13N+M15S/T, M16N+L18S/T, A19N+M21S/T, S25N+F27S/T, S28N+L30S/T, E41N+F43S/T, D44N+N46S/T,F48S/T, F48S/T, H47N+Q49S/T, Q49N+V51S/T, K50N+Q52S/T, F68S/T, K71N, K71N+S73T, A75N+W77S/T, M1OlN+E103S/T, Q102N+V104S/T, E103N+G105S/T, G105N+E107S/T, E107, E107N+T109S, E108N+P110S/T, L111N+N113S/T, V114N, V114N+S116T, D115N+I117S/T, L118N+V120S/T, R121N+Y123S/T, K122N+F124S/T, R150N+F152S/T, K160N+L162S/T, L162N+R164S/T, R163N+K165S/T 및 R164N+E166S/T (표면에 노출된 측쇄의 50% 초과를 가지고, 추정적 수용체 결합 부위의 부분을 형성하지 않는 잔기). 일부 예에서, 상기 위치들 중, 위치 47 및 51 중 하나 또는 양자 모두에서의 아미노산 잔기는 상기와 같이 변형되지 않는다. S/T는 세린 또는 트레오닌 잔기, 바람직하게는 트레오닌 잔기로의 치환을 가리킨다.
도입된 N-글리코실화 부위의 효율적인 이용을 수득하기 위해, 약 125 N-말단 아미노산 잔기 이내, 예컨대 약 100 N-말단 아미노산 잔기, 예를 들어 75 N-말단 아미노산 잔기 또는 50 N-말단 아미노산 잔기 이내에 상기 언급된 치환들 중 임의의 것을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 접합체의 인터페론-알파 폴리펩티드 부분을 글리코실화하는 경우, 그것은 생체내 글리코실화 부위에 도입된 싱글, 예컨대 생체내 N-글리코실화 부위에 도입된 싱글을 함유할 수 있다. 그러나, 모 폴리펩티드의 표면 상에 존재하는 에피토프의 효율적인 차폐를 수득하기 위해, 폴리펩티드가 하나 초과의 생체내 글리코실화 부위, 예를 들어 2-5 생체내 글리코실화 부위, 예컨대 2, 3, 4, 또는 5 생체내 글리코실화 부위를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
모 폴리펩티드에 대한 변형의 예는 일반적으로 본원에서 서열 서열번호 1를 기준으로 (또는 일부 다른 특정된 서열을 기준으로) 제공되나, 개시된 변형은 또한 (서열번호 2-15 및 서열번호 44-104 및 그것의 변이체를 포함하는) 본 발명의 다른 폴리펩티드들 중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에서 이루어질 수도 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, 한 예로서, 서열번호 1을 기준으로 한 치환 H47N+Q49S/T는 서열번호 5에서의 Q47N+Q49S/T에 상응하는 것으로 이해된다.
본 발명의 접합체의 비폴리펩티드 부분기
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 접합체의 비폴리펩티드 부분기는 일반적으로 중합체 분자, 친지성 화합물, 당 부분기 (예컨대, 생체내 N-글리코실화에 의함) 및 유기 유도화제로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 제제들의 모두는 접합체의 폴리펩티드 부분에 대해 바람직한 성질, 예컨대 감소된 면역원성, 증가된 기능적 생체내 반감기, 증가된 혈청 반감기, 증가된 생체이용성 및/또는 증가된 AUCsc를 부여할 수 있다. 접합체의 폴리펩티드 부분은 조종 단지 한 유형의 비폴리펩티드 부분기에만 접합되나, 또한 2개 이상의 상이한 유형들의 비폴리펩티드 부분기, 예컨대 중합체 분자 및 당 부분기 등에 접합될 수도 있다. 2개 이상의 상이한 비폴리펩티드 부분기에 대한 접합은 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 비폴리펩티드 부분기/부분기들의 선택은, 접합에 의해 달성하기 원하는 효과에 따라 좌우된다. 예를 들어, 당 부분기는 면역원성을 감소시키는데 특히 유용한 것으로 나타났고, 반편 PEG와 같은 중합체 분자는 기능적 생체내 반감기 및/또는 혈청 반감기를 증가시키는데 특별하게 사용된다. 중합체 분자 및 당 부분기의 조합을 이용하여, 면역원성을 감소시키고, 기능적 생체내 또는 혈청 반감기를 증가시키는 것을 증진할 수 있다.
하기 단락들 "친지성 화합물에 대한 접합", "중합체 분자에 대한 접합","당 부분기에 대한 접합" 및 "유기 유도화제에 대한 접합"에서, 특정 유형의 비폴리펩티드 부분기에 대한 접합이 기재된다.
친지성 화합물에 대한 접합
친지성 화합물에 대한 접합을 위해, 하기 폴리펩티드기는 결합기로서 작용할 수 있다: 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단, 아미노산 잔기 Ser, Thr 또는 Tyr의 히드록시기, Lys의 아미노기, Cys의 SH기 또는 Asp 및 Glu의 카르복실기. 폴리펩티드 및 친지성 화합물은 직접적으로 또는 연결기를 이용함으로써 서로 접합될 수 있다.
친지성 화합물은 천연 화합물, 예컨대 포화 또는 불포화 지방산, 지방산 디케톤, 테르펜, 프로스타글란딘, 비타민, 카르티노이드 또는 스테로이드, 또는 합성 화합물, 예컨대 하나 이상의 알킬, 아릴, 알케닐 또는 다른 다수의 불포화 화합물을 갖는 카르본산, 알코올, 아민 및 술폰산일 수 있다. 임의적으로 연결기를 통한, 폴리펩티드 및 친지성 화합물 간의 접합은, 당업계에 공지된 방법에 따라, 예컨대 [Bodanszky, 펩티드 합성(Peptide Synthesis), John Wiley, 미국 뉴욕 소재, 1976 및 WO96/12505]에 기재된 바대로 이루어질 수 있다.
중합체 분자에 대한 접합
폴리펩티드에 커플링되는 중합체 분자는 임의의 적당한 중합체 분자, 예컨대 전형적으로 분자량이 약 300-100,000 Da, 예컨대 약 1000-50,000 Da의 범위, 예컨대 약 1000-40,000 Da의 범위인, 천연 또는 합성 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있다. 보다 특히, 중합체 분자, 예컨대 PEG, 특히 mPEG는 약 2, 5, 10, 12, 15, 20, 30, 40 또는 50 kDa의 분자량, 특히 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 12 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa 또는 약 40 kDa의 분자량을 가진다. PEG 분자는 분지형이거나 (예컨대, mPEG2), 비분지형 (즉, 선형)일 수 있다.
본원에서 중합체 분자에 대해 사용되는 용어 "약"은 대략적 평균 분자량을 가리키고, 정상적으로 주어진 중합체 제조에서 특정 분자량 분포이게 됨을 반영한다.
동종중합체의 예는 폴리올 (즉, 폴리-OH), 폴리아민 (즉, 폴리-NH2) 및 폴리카르복실산 (즉, 폴리-COOH)을 포함한다. 이종중합체는 하나 이상의 상이한 커플링기, 예컨대 히드록실기 및 아민기를 포함하는 중합체이다.
적당한 중합체 분자의 예는 폴리알킬렌 옥시드 (PAO), 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 분지형 PEG (PEG2), 폴리-비닐 알코올 (PVA), 폴리-카르복실레이트, 폴리-(비닐피롤리돈), 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말산 무수물, 카르복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란, 또는 면역원성의 감소 및/또는 기능적 생체내 반감기 및/또는 혈청 반감기의 증가에 적당한 임의의 다른 생중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 중합체 분자를 포함한다. 일반적으로, 폴리알킬렌 글리콜-유도 중합체는 생체적합성, 비독성, 비항원성, 비면역원성이고, 각종 수용해 성질을 가지며, 생 유기체로부터 용이하게 배출된다.
PEG는 사용하기에 바람직한 중합체 분자이며, 그것은 예컨대, 덱스트란과 같은 다당류에 비해, 가교결합가능한 반응성기를 매우 소량만을 가지기 때문에, 특히, 단기능적 PEG, 예컨대 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)가 그 커플링 화학이 비교적 단순하기 때문에 (단지 하나의 반응성 기만이 폴리펩티드 상의 결합기와 접합하는데 유용함), 유리하다. 결과적으로, 가교결합의 위험이 제거되고, 수득된 폴리펩티드 접합체는 더욱 균질하며, 중합체 분자의 폴리펩티드와의 반응의 조절이 더 용이하다.
폴리펩티드에 대한 중합체 분자(들)의 공유 결합을 행하기 위해, 중합체 분자의 히드록실 말단기가 불활성 형태로, 즉 반응성 관능기 (그 예에는 일차 아미노기, 히드라지드(HZ), 티올, 숙시네이트(SUC), 숙신이미딜 숙시네이트(SS), 숙신이미딜 숙신아미드(SSA), 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA), 숙신이미딜 부타노에이트(SBA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트(SCM), 벤조트리아졸 카르보네이트(BTC), N-히드록시숙신이미드(NHS), 알데히드, 니트로페닐카르보네이트(NPC), 및 트레실레이트(TRES))로 제공되어야 한다. 적당히 활성화된 중합체 분자는, 예컨대 [넥타르 테라퓨틱스 인코포레이티드, 미국 알라바마주 헌츠빌 소재; 폴리마스크 파마슈티칼즈 사(PolyMASC Pharmaceuticals plc), 영국; 또는 선바이오 코포레이션(SunBio Corporation), 대한민국 안양시 소재]로부터 시중 입수가능하다. 대안적으로, 중합체 분자는 당업계에 공지된 통상적 방법에 의해, 예컨대 WO90/13540에 개시된 바대로 활성화될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 활성화된 선형 또는 분지형 중합체 분자의 구체적 예는, 본원에 참고로 인용되는 [넥타르 테라퓨틱스 인코포레이티드, 2003 카달로그 ("넥타르 분자 공학처리: 진보된 PEG화를 위한 폴리에틸렌 글리콜 및 그것의 유도체(Nektar Molecule Engineering: Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation), 카달로그 2003")에 기재되어 있다. 활성화된 PEG 중합체의 구체적 예는 하기 선형 PEG: NHS-PEG, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG,CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, IODO-PEG, 및 MAL-PEG, 및 분지형 PEG, 예컨대 PEG2-NHS, PEG2-MAL, 및 본원에 참고로 인용되는 US 5,932,462 및 US 5,643,575에 기재된 것들을 포함한다. 또한, 본원에 참고로 인용되는 하기 공보들은 유용한 중합체 분자 및/또는 PEG화 화학을 개시한다: US 5,824,778, US 5,476,653, WO97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO92/16555, WO94/04193, WO94/14758, WO94/17039, WO94/18247, WO94/28024, WO95/00162, WO95/11924, W095/13090, WO95/33490, WO96/00080, WO97/18832, WO98/41562, WO98/48837, WO99/32134, WO99/32139, WO99/32140, WO96/40791, WO98/32466, WO95/06058, EP 439 508, WO97/03106, WO96/21469, WO95/13312, EP 921 131, US 5,736,625, WO98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO96/41813, WO96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316.
폴리펩티드 및 활성화된 중합체 분자의 접합은 임의의 통상적 방법을 이용하여, 예컨대 (중합체 분자의 활성화를 위한 적당한 방법도 또한 기술하는) 하기 참고문헌들에 기재된 바대로 수행된다: Harris 및 Zalipsky, 편저, 폴리(에틸렌 글리콜) 화학 및 생물학적 응용(Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications), AZC, 미국 워싱턴주 소재; R. F. Taylor, (1991), "단백질 고정화. 기초 및 응용(Protein immobilisation. Fundamental and applications)", Marcel Dekker, 미국 뉴욕 소재; S. S. Wong, (1992), "단백질 접합 및 가교결합의 화학(Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking)", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson 등, (1993), "고정화된 친화성 리간드 기술(Immobilized Affinity Ligand Techniques)", Academic Press, 미국 뉴욕 소재.
시스테인 잔기의 PEG화를 위해, 폴리펩티드를 PEG화 이전에, 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DDT)로 주로 처리한다. 이어서, 환원제를 임의의 통상적 방법, 예컨대 탈염화로 제거한다. PEG의 시스테인 잔기로의 접합은 전형적으로 pH 6-9의 적당한 완충액 중에 4℃ 내지 25℃에서 변화하는 온도에서 약 16시간 이하동안 일어난다. 시스테인 잔기의 커플링을 위한 활성화된 PEG 중합체의 예는 하기 선형 및 분지형 PEG: 비닐술폰-PEG(PEG-VS), 예컨대 비닐술폰-mPEG(mPEG-VS); 오르토피리딜-디술피드-PEG(PEG-OPSS), 예컨대 오르토피리딜-디술피드-mPEG(mPEG-OPSS); 및 말레이미드-PEG(PEG-MAL), 예컨대 말레이미드-mPEG(mPEG-MAL) 및 분지형 말레이미드-mPEG2(mPEG2-MAL)를 포함한다.
리신의 PEG화는 종종 PEG-N-히드록실숙신이미드 (예컨대, mPEG-NHS 또는 mPEG2-NHS), 또는 에스테르, 예컨대 PEG 숙신이미딜 프로피오네이트 (예컨대, mPEG-SPA) 또는 PEG 숙신이미딜 부타노에이트 (예컨대, mPEG-SBA)를 이용한다. 약 동몰량의 PEG 및 단백질을 혼합할 경우, 하나 이상의 PEG를 실온에서 pH 8 내지 9.5에서 30분 이내에 단백질에 결합시킨다. PEG: 단백질 아미노기의 몰비 1 - 5 : 1이면 주로 충분할 것이다. PH가 증가하면, 반응 속도가 증가하나, pH가 감소하면 반응 속도가 감소한다. 이 매우 반응성인 활성 에스테르는 생리학적 pH에서 커플링할 수 있으나, 덜 반응성인 유도체는 전형적으로 보다 높은 pH를 필요로 한다. 비활성 단백질을 사용하는 경우, 저온도 또한 이용될 수 있다. 저온 조건 하에서는, 보다 긴 반응 시간을 사용할 수 있다.
N-말단 PEG화는 N-말단 아미노산의 외측-아미노기의 pKa 값(~7.6 내지 8.0) 및 리신의 α-아미노기의 pKa 값(~10) 간의 차이에 의해 용이해진다. N-말단 아미노기의 PEG화는 종종 아민에 대해 덜 선택적이며, 이에 따라 히스티딘의 이미다졸기와 덜 반응하기 쉬운 PEG-알데히드 (예컨대, mPEG-프로피온알데히드 또는 mPEG-부틸알데히드)을 이용하며; 부가적으로, 리신 접합 (예컨대, mPEG-SPA 또는 mPEG-SBA) 에 사용되는 PEG 시약은 또한 N-말단 아민의 접합에도 사용될 수 있다. PEG-알데히드의 N-말단 아미노기로의 접합은 전형적으로 pH ~5.0의 적당한 완충액 (예컨대, 20 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드를 갖는 100 mM 나트륨 아세테이트 또는 100 mM 나트륨 비스포스페이트 완충액) 중에, 하룻밤동안 약 4℃ 내지 25℃에서 변화하는 온도에서 일어난다. 유용한 N-말단 PEG화 방법 및 화학은, 또한 본원에 참고로 인용되는 US 특허 제5,985,265호 및 US 특허 제6,077,939호에 기재되어 있다.
전형적으로, 선형 PEG 또는 mPEG 중합체는 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 12 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 또는 약 30 kDa의 분자량을 가질 것이다. 분지형 PEG (PEG2 또는 mPEG2) 중합체는 전형적으로 약 10 kDa, 약 20 kDa, 또는 약 40 kDa의 분자량을 가질 것이다. 일부 예에서, 보다 높은 분자량의 분지형 PEG2 시약, 예컨대 20 kDa 또는 40 kDa PEG2, 예를 들어 리신 PEG화를 위한 mPEG2-NHS, 시스테인 PEG화를 위한 mPEG2-MAL, 또는 N-말단 PEG화를 위한 MPEG2-알데히드 (이 모두는 넥타르 테라퓨틱스 인코포레이티드(미국 알라바마주 헌츠빌 소재)로부터 입수가능함)가 사용될 수 있다. PEG2 화합물의 분지형 구조는 비교적 큰 분자 체적을 초래하고, 따라서 보다 적은 수의 결합된 분자 (또는 하나의 결합된 분자)는 PEG화 분자의 원하는 특성을 부여할 수 있다.
당업자는 사용되는 활성화 방법 및/또는 접합 화학이 인터페론-알파 폴리펩티드의 결합기(들) 및 중합체의 관능기 (예컨대, 아미노, 히드록실, 카르복실, 알데히드 또는 술프히드릴)에 의존한다는 것을 인지할 것이다. PEG화는 폴리펩티드 상의 모든 이용가능한 결합기 (즉, 폴리펩티드의 표면에 노출된 상기 결합기)에 대한 접합으로 지정되거나, 특이적 결합기, 예컨대 시스테인 잔기, 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기로 지정될 수 있다. 또한, 접합은 단일 단계 또는 단계별 방식으로 (예컨대, WO99/55377에 기재된 바와 같음) 달성될 수 있다.
일부 예에서, 중합체 접합은 중합체 분자에 있어 가능한, 이용가능한 많은 중합체 결합기로서 반응하는 것을 목적으로 하는 조건 하에서 수행된다. 이는 폴리펩티드에 대해 적당한 몰과량의 중합체를 이용하여 달성된다. 전형적인 몰비의 활성화된 중합체 분자: 폴리펩티드는 약 1000-1, 예컨대 약 200-1 또는 약 100-1에 달한다. 일부 경우들에서, 그 비는 다수 더 낮을 수 있으나, 예컨대 약 50-1, 10-1 또는 5-1에 달한다. 또한 동몰비가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라서, 연결기를 통해 폴리펩티드에 중합체 분자를 커플링하는 것도 고찰된다. 적당한 연결기는 당업자에게 공지된다. 바람직한 예는 염화시아누르산이다 (Abuchowski 등, (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 제4,179,337호; Shafer 등, (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).
접합에 이어서, 잔류 활성화된 중합체 분자는 당업계에 공지된 방법에 따라, 예컨대 반응 혼합물에 일차 아민을 첨가함으로써, 블록킹되며, 이로써 적당한 방법에 의해 제거된 활성화된 중합체 분자가 생성된다.
당 부분기의 인터페론-알파의 아미노산 잔기로의 생체외 공유 커플링은 당 치환기의 수 또는 프로파일을 변형 또는 증가시키는데 사용될 수 있다. 사용된 커플링 방식에 따라, 탄수화물(들)은 a) 아르기닌 및 히스티딘 (Lundblad 및 Noyes, 단백질 변형을 위한 화학적 시약(Chemical Reagents for Protein Modification), CRC Press Inc. 미국 플로리다주 보카래튼 소재), b) (예컨대, C-말단 아미노산 잔기, 아스파라긴 또는 글루타민의) 유리 카르복실기, c) 유리 술프히드릴기, 예컨대 시스테인의 유리 술프히드릴기, d) 유리 히드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌, 티로신 또는 히드록시프롤린의 유리 히드록실기, e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌 또는 트립토판의 방향족 잔기, 또는 f) 글루타민의 아미드기에 결합될 수 있다. 이 아미노산 잔기는 인터페론-알파 폴리펩티드에 도입 및/또는 제거될 수 있는, 당 부분기를 위한 결합기의 예를 구성한다. 생체외 커플링의 적당한 방법이 [WO87/05330 및 Aplin 등, CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306, 1981]에 기재되어 있다. 당 부분기 또는 PEG의 단백질- 및 펩티드-결합된 Gln-잔기의 생체외 커플링은 또한 트랜스글루타미나제(TGase)에 의해, 예컨대 [Sato 등, 1996 Biochemistry 35, 13072-13080 또는 EP 725145]에 기재된 바대로 수행될 수도 있다.
당 부분기에 대한 커플링
하나 이상의 글리코실화 부위의 도입에 의해 변형된 인터페론-알파 폴리펩티드의 생체내 글리코실화를 달성하기 위해 (단락 " 비폴리펩티드 부분기가 당 부분기인 본 발명의 접합체"를 참고할 것), 접합체의 폴리펩티드 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 글리코실화, 진핵생물의 발현 숙주에 삽입된다. 발현 숙주 세포는 진균류 (필라멘트 진균류 또는 효모), 곤충류, 포유동물의 동물 세포, 형질전환 식물 세포 또는 형질전환 동물로부터의 선택될 수 있다. 또한, 글리코실화는 유전자 치료에 있어, 본 발명의 접합체 또는 본 발명의 폴리펩티드의 폴리펩티드 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이용할 때, 인간 몸체에서 달성될 수 있다. 한 측면에서, 숙주 세포는 포유동물의 세포, 예컨대 CHO 세포, COS 세포, BHK 또는 HEK 세포, 예컨대 HEK293, 또는 곤충 세포, 예컨대 SF9 세포, 또는 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 예컨대 이하 기술되는 바와 같은 임의의 다른 적당한 글리코실화 숙주이다. 임의적으로, 생체내 글리코실화에 의해 인터페론-알파 폴리펩티드에 결합된 당 부분기는 글리코실트랜스퍼라제의 사용에 의해, 예컨대 글라이코어드밴스(GlycoAdvance)TM 기술 (네오스(Neose), 미국 펜실베니아주 호샴 소재 시판)을 이용함으로써, 추가 변형된다. 이로써, 예컨대 CHO 세포에 의한 발현 및 생체내 글리코실화에 따르는, 글리코실화 인터페론-알파 폴리펩티드의 시알리화를 증가시키는 것이 가능하다.
유기 유도화제에 대한 커플링
인터페론-알파 폴리펩티드의 공유 변형은 폴리펩티드의 결합기(들)를 유기 유도화제와 반응시킴으로써 수행될 수 있다.
적당한 유도화제 및 방법이 당업계에 공지된다. 예를 들어, 시스테이닐 잔기는 가장 통상적으로 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응하여, 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 수득한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(4-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술피드, 메틸 2-피리딜 디술피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응함으로써 유도화된다. 히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸피로카르보네이트와 반응함으로써 유도화되며, 그 이유는 이 제제가 히스티딜 측쇄에 대해 비교적 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드는 또한 유용하며; 반응은 바람직하게는 pH 6.0의 0.1 M 나트륨 카코딜레이트에서 수행된다. 리시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 무수물 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이 제제를 이용한 유도화는 리시닐 잔기의 전하를 역상시키는 효과를 가진다. α-아미노-함유 잔기를 유도화하기 위한 다른 적당한 시약은 이미도에스테르, 예컨대 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 크리니트로벤젠술폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트로 트랜스아미나제-촉매된 반응을 포함한다. 아르기닐 잔기는 하나 또는 수개의 통상적 시약, 그것들 중에서 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온, 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도화는, 반응이 구아니딘 관능기의 높은 pKa으로 인해 알칼리성 조건에서 수행될 것을 필요로 한다. 또한, 이 시약은 리신의 기, 및 아르기닌 구아니디노기와 반응할 수 있다. 카르복실 측기 (아스파르틸 또는 글루타밀 또는 C-말단 아미노산 잔기)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R') (식 중, R 및 R'은 상이한 알킬기, l-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐l-4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드임)와의 반응에 의해 선택적으로 변형될 수 있다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해, 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
기능적 부위의 블록킹
과도한 중합체 접합은 중합체가 접합되는 인터페론-α 폴리펩티드의 활성의 손실을 가져올 수 있기 때문에, 기능적 부위에 위치한 결합기를 제거하거나, 접합 이전에 기능적 부위를 블록킹하는 것이 유리할 수 있다. 이 후자 방법은 본 발명의 추가적 측면들을 구성한다 (첫 번째 방법은 예컨대, 기능적 부위 부근에 위치한 리신 잔기의 제거에 의해, 상기 추가 예시된다). 보다 구체적으로, 두 번째 방법에 따라, 인터페론-알파 폴리펩티드 및 비폴리펩티드 부분기 간의 접합은 폴리펩티드의 기능적 부위가 폴리펩티드의 기능적 부위에 결합할 수 있는 헬퍼 분자에 의해 블록킹되는 조건 하에서 수행된다. 바람직하게, 헬퍼 분자는 폴리펩티드의 기능적 부위, 예컨대 수용체, 특히 I형 인터페론 수용체를 특이적으로 인식하는 분자이다. 대안적으로, 헬퍼 분자는 항체, 특히 인터페론-알파 폴리펩티드를 인식하는 단클론성 항체일 수 있다. 특히, 헬퍼 분자는 중성화 단클론성 항체일 수 있다.
폴리펩티드는 접합을 행하기 전에, 헬퍼 분자와 상호작용되게 된다. 이는, 폴리펩티드의 기능적 부위가 차폐 또는 보호되고, 결과적으로 된 비폴리펩티드 부분기, 예컨대 중합체에 의해 유도화하는데 이용불가능하게 된다는 것으로 확실히 한다. 헬퍼 분자로의 용리에 이어, 비폴리펩티드 부분기 및 폴리펩티드 간의 접합은 하나 이상의 부분적으로 보존된 기능적 부위로 회수될 수 있다.
중합체, 친지성 화합물, 유기 유도화제 또는 임의의 다른 화합물에 대한, 블록킹된 기능적 부위를 갖는 폴리펩티드의 후속 접합은 정상적 방식으로, 예컨대 제목 "...에 대한 접합"의 상기 단락에 기재된 바대로 수행된다.
폴리펩티드의 기능적 부위를 접합으로부터 차폐시키기 위해 사용되는 헬퍼 분자의 성질과 무관하게, 헬퍼 분자가, 분자의 부분들에서 선택의 비폴리펩티드 부분기에 대한 몇 개의 결합기만을 포함하거나 그 결합기가 없는 것이 바람직하고, 여기에서 그러한 기에 대한 접합은 헬퍼 분자로부터의 접합 폴리펩티드의 탈착을 방해하게 된다. 이로써, 폴리펩티드의 비차폐된 부분들에 존재하는 결합기에 대한 선택적 접합이 수득될 수 있고, 반복되는 접합 주기들 동안 헬퍼 분자를 재사용할 수 있다. 예를 들어, 비폴리펩티드 부분기가 리신 또는 N-말단 아미노산 잔기의 입실론 아미노기를 결합기로서 가지는 PEG와 같은 중합체 분자인 경우, 헬퍼 분자가 실질적으로 접합성 입실론 아미노기가 없거나, 바람직하게는 임의의 입실론 아미노기가 없는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 예들에서, 헬퍼 분자는, 단백질 또는 펩티드가 선택의 비폴리펩티드 부분기에 대한 임의의 접합성 결합기가 없는, 폴리펩티드의 기능적 부위에 결합가능한 단백질 또는 펩티드이다.
다른 한 측면에서, 헬퍼 분자는 칼럼 충전 물질, 예를 들어 세파덱스(Sephadex) 또는 아가로스 비이드와 같은 고체상, 또는 표면, 예컨대 반응 용기에 첫 번째로 공유결합된다. 후속하여, 폴리펩티드는 칼럼 물질 담지 헬퍼 분자에 로딩되어, 당업계에 공지된 방법에 따라, 예컨대 제목 "...에 대한 접합"의 상기 단락에 기재된 바대로 접합이 수행된다. 이 절차는 폴리펩티드 접합체가 용리에 의해 헬퍼 분자로부터 분리되도록 한다. 폴리펩티드 접합체는 폴리펩티드 접합체의 실질적 분해를 야기하지 않는 물리-화학적 조건 하에서 통상적 기술에 의해 용리된다. 폴리펩티드 접합체를 포함하는 유동상은 헬퍼 분자가 공유결합되도록 유지되는 고체상으로부터 분리된다. 분리는 다른 방식들로 달성될 수 있다: 예를 들어, 헬퍼 분자는 특이적 결합제 (예컨대, 스트렙타비딘)에 의해 인식될 수 있는 2차 분자 (예컨대, 비오틴)로 유도화될 수 있다. 특이적 결합제는 고체상에 연결될 수 있고, 이로써 후속 용리 시에, 헬퍼 분자-2차 분자 착체를 보유하나 폴리펩티드 접합체를 보유하지 않는 2차 헬퍼-고체상 칼럼 상에 통과함으로써, 헬퍼 분자-2차 분자 착체로부터 폴리펩티드 접합체가 분리된다. 폴리펩티드 접합체는 임의의 적당한 양식으로 헬퍼 분자로부터 방출될 수 있다. 탈보호는 헬퍼 분자가 그것이 결합된 인터페론-α의 기능적 부위로부터 해리되는 조건을 제공함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 중합체가 접합되는 항체와 항-유전자형 항체 간의 착체가 pH를 산성 또는 알칼리성 pH로 조정함으로써 해리될 수 있다.
태그된 인터페론-알파 폴리펩티드의 접합
다른 한 측면에서, 인터페론-알파 폴리펩티드는 전형적으로 1-30, 예컨대 1-20 또는 1-15 또는 1-10 또는 1-5 아미노산 잔기로 구성된 택을 갖는 융합 단백질, 즉 아미노산 서열 또는 펩티드, 예컨대 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 첨가된 상기 것으로 표현된다. 빠르고 용이한 정제를 허용하는 것 외에도, 태그는 태그 폴리펩티드 및 비폴리펩티드 부분기 간의 접합을 달성하기 위한 편리한 도구이다. 특히, 택은 마이크로티터 플레이트 또는 다른 담체, 예컨대 태그 폴리펩티드가 택을 통해 고정화될 수 있는 상자성 비이드에서 접합을 달성하는데 사용될 수 있다. 예컨대 마이크로티터 플레이트에서의, 태그 폴리펩티드에 대한 접합은 배양 브로쓰 (원칙적으로 임의의 정제가 없음)로부터 직접적으로 마이크로티터 플레이트에서 고정화되어, 접합될 수 있다는 이점을 가진다. 이로써, 공정 단계들 (발현에서 접합)의 총 수가 감소될 수 있다. 또한, 택은 접합되는 고정화 폴리펩티드에 대한 향상된 접근성을 보장하는 스페이서 분자로서 작용할 수 있다. 태그 폴리펩티드를 이용한 접합은 본원에 개시된 비폴리펩티드 부분기들 중 임의의 것, 예컨대 PEG와 같은 중합체 분자에 대한 것일 수 있다.
사용되는 특이적 태그의 동일성은, 택이 폴리펩티드로 발현될 수 있고, 적당한 표면 또는 담체 물질 상에 고정화될 수 있는 한, 중요하지 않다. 수많은 적당한 택들이 예컨대, 유니자임 라보라토리즈(Unizyme Laboratories) (덴마크 소재)로부터 시중 입수가능하다. 그러한 택에 대한 항체는, 예컨대 ADI, 아베스 연구소(Aves Lab) 및 리서치 다이아그노스틱스(Research Diagnostics)로부터 시중 입수가능하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 "본 발명의 핵산 (또는 폴리뉴클레오티드)"으로도 집합적으로 칭해지는, (본원에 폴리뉴클레오티드로도 칭해지는) 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다양한 용도들에서 유용하다. 상기 논의된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 유용하다. 부가적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이하 더욱 상세하게 설명되는 바와 같은, 유전자 치료, DNA 백신접종, 및 면역치료에 유용한 발현 벡터에 혼입될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 각기 포함하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다: (a) 서열번호 16-30으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 1-15 및 44-104로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열.
본 발명은 또한 0-16 아미노산 위치 (예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 0-16 위치, 0-15 위치, 0-14 위치, 0-13 위치, 0-12 위치, 0-11 위치, 0-10 위치, 0-9 위치, 0-8 위치, 0-7 위치, 0-6 위치, 0-5 위치, 0-4 위치, 0-3 위치, 0-2 위치, 또는 0-1 위치에서, 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나)와 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다. 일부 예에서, 코딩된 폴리펩티드 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
본 발명은 또한 서열번호 1-15 및 서열번호 44-104 중 임의의 하나 (예컨대, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 47 또는 서열번호 53 중 하나)에 대해 약 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 각기 포함하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다. 일부 예에서, 코딩된 폴리펩티드 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
본 발명은 또한 모 인터페론-알파 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공하며, 상기 코딩된 변이체가 하나 이상의 아미노산 위치에서 모 인터페론-알파 폴리펩티드 서열과 상이한 서열을 포함하며, 상기 변형 서열은 위치 47에서의 His, 위치 51에서의 Val, 위치 55에서의 Phe, 위치 56에서의 Leu, 위치 58에서의 Tyr, 위치 133에서의 Lys, 위치 140에서의 Ser (위치는 서열번호 1을 기준으로 하여 넘버링됨) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 예에서, 모 인터페론-알파 폴리펩티드 서열은 자연 발생 인간 인터페론-알파의 서열 (예컨대, 서열번호 31 내지 서열번호 42, 또는 서열번호 32+R23K, 또는 본원 및/또는 [Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 이하 상기와 동일함]에 기재된 바와 같은 다른 huIFN-알파 서열이거나, 비자연 발생 (즉, 합성) 인터페론-알파의 서열, 예컨대 IFN-알파 Conl (서열번호 43)이다. 일부 예에서, 변형 서열은 1-16 아미노산 위치 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 아미노산 위치), 예컨대 1-10 아미노산 위치, 1-5 아미노산 위치, 또는 1-3 아미노산 위치에서, 모 폴리펩티드 서열과 상이하다. 일부 예에서, 변이체 인터페론-알파 활성을 나타낸다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열이 인터페론 알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 16-30 중 하나의 실질적으로 전체 길이에 걸쳐, 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 각기 포함하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
부가적인 측면들
(상기된 것들을 포함하는) 본 발명의 핵산들 중 임의의 것은 하나 이상의 부가적 아미노산 서열, 예를 들어 배출/국소화 서열, 폴리펩티드의 (예컨대, 세포 표면 발현을 위한) 가용화 또는 고정화에 유용한 서열, 폴리펩티드의 검출 및/또는 정제에 유용한 서열 (예를 들어, 폴리펩티드 정제 하위서열, 예컨대 에피토프 택, 폴리히스티딘 서열 등)을 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 다른 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산들 중 하나 이상을 포함하는 세포를 제공한다. 그러한 세포는 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산들 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 제공한다. 그러한 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 또는 바이러스의 단편을 포함할 수 있다. 그러한 벡터는 발현 벡터를 포함할 수 있고, 원할 경우, 핵산이 여기 및 이하에 논의되는 것들을 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 또한, 또 다른 한 측면에서, 본 발명은 부형제 또는 담체, 및 본 발명의 핵산들 중 임의의 것, 또는 그러한 핵산을 포함하는 벡터, 세포, 또는 숙주 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 약제학적 조성물일 수 있고, 부형제 또는 담체는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체일 수 있다.
본 발명은 또한 (예컨대, 재조합을 위한 기질로서) 본 발명의 2개 이상의 핵산, 또는 그것의 단편을 갖는 조성물을 포함한다. 조성물은 재조합 핵산의 라이브러리로서, 2 이상, 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상, 또는 100 이상, 또는 그 이상의 상기 기재된 핵산들을 갖는 라이브러리를 포함할 수 있다. 핵산은 발현 벡터로 임의적으로 클로닝되어, 발현 라이브러리를 제공한다.
본 발명의 핵산 및 그것의 단편, 및 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 적당한 담체, 예컨대 약제학적 담체와 함께 조합되어, 치료적 또는 예방적 용도를 위해 이용될 수 있다. 그러한 조성물은 치료적으로 및/또는 예방적으로 유효량의 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 그러한 담체 또는 부형제는 비제한적으로 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 조합을 포함한다. 제형물은 투여 방식에 적합하여야 한다. 핵산, 폴리펩티드, 및 단백질의 투여 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이하 추가 논의된다.
본 발명은 또한 (예컨대, 상기 언급된 일부 재조합 형식들에서 수행되는 바와 같이) 제한 엔도뉴클레아제, RNA 분해효소, 또는 DNA 분해효소를 이용하여 본 발명의 핵산들 중 임의의 것들 중 하나 이상을 소화시킴으로써 생성되는 조성물; 및 본 발명의 핵산들 중 하나 이상을 기계적 수단 (예컨대, 초음파처리, 보어텍싱 등)을 이용하여 단편화 또는 전단함으로써 생성된 조성물 (이는, 본원에 기재된 방법으로 재조합을 위한 기재를 제공하는데 사용될 수 있음)을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산들 중 임의의 것들 중 하나 이상을 절단함으로써 생성된 조성물을 제공한다. 절단은 기계적, 화학적, 또는 효소적 절단을 포함할 수 있고, 효소적 절단은 제한 엔도뉴클레아제, RNA 분해효소, 또는 DNA 분해효소를 이용한 절단을 포함할 수 있다.
리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 본 발명의 단편화된 핵산들 중 하나 이상을 배양함으로 포함하는 방법에 의해 생성된 조성물도 또한 본 발명에 포함된다. 이 수득된 조성물은 많은 재조합 형식들에 대한 재조합 혼합물을 형성한다. 핵산 폴리머라제는 RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제, 또는 RNA-지정 DNA 폴리머라제 (예컨대, "역전사효소")일 수 있고; 폴리머라제는 예컨대 열안정한 DNA 폴리머라제 (예컨대, VENT, TAQ 등)일 수 있다.
마찬가지로, 하나 초과의 본 발명의 핵산들에 상응하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 조성물은 재조합 기질로서 유용하고, 본 발명의 한 특성이다. 편의상, 이 단편화, 전단화 또는 올리고뉴클레오티드 합성된 혼합물은 단편화된 핵산 세트로 칭해진다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산을 변이 또는 재조합함으로써 생성된, 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
폴리뉴클레오티드의 제조
폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 및 본 발명의 핵산 단편은 공지된 합성 방법에 따라, 표준 고체상 방법에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 약 100개 염기에 달하는 단편은 개별적으로 합성된 후, (예컨대, 효소적 또는 화학적 라이게이션 방법, 또는 폴리머라제 매개된 재조합 방법에 의해) 결합하여, 필수적으로 임의의 원하는 연속적 서열을 형성한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 화학적 합성에 의해, 예컨대 [Beaucage 등 (1981), Tetrahedron Letters 22: 1859-69]에 기재된 정통적 포스포르아미다이트 방법, [Matthes 등 (1984) EMBO J 3: 801-05]에 기재된 방법에 의해, 예컨대 전형적으로 자동화 합성 방법으로 수행되는 바와 같이, 제조될 수 있다. 포스포라미다이트 방법에 따라, 올리고뉴클레오티드가 예컨대 자동 DNA 합성장치로 합성되고, 정제되고, 어닐링되며, 라이게이션되어, 적당한 벡터로 클로닝된다.
부가적으로, 본질적으로 임의의 폴리뉴클레오티드는 다양한 상업적 출처, 예컨대 [오페론 테크놀로지즈 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.) (미국 캘리포니아주 알라메다 소재)] 등 기타로부터의 주문품일 수 있다. 마찬가지로, 펩티드 및 항체는 임의의 다양한 출처들, 예컨대 셀텍 펩티드즈(Celtek Peptides) (미국 테네시주 내쉬빌 소재); 워싱턴 바이오테크놀로지즈 인코포레이티드(Washington Biotechnology, Inc.) (미국 매릴랜드주 발티모어 소재); 글로발 펩티드 서비스(Global Peptide Services) Ft. (미국 콜로라도주 콜린 소재) 등, 기타로부터의 주문품일 수 있다.
본 발명의 특정 폴리뉴클레오티드는 또한 인터페론-알파 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하거나, 그 폴리뉴클레오티드를 PCR-증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여, cDNA 라이브러리 (예컨대, 전형적인 재발성 서열 재조합 방법에서와 같이 동종성 핵산을 재조합함으로써 생성된 라이브러리)를 선별함으로써 수득될 수도 있다. cDNA 클론을 선별 및 단리하기 위한 절차는 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 기술은 예컨대, [Berger 및 Kimmel, 분자 클로닝 기술에 대한 지침(Guide to Molecular Cloning Techniques), Method in Enzymol. 제152권, Acad. Press, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 ("버저(Berger)"); Sambrook, 이하 상기와 동일함, 및 Current Protocol in Molecular Biology, Ausubel, 이하 상기와 동일함]에 기재되어 있다. 본 발명의 일부 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 서열을 변경시킴으로써, 예컨대 변이유발, 재발성 서열 재조합 (예컨대, 셔플링), 또는 올리고뉴클레오티드 재조합에 의해 수득될 수 있다. 다른 경우들에서, 그러한 폴리뉴클레오티드는 컴퓨터로 제조되거나, 그 안에 참고문헌에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 본원에서 특정된 서열에 적어도 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 코딩 서열은 특별한 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 도메인, 영역 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 코딩 서열은 상기 기재된 바와 같은 인터페론 알파 활성을 나타내는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있고, 이는 mRNA, cRNA, 합성 RNA 및 DNA, 및 cDNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 이중 나선 또는 단일 나선일 수 있고, 단일 나선일 경우, 코딩 나선 또는 비코딩 나선 (안티센스, 상보적) 나선일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 (i) 단리, (ii) 예컨대 융합 단백질, 프리-단백질, 프리프로-단백질 등을 코딩하기 위한, 하나 이상의 부가적 코딩 서열과의 조합, (iii) 비코딩 서열, 종결자 요소, 또는 적당한 숙주에서의 코딩 서열의 발현에 효과적인 5' 및/또는 3' 비번역 영역과의 조합, 및/또는 (iv) 코딩 서열이 이질성 유전자인 벡터, 세포, 또는 숙주 환경 하에 본 발명의 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 당업자에게 공지된 바와 같이, 담체, 완충액, 보조제, 부형제 등의 존재 하에서, 핵산의 전형적인 조성적 제형물과 조합되어 발견될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 단편은 전형적으로 약 200개 이상 뉴클레오티드 염기, 예컨대 적어도 약 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 460개 이상, 470개 이상, 또는 그 이상의 염기를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단편은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화하고/하거나, 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩티드의 성질들 중 하나 이상을 갖는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
변형된 코딩 서열
당업자에 의해 이해되어지는 바와 같이, 특별한 숙주에서의 발현을 증진시키기 위해 코딩 서열을 변형하는 것이 유리할 수 있다. 유전 코드는 64개 가능한 코돈으로 매우 풍부하나, 대부분의 유기체는 이 코돈의 서브세트를 우선적으로 이용한다. 종에서 가장 종종 이용되는 코돈은 최적 코돈으로 간주되고, 매우 종종 이용되지 않는 코돈은 희귀-사용 또는 저빈도-사용 코돈으로 분류된다 (예컨대, [Zhang, S.P. 등 (1991) Gene 105: 61-72]를 참고한다). 코돈은 숙주의 바람직한 코돈 사용, 경우에 따라 "코돈 최적화" 또는 "종 코돈 바이어스를 위한 조절"로 일컬어지는 공정을 반영하도록 치환될 수 있다.
예를 들어, 번역 속도를 증가시키기 위해, 또는 바람직한 성질들, 예컨대 비최적화 서열로부터 생성된 전사체에 비해 보다 긴 반감기를 갖는 재조합 RNA 전사체를 생성시키기 위해, 특별한 진핵 또는 원핵 숙주에 의해 요망되는 코돈을 포함하는 변형된 코딩 서열 (예컨대, [Murray, E. 등 (1989) Nucl. Acids Res 17: 477-508]을 참고함)을 제조할 수 있다. 번역 정지 코돈은 또한 숙주 선호를 반영하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, S. 세레비지아에 및 포유동물을 위한 바람직한 정지 코돈은 각기 UAA 및 UGA이다. 단자엽 식물을 위한 바람직한 정지 코돈은 UGA이며, 반면 곤충 및 E. 콜라이(E. coli)는 정지 코돈으로서 UAA의 사용을 선호한다 (Dalphin, M. E. 등 (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218).
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은, 비제한적으로 유전자 산물의 클로닝, 가공 및/또는 발현을 변형시키는 변경을 포함하는, 다양한 이용에서의 본 발명의 코딩 서열을 변경하기 위해 공학처리될 수 있다. 예를 들어, 변경은 당업계에 공지된 기술들, 예컨대 새로운 제한 부위의 삽입, 글리코실화 방식 변경, (예컨대, PEG화 또는 다른 접합을 위한) 결합기의 도입 또는 제거, 코돈 선호의 변화, 스플라이스 부위의 도입을 위한 부위-지정 변이유발을 이용하여 도입될 수 있다.
침묵 변이
유전 코드의 퇴화로 인해, 수많은 기능적으로 일치하는 핵산은 임의의 주어진 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 하기 코돈 표 (표 5)를 검토해보면, 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, 및 CGU는 모두 아미노산 아르기닌을 코딩한다. 이에 따라, 아르기닌이 한 코돈으로 특정되는 핵산 서열에서의 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 상기 상응하는 코돈들 중 임의의 것으로 변경될 수 있음을 알 수 있다. 그러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이다. RNA 서열에서의 U는 DNA 서열에서의 T에 상응함을 이해하도록 한다.
이에 따라, 당업자는, 유전 코드의 퇴화로 인해, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 핵산 서열이 생산될 수 있고, 그 서열의 일부는 본원에 명시된 핵산 서열에 대해 최소한의 서열 동일성을 가질 수 있음을 인지할 것이다. 당업자라면, (일반적으로 각기 단지 메티오닌 및 트립토판에 대한 코돈인 AUG 및 UGC를 제외한) 핵산에서의 각 코돈은 기능적으로 일치하는 폴리펩티드를 코딩하기 위한 표준 기술에 의해 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 임의의 원하는 서열에 내재된다. 본 발명은 또한 가능한 코돈 선택을 기초로 조합을 선택함으로써 이루어질 수 있는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 각각의 모든 가능한 변이를 제공한다. 이 조합은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 적용되는 바와 같이, (예컨대, 표 5에 나와 있는 바와 같은) 표준 트리플릿 (코돈) 유전 코드에 따라 이루어진다. 본원에서의 모든 핵산의 그러한 모든 변이가 유전 코드와 함께 서열을 고려하여, 특정적으로 제공 및 기술된다. 당 기술에 의해서라면 본원에 열거된 서열의 임의의 침묵 치환을 충분히 생성시킬 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 용도
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 전형적으로 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 발현 벡터의 발현을 통한 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산 (즉, 발현)에서; 치료제로서; 예방제로서; 진단용 도구로서; 면역원으로서; 보조제로서; (야생형 인터페론-알파 핵산의 검출을 포함하는) 상보적 또는 부분 상보적 핵산의 존재를 위한 진단용 프로브로서; 추가적 반응, 예컨대 신규 및/또는 향상된 변이체를 생산하기 위한 재발성 서열 재조합 반응 또는 변이 반응을 위한 기질로서, 기타 등에서 다양한 용도들을 가진다.
벡터, 프로모터 및 발현 시스템
본 발명은 또한 상기 광범위하게 기술된 핵산 서열들 중 하나 이상을 갖는 재조합 구축물을 포함한다. 구축물은 예컨대 본 발명의 핵산 서열이 전방 또는 역방으로 삽입된, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 등과 같은 벡터를 포함한다. 일부 예에서, 구축물은 예를 들어, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 비롯한 조절 서열을 추가로 포함한다. 수많은 적당한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고, 시중 입수가능하다.
벡터, 프로모터의 사용 및 많은 다른 관련 주제를 비롯한, 본원에 유용한 분자생물학적 기술을 기술하는 일반 텍스트들은 [Berger, 이하 상기와 동일함; Sambrook (1989), 이하 상기와 동일함, 및 Ausubel, 이하 상기와 동일함] 를 포함한다. 폴리머라제 사슬 반응(PCR), 리가제 사슬 반응 (LCR), Qαβ-레플리카제 증폭 및 예컨대, 본 발명의 동종성 핵산의 생산을 위한 다른 RNA 폴리머라제 매개된 기술 (예컨대, NASBA)을 비롯한, 생체외 증폭 방법을 통해 당업자를 지도하기에 충분한 기술의 예가 [Berger, Sambrook, 및 Ausubel, 모두 이하 상기와 동일함, 및 Mullis 등 (1987) U.S. 특허 제4,683,202호; PCR Protocols: 방법 및 응용에 대한 지침(A Guide to Methods and Applications) (Innis 등, 편저) Academic Press Inc. 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1990년 10월 1일) C & EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh 등 (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1173-1177; Guatelli 등 (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 1874-1878; Lomeli 등 (1989) J Clin Chem 35:1826-1831; Landegren 등 (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu 및 Wallace (1989) Gene 4: 560-569; Barringer 등 (1990) Gene 89: 117-122, 및 Sooknanan 및 Malek (1995) Biotechnology 13:563-564)에 나와 있다. 생체외 증폭된 핵산을 클로닝하는 향상된 방법이 [Wallace 등, U.S. 특허 제5,426,039호]에 기재되어 있다. PCR에 의한 큰 핵산을 증폭하는 향상된 방법이 [Cheng 등 (1994) Nature 369: 684-685 및 그 문헌 내에 인용된 참고문헌들 (여기에서, 40 킬로염기(kb)에 달하는 PCR 증폭산물이 생성된다)]에 요약되어 있다. 당업자라면 본질적으로 임의의 RNA가 제한 소화, 연전사효소 및 폴리머라제를 시퀀싱하는데 적당한 이중 나선 DNA로 전환될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이에 대해, [Ausubel, Sambrook 및 Berger, 모두 이하 상기와 동일함]을 참고한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질도입된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 생산을 제공한다. 숙주 세포는 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는, 본 발명의 벡터로 일반적으로 공학처리 (예컨대, 형질도입, 형질전환 또는 트랜스펙션)된다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 바이러스성 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 공학처리된 숙주 세포는 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선택, 또는 유전자의 증폭에 적당하도록 변형된 통상적 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현에 대해 선택된 숙주 세포에 미리 사용된 것이며, 당업자에게 분명하고, 예컨대 [Freshney (1994) 동물 세포의 배양(Culture of Animal Cells), 기본 기술의 매뉴얼(Manual of Basic Technique) (제3판), Wiley-Liss, 미국 뉴욕 소재, 및 그 문헌 내에 인용된 참고문헌들을 비롯한 인용 참고문헌들에 명백하다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 식물, 효모, 진균류, 세균류 등과 같은 비동물 세포에서 생산될 수도 있다. 부가적으로, [Sambrook, Berger 및 Ausubel]에 부가하여, 세포 배양에 대한 상세 내용이 예컨대 [Payne 등 (1992) 액체 시스템에서의 식물 세포 및 조직 배양(Plant Cells and Tissue Culture in Liquid Systems), John Wiley & Sons, Inc. 미국 뉴욕주 뉴욕 소재; Gamborg 및 Phillips (편저) (1995) 식물 세포, 조직 및 기관 배양(Plant Cells, Tissue and Organ Culture); 기본 방법 스프링거 랩 매뉴얼(Fundamental Method Springer Lab Manual), Springer-Verlag (베를린, 하이델베르크, 뉴욕 소재); Atlas & Parks (편저), 미생물학적 배지의 편람(Handbook of Microbiological Media) (1993) CRC Press, 미국 플로리다주 보라 랜튼 소재]을 참고한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 그것의 단편은 폴리펩티드를 발현하기 위한 다양한 발현 벡터들 중 임의의 하나에 포함될 수 있다. 그러한 벡터는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예컨대 SV40의 유도체, 세균 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 바이러스성 DNA, 예컨대 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성 광견병, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 및 기타 많은 것들을 포함한다. 유전적 물질을 세포에 형질도입하는 임의의 벡터, 및 복제를 원하는 경우, 관련 숙주에서 복제가능하고 생존가능한 벡터를 사용할 수 있다.
발현 벡터에서의 핵산 서열은 mRNA 합성을 지정하는 적당한, 전사 조절 서열 (프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 그러한 프로모터의 예는 LTR 또는 SV40 프로모터, E. 콜라이 lac 또는 trp 프로모터, 파지 람다 PL 프로모터, CMV 프로모터, 및 원핵생물 또는 진핵생물의 세포 또는 그것의 바이러스에서의 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 다른 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결자도 포함한다. 벡터는 임의적으로 발현을 증폭시키기 위한 적당한 서열, 예컨대 인핸서를 포함한다. 부가적으로, 발현 벡터는 임의적으로 진핵생물의 세포 배양을 위한 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 예컨대 E. 콜라이에서의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 형질을 제공하기 위한 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 적당한 DNA 서열, 및 적당한 프로모터 또는 조절 서열을 갖는 벡터는, 또한 숙주가 폴리펩티드를 발현하도록 하기 위해 적당한 숙주를 형질전환하는데 사용될 수 있다. 적당한 발현 숙주의 예는 세균 세포, 예컨대 E. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 진균류 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에, 피치아 파스토리스 및 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 포유동물의 세포, 예컨대 CHO, COS, BHK, HEK 293 또는 보웨스 멜라노마(Bowes melanoma); 식물 세포 등을 포함한다. 모든 세포 또는 세포주가 충분히 기능적인 본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 생산할 수 있어야 할 필요가 없음이 이해되어지고; 예를 들어, 폴리펩티드의 항원성 단편이 세균 또는 다른 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 본 발명은 이용되는 숙주 세포들에 의해 제한되지 않는다.
세균 시스템에서, 수많은 발현 벡터들은 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 의도로 한 용도들에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 폴리펩티드 또는 그것의 단편이 항체의 도입에 필요할 때, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준 발현을 지정하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터는 비제한적으로 다관능성 E. 콜라이 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 뉴클레오티드 코딩 서열이 베타-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 후속 7 잔기에 대한 서열로 인-플레임 벡터에 라이게이션되어, 혼성체 단백질이 생산되는 BLUESCRIPT (Stratagene); pIN 벡터 (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264: 5503-5509); pET 벡터 (Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 등을 포함한다.
마찬가지로, 효모 사카로마이세스 세레비지아에에서, 구성 또는 유도성 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH를 포함하는 수많은 벡터들이 본 발명의 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있다. 이에 대한 검토를 위해, [Ausubel, 이하 상기와 동일함, Berger, 이하 상기와 동일함, 및 Grant 등 (1987) Methods in Enzymology 153: 516-544]을 참고한다.
포유동물의 숙주 세포에서, 수많은 발현 시스템들, 예컨대 바이러스성-기재의 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 코딩 서열은 후 프로모터 및 3면 리더 서열로 구성되는 아데노바이러스 전사/번역 착체로 임의적으로 라이게이션된다. 바이러스성 게놈의 비본질적 E1 또는 E3 영역에의 삽입은 감염된 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생존가능한 바이러스를 수득케 한다 (Logan 및 Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 미국 81:3655-3659). 부가적으로, 전사 인핸서, 예컨대 라우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서가 포유동물의 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 사용된다. 숙주 세포, 배지, 발현 시스템, 및 생산 방법은 각종 포유동물의 인터페론-알파 (예컨대, 인간 인터페론-알파)의 클로닝 및 발현으로 알려진 것들을 포함한다.
부가적인 발현 요소
특정 개시 시그널은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 및/또는 그것의 단편의 효율적 번역을 보조할 수 있다. 이 시그널은, 예컨대 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있다. 코딩 서열, 그것의 개시 코돈 및 상향류 서열이 적당한 발현 벡터에 삽입된 경우, 부가적 번역 조절 시그널이 필요없을 수 있다. 그러나, 단지 코딩 서열 (예컨대, 성숙 단백질 코딩 서열), 또는 그것의 부분이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 핵산 전사적 조절 시그널이 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈이 전체 삽입부의 전사를 확실히 하게 위해 올바른 해독 프레임 내에 있어야 한다. 외인성 전사적 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 각종 기원의 것일 수 있다. 발현 효율성은 사용되는 세포 시스템에 적당한 인핸서의 삽입에 의해 증진될 수 있다 (예컨대, Scharf D. 등 (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; 및 Bittner 등 (1987) Methods in Enzymol 153: 516-544).
배출/국소화 서열
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 원하는 세포적 구획, 막 또는 세포기관으로의 폴리펩티드 발현을 표적화하거나, 원형질막주위 공간 또는 세포 배양 배지로의 폴리펩티드 배출을 지정하기 위해, 예를 들어 배출/국소화 서열을 코딩하는 핵산을 인프레임 융합될 수도 있다. 그러한 서열은 당업자에게 공지되고, 배출 리더 또는 시그널 펩티드, 세포기관 표적화 서열 (예컨대, 핵 국소화 서열, ER 보유 시그널, 미토콘드리아 전이 서열, 엽록체 전이 서열), 막 국소화/앵커 서열 (예컨대, 정지 이송 서열, GPI 앵커 서열) 등을 포함한다.
발현 숙주
다른 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기된 핵산, 벡터, 또는 다른 구축물 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 진핵생물의 세포, 예컨대 포유동물의 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 원핵생물의 세포, 예컨대 세균 세포일 수 있다. 구축물의 숙주 세포로의 도입을, 생체내, 세포외 또는 생체외 방법을 위해, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 전기충격, 유전자 또는 백신 총, 주입, 또는 다른 일반 기술에 의해 행할 수 있다 (예컨대, Davis, L., Dibner, M., 및 Battey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biology).
숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 양식으로 발현된 단백질을 가공하는 능력을 위해 임의적으로 선택된다. 단백질의 그러한 변형은, 비제한적으로 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함한다. "프리(pre)" 또는 "프리프로(prepro)" 형태의 단백질을 절단하는 후-번역 가공은 또한 올바른 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 위해 중요할 수도 있다. 상이한 숙주 세포, 예컨대 E. 콜라이, 바실러스속, 효모 또는 포유동물의 세포, 예컨대 CHO, HeLa, BHK, MDCK, HEK 293, WI38 등은 그러한 후-번역 활성을 위한 특이적 세포적 기계작용 및 특징적 메커니즘을 가지고, 도입된 외래성 단백질의 올바른 변형 및 가공을 확실히 하기 위해 선택될 수 있다.
안정한 발현은 재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 안정하게 발현하는 세포주는 복제의 바이러스성 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 형질도입된다. 벡터의 도입에 이어서, 세포가 선택적 배지에 스위칭되기 전에, 풍부 배지에서 1 내지 2일간 성장될 수 있다. 선택가능한 마커의 목적은, 선택에 대한 내성을 부여하는 것이고, 그것의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 예를 들어, 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클럼프는 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양으로부터 코딩된 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에 임의적으로 배양된다. 재조합 세포에 제조된 폴리펩티드가 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라, 배출되거나, 막 결합되거나, 세포내 포함될 수 있다. 당업자에 의해 이해되어지는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 원핵생물 또는 진핵생물의 세포 막을 통해, 성숙 폴리펩티드의 배출을 지정하는 시그널 서열로 설계될 수 있다.
부가적인 서열
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 코딩된 폴리펩티드의 정제 및/또는 검출을 용이하게 하는 마커 서열로 인프레임 융합된 코딩 서열을 임의적으로 포함한다. 그러한 정제 하위서열은 비제한적으로 금속 킬레이트화 펩티드, 예컨대 고정화된 금속 상의 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈, 글루타티온 (예컨대, GST), 헤마굴티닌 (HA) 태그 (인플루엔자 헤마굴티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응함; Wilson, I. 등 (1984) 세포 37:767)에 결합하는 서열, 말토스 결합 단백질 서열, FLAGS 신장/친화성 정제 시스템 등에 이용되는 FLAG 에피토프를 포함한다. 정제 도메인 및 폴리펩티드 서열 사이에 프로테아제-절단가능한 폴리펩티드 연결기 서열을 포함시킴은 정제를 용이하게 하는데 유용하다.
예를 들어, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기에 가능한 하나의 발현 벡터는 엔테로키나제 절단 부위에 의해 분리된 영역에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 IMIAC ([Porath 등 (1992) 단백질 발현 및 정제(Protein expression and purification) 3: 263-281]에 기재된 와 같은 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피) 상의 정제를 용이하게 하며, 한편 엔테로키나제 절단 부위는 폴리히스티딘 영역으로부터 원하는 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다. pGEX 벡터 (프로메가(Promega); 미국 위스콘신주 매디슨 소재)는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)를 이용하여 융합 단백질로서 외래성 폴리펩티드를 발현하는데 임의적으로 사용된다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질은 가용성이고, 디간드-아가로스 비이드 (예컨대, GST-융합의 경우에는 글루타티온-아가로스)에의 흡착 후, 유리 리간드의 존재 하에서의 용리에 의해, 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서의 부가적 구축물은, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이, Ig 분자, 예컨대 인간 IgG Fc ("단편 결정화가능한" 또는 단편 상보체 결합) 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인 (및 그것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)에 융합된 본 발명의 폴리펩티드 (또는 하나 이상의 그것의 단편)를 포함하는, 단백질, 및 그것의 코딩 핵산을 제공한다. Fc는 상보체의 C1q 성분 및 세포 상의 항체 수용체에 대한 결합을 초래하는 항체의 부분이다. 이 융합 단백질 또는 그것의 단편 및 그것의 코딩 핵산은 예방적 및/또는 치료적 약물로서, 또는 진단용 도구로서 임의적으로 유동하다 (또한, 예컨대 [Challita-Eid, P. 등 (1998) J Immunol 160:3419-3426; Sturmhoefel, K. 등 (1999) Cancer Res 59: 4964-4972]을 참고한다).
폴리펩티드 생산 및 회수
적당한 숙주 균주의 형질도입 및 적당한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장에 이어서, 선택된 프로모터는 적당한 수단 (예컨대, 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도되고, 세포는 추가 기간동안 배양된다. 세포는 전형적으로 원심적으로 채취되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 붕괴되며, 수득된 조 추출물은 추가적 정제를 위해 보유된다. 단백질의 발현에 이용된 진핵생물 또는 미생물 세포는 냉해동 주기, 초음파처리, 기계적 붕괴 또는 세포융해제의 사용, 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 붕괴될 수 있다.
세균, 식물, 동물 (특히, 포유동물) 및 고세균 기원의 세포를 포함한, 많은 세포들의 배양 및 생산을 위해, 언급된 바와 같이, 많은 참고문헌들이 이용가능하다. 이에 대해, 예컨대 [Sambrook, Ausubel, 및 Berger (모두 이하 상기와 동일함), 및 Freshney (1994) 동물 세포의 배양(Culture of Animal Cells), 기본 기술의 매뉴얼(Manual of Basic Technique), 제3판, Wiley-Liss, 미국 뉴욕 소재, 및 그 문헌 내에 인용된 참고문헌들; Doyle 및 Griffiths (1997) 포유 동물의 세포 배양(Mammalian Cell Culture): 기본적 기술(Essential Techniques), John Wiley and Sons, 미국 뉴욕 소재; Humason (1979) 동물 조직 기술(Animal Tissue Techniques), 제4판, W. H. Freeman and Company; 및 Ricciardelli 등 (1989) In vitro Cells Dev Biol 25: 1016-1024]를 참고한다. 식물 세포 배양 및 재생에 대해서는, 예컨대 [Payne 등 (1992), 액체 시스템에서의 식물 세포 및 조직 배양(Plant Cells and Tissue Culture in Liquid Systems), John Wiley & Sons, Inc. 미국 뉴욕주 뉴욕 소재; Gamborg 및 Phillips (편저) (1995), 식물 세포, 조직 및 기관 배양(Plant Cells, Tissue and Organ Culture); 기본적 방법 스프링거 랩 매뉴얼(Fundamental Method Springer Lab Manual), Springer-Verlag (베를린, 하이델베르크, 뉴욕) 및 Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (편저) Bios Scientific Publishers, 영국 옥스포드 소재, ISB N0 12 198370 6]를 참고한다. 세포 배양 배지는 일반적으로 [Atlas 및 Parks (편저) 미생물학적 배지의 편람 (1993), CRC Press, 미국 플로리다주 보라랜튼 소재]에 설명되어 있다. 세포 배양을 위한 부가적 정보가 시그마-알드리히 인코포레이티드(Sigma-Aldrich, Inc.)의 생명 과학 연구 세포 배양 카달로그 (미국 미조리주 세인트루이스 소재) ("시그마(Sigma)-LSRCCC") 및, 예컨대 시그마-알드리히 인코포레이티드의 식물 배양 카달로그 및 별책 (미국 미조리주 세인트루이스 소재) ("시그마-PCCS")와 같은 시중 입수가능한 문헌들에 나와 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 석출, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, (예컨대, 본원에 언급된 태그 시스템들 중 임의의 것을 이용하는), 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는, 당업계에 공지된 수많은 방법들 중 임의의 것에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 원할 경우, 하는, 성숙 단백질 또는 그것의 단편의 형체화를 완성함에 있어, 단백질 리폴딩(refolding; 재접힘) 단계를 이용할 수 있다. 마지막으로, 최종 정제 단계에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용할 수 있다. 언급된 참고문헌들(이하 상기와 동일함)에 부가적으로, 예컨대 [Sandana (1997) 단백질의 생물학적 분리(Bioseparation of Protein), Academic Press, Inc.; Bollag 등 (1996) Protein Method, 제2판, Wiley-Liss, 미국 뉴욕 소재; Walker (1996) 단백질 프로토콜 편람, Humana Press, 미국 뉴저지주 소재; Harris 및 Angal (1990), 단백질 정제 응용(Protein Purification Applications): 실질적 접근법(A Practical Approach), IRL Press (옥스포드), 영국 옥스포드 소재; Harris 및 Angal, 단백질 정제 방법(Protein Purification Method): 실질적 접근법(A Practical Approach), IRL Press (옥스포드), 영국 옥스포드 소재; Scopes (1993) 단백질 정제(Protein Purification): 원리 및 실습(Principles and Practice), 제3판, Springer Verlag, 미국 뉴욕 소재; Janson 및 Ryden (1998) 단백질 정제(Protein Purification): 원리, 고해상 방법 및 응용(Principles, High Resolution Method and Applications), 제2판, Wiley-VCH, NY; 및 Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, 미국 뉴저지주 소재]에 설명된 방법들을 비롯한, 다양한 정제 방법들이 당업계에 공지되어 있다.
생체외 발현 시스템
무세포 전사/번역 시스템을 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 이용할 수도 있다. 수개의 그러한 시스템들이 시중 입수가능하다. 생체외 전사 및 번역 프로토콜에 대한 일반 지침이 [Tymms (1995) 생체외 전사 및 번역 프로토콜(In vitro Transcription and Translation Protocols): 분자 생물학 방법(Method in Molecular Biology), 제37권, Garland Publishing, 미국 뉴욕 소재]에 나와 있다.
생체내 용도 및 적용
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 (예컨대, 안티센스 또는 리보자임 분자를 포함하는) 폴리뉴클레오티드의 상보체는, 치료적으로 유용한 공정을 달성하기 위해, 또는 치료적으로 유용한 산물을 발현하기 위해, 세포에 임의적으로 투여된다. 유전자 치료를 비롯한 이 생체내 용도들은 다수의 기술들을 포함하며, 이로써 유전자 발현이 세포에서 변경될 수 있다. 그러한 방법은, 예를 들어, 예컨대 치료적으로 및/또는 예방적으로 유용한 폴리펩티드, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 유전자의 도입을 포함한다.
생체내 폴리펩티드 발현
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여, 생체내 치료적 용도들을 위해 특히 유용하다. 예를 들어, 배양된 세포는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 {DNA 또는 RNA} 및/또는, 예컨대 항원, 사이토킨, 다른 동시-자극적인 분자, 보조제 등 중 하나 이상을 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드 서열 등으로 세포외 공학처리되고, 이어서 공학처리된 세포는 환자에게 복귀시킨다. 세포는 또한 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 항원성 펩티드를 비롯한 하나 이상의 폴리펩티드의 생체내 발현을 위해 생체내 공학처리될 수도 있다.
유기체 생체내 형질도입 및 발현에 적당한 수많은 바이러스성 벡터들이 공지되어 있다. 그러한 벡터는 레트로바이러스성 벡터를 포함한다 (예컨대, [Miller, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158: 1-24; Salmons 및 Gunzburg (1993) Human Gene Therapy 4: 129-141; Miller 등 (1994) Method in Enzymology 217:581-599] 및 [아데노-연관 벡터 (Carter (1992) Curr Opinion Biotech 3: 533-539; Muzcyzka (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158: 97-129에서 검토됨)]를 참고한다). 사용되는 다른 바이러스성 벡터는, 예컨대 [Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1: 51-64; Latchman (1994) Molec Biotechnol 2: 179-195; 및 Johanning 등 (1995) Nucl Acids Res 23: 1495-1501]에 일반적으로 기재된 바와 같이, 아데노바이러스성 벡터, 포진 바이러스성 벡터 및 신드비스 바이러스성 벡터를 포함한다.
한 측면에서, 폭스 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 폭스 바이러스성 벡터는 폴리본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 eIL-2 폴리펩티드로 트랜스펙션되고, 면역 반응의 증진, 예컨대 예컨대, 증가되거나 향상된 T 세포 증식이 요망되는 예방적, 치료적 및 진단용 용도들에서 유용하다. 예컨대 [Berencsi 등, J Infect Dis (2001) 183 (8): 1171-9; Rosenwirth 등, Vaccine 2001 Feb 8; 19 (13-14): 1661-70; Kittlesen. 등, J Immunol (2000) 164 (8): 4204-11; Brown 등 Gene Ther 2000 7 (19): 1680-9; Kanesa-thasan 등, Vaccine (2000) 19 (4-5): 483-91; Sten (2000) Drug 60 (2): 249-71]에 논의된 바이러스성 벡터를 참고한다. 그러한 벡터 및 수용가능한 부형제를 포함하는 조성물도 또한 본 발명의 한 특성이다.
유전자 치료 및 유전적 백신은 만성 감염성 질병 (예컨대, HIV 감염, 바이러스성 간염), 및 비감염성 질병, 예컨대 암 및 일부 형태의 선천성 결함, 예컨대 효소 부족을 퇴치하기 위한 방법을 제공하며, 그러한 방법은 예컨대, 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포를 포함하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 함께 이용될 수 있다. 핵산 및 벡터를 세포 생체내, 세포외 및 세포외 도입하기 위한 수가지 방법들이 이용되어져 왔고, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 및 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 함께 이용될 수 있다. 이 방법들은 리포좀 기재의 유전자 전달 (Debs 및 Zhu (1993) WO93/24640 및 U.S. 특허 제5,641,662호; Mannino 및 Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6 (7): 682-691; Rose, U.S. 특허 제5,279,833호; Brigham (1991) WO91/06309; 및 Felgner 등 (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413-7414; Brigham 등 (1989) Am J Med Sci 298: 278-281; Nabel 등 (1990) Science 249: 1285-1288; Hazinski 등 (1991) Am J Resp Cell Molec Biol 4: 206-209; 및 Wang 및 Huang (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7851-7855); 예컨대 암 치료를 위한, 아데노바이러스성 벡터 매개된 유전자 전달 (예컨대, [Chen 등 (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 3054-3057; Tong 등 (1996) Gynecol Oncol 61: 175-179; Clayman 등 (1995) Cancer Res. 5: 1-6; O'Malley 등 (1995) Cancer Res 55: 1080-1085; Hwang 등 (1995) Am J Respir Cell Mol Biol 13: 7-16; Haddada 등 (1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt. 3): 297-306; Addison 등 (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 8522-8526; Colak 등 (1995) Brain Res 691: 76-82; Crystal (1995) Science 270:404-410; Elshami 등 (1996) Human Gene Ther 7: 141-148; Vincent 등 (1996) J Neurosurg 85: 648-654]을 참고한다), 및 기타 많은 유전자 전달들을 포함한다. 레트로바이러스성 게놈의 일부로서 치료적 폴리뉴클레오티드 서열을 고정하는 복제-결함 레트로바이러스성 벡터가 또한, 특히 단순 MuLV 벡터에 대해 사용되어져 왔다. 예컨대 [Miller 등 (1990) Mol Cell Biol 10: 4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res 4: 43, 및 Cornetta 등 (1991) Hum Gene Ther 2: 215]을 참고한다. 리간드-특이적, 양이온-기재의 운송 시스템에 커플링된 핵산 운송 (Wu and Wu (1988) J Biol Chem, 263: 14621-14624)도 또한 사용되어져왔다. 네이키드 DNA 발현 벡터도 또한 기재되어 왔다 (Nabel 등 (1990), 이하 상기와 동일함); Wolf 등 (1990) Science, 247: 1465-1468). 일반적으로, 이 방법들은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 적당한 벡터에 혼입함으로써, 본 발명에 적응될 수 있다.
본 발명의 핵산을 환자에 도입함으로써 본 발명에 적응될 수 있는, 유전자 치료 프로토콜을 기술하는 일반적 텍스트는, 예컨대 [Robbins (1996) 유전자 치료 프로토콜(Gene Therapy Protocols), Humana Press, 미국 뉴저지주 소재, 및 Joyner (1993) 유전자 표적화(Gene Targeting): 실질적 접근법(A Practical Approach), IRL Press, 영국 옥스포드 소재]를 포함한다.
안티센스 기술
유전자 치환 핵산으로서의 본 발명의 핵산의 발현에 부가적으로, 핵산은 또한 예컨대 본 발명의 핵산의 발현을 하향 조절하기 위해, 또는 핵산의 발현이 세포에서 더 이상 요망되지 않으면 혹은 않을 때, 발현의 센스 및 안티센스 억제에도 유용하다. 마찬가지로, 본 발명의 핵산, 또는 그것의 하위서열 또는 안티센스 서열이 또한 자연 발생 동종성 핵산의 발현을 차단하는데 사용될 수도 있다. 다양한 센스 및 안티센스 기술이, 예컨대 [Lichtenstein 및 Nellen (1997) 안티센스 기술(Antisense Technology): 실질적 접근법(A Practical Approach), IRL Press (옥스포드대학), 영국 옥스포드 소재, 및 Agrawal (1996) 안티센스 써라퍼틱스(Antisense Therapeutics), Humana Press, 미국 뉴저지주 소재, 및 그 문헌 내에 인용된 참고문헌들]에 설명된 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
프로브로서의 용도
또한, 매우 엄격한 조건 하에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 그것의 단편에 혼성화하는, 전형적으로 12 이상 염기, 바람직하게는 15 이상, 더욱 바람직하게는 20 이상, 30 이상, 또는 50 이상 염기를 갖는, 올리고뉴클레오티드로도 칭해지는 폴리뉴클레오티드의 사용도 또한 고찰된다. 폴리뉴클레오티드는 상기 언급된 바와 같은 방법에 따라, 프로브, 프라이머, 센스 및 안티센스 제제로서 사용될 수 있다.
핵산 혼성화
전형적으로 핵산이 전형적으로 용액에서 연합할 때, 핵산은 "혼성화한다". 핵산은 다양한 잘 특정된 물리화학적 힘들, 예컨대 수소결합, 용매배제, 염기 쌓임 등으로 인해 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침이 [Tijssen (1993) 핵산 프로브를 이용한 생화학, 및 분자생물학-혼성화의 실험적 기술(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes), 파트 I, 제2장, "혼성화 원리의 개론 및 핵산 프로브 검정 방법(Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)" (Elsevier, 미국 뉴욕) (이후, "Tjissen"), 및 Ausubel, 이하 상기와 동일함]에 나와 있고, [Hames 및 Higgins (1995) Gene Probes 1, IRL Press (옥스포드대학 출판부), 영국 옥스포드 소재 (Hames 및 Higgins 1) 및 Hames 및 Higgins (1995) Gene Probes 2, IRL Press (옥스포드대학 출판부), 영국 옥스포드 소재 (Hames 및 Higgins 2)]는 올리고뉴클레오티드를 비롯한, DNA 및 RNA의 합성, 라벨링, 검출 및 정량화에 대한 상세한 설명을 제공한다.
2개의 핵산 서열이 실질적으로 일치함을 가리키는 것은, 2개의 분자가 적어도 엄격한 조건 하에서 상호 혼성화하는 것이다. 표현 "특이적으로 혼성화함"은 서열이 착체 혼합물 (예컨대, 총 세포적) DNA 또는 RNA 중에 존재할 때, 엄격한 조건 하에서 특별한 뉴클레오티드 서열에 대해서만 분자가 결합, 중복 부위를 가지거나 혼성화함을 가리킨다. "실질적으로 결합함"은 프로브 핵산 및 표적 핵산 간의 상보적 혼성화를 가리키고, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 원하는 검출을 달성하기 위한 혼성화 배지의 엄격성을 감소시킴으로써 수용될 수 있는 소량의 미스매치도 포괄한다.
핵산 혼성화 실험, 서던 및 노던 혼성화의 관련 부문에서 "엄격한 혼성화 세척 조건" 및 "엄격한 혼성화 조건"은 서열 의존적이고, 상이한 환경적 변수 하에서 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침이 [Tijssen (1993), 이하 상기와 동일함, 및 Hames 및 Higgins 1 및, Hames 및 Higgins 2, 이하 상기와 동일함]에 나와 있다.
본 발명의 목적을 위해, 일반적으로, "매우 엄격한" 혼성화 및 세척 조건은 특정된 이온 강도 및 pH (이하 언급되는 바와 같이, 매우 엄격한 조건은 또한 비교적 조건에서 언급될 수도 있음)에서 특이적 서열의 열적 융점 (Tm)보다 약 5℃ 이하 낮도록 선택된다. Tm은 시험 서열의 50%가 완전히 매칭된 프로브로 혼성화되는 (특정된 이온 강도 및 pH 하에서의) 온도이다. 즉, Tm은 핵산 중복 부위가 주어진 조건 하에서 50% 변성되는 온도를 가리키고, 그것은 핵산 혼성체의 안정성의 직접적 측정을 나타낸다. 이에 따라, Tm은 나선에서 무작위 코일로 전이하는 중간점에 상응하는 온도를 상응하고; 그것은 길이, 뉴클레오티드 조성물, 및 긴 신장의 뉴클레오티드를 위한 이온 강도에 의존한다. 전형적으로, "엄격한 조건" 하에서, 프로브는 그것의 표적 하위서열에 혼성화하나, 다른 서열에는 혼성화하지 않는다. "매우 엄격한 조건"은 특별한 프로브를 위한 Tm와 같도록 선택된다.
혼성화 후에, 비혼성화 핵산 물질은 일련의 세척에 의해 제거될 수 있고, 그 세척의 엄격성은 원하는 결과에 따라 조정될 수 있다. 낮은 엄격성 세척 조건 (예컨대, 보다 높은 염 및 보다 낮은 온도)는 감도를 증가시키나, 비특이적 혼성화 시그널 및 높은 배경 시그널을 생산시킬 수 있다. 보다 높은 엄격성 조건 (예컨대, 보다 낮은 염, 및 혼성화 온도에 근접하는 보다 높은 온도)은 배경 시그널을 저하시키며, 전형적으로 단지 특이적 시그널만이 남는다. 이에 대해, 본원에 전체적으로 모든 목적을 위해 참고 인용된 [Rapley, R. 및 Walker, J.M. 편저, 분자 생물학적 방법의 편람(Molecular Biomethod Handbook) (Humana Press, Inc. 1998) (이후 "Rapley 및 Walker")]를 참고한다.
DNA-DNA 중복 부위의 Tm은 방정식(1):
Tm (℃) = 81.5℃ + 16.6(log10M) + 0.41 (%G + C) - 0.72 (%f) - 500/n
(식 중, M은 단가 양이온 (주로 Na+)의 몰농도이고, (%G + C)는 구아노신(G) 및 시스토신(C) 뉴클레오티드의 퍼센티지이며, (%f)는 포름아미드의 퍼센티지이고, n은 혼성체와의 뉴클레오티드 염기수 (즉, 길이)임)을 이용하여 산정될 수 있다. 이에 대해, [Rapley 및 Walker, 이하 상기와 동일함]을 참고한다.
RNA-DNA 중복 부위의 Tm은 방정식(2):
Tm (℃) = 79.8℃ + 18.5 (log10M) + 0.58 (%G + C) -11. 8 (%G + C)2 - 0.56 (%f) - 820/n,
(식 중, M은 단가 양이온 (주로 Na+)의 몰농도이고, (%G + C)는 구아노신(G) 및 시스토신(C) 뉴클레오티드의 퍼센티지이며, (%f)는 포름아미드의 퍼센티지이고, n은 혼성체와의 뉴클레오티드 염기수 (즉, 길이)임)을 이용하여 산정될 수 있다. Id. 상기 방정식 1 및 2는 전형적으로 약 100 내지 200개 뉴클레오티드보다 긴 혼성체 중복 부위에 대해서만 정확하다. Id.
50개 뉴클레오티드보다 짧은 핵산 서열의 Tm은 하기와 같이 계산될 수 있다: Tm (℃) = 4(G + C) + 2(A + T) (여기에서, A(아데닌), C, T(티민), 및 G는 상응하는 뉴클레오티드의 수이다).
서던 또는 노던 블로트에서 필터 상의 100개 초과의 상보적 잔기를 가지는 상보적 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는, 42℃에서 1 mg의 헤파린을 갖는 50% 포르말린 (또는 포름아미드)이며, 이 때 하룻밤동안 혼성화를 수행한다. 엄격한 세척 조건의 예는, 65℃에서 15분간의 0.2×SSC 세척이다 (SSC 완충액에 대한 설명에 대해, [Sambrook, 이하 상기와 동일함]을 참고한다). 종종, 고엄격성 세척 이전에, 배경 프로브 시그널을 제거하기 위한 저엄격성 세척이 선행된다. 저엄격성 세척의 예는 40℃에서 15분간의 2×SSC이다. 고엄격성 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분간의 0.15 M NaCl이다. 예컨대, 100개 초과의 뉴클레오티드의 중복 부위에 대한 중엄격성 세척의 예는 45℃에서 15분간의 1×SSC이다. 예컨대, 100개 초과의 뉴클레오티드의 중복 부위에 대한 저엄격성 세척의 예는 40℃에서 10분간의 4 - 6×SSC이다. 짧은 프로브 (예컨대, 약 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우, 엄격한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M Na+ 이온 미만의 염 농도, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na+ 이온 농도 (또는 다른 염)를 포함하고, 온도는 전형적으로 약 30℃ 이상이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로써 달성될 수도 있다.
일반적으로, 특별한 혼성화 검정에서 비관련 프로브에 대해 관찰되는 것보다 2× 또는 2.5× 내지 5× (또는 그 초과)인 시그널 대 노이즈 비는, 특이적 혼성화의 검출을 나타낸다. 본 발명의 관련 부문에서 2개의 서열간의 적어도 엄격한 혼성화의 검출은, 예컨대 본원에서의 서열목록에 제공된 본 발명의 핵산에 대해 비교적 강한 구조적 유사성 또는 동종성을 나타낸다.
언급되는 "매우 엄격한" 조건은 특정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 이하 낮도록 선택된다. 관심 뉴클레오티드 서열 (예컨대, "프로브")와 밀접히 관련되거나 일치하는 표적 서열이 고엄격성 조건 하에서 동정될 수 있다. 보다 낮은 엄격성의 조건이 덜 상보적인 서열을 위해 적당하다. 이에 대해, 예컨대 [Rapley 및 Walker; Sambrook, 모두 이하 상기와 동일함]을 참고한다.
본 발명의 핵산을 동정하기 위해, 비교 혼성화를 사용할 수 있고, 이 비교 혼성화 방법은 본 발명의 핵산을 구별하는 바람직한 방법이다. 본 발명의 관련 부문에서 2개의 뉴클레오티드 서열들 간의 매우 엄격한 혼성화의 검출은 예컨대, 본원의 서열목록에 제공된 핵산에 대해 비교적 강한 유사성/동종성을 나타낸다. 2개의 뉴클레오티드 서열들 간의 매우 엄격한 혼성화는 엄격한 혼성화 조건에 의해 검출되는 것보다 큰 구조, 뉴클레오티드 염기 조성, 배열 또는 순서의 유사성 또는 동종성 정도를 입증한다. 특히, 본 발명의 관련 부문에서 매우 엄격한 혼성화의 검출은, 예컨대, 본원의 서열목록에 제공된 핵산에 대한 강한 구조적 유사성 또는 구조적 동종성 (예컨대, 뉴클레오티드 구조, 염기 조성, 배열 또는 순서)을 나타낸다. 예를 들어, 엄격한 조건 하에서 본원의 표본 핵산에 혼성화하는 시험 핵산을 동정하는 것이 바람직하다.
이에 따라, 엄격한 혼성화의 한 척도는, 매우 엄격한 조건 (또는 매우 엄격한 조건, 또는 초고염격성 혼성화 조건, 또는 극도의 초엄격성 혼성화 조건) 하에서, 열거된 본 발명의 핵산 (예컨대, 핵산 서열 서열번호 16 내지 30, 및 그것의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열) 중 하나에 혼성화하는 능력이다. (예컨대 매우 엄격한, 초고엄격성 또는 극도의 초염격성 혼성화 조건을 포함하는) 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 임의의 핵산에 대해 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
예를 들어, 매우 엄격한 혼성화 및 세척 조건을 결정할 때, 혼성화 및 세척 조건은, 선택된 기준 세트가 충족될 때까지, (예컨대, 혼성화 또는 세척 시에, 온도의 증가, 염 농도의 감소, 세제 농도의 증가 및/또는 유기 용매, 예컨대 포르말린의 농도 증가에 의해) 점차적으로 증가된다. 예를 들어, 혼성화 및 세척 조건은, 비매칭된 표적에 대한 프로브의 혼성화에서 관찰되는 것에 비해 2.5× 이상, 임의적으로는 5× 이상 높은 시그널 대 노이즈의 비로, 서열번호 16-30로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열, 및 그것의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브가, 완벽하게 매칭된 상보적 표적 (이 또한, 서열번호 16-30로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열, 및 그것의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)에 결합할 때까지 점차적으로 증가된다. 이 경우에서, 비매칭된 표적은 예컨대, 공지된 인터페론-알파 핵산 서열 (예컨대, 당 출원 시에, GenBank 또는 GENESEQ와 같은 공중 데이터베이스에 존재하는 인터페론-알파 핵산 서열)에 상응하는 핵산이다.
시험 핵산은, 완벽하게 매칭된 상보적 표적에 대한 경우에서보다 프로브에 대해 1/2 이상 혼성화할 때, 즉 비매칭된 표적 핵산들 중 임의의 것, 예컨대 상기 기술된 공지된 인터페론-알파 핵산 서열에 대한 혼성화에서 관찰되는 것에 비해 적어도 약 2.5× 내지 10×, 전형적으로는 5× - 1O×으로 높은 시그널 대 노이즈 비로 완벽하게 매칭된 프로브가 완벽하게 매칭된 상보적 표적에 결합하는 조건 하에서 프로브의 표적으로의 혼성화에서보다 1/2 이상인 시그널 대 노이즈 비로써, 프로브 핵산에 특이적으로 혼성화하는 것으로 일컬어진다. 일부 그러한 핵산의 경우, 완벽하게 상보적인 올리고뉴클레오티드의, 상기 기술된 공지된 인터페론-알파 서열에 상응하는 대조 핵산으로의 혼성화에서보다 적어도 약 5× 높은 시그널 대 노이즈 비로써, 코딩 올리고뉴클레오티드에 대해 완벽하게 상보적인 올리고뉴클레오티드가 코딩 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록, 엄격한 조건이 선택된다.
초고염격성 혼성화 및 세척 조건은, 프로브가 완벽하게 매칭된 상보적 표적 핵산에 결합하기 위한 시그널 대 노이즈 비가 비매칭된 표적 핵산들 중 임의의 것, 예컨대 상기 기술된 공지된 인터페론-알파 서열에 대한 혼성화에서 관찰되는 것보다 적어도 10× 높게 될 때까지, 혼성화 및 세척 조건의 엄격성이 증가되는 조건이다. 그러한 조건 하에서, 완벽하게 매칭된 상보적 표적 핵산의 경우의 1/2 이상인 시그널 대 노이즈 비로, 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은 초엄격성 조건 하에서 프로브에 결합한다고 일컬어진다.
마찬가지로, 보다 높은 수준의 엄격성은 관련 혼성화 검정의 혼성화 및/또는 세척 조건을 점차적으로 증가시킴으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 및 세척 조건의 엄격성에 있어서는, 프로브가 완벽하게 매칭된 상보적 표적 핵산에 결합하기 위한 시그널 대 노이즈 비가 비매칭된 표적 핵산들 중 임의의 것, 예컨대 상기 기술된 공지된 인터페론-알파 서열에 대한 혼성화에서 관찰되는 것보다 적어도 10×, 20×, 50×, 100×, 또는 500× 또는 그 이상 높을 때까지 증가되도록 하는 조건이다. 그러한 조건 하에서, 완벽하게 매칭된 상보적 표적 핵산의 경우의 1/2 이상인 시그널 대 노이즈 비로, 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은 극도의 초엄격성 조건 하에서 프로브에 결합한다고 일컬어진다.
고엄격성, 초고엄격성 및 극도의 초고엄격성 조건 하에서 서열번호 16-30로 표시되는 핵산에 혼성화하는 표적 핵산은 본 발명의 한 특성이다. 그러한 핵산의 예는, 주어진 핵산 서열에 비해, 침묵 또는 보존적 핵산 치환을 하나 가지거나 거의 가지지 않는 것들을 포함한다.
서열 재조합을 위한 기질 및 형식
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 그것의 단편은, 예컨대 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 부가적 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해, 예컨대 [Ausubel, Berger 및 Sambrook]에 설명된 바와 같은 표준 클로닝 방법에서의 사용에 부가하여, 다양한 재조합 및 재발성 서열 재조합 반응들 중 임의의 것을 위한 기질로서 임의적으로 사용된다. 본 발명자 및 그의 동료들에 의해 개발된 반응들을 비롯한 다양한 그러한 반응들이 공지되어 있다.
본원에 기재된 성질들 하나 이상을 갖는 분자를 생성 및 동정하기 위한 다양한 다양성 생성 프로토콜이 당업계에 이용가능하며 기재된다. 절차는 하나의 핵산 또는 세트의 핵산들의 하나 이상의 변이체, 및/또는 코딩된 단백질의 변이체를 생산하는 것과 함께, 또는 그와 독립적으로 사용될 수 있다. 개별적으로 및 집합적으로, 이 절차는 예컨대, 새롭고/새롭거나 향상된 특성을 갖는, 핵산, 단백질, 경로, 세포 및/또는 유기체의 공학처리 또는 급속한 진화에 유용한 (예컨대, 핵산 라이브러리를 비롯한) 다양화된 핵산 및 세트의 핵산들을 생성하기 위한 확고하고, 널리 적용가능한 방법을 제공한다. 구별 및 분류가 명확화를 위해 뒤잇는 논의 과정에서 이루어지나, 기술이 종종 상호 배제적이지 않음을 인지할 것이다. 실제로, 다양한 서열 변이체에 접근하기 위해, 각종 방법들이 단독으로 또는 조합되어, 병렬식 또는 직렬식으로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 다양성 생성 절차들 중 임의의 것의 결과는 원하는 성질을 가지거나 원하는 성질을 부여하는 핵산을 위해 선택 또는 선별될 수 있거나, 원하는 성질을 가지거나 원하는 성질을 부여할 수 있는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 생성일 수 있다. 본원의 방법들 또는 그와 달리 당업자에게 적용가능한 방법들 중 하나 이상에 의한 다양화에 이어, 생산될 수 있는 임의의 핵산이 원하는 활성 또는 성질, 예컨대 인터페론-알파 수용체에 대핸 변경된 결합 친화성, 변경된 항바이러스성 또는 증식억제 활성, TH1 분화를 유도하기 위한 변경된 성능, 사이토킨 생산을 유도하거나 억제하기 위한 변경된 능력을 위해 선택될 수 있다. 이는 예를 들어, 자동화 또는 자동화가능한 형식으로, 여기에서 또한 이하 실시예 단락에서 논의되는 본 발명의 검정법들 중 임의의 것에 의해, 검출될 수 있는 임의의 활성을 동정하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 관련된 (또는 심지어 비관련된) 성질들을, 업자의 분별에 따라, 병렬식 또는 직렬식으로 평가할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 개질된 핵산 서열을 생성하기 위한, 다양한 다양성 생성 절차의 기재가 하기 공보들 및 그 문헌 내에 인용된 참고문헌들에 나와 있다: Soong, N. 등 (2000) "바이러스의 분자적 육종(Molecular breeding of viruses)" Nat Genet 25 (4): 436-439; Stemmer 등 (1999) "표적화 및 기타 임상적 성질을 위한 바이러스의 분자적 육종(Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties)" Tumor Targeting 4: 1-4; Ness 등 (1999) "서브틸리신의 서브게놈 서열의 DNA 셔플링(DNA Shuffling of subgenomic sequences of subtilisin)" Nature Biotechnology 17: 893-896; Chang 등 (1999) "DNA 부류 셔플링을 이용하는 사이토킨의 진화(Evolution of a cytokine using DNA family shuffling)" Nature Biotechnology 17: 793-797; Minshull 및 Stemmer (1999) "분자적 육종에 의한 단백질 진화(Protein evolution by molecular breeding)" Current Opinion in Chemical Biology 3: 284-290; Christians 등 (1999) "DNA 부류 셔플링을 이용하는 AZT 인산화를 위한 티미딘 키나제의 지정 진화(Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling)" Nature Biotechnology 17: 259-264; Crameri 등 (1998) "다양한 종으로부터의 한 부류의 유전자들은 DNA 셔플링의 지정 진화를 가속화함(DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution)" Nature 391: 288-291; Crameri 등 (1997) "DNA 셔플링에 의한 비산염 해독의 분자적 진화(Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling), "Nature Biotechnology 15 : 436-438; Zhang 등 (1997) "DNA 셔플링 및 선별에 의한 갈락토시다제로부터의 효과적인 푸큐시다제의 지정 진화(Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening)" Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 94: 4504-4509 ; Patten 등 (1997) "DNA 셔플링의 약품 및 백신을 위한 용도(Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines)" Current Opinion in Biotechnology 8: 724-733; Crameri 등 (1996) "DNA 셔플링에 의한 항체-파지 라이브러리의 구축 및 진화(Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling)" Nature Medicine 2: 100-103; Crameri 등 (1996) "DNA 셔플링을 이용하는 분자적 진화에 의한 향상된 녹색 형광 단백질(Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling)" Nature Biotechnology 14: 315-319; Gates 등(1996) "lac 억제자 '헤드피스 이량체' 상의 표시를 통한 펩티드 라이브러리로부터의 리간드의 친화성 선택적 단리(Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer'"), Journal of Molecular Biology 255: 373-386; Stemmer (1996) "성 PCR 및 어셈블리 PCR(Sexual PCR and Assembly PCR)", (The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, 뉴욕 소재. pp. 447-457); Crameri 및 Stemmer (1995) "조합적 다수 카세트 변이유발은 변이체 및 야행형 카세트의 모든 순열을 창출함(Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes)" BioTechniques 18: 194-195; Stemmer 등 (1995) "유전자 및 전체 플라스미드의 단일-단계 어셈블리는 다수의 올리고데옥시-리보뉴클레오티드를 형성함(Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleotides)" Gene, 164: 49-53 ; Stemmer (1995) "분자적 산정의 진화(The Evolution of Molecular Computation)" Science 270:1510; Stemmer (1995) "서열 공간의 조사(Searching Sequence Space)" Bio/Technology 13: 549-553; Stemmer (1994) "DNA 셔플링에 의한 생체외 단백질의 급속한 진화(Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling)" Nature 370 :389-391; 및 Stemmer (1994) "무작위 분획화 및 리어셈블리에 의한 DNA 셔플링: 분자적 진화를 위한 생체외 재조합(DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution)" Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 91: 10747-10751]에 나와 있다.
용어 "셔플링"은 하는 서열들 간의 재조합을 가리키기 위해 본원에 사용되고, 일부 예들에서 셔플링은 동종성 재조합 또는 비동종성 재조합, 예컨대 cre/lox 및/또는 flp/frt 시스템을 통한 교차를 포함할 수 있다. 셔플링은 예를 들어, 생체외 및 생체내 셔플링 형식, 컴퓨터를 이용한 셔플링 형식, 이중 나선 또는 단일 나선 주형을 이용하는 셔플링 형식, 프라이머 기재의 셔플링 형식, 핵산 단편화 기재의 셔플링 형식 및 올리고뉴클레오티드-매개된 셔플링 형식을 포함하는 다양한 상이한 형식들을 통해 수행될 수 있고, 이들 모두는 불일치하는 서열들 간의 재조합 이벤트들에 기초하며, 다른 유사한 재조합 기재의 형식들뿐만 아니라, 본원에서 이하에 더욱 상세하게 기재 및 참조된다.
다양성 창출의 변이적 방법은 예를 들어, 부위-지정 변이유발 (Ling 등 (1997) "DNA 변이유발방법: 개론(Approaches to DNA Mutagenesis: an overview)" Anal Biochem. 254 (2): 157-178; Dale 등 (1996) "포스포로티오에이트 방법을 이용한 올리고뉴클레오티드-지정 무작위 변이유발(Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method)" Methods Mol. Biol. 57: 369-374; Smith (1985) "생체외 변이유발(In vitro mutagenesis)" Ann. Rev. Genet. 19: 423-462; Botstein & Shortle(1985) "생체외 변이유발의 방법 및 용도(Strategies and applications of in vitro mutagenesis)" Science 229:1193-1201; Carter(1986) "부위-지정 변이유발(Site-directed mutagenesis)" Biochem. J. 237: 1-7; 및 Kunkel (1987) "올리고뉴클레오티드 지정 변이유발의 효율(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis)", Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. 및 Lilley, D. M. J. 편저, Springer Verlag, 독일 베를린 소재)); 주형을 포함하는 우라실을 이용하는 변이유발 (Kunkel (1985) "표현형 선택없는 급속하고 효율적인 부위-특이적 변이유발(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel 등 (1987) "표현형 선택없는 급속하고 효율적인 부위-특이적 변이유발(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)" Methods in Enzymol. 154,367-382; 및 Bass 등 (1988) "새 DNA-결합 특이성을 갖는 변이체 Trp 억제자(Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities)"Science 242: 240-245); 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발 (Method in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) " M13-유도 벡터를 이용하는 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발: 임의의 DNA 단편에서의 점 돌연변이의 생산을 위한 효율적이고 일반적인 절차(Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment)" Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller & Smith (1983) "M13 벡터로 클로닝된 DNA 단편의 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발(Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors)" Methods in Enzymol. 100:468-500; 및 Zoller & Smith (1987) "올리고뉴클레오티드-지정 변이유발: 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 단일 나선 DNA 주형을 이용하는 단순 방법(Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template)" Methods in Enzymol. 154: 329-350); 포스포로티오에이트-변형 DNA 변이유발 (Taylor 등 (1985) "틈이 생긴(nicked) DNA를 제조하기 위한 제한 효소 반응에서의 포스포로티오에이트-변형 DNA의 용도" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor 등 (1985) "포스포로티오에이트-변형 DNA을 이용하는 고빈도수의 올리고뉴클레오티드-지정 변이의 급속 생성(The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA)" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein (1986) "포스포로티오에이트기에 의한 제한 엔도뉴클레아제 Nci I 절단의 억제 및 그것의 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발에의 용도(Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis)" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers 등 (1988) "포스포로티오에이트-기재의 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발에서의 Y-T 엑소뉴클레아제(Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)" Nucl. Acids Res. 16: 791-802; 및 Sayers 등 (1988) "브롬화에티디움의 존재 하에서의 제한 뉴클레아제를 이용한 반응에 의한 포스포로티오에이트-함유 DNA의 나선 특이적 절단(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide)" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); 갭이 있는 중복 부위 DNA를 이용하는 변이유발 (Kramer 등 (1984) "올리고뉴클레오티드-지정 변이 구축을 위한 갭이 있는 중복 부위 DNA 접근법(The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction)" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Method in Enzymol. "갭이 있는 중복 부위 DNA를 통한 변이의 올리고뉴클레오티드-지정 구축(Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA)" 154: 350-367; Kramer 등 (1988) "변이의 올리고뉴클레오티드-지정 구축을 위한 갭이 있는 중복 부위 DNA 방법에서의 향상된 효소적 생체외 반응(Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations)" Nucl. Acids Res. 16: 7207; 및 Fritz 등 (1988) "변이에서의 올리고뉴클레오티드-지정 구축: 생체외 효소적 반응이 없는 갭이 있는 중복 부위 DNA 절차(Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro)" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).
부가적인 적당한 방법은 점 미스매치 수복 (Kramer 등 (1984) "점 미스매치 수복(Point Mismatch Repair)" Cell 38: 879-887), 수복-결여 숙주 균주를 이용하는 변이유발 (Carter 등 (1985) "M13 벡터를 이용하는 향상된 올리고뉴클레오티드 부위-지정 변이유발(Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors)" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; 및 Carter (1987) " M13 벡터를 이용하는 향상된 올리고뉴클레오티드 부위-지정 변이유발(Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors)" Methods in Enzymol. 154: 382-403), 결실 변이유발 (Eghtedarzadeh & Henikoff (1986) "큰 결실을 생성하기 위한 올리고뉴클레오티드의 용도(Use of oligonucleotides to generate large deletions)" Nucl. Acids Res. 14: 5115), 제한-선택 및 제한-정제 (Wells 등 (1986) "서브틸리신의 전이 상태를 안정화시킴에 있어서의 수소결합 형성의 중요성(Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin)" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A317: 415-423), 총 유전자 합성에 의한 변이유발 (Nambiar 등 (1984) "리보뉴클레아제 S 단백질을 코딩하는 유전자의 총 합성 및 클로닝(Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein)" Science 223: 1299-1301; Sakamar 및 Khorana (1988) "소 간상 세그먼트 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질(트랜스두신)의 서브유니트를 위한 유전자의 총 합성 및 발현(Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin))" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells 등 (1985) "카세트 변이유발: 특정된 부위에서의 다수 변이의 생성을 위한 효율적인 방법(Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites)" Gene 34: 315-323; 및 Grundstrom 등 (1985) "마이크로크기의 샷건 유전자 합성에 의한 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발(Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis)" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), 이중 나선 파괴 수복 (Mandecki (1986) "에쉐리키아 콜리아의 플라스미드에서의 올리고뉴클레오티드-지정 이중 나선 파괴 수복: 부위-특이적 변이유발을 위한 방법 (Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmidsof Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181; 및 Arnold (1993) "비통상적 환경을 위한 단백질 공학처리(Protein engineering for unusual environments)" Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455)을 포함한다. 상기 방법들 중 많은 방법들에 관한 부가적인 상세 내용이 각종 변이유발 방법에 관한 문제 해결을 위한 유용한 대책에 조절책을 기술하고 있는 [Method in Enzymology 제154권]에서 찾아볼 수 있다.
각종 다양성 생성 방법에 관한 부가적 상세내용은 하기 U.S. 특허들, PCT 공보들 및 출원들, 및 EPO 공보들에서 찾아볼 수 있다:
U.S. 특허 제5,605,793호 (Stemmer) (1997년 2월 25일), "생체외 재조합을 위한 방법(Methods for In Vitro Recombination)"; U.S. 특허 제5,811,238호 (Stemmer 등) (1998년 9월 22일) "반복적 선택 및 재조합에 의한 원하는 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 생성 방법(Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination)"; U.S. 특허 제5,830,721호 (Stemmer 등) (1998년 11월 3일), "무작위 분획화 및 리어셈블리에 의한 DNA 변이유발(DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly); U.S. 특허 제5,834,252호 (Stemmer 등) (1998년 11월 10일) "말단-상보적 폴리머라제 반응(End-Complementary Polymerase Reaction)"; U.S. 특허 제5,837,458호 (Minshull 등) (1998년 11월 17일), "세포적 및 대사적 공학처리를 위한 방법 및 조성물(Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering)"; WO95/22625 (Stemmer 및 Crameri), "무작위 분획화 및 리어셈블리에 의한 변이유발(Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly)"; WO96/33207 (Stemmer 및 Lipschutz) "말단-상보적 폴리머라제 사슬 반응"; WO97/20078 (Stemmer 및 Crameri) 반복적 선택 및 재조합에 의한 원하는 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 생성 방법(Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination)"; WO97/35966 (Minshull 및 Stemmer), "세포적 및 대사적 공학처리를 위한 방법 및 조성물(Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering)"; WO99/41402 (Punnonen 등) "유전 벡터의 표적화(Targeting of Genetic Vectors"); WO99/41383 (Punnonen 등) "항원 라이브러리 면역화(Antigen Library Immunization)"; WO99/41369 (Punnonen 등) "유전 백신 벡터 공학처리(Genetic Vaccine Vector Engineering)"; WO99/41368 (Punnonen 등) "유전 백신의 면역조절 성질의 최적화(Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines)"; EP 752008 (Stemmer 및 Crameri), "무작위 분획화 및 리어셈블리에 의한 DNA 변이유발(DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly)"; EP 0932670 (Stemmer) "재발성 서열 재조합에 의한 진화 세포적 DNA 흡수(Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination)"; WO99/23107 (Stemmer 등) "바이러스성 게놈 셔플링에 의한 바이러스 굴성 및 숙주 범위의 변형(Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling)" WO99/21979 (Apt 등) "인간 파필로마바이러스 벡터(Human Papillomavirus Vectors)"; WO98/31837 (del Cardayre 등) "재발성 서열 재조합에 의한 전체 세포 및 유기체 진화의 진화(Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination)"; WO98/27230 (Patten 및 Stemmer) "폴리펩티드 공학처리를 위한 방법 및 조성물(Methods and Compositions for Polypeptide Engineering)"; WO98/27230 (Stemmer 등) "재발성 서열 셔플링 및 선택에 의한 유전자 치료의 최적화 방법(Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection)"; WO 00/00632 "매우 다양한 라이브러리의 생성 방법(Methods for Generating Highly Diverse Libraries)"; WO 00/09679 "생체외 재조합 폴리뉴클레오티드 서열 뱅크 및 수득된 서열을 수득하기 위한 방법(Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences)"; WO 98/42832 (Arnold 등) "무작위 또는 특정 프라이머를 이용하는 폴리뉴클레오티드 서열의 재조합(Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers)"; WO 99/29902 (Arnold 등) "폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 창출 방법(Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences)"; WO 98/41653 (Vind) "DNA 라이브러리의 구축을 위한 생체외 방법(An in Vitro Method for Construction of a DNA Library,)"; WO 98/41622 (Borchert 등) "DNA 셔플링을 이용하는 라이브러리의 구축 방법(Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling)" 및 WO98/42727 (Pati 및 Zarling) "동종성 재조합을 이용하는 서열 교대(Alterations using Homologous Recombination)"; WO00/18906 (Patten 등) "코돈-변경 유전자의 셔플링"; "WO 00/04190 (del Cardayre 등) "재발성 재조합에 의한 전체 세포 및 유기체의 진화(Shuffling of Codon Altered Genes)"; WO 00/42561 (Crameri 등) "올리고뉴클레오티드 매개된 핵산 재조합(Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination)"; WO00/42559 (Selifonov 및 Stemmer) "진화 모의에서 사용하기 위한 데이터 구조의 집합 방법(Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations)"; WO00/42560 (Selifonov 등) "원하는 특성을 갖는 문자열, 폴리뉴클레오티드 & 폴리펩티드의 제조 방법(Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics)"; PCT/USOO/26708 (Welch 등) "합성 셔플링을 위한 코돈-변화 올리고뉴클레오티드 합성의 용도(Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling)"; 및 PCT/USO1/06775 "단일 나선의 핵산 주형-매개된 재조합 및 핵산 단편 단리(Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombinationand Nucleic Acid Fragment Isolation)" (Affholter).
수가지 상이한 일반적 부류의 서열 변형 방법들, 예컨대 변이, 재조합 등을 본 발명에 적용할 수 있고, 예컨대 상기 및 하기 참고문헌들에 설명되어 있다. 이하는 예컨대 특정 재조합 기재의 다양성 유전자 생성 형식을 비롯한, 본 발명의 관련 부문에서 다양성 생성을 위한 상이한 유형의 바람직한 형식들 중 일부를 예시한다.
핵산은 예컨대, 재조합되는 핵산의 DNA 분해효소 소화, 및 그에 이은 핵산의 라이게이션 및/또는 PCR 리어셈블리를 비롯한, 상기 참고문헌들에서 논의된 다양한 기술들 중 임의의 것에 의해 생체외 재조합될 수 있다. 예를 들어, DNA 분자의 무작위 (또는 유사 무작위, 또는 심지어는 비무작위) 단편화 후에, 상이하나 관련된 DNA 서열을 갖는 DNA 분자들 간의 서열 유사성에 기초한 생체외 재조합, 및 그 후 폴리머라제 사슬 반응에서 신장에 의한 교차의 고정화가 이어지는 성 PCR 변이유발이 이용될 수 있다. 이 공정 및 많은 공정 변이체가 상기 참고문헌들 중 수개 문헌, 예컨대 [Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751]에 기재되어 있다.
마찬가지로, 핵산은 예컨대, 재조합이 세포 내 핵산들 중에 일어나도록 함으로써, 재발적으로 생체내 재조합될 수 있다. 그러한 많은 생체내 재조합 형식이 상기 참고문헌들에 설명되어 있다. 그러한 형식은 다른 형식들뿐만 아니라, 임의적으로 관심 핵산들 사이의 직접적 재조합을 제공하거나, 관심 핵산을 포함하는, 벡터, 바이러스, 플라스미드 등 사이의 재조합을 제공한다. 그러한 절차에 관한 상세 내용이 상기 참고문헌들에 나와 있다.
임의적으로 원하는 라이브러리 성분 (예컨대, 본 발명의 경로에 상응하는 유전자)을 갖는 게놈 재조합 혼합물의 소량 첨가를 포함하는 전체 게놈 재조합 방법도 또한 이용될 수 있다. 이 방법은 표적 유전자의 동일성이 알려져 있지 않은 것을 비롯한 수많은 용도들을 가진다. 그러한 방법에 관한 상세 내용이 예컨대, WO98/31837 (del Cardayre 등) "재발성 서열 재조합에 의한 전체 세포 및 유기체의 진화(Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination)" 및 예컨대 PCT/US99/15972 (del Cardayre 등) 발명의 명칭: " 재발성 서열 재조합에 의한 전체 세포 및 유기체의 진화(Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination)"에 나와 있다.
관심 표적에 상응하는 올리고뉴클레오티드가 하나 초과의 모 핵산에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PCR 또는 라이게이션 반응으로 합성 및 재조합되며, 이로써 신규 재조합된 핵산을 생성시키는 합성 재조합 방법도 또한 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 첨가 방법에 의해 제조되거나, 예컨대 트리-뉴클레오티드 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법에 관한 상세 내용이 상기 참고문헌, 예컨대 WO00/42561 (Crameri 등) "올리고뉴클레오티드매개된 핵산 재조합(Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination)"; PCT/USOO/26708 (Welch 등) "합성 셔플링을 위한 코돈-변화 올리고뉴클레오티드 합성의 용도(Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling)"; WO00/42560 (Selifonov 등) "원하는 특성을 갖는 문자열, 폴리뉴클레오티드 & 폴리펩티드의 제조 방법(Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics)"; 및 WO00/42559 (Selifonov 및 Stemmer) "진화 모의에서 사용하기 위한 데이터 구조의 집합 방법(Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations)"에 나와 있다.
동종성 (또는 심지어는 비동종성) 핵산에 상응하는 서열 열을 재조합하기 위해, 유전적 알고리즘이 컴퓨터에 사용되는 컴퓨터를 이용한 재조합 방법이 수행될 수 있다. 수득된 재조합된 서열 열은 예컨대, 올리고뉴클레오티드 합성/유전자 리어셈블리 기술과 함께, 재조합된 서열에 상응하는 핵산의 합성에 의해 핵산으로 임의적으로 전환된다. 이 방법은 무작위, 부분적으로 무작위 또는 설계된 변이체를 생성시킬 수 있다. (예컨대, 교차 부위 선택에 기초하는) 설계된 핵산 및/또는 단백질의 조합, 및 설계된, 유사-무작위 또는 무작위 재조합 방법과 함께, 상응하는 핵산 (및/또는 단백질)의 생성과 조합된 컴퓨터 시스템에서의 유전적 알고리즘, 유전적 작동자 등의 사용을 포함하는 컴퓨터 재조합에 관한 많은 상세 내용이 WO00/42560 (Selifonov 등) "원하는 특성을 갖는 문자열, 폴리뉴클레오티드 & 폴리펩티드의 제조 방법(Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics)" 및 WO00/42559 (Selifonov 및 Stemmer) "진화 모의에서 사용하기 위한 데이터 구조의 집합 방법(Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations)"에 나와 있다. 컴퓨터 이용 재조합 방법에 관한 광범위한 상세 내용이 이 용도들에서 밝혀진다. 이 방법은 일반적으로 상응하는 핵산 또는 단백질의 생성 및/또는 컴퓨터 이용의 분자 재조합을 제공함에 있어 본 발명에 적용가능하다.
예컨대, 다양한 핵산 또는 핵산 단편을 단일 나선 주형에 혼성화한 후, 중합 및/또는 라이게이션으로써 전장 서열을 재생성한 후, 임의적으로 주형을 분해하고, 수득되는 변형 핵산을 회수함에 의한, 자연 다양성에 접근하는 수많은 방법들이 유사하게 이용될 수 있다. 단일 나선 주형을 이용하는 한 방법에서, 게놈 라이브러리(들)로부터 유래된 단편 집단을 반대측 나선에 상응하는 부분적 길이, 또는 종종 대략 전장 길이의 ssDNA 또는 RNA와 결합된다. 이어서, 이 집단으로부터의 착체 키메라 유전자의 어셈블리가 비혼성화 단편 말단의 뉴클레아제-염기 제거, 그러한 단편들 간의 갭을 채우기 위한 중합, 및 후속하는 단일 나선의 라이게이션에 의해 매개된다. 모 폴리뉴클레오티드 나선은 (예컨대, RNA 또는 우라실-함유의) 소화, (그러한 분리에 대해 유도적인 방식으로 표지된 경우) 변성 조건 하에서의 자기 분리 및 다른 이용가능한 분리/정제 방법에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 모 나선은 키메라 나선과 함께 같이 정제되어, 후속 선별 및 가공 단계 중에 제거된다. 이 방법에 관한 부가적인 상세 내용이, 예컨대["단일 나선의 핵산 주형-매개된 재조합 및 핵산 단편 단리(Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation)" (Affholter) PCT/USO1/06775]에 나와 있다.
또 다른 방법으로, 단일 나선 분자가 이중 나선 DNA (dsDNA)으로 전환되고, dsDNA 분자는 리간드-매개 결합에 의해 고체 지지체에 결합된다. 비결합 DNA의 분리 후에, 선택된 DNA 분자가 지지체로부터 방출되어 적당한 숙주 세포에 도입됨으로써, 프로브에 혼성화하는 서열 풍부 라이브러리를 생성한다. 이러한 식으로 생성된 라이브러리는 본원에 기재된 절차들 중 임의의 것을 이용하여 추가적 다양화를 위한 바람직한 기질을 제공한다.
상기 일반적 재조합 형식들 중 임의의 것을 반복 양식 (예컨대, 변이/재조합 또는 다른 다양성 생성 방법의 하나 이상의 주기, 임의적으로 그에 이어 하나 이상의 선택 방법)으로 수행되어, 더욱 다양한 세트의 재조합 핵산들을 생성할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 사슬 종결 방법을 이용하는 변이유발도 또한 제안되었고 (예컨대, U.S. 특허 제5,965,408호 "합성 간섭에 의한 DNA 리어셈블리 방법(Method of DNA reassembly by interrupting synthesis" (Short) 및 상기 참고문헌들을 참고함), 본 발명에 적용될 수 있다. 이 방법으로, 서열 유사성의 하나 이상의 유전자 공유 영역의 이중 나선 DNA가 유전자에 대해 특이적인 프라이머의 존재 또는 부재 하에 조합되어 변성된다. 이어서, 단일 나선의 폴리뉴클레오티드가 폴리머라제 및 사슬 종결 시약 (예컨대, 자외선, 감마선 또는 X-선 조사; 브롬화에티디움 또는 다른 삽입자; DNA 결합 단백질, 예컨대 단일 나선 결합 단백질, 전사 활성화 인자 또는 히스톤; 폴리시클릭 방향족 탄화수소; 삼가 크롬 또는 삼가 크롬염; 또는 급속 열사이클링에 의해 매개되는 중합; 등)의 존재 하에 결합 및 배양되어, 부분적 중복 부위 분자가 생성된다. 예컨대, 부분적으로 신장된 사슬을 포함하는 부분적 중복 부위 분자가 복제 또는 부분적 복제의 후속 회에서 변성 및 재결합되어, 다양한 정도의 서열 유사성을 공유하고, DNA 분자의 개시 집단에 대해 다양화되는 폴리뉴클레오티드가 생성된다. 임의적으로, 생성물, 또는 그 생성물의 부분적 풀이 공정에서의 하나 이상의 단계들에서 증폭될 수 있다. 사슬 종결 방법, 예컨대 상기 기재된 방법에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 임의의 다른 기재된 재조합 형식을 위해 적당한 기질이다.
다양성은 또한 [Ostermeier 등 (1999) "DNA 동종성과 무관한 혼성화 효소에 대한 조합적 방법(A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology)" Nature Biotech 17:1205]에 기재된 "혼성화 효소의 창출을 위한 증진적 절단" ("ITCHY")라고 하는 재조합적 절차를 이용하여 핵산 또는 핵산들의 집단에서 생성될 수 있다. 이 방법은 하나 이상의 생체외 또는 생체내 재조합 방법을 위한 기질로서 임의적으로 작용할 수 있는 변이체의 초기 라이브러리를 생성시키는데 사용될 수 있다. 이에 대해, 또한 [Ostermeier 등 (1999) "증진적 절단에 의한 조합적 단백질 공학처리(Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 3562-67; Ostermeier 등 (1999), "신규 생촉매의 공학처리에 있어 한 전략으로서의 증진적 절단 (Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts)", Biological and Medicinal Chemistry, 7: 2139-44]을 참고한다.
개별적 뉴클레오티드, 또는 인접 또는 비인접 뉴클레오티드들의 군의 변형을 초래할 수 있는 변이적 방법은 뉴클레오티드 다양성을 도입하는데 바람직하게 이용될 수 있다. 많은 변이유발 방법들이 상기 인용된 참고문헌들에 나와 있고; 변이유발 방법에 관한 부가적 상세 내용이 본 발명에 또한 적용될 수 있는 하기 문헌들에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 오류 빈발 PCR을 사용하여, 핵산 변이체를 생성할 수 있다. 이 기술을 이용하여, DNA 폴리머라제의 복사 신뢰도가 낮아, 높은 속도의 점 돌연변이가 전체 길이의 PCR 생성물에 걸쳐 수득되도록 하는 조건 하에서 PCR를 수행한다. 그러한 기술의 예가 상기 참고문헌들, 예컨대 [Leung 등 (1989) Technique 1:11-15 및 Caldwell 등 (1992) PCR Method Applic. 2:28-33]에 나와 있다. 마찬가지로, 작은 DNA 단편의 혼합물로부터의 PCR 생성물의 어셈블리를 포함하는 공정에서, 어셈블리 PCR을 사용할 수 있다. 수많은 상이한 PCR 반응들이 동일한 반응 혼합물에서 병행하여 일어날 수 있고, 이 때 한 반응의 생성물은 또 다른 반응의 생성물을 프라이밍한다.
올리고뉴클레오티드 지정 뮤타진은 지정 대상 핵산 서열에서 부위-특이적 변이를 도입하는데 사용될 수 있다. 그러한 기술의 예가 상기 참고문헌 및, 예컨대 [Reidhaar-Olson 등 (1988) Science, 241: 53-57]에 나와 있다. 마찬가지로, 이중 나선 DNA 분자의 작은 영역을 네이티브 서열과 상이한 합성 올리고뉴클레오티드 카세트로 치환하는 공정에서, 카세트 변이유발을 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 완전히 및/또는 부분적으로 무작위화된 네이티브 서열(들)을 포함할 수 있다.
재발성 앙상블 변이유발은 구성원의 아미노산 서열이 상이한, 표현형으로 관련된 변이체의 다양한 집단들을 생성하는데 단백질 변이유발을 위한 알고리즘을 사용하는 공정이다. 이 방법은 피드백 메커니즘을 사용하여, 연속적 회수의 조합적 카세트 변이유발을 모니터링한다. 이 방법의 예가 [Arkin & Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815]에 나와 있다. 지수 앙상블 변이유발이, 높은 퍼센티지의 독특하고 기능적인 변이체를 갖는 조합적 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 관심 서열 내의 잔기의 작은 기는, 각 변경된 위치에서 기능적 단백질로 이어지는 아미노산을 동정하는데 병행하여 무작위화된다. 그러한 절차의 예는 [Delegrave & Youvan (1993) Biotechnology Research 11: 1548-1552]에 있다.
생체내 변이유발은, 예컨대 DNA 수복 경로들 중 하나 이상에서 변이를 담지하는 E. 콜라이의 균주에서, DNA를 증식함으로써 임의의 클로닝된 관심 DNA에서의 무작위 변이를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 "변이화" 균주는 야생형 모의 무작위 변이 속도보다 높은 무작위 변이 속도를 가진다. 이 균주들 중 하나에서의 DNA의 증식은 궁극적으로 DNA 내에서의 무작위 변이를 생성하게 된다. 그러한 절차는 상기 참고문헌들에 기재되어 있다.
다양성을 게놈, 예컨대 세균류, 진균류, 동물 또는 식물 게놈에 도입하기 위한 다른 절차가, 상기 기술되고/되거나 참고된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법에 부가적으로, 다양한 종으로 형질전환하는데 적당한 핵산 다량체를 생산하는 기술이 제안되었다 (예컨대, Schellenberger U.S. 특허 제5,756,316호 및 상기 참고문헌들을 참고한다). 상호 발산적인 (예컨대, 자연적 다양성으로부터 유도되거나, 부위 지정 변이유발, 오류 빈발 PCR, 변이성 세균 균주에의 통과 등의 적용을 통한) 유전자들로 구성되는 상기 다량체 내에서의 적당한 숙주의 형질전환은, 예컨대 상기 나타낸 바와 같은 생체내 재조합 공정에 의해, DNA 다양화를 위한 핵산 다양성의 소스를 제공한다.
대안적으로, 서열 유사성의 영역을 공유하는 다수의 단량체성 폴리뉴클레오티드가 숙주 종으로 형질전환되어, 숙주 세포에 의해 생체내 재조합될 수 있다. 후속 회의 세포 분할은 구성원이 단일의 동종의 집단 또는 단량체성 폴리뉴클레오티드의 풀을 포함하는 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 단량체성 핵산은 표준 기술, 예컨대 PCR 및/또는 클로닝에 의해 회수되어, 상기 기재된 재발성 재조합 형식들을 포함하는 임의의 재조합 형식에 의해 재조합될 수 있다.
다종 발현 라이브러리의 생성 방법이 기재되었고 (상기 참고문헌들에 부가적으로, 예컨대 [Peterson 등 (1998) U.S. 특허 제5,783,431호 "신규 대사적 경로의 발생 및 선별을 위한 방법(METHODS FOR GENERATING AND SCREENING NOVEL METABOLIC PATHWAYS)" 및 Thompson 등 (1998) U.S. 특허 제5,824,485호 "신규 대사적 경로의 발생 및 선별을 위한 방법(METHODS FOR GENERATING AND SCREENING NOVEL METABOLIC PATHWAYS)"을 참고한다], 그것의, 관심 단백질 활성을 확인하기 위한 용도가 제안되었다 (상기 참고문헌들에 부가적으로, 예컨대 [Short (1999) U.S. 특허 제5,958,672호 "비배양 미생물로부터의 DNA를 갖는 클론의 단백질 활성 선별(PROTEIN ACTIVITY SCREENING OF CLONES HAVING DNA FROM UNCULTIVATED MICROORGANISMS)"]을 참고한다). 다종 발현 라이브러리는 발현 카세트에서 적당한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 복수의 종 또는 균주로부터의 cDNA 또는 게놈 서열을 포함하는 라이브러리를 일반적으로 포함한다. cDNA 및/또는 게놈 서열은 다양성을 더욱 증진시키기 위해, 임의적으로 무작위로 라이게이션된다. 벡터는 하나 초과의 숙주 유기체, 예컨대 세균 종, 진핵생물의 세포에서 형질전환 및 발현을 위해 적당한 셔틀 벡터일 수 있다. 일부의 경우들에서, 라이브러리는 관심 단백질을 코딩하고, 관심 핵산에 혼성화하는 서열을 예비선택함으로써 바이어스된다. 임의의 그러한 라이브러리는 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법을 위한 기질로서 제공될 수 있다.
상기된 절차는 대체로 핵산 및/또는 코딩된 단백질 다양성을 증가시키기 위한 것이었다. 그러나, 많은 경우들에서, 모든 다양성이 유용한 것은 아니며, 예컨대 기능적인 것은 아니며, 극소수의 바람직한 변이체를 동정하기 위해 선별 또는 선택되어야 하는 변이체의 배경을 증가시키는 것에만 기여한다. 일부 용도들에서, 예컨대 재조합-기재의 변이유발 절차에 의해 다양화하기 전에 라이브러리 (예컨대, 증폭된 라이브러리, 게놈 라이브러리, cDNA 라이브러리, 정규화 라이브러리 등) 또는 다른 기질 핵산을 예비 선택 또는 예비 선별하거나, 그와 달리 기능적 생성물을 코딩하는 핵산으로 기질을 바이어스하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체 공학처리의 경우, 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의한 조작 이전에 생체내 재조합 이벤트를 이용함으로써 기능적 항원 결합 부위를 갖는 항체로 다양성 생성 공정을 바이어스하는 것이 가능하다. 예를 들어, B 세포 cDNA 라이브러리로부터 유래된 재조합된 CDR은, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 따라 다양화하기 전에, 증폭되어 기본틀(Framework) 영역으로 어셈블리될 수 있다 (예컨대, Jirholt 등 (1998) "서열 공간의 이용: 마스터 프레임워크로의 생체내 형성된 상보성 결정 영역의 셔플링(Exploiting sequence space: shuffling in vivo formed complementarity determining regions into a master framework)" Gene 215: 471).
라이브러리는 바람직한 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산으로 바이어스될 수 있다. 예를 들어, 특정된 활성을 나타내는 라이브러리로부터 클론을 동정한 후, 클론을 DNA 변경을 도입하기 위한 임의의 공지된 방법을 이용하여 변이유발될 수 있다. 이어서, 변이유발된 동종체를 포함하는 라이브러리를, 초기에 특정된 활성화와 동일 또는 상이할 수 있는 원하는 활성을 위해 선별한다. 그러한 절차의 한 예가 [Short (1999) U.S. 특허 제5,939,250호 "변이유발에 의한 원하는 활성을 갖는 효소의 제조(PRODUCTION OF ENZYMES HAVING DESIRED ACTIVITIES BY MUTAGENESIS)"]에 기재되어 있다. 원하는 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, WO99/10539는 유전자 라이브러리가 대사적으로 풍부한 세포로부터 수득된 성분과 유전자 라이브러리로부터의 추출물을 조합하고, 원하는 활성을 나타내는 조합을 동정함으로써 선별될 수 있음을 제안한다. 라이브러리의 샘플로 생활성 기질을 삽입하고, 형광 분석기, 예컨대 유세포 장치, CCD, 플루오로미터 또는 분광계를 이용하여 본원에 기재된 바와 같은 원하는 활성의 생성물에 상응하는 생활성 형광을 검출함으로써 원하는 활성을 갖는 클론을 동정할 수 있음도 또한 제안되었다 (예컨대, WO98/58085).
라이브러리는 또한 특정된 특성, 예컨대 선택된 핵산 프로브로의 혼성화를 갖는 핵산으로 바이어스될 수 있다. 예를 들어, 출원 WO99/10539는, 원하는 활성 (예컨대, 효소적 활성, 예를 들어: 리파제, 에스테라제, 프로테아제, 글리코시다제, 글리코실 트랜스퍼라제, 포스파타제, 키나제, 옥시게나제, 퍼옥시다제, 히드롤라제, 히드라타제, 니트릴라제, 트랜스아미나제, 아미다제 또는 아실라제)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 하기 방식으로 게놈 DNA 서열로부터 동정될 수 있음을 제안한다. 게놈 DNA의 집단으로부터의 단일 나선의 DNA 분자는 리간드-접합 프로브에 혼성화된다. 게놈 DNA는 증식 또는 비증식 미생물 유기체, 또는 환경적 샘플로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 게놈 DNA는 다세포적 유기체, 또는 그로부터 유래된 조직으로터 유래될 수 있다. 두 번째 나선 합성은, 포획 배지로부터의 사전 방출의 존재 또는 부재 하에, 또는 당업계에 공지된 광범위하게 다양한 다른 전략들에 의해 포획에 사용되는 혼성화 프로브로부터 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 단리된 단일 나선 게놈 DNA 집단은 예컨대, 상기된 바와 같은 단일 나선 주형을 이용하는 재조합-기재의 방법으로, 추가적 클로닝없이 단편화되어 직접적으로 사용될 수 있다.
핵산 및 폴리펩티드를 생성하는 "비추계학적" 방법은 [Short, "유전 백신 및 효소의 비추계학적 생성(Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines and Enzymes)" WO 00/46344]에 언급되어 있다. 제안된 비추계학적 폴리뉴클레오티드 리어셈블리 및 부위-포화 변이유발 방법을 비롯한 상기 방법은 본 발명에도 또한 적용된다. 도핑되거나 퇴화 올리고뉴클레오티드를 이용하는 무작위 또는 반-무작위 변이유발이 또한 예컨대, [Arkin 및 Youvan (1992) "반-무작위 변이유발을 위한 아미노산의 특이적 서브세트를 코딩하기 위한 뉴클레오티드 혼합물의 최적화(Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis)" Biotechnology 10:297-300; Reidhaar-Olson 등 (1991) "올리고뉴클레오티드 카세트를 이용하는 단백질 서열의 무작위 변이 유발(Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes)" Methods Enzymol. 208: 564-86; Lim 및 Sauer (1991) "단백질의 구조 및 안정성을 결정함에 있어 내부 팩킹 상호작용의 역할(The role of internal packing interactions in determining the structure and stability of a protein)" J. Mol. Biol. 219: 359-76; Breyer 및 Sauer (1989) "람다 억제자에 대한 단일클론 항체 51F의 결합의 미세 특이성의 상호 분석(Mutational analysis of the fine specificity of binding of monoclonal antibody 51F to lambda repressor)" J Biol. Chem. 264.13355-60]; 및 "워크-쓰루 변이유발(Walk-Through Mutagenesis)" (Crea, R; US 특허 제5,830,650호 및 제5,798,208호 및 EP 특허 0527809 B1.
다양화 이전의 라이브러리를 풍부화하는데 적당한 상기 기재된 기술들 중 임의의 기술이 또한 다양성 생성 방법에 의해 생성된 생성물, 또는 생성물의 라이브러리를 선별하는데 사용될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
변이유발, 라이브러리 구축 및 기타 다양성 생성 방법을 위한 키트가 또한 시중 입수가능하다. 예를 들어, 키트는 예컨대, 스트라타겐(Stratagene) (예컨대, 퀵체인지(QuickChange)TM 부위-지정 변이유발 키트; 및 차멜레온(Chameleon)TM 이중 나선의 부위 지정 변이유발 키트), 바이오/캔 사이언티픽(Bio/Can Scientific), 바이오-래드(Bio-Rad) (예컨대, 상기 쿤켈(Kunkel) 방법 이용), 베링거 만하임 코포레이션(Boehringer Mannheim Corp.), 클론테크 라보라토리즈(Clonetech Laboratories), DNA 테크노로지즈(DNA Technologies), 에피센터 테크놀로지즈(Epicentre Technologies) (예컨대, 5 프라임 3 프라임 키트); 겐팍 인코포레이티드(Genpak Inc.), 레마르고 인코포레이티드(Lemargo Inc.), 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) (Gibco BRL), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech), 프로메가 코포레이션(Promega Corp.), 퀀텀 바이오테크놀로지즈(Quantum Biotechnologies), 아머샴 인터내셔날사(Amersham International plc) (예컨대, 엑슈타인(Eckstein) 방법 이용) 및 앵글리언 바이오테크놀로지사(Anglian Biotechnology Ltd.) (예컨대, 상기 카터/윈터(Carter/Winter) 방법 이용)로부터 입수가능하다.
상기 참고문헌들은 재조합, 반복 재조합, 반복 변이 및, 다른 형태의 변이유발과의 조합 또는 재조합을 비롯한 많은 변이적 형식, 및 상기 형식의 많은 변형들을 제공한다. 사용되는 다양성 생성 형식과 상관없이, 본 발명의 핵산은 (상호간 또는 관련된 (또는 심지어는 비관련된) 서열과) 재조합되어, 예컨대 동종성 핵산의 다양한 세트 및 상응하는 폴리펩티드를 비롯한, 다양한 세트의 재조합 핵산을 생산할 수 있다.
상기 형식들 중 임의의 형식을 단독 또는 함께 이용하여, 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 하나 이상의 부가적 핵산을 조합함으로써 생성된 재조합 핵산도 또한 본 발명의 일부를 구성한다. 하나 이상의 부가적 핵산은 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 임의적으로는 그와 달리 하나 이상의 부가적 핵산은 예컨대, 천연 발생 인터페론-알파 또는 그것의 하위서열, 또는 (예컨대, GenBank 또는 다른 입수가능한 문헌에 나와 있는 바와 같은) 임의의 동종성 인터페론-알파 또는 그것의 하위서열, 또는 예컨대 임의의 다른 동종성 또는 비동종성 핵산 또는 그것의 단편 (상기 논의된 특정 재조합 형식, 주목하게는 합성적으로 또는 컴퓨터를 이용하여 수행되는 재조합 형식은 재조합을 위한 동종성을 필요로 하지 않음)을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
치료적 용도
각종 인터페론-알파 폴리펩티드 및 인터페론-알파 접합체는 승인되어, 바이러스성 상태, 예컨대 만성 C형 간염 및 만성 B형 간염의 치료를 위한 임상적 개발 중에 있다. 따라서, 본 발명은 상기 상태의 치료를 위한 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 포함하는 조성물 (즉, "본 발명의 조성물")의 용도를 고찰한다.
C형 간염 바이러스
한 측면에서, 본 발명은 환자에게 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 포함하는 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 C형 간염 바이러스 (HCV)에 감염된 환자의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, HCV에 감염된 환자를 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. HCV에 감염된 것으로 진단된 환자는 혈액 중에 HCV RNA를 나타내고/내거나 혈청 중에 항-HCV 항체를 나타내는 환자를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 일반적으로, 임상적으로 승인된 인터페론-알파 폴리펩티드, 예컨대 로페론-A (인터페론 알파-2a, 재조합; 호프만-라 로쉐 인코포레이티드), 인트론 A (인터페론 알파-2b, 재조합; 쉐링 코포레이션) 및 인페그렌 (인터페론 알파콘-1; 인터뮨 인코포레이티드)을 이용하는 HCV 치료법에 이용되는 것과 유사한 투약량 및 빈도수로 투여될 것이다. 만성 HCV의 치료를 위한 로페론 또는 인트론 A의 예시적 권장 투약 스케줄은 예컨대, 24 내지 48주 동안, 피하 주사에 의해 1주일에 3회씩 3백만 IU(대략 15 마이크로그램(mcg)이다. 만성 HCV의 치료를 위한 인페그렌의 예시적 권장 투약 스케줄은 예컨대, 24 내지 48 주 동안, 피하 주사에 의해 1주일에 3회씩 9 mcg이다. (비제한적으로 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및 약동력학적 성질, 및 환자의 크기 및 건강을 포함하는) 수많은 인자들에 따라, 폴리펩티드는 상기 기재된 것보다 낮은 양 (예컨대, 예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 mcg) 및/또는 보다 낮은 빈도로 (예컨대, 1주일에 1회, 또는 1주일에 2회) 투여될 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 접합체를 포함하는 조성물은 일반적으로 임상적으로 승인된 인터페론-알파 접합체, 예컨대 페가시스 (페그인터페론 알파-2a; 호프만-라 로쉐 인코포레이티드) 또는 페그-인트론 (페그인터페론 알파-2b; 쉐링 코포레이션)을 이용하는 HCV 치료법에 이용되는 것과 유사한 투약량 및 빈도수로 투여될 것이다. 만성 HCV의 치료를 위한 페가시스의 예시적 권장 투약 스케줄은 예컨대, 24 내지 48주 동안, 피하 주사에 의해 1주일에 1회씩 180 mcg이다. (비제한적으로 본 발명의 접합체의 분자량, 활성 및 약동력학적 성질, 및 환자의 크기 및 건강을 포함하는) 수많은 인자들에 따라, 접합체는 상기 기재된 것보다 낮은 양 (예컨대, 예를 들어 약 25, 50, 75, 100, 125, 또는 150 mcg) 및/또는 보다 낮은 빈도로 (예컨대, 매 10일마다 1회, 또는 매 2주마다 1회) 투여될 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 하나 이상의 부가적 치료제(들)와 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 항바이러스성 약물, 예컨대 코페구스(COPEGUS) (호프만-라 로쉐 인코포레이티드) 및 레베톨(REBETOL) (쉐링 코포레이션)이라는 상품명으로 시판되는 리바비린과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체의 정확한 투여량 및 투여 빈도수는 수많은 인자들, 예컨대 당업자에게 공지된 다른 인자들 중에서도 폴리펩티드 또는 접합체의 특이적 활성 및 약동력학적 성질, 및 피처리 상태의 성질 (예컨대, 피처리 C형 간염 바이러스의 유전자형)에 의존할 것이다. 정상적으로, 투약량은 처리되는 증세의 중도 또는 전착을 방지 또는 감축시킬 수 있어야 한다. 그러한 투약량은 "유효한" 또는 "치료적으로 유효한" 양으로 표현될 수 있다. 유효량의 본 발명의 폴리펩티드, 접합체 또는 조성물은, 특히 피처리 상태, 투약량, 투여 스케줄, 폴리펩티드 또는 접합체 또는 조성물이 단독으로 혹은 다른 치료제와 함께 투여되는지의 여부, 폴리펩티드, 접합체 또는 조성물의 혈청 반감기 및 다른 약동력학적 성질, 및 환자의 크기, 연령 및 일반적 건강에 의존한다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 투여량 및 투여 빈도는 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 확인가능하다.
바이러스 부하를 측정하여, 예를 들어 당업계에 공지된 방법을 이용하여 혈청 또는 혈장 내의 바이러스의 역가 또는 수준을 결정함으로써, 예컨대 정량적 PCR-기재의 시험, 예컨대 코바스 암플리코르(COBAS AMPLICOR) HCV 테스트, v2.0 또는 코바스 암플리코르 HCV 모니터(COBAS AMPLICOR HCV MONITOR) 테스트, v2.0 (양자 모두 로쉐 다이어그노스틱스(Roche Diagnostics 사 제품임)을 이용하여 바이러스성 RNA 수준을 모니터링함으로써, 치료 효능을 결정할 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 조성물의 유효량은 치료 이전의 바이러스 부하에 비해, 치료 과정에 걸쳐 2 로그 단위 이상, 3 로그 단위 이상, 4 로그 단위 이상, 5 로그 단위 이상, 6 로그 단위 이상, 또는 7 로그 단위 이상 바이러스 부하의 감소를 달성하는데 충분한 양이다 (일반적으로, 만성 HCV 환자의 경우, 105 내지 107 개 HCV RNA 복사체/ml의 범위임). 일부 예에서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 부하를 본질적으로 검출불가능한 수준을, 예컨대 예를 들어, 약 500 복사체/혈청 ml 미만, 또는 약 100 복사체/혈청 ml 미만으로 감소시키는데 충분한 양이다. 본 발명은 또한 HCV에 감염된 환자의 혈청 내의 HCV RNA 수준을 감소시키는 방법으로서, 환자에게 치료 개시 전에 존재하는 HCV RNA 수준에 비해 HCV RNA 수준을 감소시키는데 효과적인 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
치료 효능은 예컨대, 간 손상과 같은 HCV 감염과 연관된 상태를 가리키는 변수를 측정함으로써 , 대안적으로 또는 부가적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 수준은 표준 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 약 50 인터내셔널 단위/ml(IU/ml) 혈청 미만의 ALT 수준은 정상적인 것으로 간주된다. 보다 높은 ALT 수준은 진행중인 간 손상을 가리킬 수 있다. 일부 예에서, 유효량의 본 발명의 조성물은 정상적 ALT 수준보다 높은 환자의 경우, ALT 수준을 약 50 IU/ml 미만의 혈청으로 감소시키는데 효과적인 양이다. 이에 따라, 본 발명은 50 IU/ml 초과의 초기 ALT 수준을 나타내는 HCV에 감염된 환자의 혈청 ALT 수준을 감소시키는 방법으로서, 환자에게 ALT 수준을 약 50 IU/ml 미만으로 감소시키기 위한 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
B형 간염 바이러스
다른 한 측면에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV)에 감염된 환자의 치료 방법으로서, 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 포함하는 유효량의 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물의, HBV에 감염된 환자를 치료하기 위한 용도를 제공한다.
HBV에 감염된 것으로 진단된 환자는 혈청 내 검출가능한 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)을 나타낸다. 만성 HBV 감염은 또한 "증식성(replicative)" 또는 "비증식성"으로 분류된다. 증식성 감염에서, 환자는 주로 높은 바이러스 복제의 조건 하에 합성되는 HBV 프리-코어 유전자의 대안적으로 가공된 단백질인 검출가능한 HbeAg 및 바이러스성 DNA의 비교적 높은 혈청 농도를 가진다. 그러나, 프리-코어 유전자에서의 변이를 갖는 HBV의 희귀 균주에서, 증식성 감염이 검출가능한 혈청 HbeAg의 부재 하에 일어날 수 있다. 만성 B형 간염 및 증식성 감염을 갖는 환자는 일반적으로 더 나쁜 예후를 가지고, HbeAg가 없는 것에 비해 간경변 및/또는 간세포적 암종 발달 가능성이 더 크다. 비증식성 감염에서, 간 내의 바이러스 복제 속도는 낮고, 혈청 HBV DNA 농도는 일반적으로 낮으며, 간염 Be 항원 (HBeAg)은 검출되지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 일반적으로 임상적으로 승인된 인터페론-알파 폴리펩티드, 예를 들어, 예컨대 인트론 A (인터페론 알파-2b, 재조합; 쉐링 코포레이션)을 이용하는 HBV 치료법에서 이용되는 것과 유사한 투약량 및 빈도수로 투여될 것이다. 성인의 경우, 만성 HBV의 치료를 위한 인트론 A의 예시적 권장 투약 스케줄은 16주간 5백만 IU/일 (qd) 또는 1천만 IU/주당 3회로, 피하 또는 근육내 주사에 의해 3천만 내지 3천5백만 IU/주이다. (비제한적으로 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및 약동력학적 성질, 및 환자의 크기 및 건강을 포함하는) 수많은 인자들에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 기재된 것보다 낮은 양 (예컨대, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 또는 2천5백만 IU/주) 및/또는 보다 낮은 빈도로 (예컨대, 1주일에 1회, 또는 1주일에 2회) 투여될 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 접합체를 포함하는 조성물은 일반적으로 현재 수행 중인 임상적 시험에서 인터페론-알파 접합체, 예를 들어 예컨대 페가시스 (페그인터페론 알파-2a; 호프만-라 로쉐 인코포레이티드)를 이용하는 HBV 치료법에 이용되는 것과 유사한 투약량 및 빈도로 투여될 것이다. 만성 HBV의 치료를 위한 페가시스의 예시적 투약 스케줄은 총 24주의, 90 mcg 내지 270 mcg 주사/주이다. (비제한적으로 본 발명의 접합체의 분자량, 활성 및 약동력학적 성질, 및 환자의 크기 및 건강을 포함하는) 수많은 인자들에 따라, 접합체는 상기 기재된 것보다 낮은 양 (예컨대, 예를 들어 약 25, 50, 75, 100, 125, 150 또는 200 mcg) 및/또는 보다 낮은 빈도로 (예컨대, 매 10일마다 1회, 또는 매 2주마다 1회) 투여될 수 있다.
일부 예에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 하나 이상의 부가적 치료제(들)와 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 항바이러스성 약물, 예컨대 상품명 에피비르(Epivir)-HBV (글락소스미쓰클라인(GlaxoSmithKline))으로 시판되는 라미부딘 (3TC로도 알려짐), 또는 상품명 헤프세라(Hepsera) (길리드 사이언시스(Gilead Sciences))로 시판되는 아데포비르 디피복실(adefovir dipivoxil)과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체의 정확한 투여량 및 투여 빈도수는 수많은 인자들, 예컨대 당업자에게 공지된 다른 인자들 중에서도 폴리펩티드 또는 접합체의 특이적 활성 및 약동력학적 성질, 및 피처리 상태의 성질 (예컨대, 만성 HBV 감염의 경우, 감염이 증식성 또는 비증식성인 것인지의 여부)에 의존할 것이다. 정상적으로, 투약량은 처리되는 증세의 중도 또는 전착을 방지 또는 감축시킬 수 있어야 한다. 그러한 투약량은 "유효한" 또는 "치료적으로 유효한" 양으로 표현될 수 있다. 유효량의 본 발명의 폴리펩티드, 접합체 또는 조성물은, 특히 피처리 상태, 투약량, 투여 스케줄, 폴리펩티드 또는 접합체 또는 조성물이 단독으로 혹은 다른 치료제와 함께 투여되는지의 여부, 폴리펩티드, 접합체 또는 조성물의 혈청 반감기 및 다른 약동력학적 성질, 및 환자의 크기, 연령 및 일반적 건강에 의존한다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 투여량 및 투여 빈도는 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 확인가능하다.
당업계에 공지된 방법을 이용하여 바이러스 부하, 예를 들어 혈청 또는 혈장 내의 바이러스의 역가 또는 수준을 결정함으로써, 처리 효능을 결정할 수 있다. HBV DNA 수준의 모니터링 방법은, 정량적 PCR-기재의 시험, 예컨대 코바스 암플리코르 HCV 테스트, v2.0 또는 코바스 암플리코르 HCV 모니터 테스트, v2.0 (양자 모두 로쉐 다이어그노스틱스사 제품임)을 포함한다. 일부 예에서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스성 DNA를, 예컨대 약 500,000개 복사체/혈청 ml 미만 또는 약 100,000개 복사체/혈청 ml 미만 또는 약 10,000개 복사체/혈청 ml 미만, 또는 본질적으로 검출불가능한 수준 (예컨대, 예를 들어, 약 1000개 복사체/혈청 ml 미만, 약 500개 복사체/혈청 ml 미만, 또는 약 200개 복사체/혈청 ml 미만)으로 감소시키기에 충분한 양이다. 본 발명은 또한 HBV에 감염된 환자의 혈청 내의 HBV DNA 수준을 감소시키는 방법으로서, 환자에게 치료 개시 전에 존재하는 HBV DNA 수준에 비해 HBV DNA 수준을 감소시키는데 효과적인 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
치료 효능은 대안적으로 또는 부가적으로 HbeAg와 같은 HBV 복제를 위한 다른 혈청 마커를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 조성물의 유효량은 본질적으로 HbeAg의 수준을 검출불가능한 수준으로 감소시키기에 충분한 양이다. 본 발명은 HBV에 감염된 환자의 혈청 내의 HBeAg 수준을 감소시키는 방법으로서, 환자에게 치료 개시 전에 존재하는 HBeAg 수준에 비해 HBeAg 수준을 감소시키는데 효과적인 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, HBV 감염을 가리키는 또 다른 혈청 마커는 HBsAg이다. 이에 따라, 치료 효능은 대안적으로 또는 부가적으로 혈청 내 HBsAg의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 조성물의 유효량은 본질적으로 HBsAg의 수준을 검출불가능한 수준으로 감소시키기에 충분한 양이다. 본 발명은 HBV에 감염된 환자의 혈청 내의 HBsAg 수준을 감소시키는 방법으로서, 환자에게 치료 개시 전에 존재하는 HBsAg 수준에 비해 HBsAg 수준을 감소시키는데 효과적인 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
치료 효능은 예컨대, 간 손상과 같은 HCV 감염과 연관된 상태를 가리키는 변수를 측정함으로써, 대안적으로 또는 부가적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 수준은 표준 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 약 50 인터내셔널 단위/ml(IU/ml) 혈청 미만의 ALT 수준은 정상적인 것으로 간주된다. 보다 높은 ALT 수준은 진행중인 간 손상을 가리킬 수 있다. 일부 예에서, 유효량의 본 발명의 조성물은 정상적 ALT 수준보다 높은 환자의 경우, ALT 수준을 약 50 IU/ml 미만의 혈청으로 감소시키는데 효과적인 양이다. 이에 따라, 본 발명은 50 IU/ml 초과의 초기 ALT 수준을 나타내는 HCV에 감염된 환자의 혈청 ALT 수준을 감소시키는 방법으로서, 환자에게 ALT 수준을 약 50 IU/ml 미만으로 감소시키기 위한 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
투여 제형물 및 투여 경로
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체의 치료용 제형물은 전형적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물로 투여된다. 그러한 약제학적 조성물은 충분히 저장 안정하고, 인간 또는 동물에 대해 투여하기에 적당한 폴리펩티드 약제를 수득하기 위한 당업계에 지금까지 공지된 방식으로 제조될 수 있다.
약물 형태
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 "그 자체로" 및/또는 그것의 염의 형태로 사용될 수 있다. 적당한 염은 비제한적으로 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘과의 염, 및 예컨대 아연 염을 포함한다. 이 염 또는 착체는 결정성 및/또는 비정형 구조로 존재할 수 있다.
부형제
"약학적으로 허용가능한" 부형제는 이용되는 투약량 및 농도가 투여 대상인 환자에게 임의의 해로운 효과를 유발하지 않는 담체 또는 부형제를 의미한다. 그러한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제는 당업계에 공지되어 있다 ([Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, A.R. Gennaro 편저, Mack Publishing Company (1990); 펩티드 및 단백질의 약제학적 제형물 개발(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins), S. Frokjaer 및 L. Hovgaard, 편저, Taylor & Francis (2000); 및 약제학적 부형제 편람(Handbook of Pharmaceutical excipients), 제3판, A. Kibbe, 편저, Pharmaceutical Press (2000)를 참고한다].
약물들의 혼합
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 리바비린은 IFN-알파와 함께 동시 투여되고, HCV 치료에 있어 효과를 증가시키는 것으로 나타났다. 다양한 작은 분자들은 바이러스성 표적 (바이러스성 프로테아제, 바이러스성 폴리머라제, 바이러스 복제 착체의 어셈블리) 및 숙주 표적 (바이러스성 가공에 필요한 숙주 프로테아제, 바이러스성 표적의 인산화에 필요한 숙주 키나제, 예컨대 NS5A 및 바이러스성 IRES를 효율적으로 이용하는데 필요한 숙주 인자의 억제제)에 대해 개발되어지고 있다. 다른 사이토킨, 예컨대 IL-12, IL-23, IL-27, 또는 IFN-감마가 동시 투여될 수 있다. 이 제제는 동일한 약제학적 조성물의 일부로서 혼입되거나, 동시에 또는 다른 치료 스케줄에 따라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체와 별도로 투여될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 폴리펩티드, 접합체 또는 약제학적 조성물은 다른 치료법에 대한 보조제로서 사용될 수 있다.
환자
본 발명의 목적을 위한 "환자"는 인간 및 다른 포유동물을 모두 포함한다. 이에 따라, 그 방법은 인간 치료 및 수의 용도에 모두 적용가능하다.
조성물의 유형 및 투여 경로
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 다양한 형태들, 예컨대 액체, 겔, 동결건조물 또는 압착 고체로 제형될 수 있다. 바람직한 형태는 치료되는 특별한 상태에 따라 좌우되며, 당업자에게 자명하다.
본 발명의 제형물의 투여는, 비제한적으로, 경구, 피하, 정맥내, 뇌내, 비강내, 경피, 복막내, 근육내, 폐내, 질내, 직장, 안내 투여, 또는 임의의 다른 수용가능한 방식의 투여를 비롯한 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 제형물은 주입에 의해 연속적으로 투여될 수 있으나, 펌프 (예컨대, 피하 삼투 펌프) 또는 이식과 같은 당업계에 공지된 기술을 이용하여, 큰 환약(bolus) 주입도 수용가능하다. 일부 예에서, 제형물은 용액 또는 분무로서 직접적으로 적용될 수 있다.
비경구제
약제학적 조성물의 한 예는 비경구 투여용으로 고안된 용액이다. 많은 경우들에서 약제학적 용액 제형물이 즉시적 용도에 적당한 액체 형태로 제공되나, 그러한 비경구 제형물은 또한 냉동 또는 동결건조된 형태로 제공될 수도 있다. 전자의 경우, 조성물은 사용 전에 해동되어야 한다. 후자 형태는 동결건조된 제제가 일반적으로 그것의 액체 상응물보다 더욱 안전하다는 것이 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 더욱 광범위하게 다양한 저장 조건들 하에서 조성물 내에 포함된 활성 화합물의 안정성을 증진시키기 위해 종종 사용된다. 그러한 동결건조된 제제는 주사용 무군슈 또는 무균 생리염수 용액과 같은 하나 이상의 적당한 약학적으로 허용가능한 희석제를 첨가함으로써 사용 전에 재구성된다.
비경구제는 적당한 경우, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는, 전형적으로 당업계에서 이용되는 안정화제 (이 모두를 "부형제"라고 함), 예를 들어 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비이온성 세제, 항산화제 및/또는 다른 미량 첨가제와 함께, 원하는 순도를 갖는 폴리펩티드를 혼합함으로써, 동결건조된 제형물 또는 수용액으로서 저장하기 위해 제조될 수 있다.
완충제는 pH를 생리학적 조건에 근사하는 범위 내로 유지시키도록 돕는다. 그것은 전형적으로 약 2 mM 내지 약 50 mM의 농도 범위로 존재한다. 본 발명에 사용하기 위해 적당한 완충제는 유기 및 무기산, 및 그것의 염, 예컨대 시트레이트 완충액 (예컨대, 모노나트륨 시트레이트-디나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노나트륨 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충액 (예컨대, 숙신산-모노나트륨 숙시네이트 혼합물, 숙신산-나트륨 히드록시드 혼합물, 숙신산-디나트륨 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충액 (예컨대, 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-나트륨 히드록시드 혼합물, 등), 푸마레이트 완충액 (예컨대, 푸마르산-모노나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디나트륨 푸마레이트 혼합물, 모노나트륨 푸마레이트-디나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 완충액 (예컨대, 글루콘산-나트륨 글루코네이트 혼합물, 글루콘산-나트륨 히드록시드 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충액 (예컨대, 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-나트륨 히드록시드 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충액 (예컨대, 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-나트륨 히드록시드 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충액 (예컨대, 아세트산-나트륨 아세테이트 혼합물, 아세트산-나트륨 히드록시드 혼합물 등)을 포함한다. 부가적으로, 포스페이트 완충액, 히스티딘 완충액 및 트리메틸아민 염, 예컨대 트리스(Tris)가 가능하다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가되며, 전형적으로 약 0.2% 내지 1% (w/v)의 양으로 첨가된다. 본 발명에 사용하기 위한 적당한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 할로겐화벤즈알코늄 (예컨대, 염화벤즈알코늄, 브롬화벤즈알코늄 또는 요오드화벤즈알코늄), 염화헥사메토늄, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다.
등장화제는 액체 조성물의 등장성을 증진시키기 위해 첨가되며, 다가 당 알코올, 바람직하게는 삼가 또는 그 이상의 고가 당 알콜, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 다가 알코올은 다른 성분들의 상대적 양으로 고려하여, 0.1 내지 25 중량%, 전형적으로는 1 내지 5 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
안정화제는 벌크화제 내지, 치료제를 가용화하고, 변성 또는 용기 벽으로의 부착을 방지하는 것을 돕는 첨가제로 작용할 수 있는 광범위한 부류의 부형제를 가리킨다. 전형적인 안정화제는 (상기 열거된) 다가 당 알코올; 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오미틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미요이니시톨, 갈락티톨, 이노시톨과 같은 시클리톨을 비롯한 글리세롤 등; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유의 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 나트륨티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오술페이트; 저분자량 폴리펩티드 (즉 < 10개 잔기); 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 예컨대 자일로스 만노스, 프룩토스 및 글루코스; 이당류, 예컨대 락토스, 말토스 및 수크로스; 삼당류, 예컨대 라피노스 및 다당류, 예컨대 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질의 양을 기준으로 하여, 전형적으로 0.1 내지 10,000 중량부 범위로 존재한다.
비이온성 계면활성제 또는 세제 ("습윤제"로도 알려짐)는, 교반으로 유도된 응집으로부터 치료적 폴리펩티드를 보호할 뿐만 아니라, 치료제를 가용화하는 것을 돕도록 존재하며, 또한 폴리펩티드의 변성을 유발하지 않으면서 제형물이 전단 표면에 노출될 수 있도록 하기 위해 존재할 수 있다. 적당한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 80 등), 폴리엑사머 (184, 188 등), 플루로닉(Pluronic) (E 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (트윈(Tween)-20, 트윈-80 등)을 포함한다.
부가적인 소량 부형제는 벌크화제 또는 충전제 (예컨대, 전분), 킬레이트화제 (예컨대, EDTA), 산화방지제 (예컨대, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 조용매를 포함한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스, 젤라틴 또는 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에서, 또는 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐)에서, 또는 마크로에멀션에서 포획될 수도 있다. 그러한 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 이하 상기와 동일함]에 개시되어 있다.
본 발명의 한 측면에서, 조성물은 액체 조성물, 예컨대 수성 조성물이고, 하기 화학식의 술포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체를 포함한다:
(식 중에서, n은 4, 5 또는 6이고; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 각기 독립적으로, -O- 또는 -O-(C2-C6 알킬)-S03- 기이고, 여기에서 R1, R2 또는 R3 중 하나 이상은 독립적으로 -0-(C2-C6 알킬)-S03- 기이며; S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, 및 S9는 각기 독립적으로, H+을 비롯한 약학적으로 허용가능한 양이온이다).
n = 4일 때, 술포알킬 에테르 시클로덱스트린은 α-술포알킬 에테르 시클로덱스트린으로도 칭해질 수 있음을 주목하도록 한다. 유사하게도, n = 5일 때, 용어 β-술포알킬 에테르 시클로덱스트린이 이용될 수 있고, n = 6일 때, 술포알킬 에테르 시클로덱스트린은 또한 γ-술포알킬 에테르 시클로덱스트린으로도 칭해질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, n은 5 또는 6이다. 한 바람직한 실시양태에서, n = 6이다.
또 다른 실시양태에서, R1, R2 또는 R3은 -OCH2CH2CH2SO3-, -OCH2CH2CH2CH2SO3- 및 -OCH2CH2CH2CH2CH2SO3-으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 가장 바람직하게는, R1, R2 또는 R3은 독립적으로 -OCH2CH2CH2CH2SO3-이다.
또 다른 실시양태에서, S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, 및 S9는 각기 독립적으로, H+, 알칼리 금속 (예컨대, Li+, Na+, K+), 알칼리 토금속 (예컨대, Ca+2, Mg+2), 암모늄 이온 및 아민 양이온, 예컨대 (C1-C6) 알킬아민, 피페리딘, 피라진, (C1-C6) 알칸올아민 및 (C4-C8) 시클로알칸올아민의 양이온으로 구성되는 선택되는 약학적으로 허용가능한 양이온이다. 가장 바람직하게는, S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, 및 S9는 각기 독립적으로 H+, Li+, Na+, K+로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적으로 허용가능한 양이온, 특히 Na+. 이다.
술포알킬 에테르 시클로덱스트린은 1 내지 18개 술포알킬기 (n = 4), 1 내지 21개 술포알킬기 (n = 5) 또는 1 내지 21개 (n = 6)를 함유할 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, n = 5이고, 술포알킬에테르 유도체는 평균 2 내지 20개 술포알킬기 (특히 술포부틸기), 예컨대 3 내지 10개 술포알킬기 (특히 술포부틸기), 더욱 바람직하게는 4 내지 9개 술포알킬기 (특히 술포부틸기), 더욱 더 바람직하게는 5 내지 9개 술포알킬기 (특히 술포부틸기), 예컨대 6 내지 8개 술포알킬기 (특히 술포부틸기), 예컨대 7개 술포알킬기 (특히 술포부틸기)를 포함한다.
일부 예에서, 술포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체는 염, 특히 평균 7개 술포부틸기를 포함하는 β-시클로덱스트린 술포부틸 에테르 (즉, n = 5)의 나트륨 염이다. 이 술포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체는 또한 SBE7-β-CD로도 칭해지며, 캅시졸(Captisol) (사이덱스(Cydex) 미국 캔사스주 오버랜드 파크 소재)로 입수가능하다.
용어 "C1-C6 알킬"은 탄소수 1 내지 6의 분지형 또는 선형은 알킬기를 나타낸다. 전형적인 C1-C6 알킬기는 비제한적으로 메틸 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, iso-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, iso-펜틸, n-헥실 및 iso-헥실을 포함한다.
용어 "C2-C6 알킬"은 탄소수 2 내지 6의 분지형 또는 선형은 알킬기를 나타낸다. 전형적인 C2-C6 알킬기는 비제한적으로 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, iso-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, iso-펜틸, n-헥실 및 iso-헥실을 포함한다.
본원에 개시된 폴리펩티드 및 술포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체를 포함하는 조성물에 관한 추가적 상세 내용은 본원에 참고로 인용되는 [WO03/002152, 특히, 제37-49면의 제목 "술포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체"의 단락]에서 찾아볼 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 비경구 제형물은 무균성이어야 한다. 이는 예를 들어, 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성 제제
서방성 제제의 적당한 예는, 폴리펩티드 또는 접합체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스로서 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 적당한 형태를 갖는 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 프로레아제(ProLease) 테크놀로지 또는 루프론 데폿(Lupron Depot) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성되는 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이하 또는 그 초과의 긴 시간까지 분자 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 시간 동안 방출시킨다. 캡슐화된 폴리펩티드가 오랜 시간 동안 체내 유지될 때, 그것은 37℃에서 수분에 노출되는 결과로서 변성 또는 응집될 수 있고, 그 결과, 생물학적 활성이 소실되고 면역원성이 변화할 수 있다. 관련 메카니즘에 따른 안정화를 위해 합리적 방법이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호변화를 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀질 경우, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 조절, 적당한 첨가제의 이용 및 특이적 중합체 행렬 조성물의 개발에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
경구 투여
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 형태, 예컨대 캡슐, 정제, 현탁액, 에멀션 또는 용액의 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 주어진 양의 활성 성분을 포함하는 투약 단위 형태로 제조된다. 인간 또는 다른 포유동물을 위한 적당한 일일 투약량은 환자의 상태 및 다른 인자들에 따라 광범위하게 다양할 수 있으나, 통상적 방법을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투약 형태는 캡슐, 정제, 좌약, 분말 및 과립을 포함할 수 있다. 그러한 고체 투약 형태에서, 활성 화합물은 하나 이상의 불활성 희석제, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 전분과 혼합될 수 있다. 그러한 투약 형태는 또한 통상적 관행과 같이, 부가적 물질, 예컨대 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제를 포함할 수도 있다. 캡슐, 정제 및 환약의 경우, 투약 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 환약은 부가적으로 장내 코팅으로 제조될 수 있다.
폴리펩티드 또는 접합체는 락토스, 수크로스, 전분 분말, 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 스테아르산, 탈크, 스테아르산마그네슘, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘염, 아카시아, 젤라틴, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 및/또는 폴리비닐 알코올과 같은 보조제와 혼합되고, 통상적 투여를 위해 정제화 또는 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 그것은 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 오일 (예컨대, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 면실 오일 또는 참깨 오일), 트라가칸트 검 및/또는 각종 완충액에 용해될 수 있다. 기타 투여 보조제 및 방식이 약제학적 업계에 공지되어 있다. 담체 또는 희석제는 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스, 또는 당업계에 공지된 다른 물질과 함께 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 무균화와 같은 통상적 약제학적 조작에 적용되고/되거나, 통상적 보조제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 완충액, 충전제 등, 예컨대 본원에서 다른 임의의 곳에 개시된 것과 같은 통상적 보조제들을 포함할 수 있다.
구강 투여를 위한 액체 투약 형태는 물과 같은 당업계에 통상 사용되는 불활성 희석제를 포함하는, 약학적으로 허용가능한 에멀션, 용액, 현탁액, 시럽, 및 엘릭시르를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 또한 습윤제, 감미제, 풍미제 및 향료제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
폐 전달
제트 또는 초음파 분무기와 함께 사용하기에 적당한 제형물은 전형적으로, 예컨대 약 0.01 내지 25 mg의 접합체/용액 mL, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg/mL의 농도로 물에 용해된 폴리펩티드 또는 접합체를 포함할 것이다. 그 제형물은 또한 완충액 및 단순 당 (예컨대, 단백질 안정화 및 삼투압 조절을 위함), 및/또는 농도 0.1 내지 10 mg/ml 범위의 인간 혈청 알부민을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 완충액의 예는 나트륨 아세테이트, 시트레이트 및 글리신이다. 바람직하게, 완충액은 용액의 pH를 3 내지 9의 범위로 조절하기 위해 적당한 조성 및 몰 농도를 가질 것이다. 일반적으로, 1 mM 내지 50 mM의 완충액 몰 농도가 이 목적을 위해 적당하다. 이용될 수 있는 당의 예는, 주로 제형물의 중량을 기준으로 1 내지 10 중량% 범위의 양인 락토스, 말토스, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스 및 자일로스이다.
분무기 제형물은 또한 에어로졸을 형성할 때 용액의 아토마이제이션으로 인한 단백질의 표면 유도 응집을 감소시키거나 방지하기 위한 계면활성제를 포함할 수 있다. 각종 통상적 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르를 이용할 수 있다. 그 양은 제형물의 중량을 기준으로 일반적으로 0.001 내지 4 중량%의 범위일 것이다. 본 발명의 목적을 위해 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다.
본 발명의 액체 입자의 적당한 분산액을 생성하기 위한 특정 제형 및 방법이, 본원에 참고로 인용되는 WO94/20069, US 5,915,378, US 5,960,792, US 5,957,124, US 5,934,272, US 5,915,378, US 5,855,564, US 5,826,570 및 US 5,522,385에 기재되어 있다.
계측 투약량 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 제형물은 일반적으로 미세 분할 분말을 포함할 것이다. 이 분말은 액체 접합 제형물을 동결 건조한 후 분쇄함으로써 제조될 수 있고, 또한 안정화제, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 0.5% (w/w) 초과의 HSA가 첨가된다. 부가적으로, 필요한 경우, 하나 이상의 당 또는 당 알코올이 제제에 첨가될 수 있다. 그 예는 락토스, 말토스, 만니톨, 소르비톨, 소르비토스, 트레할로스, 자일리톨 및 자일로스를 포함한다. 제형물에 첨가되는 양은 존재하는 접합체 약 0.01 내지 200% (w/w), 바람직하게는 대략 1 내지 50%의 범위 내일 수 있다. 이어서, 그러한 제형물은 동결건조되어, 원하는 입자 크기로 분쇄된다.
이어서, 적절하게 크기조정된 입자를 계면활성제를 이용하여 추진제(propellant) 내에 현탁시킨다. 추진제는 이 목적을 위해 이용되는 임의의 통상적 물질, 예컨대 클로로플루오로카르본, 히드로클로로플루오로카르본, 히드로플루오로카르본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 포함하는 탄화수소, 또는 그것의 조합일 수 있다. 적당한 계면활성제는 소르비탄 트리올레에이트 및 대두 레시틴을 포함한다. 올레산이 또한 계면활성제로서 또한 유용할 수 있다. 이어서, 이 혼합물은 전달 장치에 로딩된다. 본 발명에 사용하기에 적당한 시중 입수가능한 계측 투약량 흡입기의 예는 글락소 인코포레이티드(Glaxo Inc.), 리서치 트라이앵글 파크 (미국 노스캐롤라이나주 소재)에 의해 제조된 벤톨린(Ventolin) 계측 투약량 흡입기이다.
분말 흡입기를 위한 제형물은 접합체를 포함하는 미세 분할 분말을 포함하고, 또한 장치로부터 분말의 분산을 용이하게 하는 양, 예컨대 제형물의 중량을 기준으로 예컨대 50 내지 90 중량%의 양의 벌크화제, 예컨대 락토스, 소르비톨, 수크로스 또는 만니톨을 포함할 수 있다. 분말의 입자는 10 마이크로미터 미만, 바람직하게는 0.5 내지 5 마이크로미터, 가장 바람직하게는 1.5 내지 3.5 마이크로미터의 평균 직경을 갖는 약 1 g/cm2 의 밀도를 갖는 입자에 상응하는 폐에서의 공기역학적 성질을 가질 것이다. 본원의 교시 내용에 따라 사용하기에 적당한 분말 흡입기의 예는 피슨스 코포레이션(Fisons Corp.) (미국 마이애미주 베드포드 소재)에 의해 제조된 스핀헤일러(Spinhaler) 분말 흡입기이다.
이 장치를 위한 분말은 US 5,997,848, US 5,993,783, US 5,985,248, US 5,976,574, US 5,922,354, US 5,785,049 및 US 5,654,007에 개시된 방법에 의해 생성 및/또는 전달될 수 있다.
치료적 제품의 폐 전달을 위해 고안된 기계적 장치는 비제한적으로, 분무기, 계측 투약량 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하며, 이 모두는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 수행에 적당한 시중 입수가능한 장치의 구체적 예는 말린크로드트 인코포레이티드(Mallinckrodt, Inc.) (미국 미조리주 세인트루이스 소재)에 의해 제조된 울트라벤트(Ultravent) 분무기; 마퀘스트 메디칼 프로덕츠 (Marquest Medical Products) (미국 콜로라도주 이글우드 소재)에 의해 제조된 아콘(Acorn) II 분무기; 글락소 인코포레이티드 (미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크 소재)에 의해 제조된 벤톨린 계측 투약량 흡입기; 피슨스 코포레이션 (미국 마이애미주 베드포드 소재)에 의해 제조된 스핀헤일러 분말 흡입기; 넥타르 써래퍼틱스 인코포레이티드 (미국 캘리포니아주 산카를로스 소재)의 "스탠딩 클라우드(standing cloud)" 장치; 알케르메스(Alkermes) (미국 마이애미주 캠브리지 소재)에 의해 제조된 AIR 흡입기; 및 아라다임 코포레이션(Aradigm Corporation) (미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)에 의해 제조된 AERx 폐 약물 전달 시스템이다.
키트
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 접합체, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 세포, 방법, 조성물, 및 시스템 및 장치를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 하기 것들 중 하나 이상을 임의적으로 포함한다: (1) 본원에 기재된 바와 같은 장치, 시스템, 시스템 성분, 또는 장치 성분; (2) 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 키트 성분 ; 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드 발현 벡터; 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포; 또는 임의의 그러한 성분들 중 하나 이상을 포함하는 조성물; (3) 치료적 또는 예방적 방법을 비롯한 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 지시사항, (2)에 나와 있는 임의의 성분 또는 임의의 그러한 성분들의 임의의 조성물을 이용하기 위한 지시사항; 및/또는 본원에 기재된 임의의 장치, 시스템 또는 성분을 조작하기 위한 지시사항; (4) 상기 하나 이상의 그러한 성분 또는 조성물을 보유하기 위한 용기; 및 (5) 포장 재료.
다른 한 측면에서, 본 발명은 여기에 기재된 임의의 방법 또는 검정의 수행하고/하거나 여기에 기재된 임의의 검정 또는 방법을 수행하기 위한 임의의 장치, 성분, 조성물 또는 키트의 사용을 위한, 상기 및 여기에 기재된 임의의 장치, 성분, 조성물 또는 키트의 용도를 제공한다.
하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위하여 제공된 것이나, 결코 본 발명의 취지 또는 범주를 제한하지 않는 것으로 한다.
물질 및 방법
I. 표면 접근가능한 잔기의 결정
접근가능한 표면적 (ASA)
컴퓨터 프로그램 접근법 (B. Lee 및 F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)) 버전 2 (ⓒ1983, 예일대학)을 이용하여, 구조 내 개별적 원자들의 접근가능 표면적 (ASA)을 산출하였다. 이 방법은 전형적으로 1.4 Å의 프로브-크기를 이용하고, 접근가능한 표면적 (ASA)을 프로브의 중심에 의해 형성된 면적으로 정의한다. 이 계산 이전에, 모든 물 분자들 및 모든 수소 원자들을, 단백질과 직접적으로 관련되지 않은 다른 원자들과 마찬가지로, 등위 세트로부터 제거하여야 한다.
측쇄의 ASA 분율
측쇄 원자의 ASA 분율을, 측쇄 내 원자들의 ASA의 합을 신장된 ALA-x-ALA 트리펩티드에서 그 잔기 유형의 측쇄 원자의 ASA를 나타내는 값으로 나눔으로써 산출한다. 이에 대해, [Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507-530]을 참고한다. 이 예를 위해, CA 원자는 글리신 잔기의 측쇄의 부분으로 간주되나, 나머지 잔기의 측쇄의 부분으로 간주되지 않는다. 하기 값들은 측쇄에 대한 100% ASA 기준으로 하여 사용된다 (표 6):
구조 내 검출되지 않는 잔기들은, 유연성(flexible) 영역 내에 있는 것으로 사료되는 바, 100% 노출을 가지는 것으로 정의된다. NMR 구조의 앙상블을 분석하는 경우, 앙상블의 평균 ASA 값을 사용한다.
3차원 구조가 이용가능하지 않을 경우의 표면 노출된 잔기의 결정:
3차원 구조가 이용가능하지 않거나, 구조가 표면 접근성을 결정하기 위해 충분히 상세화되지 않은 경우 (예컨대, CA 원자들의 위치만을 아는 경우), 하기와 같이 생성된 서열 배열로부터 표면 접근성을 이끌어낼 수 있다:
A: 구조가 알려져 있으나, 표면 접근성을 결정하기 위해 충분히 상세화되지 않은 경우:
저상세 구조가, 몰레큘러 시큘레이션즈 인코포레이티드(Molecular Simulations, Inc.)로부터 입수가능한 모델러(MODELER) 프로그램을 이용하여 서열 부류의 공지된 구조에 대한 구조-기재의 서열 배열에 포함된다.
B: 구조가 알려져 있지 않은 경우"
서열은 "프로파일/구조 배열" 프로그램 클러스탈W(ClustalW)의 옵션 (Thompson 등 (1994) Nucleic Acids Research 22: 4673-4680)을 이용하여 제조될 수 있는, 서열 부류의 공지된 구조의 서열을 포함하는 소정의 서열 배열로 배열된다.
A 또는 B에서 수득된 서열 배열로부터, 공지된 구조를 갖는 다른 서열들 중 하나 이상에 노출된 잔기와 동등한 위치에서 분석되는 서열 내의 잔기는 노출된 것으로 정의된다. 노출도는 다른 서열에서의 동등한 잔기에 대한 최대값이 되도록 취해진다. 분석하는 서열이 삽입부에 있는 경우 (즉, 다른 서열에 동등한 잔기가 없는 경우), 이 잔기는 턴/루프 영역에 위치할 가능성이 가장 크므로, 완전히 노출된 것으로 정의된다. 저상세 구조가 존재하는 경우, 구조 내에 관찰되지 않는 그 잔기는 유연성 영역에 있는 것으로 사료되는 바, 완전히 노출된 것으로 정의된다.
원자들 간의 거리의 결정:
원자들 간의 거리는 분자 그래픽 소프트웨어, 예컨대 인사이트II (InsightII) 98.0 (몰레큘러 시뮬레이션 인코포레이티드)을 이용하여 용이하게 결정된다.
II. 단백질 발현 및 정제
A. 발현 및 CHO 세포로부터의 정제
본 발명의 일부 폴리펩티드는 안정하게 트랜스펙션되고, G418와 함께 선택되어 클론성 세포주를 구축하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생성시켰다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 SR 알파 프로모터 (Takebe, Y. 등 (1988) Mol Cell Biol. 8 (1): 466-72), 및 N-말단 리더 펩티드를 코딩하는 서열 및, 임의적으로는 C-말단 에피토프 택을 갖는 인프레임의 조절 하에 CHO 발현 벡터로 클로닝하였다.
1. IFN-알파 폴리펩티드를 발현하는 안정한 서브클론의 선택:
물질:
배양 배지: G418, FBS 및 페니실린, 스트렙토마이신, 및 [PSG] (기브코(Gibco)/인비트로겐(Invitrogen))을 갖는 DMEM-F12;
l×PBS (기브코/인비트로겐);
트립신/EDTA
항 E-택 항체-HRP 접합체 (아머샴 바이오사이언스(Amersham BioSciences))
ECL + 웨스턴 블로팅 검출 시약 (아머샴 바이오사이언시스)
절차: FBS 및 페니실린이 있는 DMEM/F-12 배지 내에 G418과 함께 선택하여 안정한 트랜스펙션 산물을 생성하였다. 세포를 50 ml의 선택 배지가 있는 T175 플라스크에 나누어 넣고, 37℃ CO2 항온배양기에서 ~24시간 동안 또는 세포가 80% 합류성(confluence)에 도달할 때까지 배양하였다. PBS로 세척한 후, 2.5 ml 트립신/EDTA을 첨가하고, 37℃에서 3 내지 5분간 배양함으로써 세포를 채취하였다. 세포를 수집하고, 벡크만(Beckman) 모델 벤치 탑 원심분리기에서 30분동안 1000g으로 원심분리하여 회수하였다. 세포를 PBS에 1회 세척하고, 1% FBS를 갖는 3 ml PBS에 재현탁시켰다. 세포 밀도를 구하여, PBS/FBS로 1×106 세포/ml로 조정하였다. 각 IFNα 폴리펩티드에 있어, 세포를 다코사이토메이션 모플로(DakoCytomation MoFlo) 분류기에서 200 ml의 선택 배지를 포함하는 2 내지 5개의 96웰 플레이트로 분류하였다. 플레이트를 10 내지 14일 동안 37℃ 항온배양기에서 배양하여, 분류된 세포가 성장하도록 하였다. 첫번째로 도트 블로트 분석에 의해, 그에 이어서 항-E 태그 항체-HRP 접합체를 이용하는 웨스턴 블로트 분석 및 화학발광 검출에 의해 확인되는 높은 수준의 발현을 위해, 각 IFNα 폴리펩티드에 대해 2개의 서브클론을 선택하였다.
2. 단백질 발현:
물질:
DMEM-F12 배지 (기브코/인비트로겐)
울트라 CHO 배지 (바이오위트테이커(BioWhittaker))
CHO III A 배지 (기브코/인비트로겐)
엑스-사이트(Ex-Cyte) 성장 증진 배지 보충물 (세롤로지칼즈 프로테인즈(Serologicals Proteins))
ITSA (유착성 배양을 위한 인슐린, 프랜스페린, 셀레늄 보충물; 기브코/인비트로겐)
페니실린/스트렙토마이신 (P/S)
FBS, PBS, 트립신
절차:
1일째: 하나의 T-175 플라스크로부터 세포를 10% FBS 및 I×P/S를 갖는 300 ml DMEM-F12 중 하나의 롤러 병(roller bottle)에 옮겨, 37℃ CO2 항온배양기에서 성장시켰다.
3일째: 배지를 300 ml의 새 DMEM-F12-FBS-P/S로 변경시켰다.
5일째: 배지를 1/1000 엑스-사이트 및 P/S를 갖는 300 ml의 울트라 CHO로 변경시켰다.
7일째: 배지를 300 ml CHO III A + P/S 생산 배지로 치환하였다.
상등액을 8, 9 및 10일째에 채취하였다. 상등액을 벡크만 코울터 알레그라(Beckman Coulter Allegra) 6R 벤치 탑 원심분리기에서 20분 동안 2000 g으로 원심분리하여, 0.2μ PES 병 탑 무균 필터를 이용하여 여과시키고, 정제를 위해 4℃에서 저장하였다.
3. 단백질 정제:
본 발명의 일부 폴리펩티드를 C-말단에서 13 아미노산 E-택 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현시켰다. 그러한 폴리펩티드를 하기와 같이, E-택 친화성 칼럼을 이용하여 정제하였다.
물질: 재조합 파지 항체 시스템 정제 모듈 (아머샴 바이오사이언시스, 카달로그 No. 17-1362-01). 정제 키트는 16 mm 직경×25 mm 높이 (5 ml 층 체적) 항 E-택 칼럼 및 관련 완충액을 포함한다.
절차: 롤러 병에서 CHO-HK1 세포로부터 수집된 상등액을 20분 동안 2800x g에서 원심분리하면서, 0.2μ PES 병 탑 필터 모듈을 이용하여 여과하여, 명확하게 하였다. 상등액을 150 cm/h (5 ml/min)로 RPAS 결합 완충액 중에 평형화된 E-택 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 5 CV (칼럼 체적)의 결합 완충액으로 세척하고, 단백질을 RPAS 용리 완충액으로써 75 m/h (2.5 l/min)으로 용출시켰다. 용출 분액을 0.05 체적의 1 M 트리스-Cl pH 8.0로 중화시키고, PBS로 투석하였으며, 0.1-1.5 mg/ml로 농축하여, -80℃에서 분취액으로 냉동된 상태로 저장하였다. 검정용 샘플을 0.5% BSA를 갖는 PBS 중에 50 μg/ml으로 제형하였다. 샘플을 통상적으로 SDS-PAGE에 분석한 후, 인비트로겐사로부터 수득한 물질, 시약 및 프로토콜을 이용하여 쿠마지 염색으로 분석하였다. 단백질 농도를 IFN-α 표준을 이용하는 BCA 검정에 의해 통상적으로 결정하였고, 그 농도는 아미노산 분석에 의해 확인하였다.
B. 발현 및, E. 콜라이로부터의 정제
본 발명의 일부 폴리펩티드를 함체(inclusion body)로서 E. 콜라이에서 생산하여, 이를 하기와 같이 정제 및 리폴딩하였다.
1. E. 콜라이 발현 구축
폴리펩티드 B9x14 (서열번호 3)를 코딩하는 핵산 서열 (서열번호 18)을, 뉴클레오티드 위치 34-39에서의 희귀 Arg-Arg 코돈 쌍 AGGAGG, 및 뉴클레오티드 위치 64-69에서의 AGGAGA를 각기 E. 콜라이에서 바람직한 Arg-Arg 코돈 쌍 CGTCGC으로 치환함으로써, E. 콜라이 내의 향상된 발현을 위해 변형시켰다. Met 코돈 (ATG)을 또한 코딩 서열의 5' 말단에 첨가하였다. 변형된 서열을 카나마이신 선택 마커를 갖는 T7 프로모터의 조절 하에, pET-42 벡터 (노바겐(Novagen))에 넣었다.
2. 단백질 발현
인터페론 코딩 서열을 포함하는 벡터를 표준 방법을 이용하여, BL21 (DE3) E. 콜라이 균주로 형질전환하였고, 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 아가 플레이트 상에 플레이팅하였으며, 37℃에서 배양하였다. 18 내지 24 시간 후에, 세 개의 분리된 콜로니를 취하여, 50 μg/ml 카나마이신을 갖는 5 ml의 2x YT를 포함하는 관에 옮겨, 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 하룻밤동안의 배양을 이용하여, 50 μg/ml 카나마이신을 갖는 1OO ml의 2x YT를 포함하는 2 세트의 플라스크들에 접종하였다. 37℃에서의 배양물의 성장을 OD600에서 모니터링하였다. 배양물을 37℃에서 3시간동안 1 mM IPTG로 0.5 내지 0.8의 OD600에서 유도하였다. IPTG 유도된 배양물을 SDS 샘플 완충액에서 펠렛화 세포를 용해시킴(lysing)으로써, SDS-PAGE에 의해 발현에 대해 분석하였다.
3. 함체의 단리 및 리폴딩
해동된 세포를, 세포 습윤 중량 g당 10 ml PBS로 PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 균질기에 3회 통과시키면서, 10,000 psi로 APV 1000 호모지나이저에서 용해시켰다. 용해물을 30분동안 8000 g로 원심분리하여, 함체(IB)를 펠렛화하였다. IB를 1% 트리톤(Triton)X-100을 갖는 PBS 중에 재현탁시킴으로써 2회 세척하였다. IB를 8 M 우레아, 50 mM 트리스-Cl, 200 m NaCl, 1 mM EDTA, 1% 트리톤X-100, pH 8.0에 1회 추가 세척한 후, 트리톤X-100이 없는 동일한 완충액에서 세척하고, 마지막으로 물에서 세척하였다. 세척된 IB를 8 M 구아니딘 히드로클로라이드, 50 mM 트리스-Cl, pH 8.0, 200 mM NaCl, l mM EDTA 중에 재현탁시켰다.
8M 구아니딘 가용화 IB를 100 μg/ml 단백질 농도로, 냉각된 (4℃) 리폴딩 완충액 (50 mM 트리스-Cl, 0.8 M 아르기닌, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM 글루타티온 및 1 mM 산화 글루타티온, pH 8.0) 중에 희석함으로써 리폴딩하였다. 48시간 동안 4℃에서 리폴딩을 수행하였다. 리폴딩된 인터페론 샘플을 40× 체적의 50 mM 트리스-Cl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA에 대해 투석하고, Q-세파로스(Sepharose) HP 칼럼 (아머샴 바이오사이언시스) 상에 로딩하였으며, 50 내지 600 mM NaCl 구배로 용출하였다. 피크 분획을 풀링하고, 50 mM 트리스-Cl, 150 mM NaCl에 대해 투석하였다. 검정용 샘플을 5 μg/ml 및 20 μg/ml의 PBS + 0.5% BSA 중에 제형화하여, -80℃에서 냉동 저장하였다. 단백질 농도를 IFN-α 표준을 이용하는 BCA 검정에 의해 통상적으로 결정하였고, 그 농도는 아미노산 분석에 의해 확인하였다.
III. 활성 검정
A. EMCV-HuH7 항바이러스 검정
이하, 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체의 항바이러스 활성에 대한 예시적 검정이 제공된다. 그 검정은 약물의 항-바이러스성 효능을 조사하기 위해 사용되는 세포-기재의 투약량-반응 검정이고, 경우에 따라 "세포변성 효과로부터의 보호"(즉, PCPE) 검정이라고도 칭해진다. 간략히 말해, 세포를 약물과 함께 배양하여, 바이러스에 노출한다. 약물이 부재하는 경우, 바이러스에 노출된 세포는 사멸한다. 약물의 농도를 증가시키면, 세포 생존율도 증가한다. 생존 세포의 수는 (예컨대, 시각적 계수에 의해) 직접적으로, 또는 대사율을 평가함으로써 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, MTT 또는 WST-1과 같은 대사 염료를 세포 생존율의 간접적 측정법으로 사용할 수 있다. 생 세포는 그러한 염료에 대사작용하여, 분광법(광학 밀도)으로 정량화될 수 있는 대사 산물을 형성한다.
물질:
세포:
HuH7 세포: 인간 간종양 세포주 (마이클 라이 박사(Dr. Michael Lai), USC-수술부(USC Surgery Department) (미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)로부터 입수). HuH7 세포주를, 잘 분화된 간세포적 암종을 갖는 57연령 일본인 남성으로부터 J. 사토 박사(Dr. J. Sato) (오카야마 약대(Okayama University School of Medicine))의 실험실에서 이미 구축하였다. 세포주는 B형 간염 표면 항원에 대해 네가티브이다.
VERO 세포: 아프리칸 푸른 원숭이 신장 세포주(ATCC # CCL-81)
L-929 세포: 쥐과 섬유아세포 세포주(ATCC # CCL-1)
바이러스:
뇌심근염 바이러스(EMCV): 조직 배양 적응된 균주(ATCC # VR-129B). 고 역가 바이러스성 스톡을, VERO 세포 중에 통과시킴으로써 실내 생산하였다.
완전 배지:
둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 기브코 카달로그 No. 11965-092)
10% 태아 소 혈청(FBS, 하이클론(Hyclone) 카달로그 No. SH30071.03)
1×페니실린-스트렙토마이신(PS, 기브코 카달로그 No. 15140-122)
혈청 감소 배지:
둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 기브코 카달로그 No. 11965-092)
2% 태아 소 혈청(FBS, 하이클론 카달로그 No. SH30071.03)
1×페니실린-스트렙토마이신(PS, 기브코 카달로그 No. 15140-122)
트립신/EDTA(기브코 카달로그 No. 25300-054)
WST-1(로쉐; 카달로그 No. 1 644 807)
HuH7 세포를 가습화 5% C02 항온기 중에 37℃에서 완전 배지에서 유지시켰다. 세포를 트립신과 함께 채취하였고, T175 플라스크에서 1-2×106 세포/25 ml의 최종 밀도로 합류성일 때 주당 2회 분할하였다. 검정 하루 전에, 세포를 트립신화하여, 4.5×106 세포/25 ml의 밀도로 새 T175 플라스크에 파종하여, 세포가 검정 전에 로그 상태에 있도록 확실히 하였다.
절차:
고 역가 EMCV 바이러스 스톡을 VERO 세포에서 증폭시켰다. 세포의 95%가 사멸하는 치사 농도 (LC95)를 HuH7 세포 단층에 대한 EMCV 바이러스 사멸 곡선에 의해 결정하였다. 간략히 말해, HuH7 세포를 6×104 세포/웰로 하루 96-웰 마이크로티터 플레이트에 플레이팅하였다. 바이러스를 10 희석점을 갖는 MEM + 2% FBS 중에 1 : 3으로 일련 희석하여, 2일째 세포에 첨가하였다. 24시간 후-감염에, 세포 생존율을 테트라졸륨 염 대사 검정, WST-1 (로쉐)로 결정하였다. HuH7-EMCV 검정에 대해 결정된 LC95는 0.034의 MOI (PFU/세포)에 상응하였다. 바이러스 스톡의 역가를 L929 세포에 대한 표준 플라크 검정에 의해 결정하였다.
검정 첫 째날, 로그 상태의 HuH7 세포를 트립신과 함께 채취하여, 혈청 감소 배지에 재현탁시켰으며, 원심분리로 농축시켰다. 세포의 5 T175 플라스크에 상응하는 세포 펠렛을 10 ml의 혈청 감소 배지에 재현탁시키고, 40 마이크론 나일론(Nylon) 세포 스트레이너를 통해 여과시켰으며, 혈구계산기로 계수하였다. 세포 생존율을 트립판 블로 제외법에 의해 결정하였다. 세포를 최종 농도 6×105 세포/ml로 혈청 감소 배지에 재현탁시켰다. 100 마이크로리터의 희석된 세포를 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가하였고 (6×104 세포/웰), 플레이트를 4시간 동안 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서 배양하였다.
"표준" 인터페론 알파 및 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 ("시험 샘플"이라고도 함)의 강도를 투약량-반응 분석에 의해 결정하였다. 플레이트당, 일반적으로 하나의 시험 샐플 및 하나의 표준 IFN-알파가 있었고, 각기 IFN-알파 처리/EMCV 적용된 세포의 3개의 및 단독 IFN-알파 처리의 2개의 복제 곡선을 가진다. 후자를 HuH7 세포에 대한 IFN-알파의 잠재성 증식억제 영향에 대해 조절하기 위해 검정하였다. 표준 IFN-알파에 대한 투약량-반응 곡선은 일반적으로 100 ng/ml 내지 0.05 ng/ml 범위의 8개 3배 희석액으로 구성되었다. IFN-알파 시험 샘플에 있어서, 3배 희석액은 일반적으로 5 ng/ml 내지 0.002 ng/ml 범위를 가졌다. 8개 웰에서, IFN-알파는 가지지 않고 세포만 갖는, 바이러스로 처리된 세포를 대조군으로 이용하였다.
혈청 감소 배지를 이용하여 IFN-알파 희석액을 제조하였다. 100 마이크로리터의 희석된 IFN-알파 제제를 검정 플레이트에 옮겼다. 검정 플레이트를 16시간 동안 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서 배양하였다.
2일째에, 세포를 EMC 바이러스로 처리하였다. 배지를 검정 플레이트의 각 웰로부터 흡기하였다. EMCV 스톡을 DMEM + 2% FBS에서 1 : 5400으로 희석하였다. 세포당 0.034 바이러스성 입자에 상응하는 100 마이크로리터의 희석된 바이러스를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서 배양하였다.
3일째, 각 웰 내에서 생존가능한 세포의 수를 WST-1 검정에 의해 정량화하였다. 배지를 검정 플레이트의 각 웰로부터 흡기하였다. WST-1 시약을 혈청 감소 배지에서 1 : 20으로 희석하였고, 100 μl의 희석된 WST-1 시약을 각 웰에 첨가하였고, 세포를 60분 동안 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서 배양하였다. 웰 내의 생존가능한 세포의 수를 플레이트 리더 상에서 450 nm의 OD를 측정함으로써 정량화하였다.
분석:
IFN-알파 표준 및 시험 샘플의 항바이러스성 효능을 하기 방정식으로 계산하였다:
항바이러스성 효능 = (생존가능한 세포C+I+V - 생존가능한 세포C+V) / (생존가능한 세포C+I - 생존가능한 세포C+V) * 100%
(여기에서, C+V = HuH7 세포+EMCV, C+I = HuH7 세포+IFN-α, 및 C+I+V = HuH7 세포+IFN-α+EMCV
투약량-반응 곡선을 그래프패드 프리즘 4 (그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc.))를 이용하여 비선형 회귀에 의해 분석하였다. 하기 방정식을 근사 곡선에 대해 이용하였다:
Y = 하단값+[(상단값-하단값)/1+10(LogEC50-X)HillSlope
하단값은 하단 평탄역에서의 Y 값이고; 상단값은 상단 평탄역에서의 Y 값이며, LogEC50은 반응이 하단값과 상단값 사이의 중간에 있을 때의 X 값이다. 레벤베르크-마르쿼트(Levenberg-Marquardt) 방법을 최적화 알고리즘으로 이용하였다.
B. TH1 분화 검정
이하 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체의 TH1 분화 활성에 대한 예시적 검정이 제공된다.
검정 절차:
500 ml 혈액으로부터 제조된 백혈구 및 적혈구를 포함하는 인간 백혈구층(buffy coat) (25-30 ml)를 검정 개시일에 스탠포드 혈액 은행(Stanford Blood Bank)으로부터 수집하여, 실온에서 유지시켰다. 각 백혈구층을 T75 플라스크에 조심스럽게 옮기고, 100 ml의 PBS로 희석하였다. 각 백혈구층에 대해, 13 ml의 히스토파크(Histopaque)/피콜(Ficoll) (시그마 H8889)을 4개의 50 ml 원심분리관에 피펫으로 옮기고, 25 ml의 희석된 혈액 샘플을 접면을 파괴하지 않으면서 히스토파크/피콜의 상단에 조심스럽게 놓았다. 이어서, 그 관을 20분 동안 원심분리하였다 (20℃, 2500 rpm). 3 ml의 플라스틱 전달 피펫을 이용하여, 상단 혈장을 단핵 세포층으로 제거한 후, PBMC를 2개의 50 ml 원뿔형 관 (세포를 2개의 히스토파크/피콜/백혈구층 관으로부터 하나의 관으로)에 옮겼다. 이어서, PBMC를 PBS로 50 ml/관으로 희석하였고, 10분간 원심분리하여 (20℃, 1000 rpm), 혈소판을 제거하였다. PBS의 제거 후, PBMC 및 나머지 RBC를 혼합하여, 응집을 방지하였다. 5 ml의 RBC 용해 완충액 (염화암모늄 완충액)을 첨가하여, 세포의 2개 관을 한 관으로 합하였다. 이에 한 공여체로부터의 PBMC 및 RBC의 전체 단리물을 포함하는 각 관을 실온에서 10분 동안 배양하였다. 혈액 세포의 잠재성 응혈을, 세포를 세포 스트레이너 (70 μm, 팔콘(Falcon) 카달로그 No. 2350)로 여과함으로써 제거하였다. PBS를 총 체적 50 ml에 첨가한 후, 10분 동안 원심분리하였다 (20℃, 1000 rpm). 세포 수를 혈구계산기를 이용하여 최종적으로 계수하였다.
그 다음에, 각 PBMC 제제의 분획을 예비염색하고, FACS로 분석하여, 15% 초과의 미분화 THO 세포의 퍼센티지를 갖는 PBMC 제제를 선택하였다. 2 ml의 PBMC를 20 μl FITC-접합 항-인간 CD45RA (파미겐(Pharmigen), 카달로그 No. 555488), 20 μl Cy-크롬(Cy-chrome) 접합 항-인간 CD4 (파미겐, 카달로그 No. 555348), 10 μl PE-접합 항-인간 CD8 (파미겐, 카달로그 No. 555367), 10 μl PE-접합 항-인간 CD14 (파미겐, 카달로그 No. 555398), 및 10 μl PE-접합 항-인간 CD20 (파미겐, 카달로그 No. 555623)으로 염색하여, 얼음 상에서 45분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 1 ml PBS에 재현탁하였으며, 40 μM 세포 스트레이너 (Falcon, 카달로그 No. 2340)로 여과하였다. (CD4 및 CD45RA에 대해 포지티브이고, CD8, CD14, CD20에 대해 네가티브인) 미분화 THO 세포의 퍼센티지를 FACS로 정량화하였고, 15% 초과의 미분화 THO 세포를 갖는 PBMC 제제를 검정을 위해 선택하였다.
선택된 PBMC 제제를 800 μl FITC-접합 항-인간 CD45RA, 800 μl Cy-크롬 접합 항-인간 CD4, 500 μl PE-접합 항-인간 CD8, 200 μl PE-접합 항-인간 CD14, 및 200 μl PE-접합 항-인간 CD20으로 염색하여, 얼음 상에서 60분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, PI를 첨가하였으며, 세포를 20 ml/ml PBS로 희석한 후, 40 μM 세포 스트레이너로 여과하였다. 세포를 FACS 분류하였고, (CD4 및 CD45RA에 대해 포지티브이고, CD8, CD14, CD20에 대해 네가티브인) 1×104 미분화 THO 세포를 모플로(MOFLO)에 의해, 160 μl DMEM + 페니실린-스트렙토마이신 + 2 mM 글루타민 및 10% 태아 소 혈청 (하이클론 카달로그 No. SH30071.03)을 포함하는 96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 옮겼다.
20 μl 다이나비이드(Dynabeads) CD3/CD28 T 세포 익스팬더 (다이날(Dynal), 카달로그 No. 111.32)를 각 웰에 첨가하였다. 다이나비이드의 자극 효과를 실험 전에 교정하여, 로트-투-로트(lot-to-lot) 변화를 피하였다. 그 다음에, 20 μl/웰의 단백질 샘플을 검정 플레이트에 첨가하였다. 일반적으로, (R & D 시스템즈로부터 수득된) IL-4 및 IL-12 표준에 대한 농도 범위는 0.04 pg/ml 내지 10 ng/ml이었고, IFN-알파 시험 샘플 및 IFN-알파 참고 샘플에 대한 농도 범위는 0.76 pg/ml 내지 200 ng/ml이었다.
세포를 7일 동안 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서 배양하였다. 각 웰로부터의 상등액을 채취하여, 표준 ELISA를 이용하여, IFN-γ 함량의 정량화를 통해, TH1 신장도를 결정하였다.
분석:
반응 = IFN-γ 농도 (pg/ml).
근사 곡선을 구하기 위해 하기 방정식을 이용하였다:
Y = 하단값+[(상단값-하단값)/1+10(LogEC50-X)HillSlope
변수 하단값은 하단 평탄역에서의 Y 값이고; 상단값은 상단 평탄역에서의 Y 값이며, LogEC50은 반응이 하단값과 상단값 사이의 중간에 있을 때의 X 값이다. 레벤베르크-마르쿼트 방법을 최적화 알고리즘으로 이용하였다.
C. 다우디(Daudi) 증식억제 검정
이하 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체의 증식억제 활성에 대한 예시적 검정이 제공된다.
세포주 유지:
현탁액 중에 성장한 다우디 버크키트(Daudi Burkitt) 림프종 세포를, 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서, 50 ml 배양 배지 (RPMI+10% 태아 소 혈청 (FBS, 하이클론 카달로그 No. SH30071.03) + 1×페니실린-스트렙토마이신 (PS, 기브코 카달로그 No. 15140-122) + 2 mM 글루타민)을 포함하는 T175 조직 배양 플라스크 내에 유지시켰다. 세포가 합류성일 때, 1 : 10으로 분할하였다.
검정 절차:
다우디 세포를 하향회전시켜, 1×PBS로 세척하였다. 세포 수를 105 세포/ml로 조정하였다. 80 μl 배양 배지를 96 웰 둥근 바닥 검정 플레이트의 각 웰에 첨가한 후, 100 μl 세포를 각 웰에 옮겼다 (104 세포/웰).
200 ng/ml 내지 0.2 pg/ml (4-배 희석액) 범위의, IFN-알파 참고 물질 및 IFN-알파 시험 샘플의 11개 희석액을 배양 배지를 이용하여 희석 플레이트에서 제조하였다. 이어서, 20 μl의 희석된 IFN-알파 제제를 검정 플레이트에 옮겼다.
세포를 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서 배양하였다. 48 시간 후에, 1μCi의 메틸-3H 티미딘 (아머샴 파마시아, 카달로그 No. TRK758)을 각 웰에 첨가한 후, 24시간 동안 가습화 5% C02 배양기 중에 37℃에서 배양하였다. 세포를 그 다음 날에 채취하여, 티미딘의 혼입을 결정하였다.
분석:
IFN-알파 참고 및 샘플의 EC50을 하기 방정식을 이용하여 계산하였다:
Y = 하단값+[(상단값-하단값)/1+10(LogEC50-X)HillSlope
(여기에서, 하단값은 하단 평탄역에서의 Y 값이고; 상단값은 상단 평탄역에서의 Y 값이며, LogEC50은 반응이 하단값과 상단값 사이의 중간에 있을 때의 X 값이다. 레벤베르크-마르쿼트 방법을 최적화 알고리즘으로 이용하였다).
실시예 1: 인터페론-알파의 표면 접근가능한 잔기의 결정
인간 인터페론-α 2a 잔기의 표면 노출
[Klaus 등, J; Mol. Biol., 274: 661-675 (1997)]에 의해 보고된 인간 인터페론-알파 2a의 24 NMR 구조에 기초하여, 측쇄의 ASA 분율을 계산하였다. 이하 사용된 서열 넘버링은 인간 인터페론-알파 2a 단백질의 성숙 서열 (본원에 서열번호 32 + R23K로 나타냄)을 기준으로 한다. 이 구조는 Cys1-Cys98 및 Cys29-Cys138을 각기 포함하는 2개의 디술피드 연결기를 포함함을 주지한다. ASA 및 ASA 분율을 계산하고, 24 구조의 평균을 고려하여 측쇄의 ASA에 초점을 둠으로써, 하기 잔기가 25% 초과의 접근가능 표면적 분율을 가짐이 결정되었다: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, G10, R12, R13, M16, A19, Q20, R22, K23, I24, S25, L26, F27, S28, L30, K31, R33, H34, D35, G37, Q40, E41, E42, G44, N45, Q46, Q48, K49, A50, E51, E58, Q61, Q62, N65, S68, T69, K70, D71, S73, A74, D77, E78, T79, L80, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94, E96, A97, V99, I100, Q101, G102, V103, G104, T106, E107, T108, P109, L110, Mlll, K112, E113, D114, L117, R120, K121, Q124, R125, T127, L128, K131, E132, K133, K134, Y135, S136, P137, C138, A145, M148, R149, S152, L153, N156, Q158, E159, S160, L161, R162, S163, K164 및 E165 (위치는 본원에 서열번호 32+R23K로서 동정된 인터페론-알파 2a 서열을 기준으로 넘버링됨).
하기 잔기들은 측쇄의 평균 50% 초과 ASA 분율을 가지는 것으로 결정되었다: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, R12, R13, M16, A19, S25, F27, S28, K31, R33, H34, D35, G37, E41, G44, N45, Q46, Q48, K49, N65, K70, A74, D77, E78, T79, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94,I100, Q101, G102, G104, T106, E107, T108, P109,L110, E113,D114, L117, R120, K121, Q124, R125, L128, K131, E132, K134, P137, R149, E159, L161, R162, S163, K164 및 E165 (위치는 본원에 서열번호 32+R23K로서 동정된 인터페론-알파 2a 서열을 기준으로 넘버링됨).
서열번호 1에 상응하는 잔기의 표면 노출:
(IFN-알파 2 서브유형과 별도로) 공지된 인간 인터페론 알파 서열 및 본 발명의 폴리펩티드의 모두를 포함하는 많은 인터페론 알파 서열에서, 인간 인터페론-알파 2 서브유형 - 예컨대 예를 들어, 인터페론-알파 2b (서열번호 32) 및 인터페론-알파 2a (서열번호 32+R23K)의 위치 44 후에의 아미노산의 삽입으로 인해, 표면 노출된 잔기의 위치 넘버링은 예를 들어, hIFN 알파 2b로 표시되는 서열 (서열번호 32)의 넘버링을 기준으로 한, 배열 도 2에 나와 있는 서열에서 위치 번호 44에서 하나의 잔기를 지나 이동된다.
상기 분석을 기초로 하여, 하기 위치는 (이 또한, 서열번호 1을 기준으로 하여 넘버링됨) 측쇄의 25% 초과 ASA 분율을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 간주된다: 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 40, 41, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 59, 62, 63, 66, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108,109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 128, 129, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 146, 149, 150, 153, 154, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165; 및 166.
마찬가지로, 하기 위치는 (이 또한, 서열번호 1을 기준으로 하여 넘버링됨) 측쇄의 평균 50% 초과 ASA 분율을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 간주된다: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 25, 27, 28, 31, 33, 34, 35, 37, 41, 44, 46, 47, 49, 50, 66, 71, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 95, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 129, 132, 133, 135, 138, 150, 160, 162, 163, 164, 165, 및 166.
실시예 2: 인터페론-알파 폴리펩티드의 항바이러스 활성
만성 HCV에 감염된 환자는 104-107 HCV RNA 복사체/ml 범위의 초기 바이러스 부하를 가진다. IFN-알파로 처리 시에, 바이러스 부하는 특징적으로 2개의 독특한 메카니즘을 반영하는 2개의 독특한 로그-선형 상태를 나타낸다 (도 1B). 바이러스 부하의 초기 하락은 약 첫 번째 2일이 지나면 일어나고, 이는 IFN-알파 치료 시에 감염된 간 세포에 의한 바이러스 생산율의 감소로 인한 것으로 판단된다.
HCV에서의 주요 기술적 과제는 바이러스가 생체외 성장할 수 없고, 단지 취급용이한 동물 모델에서만 최근 배양되었다는 것이다. 그러나, HCV 바이러스 복제에 유용한 대용으로 간주되는 생체외 증식하는 바이러스가 있다. 생체내 HCV 항바이러스 활성을 예측하는 것으로 판단되는 생체외 대용 검정은, 인간 간-유도 세포주 HuH-7에서 EMC RNA 바이러스 (EMCV)를 이용하여, 바이러스성 감염의 세포변성 효과로부터 보호하는 시험 분자의 능력을 측정하는 상기 기재된 검정을 포함한다.
본 발명의 일부 IFN-알파 폴리펩티드의 항바이러스 활성은 상기 물질 및 방법의 단락에 기재된 EMCV/HuH-7 항바이러스 검정으로 검정하였다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 EC50 (검정에서 최대의 반(half-maximal) 보호 반응을 산출하는 샘플의 농도)이 기준 분자의 EC50과 대략 동등하거나 그 미만임에 의해 입증된 바와 같이, 기준 분자, 예컨대 huIFN-알파 2b (서열번호 32) 또는 huIFN-알파 2a (서열번호 32+R23K)의 항바이러스 활성보다 대략 동등하거나 그 미만인 항바이러스 활성을 나타냈다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 EC50가 기준 분자의 EC50보다 각기 약 0.66×이하, 약 0.5×이하, 약 0.25×이하, 약 0.2×이하, 또는 약 O.1×이하 더 낮음에 의해 입증되는 바와 같이, 기준 분자보다 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상 더 높은 항바이러스 활성을 나타냈다.
표 7는 huIFN-알파 2b에 대한 항바이러스 활성 (EC50 huIFN-알파 2b/EC50 샘플)으로 표현되는, 동일 조건 하에서 검정된 IFN-알파 Conl 및 인간 IFN-알파 2b 대비의, 본 발명의 예시적 IFN-알파 폴리펩티드의 상대적 항바이러스 활성을 나타낸다.
실시예 3: 인터페론-알파 폴리펩티드의 TH1 분화 활성
만성 HCV에 감염된 환자는 104-107 HCV RNA 복사체/ml 범위의 초기 바이러스 부하를 가진다. IFN-알파로 처리 시에, 바이러스 부하는 특징적으로 2개의 독특한 메카니즘을 반영하는 2개의 독특한 로그-선형 상태를 나타낸다 (도 1). 바이러스 부하의 초기 하락은 약 첫 번째 2일이 지나면 일어나고, 이는 IFN-알파 치료에 대한 반응으로 감염된 간 세포에 의한 바이러스 생산율의 감소로 인한 것으로 판단된다. 이는 바이러스 제거율의 두 번째 덜 급속한 로그 선형 상이 관찰되는 약 2일 후에 새로운 정상 상태(steady state)에 도달한다. 이 두 번째 상태는 항원 특이적 T 세포에 의한 감염된 간 세포의 사멸에 기인하는 것으로 판단된다. IFN-알파 치료는 TH1 세포로 분화시키기 위한 항원 특이적 T 세포의 자극을 통한 상기 생물학적 반응에서 핵심적 역할을 하는 것으로 판단된다.
특별한 이론에 제한되지 않도록 하나, THO 세포의 TH1 세포로의 분화를 자극하는 향상된 능력을 갖는 인터페론-알파가 바이러스 제거율의 더욱 강력한 두 번째 상태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 바이러스 제거율에 있어 향상된 효능을 가질 수 있음이 제안된다. 이 작용 가설에 기초하여, 혈액 공여자로부터 단리된 미분화 THO 세포에 대한 인터페론-알파의 TH1 분화 활성을 측정하기 위한 검정을 개발하였다.
본 발명의 일부 IFN-알파 폴리펩티드의 TH1 분화 활성은 상기 물질 및 방법의 단락에 기재된 바와 같이 검정하였다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 EC50 (검정에서 최대의 반(half-maximal) 보호 반응을 산출하는 샘플의 농도)이 기준 분자의 EC50과 대략 동등하거나 그 미만임에 의해 입증된 바와 같이, 기준 분자, 예컨대 huIFN-알파 2b (서열번호 32) 또는 huIFN-알파 2a (서열번호 32+R23K)의 TH1 분화 활성보다 대략 동등하거나 그 미만인 TH1 분화 활성을 나타냈다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 EC50가 기준 분자의 EC50보다 낮음에 의해 입증되는 바와 같이, 기준 분자보다 큰 TH1 분화 활성을 나타냈다.
실시예 4: 인터페론-알파 폴리펩티드의 증식억제 활성
IFN-알파는 많은 세포 유형의 증식을 억제하나, 그 증식억제 효과는 항바이러스성 반응에서 필요한 투약량보다 더 높은 투약량에서 종종 일어난다. 다우디 세포는 IFN-알파 감성의 인간 유래 EVB-형질전환된 B 세포주이다. 이 IFN-알파 반응성 세포주는 본 발명의 IFN-알파 폴리펩티드의 증식억제의 유용한 프로브로서 작용한다. 또한, 고 투약량에서의 거대세포 및 호중구에 대한 IFN-알파의 증식억제 활성은 혈소판감소증 및 호중구감소증에 각기 기여하는 것으로 판단된다. 다우디 증식억제 검정은 이 다른 림프구 세포 유형에 대한 증식억제 효과에 대한 유용한 대용 검정으로서 작용할 수 있다.
본 발명의 일부 IFN-알파 폴리펩티드의 증식억제 활성을 상기 물질 및 방법의 단락에 기재된 바와 같이 검정하였다. 본 발명의 일부 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 EC50 (검정에서 최대의 반(half-maximal) 보호 반응을 산출하는 샘플의 농도)이 기준 분자의 EC50과 대략 동등하거나 그 미만 (예컨대, 약 0.75배, 약 0.5배, 또는 약 0.25배)임에 의해 입증된 바와 같이, 기준 분자, 예컨대 huIFN-알파 2b (서열번호 32) 또는 huIFN-알파 2a (서열번호 32+R23K)의 증식억제 활성보다 대략 동등하거나 그 미만인 증식억제 활성을 나타냈다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 EC50가 기준 분자의 EC50보다 낮음에 의해 입증되는 바와 같이, 기준 분자와 대략 동등하거나 그보다 큰 증식억제 활성을 나타냈다. 본 발명의 일부 그러한 폴리펩티드는, (폴리펩티드의 EC50가 기준 분자의 EC50보다 각기 약 1.3배 이상, 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상 큼에 의해 입증되는 바와 같이), 기준 분자의 증식억제 활성보다 약 0.75배 이하, 약 0.66배 이하, 약 0.5배 이하, 약 0.25배 이하, 약 0.2배 이하, 또는 약 0.1배 이하 낮은 증식억제 활성을 나타내며, 그러한 본 발명의 폴리펩티드는 그럼에도 불구하고 측정가능한 증식억제 활성을 나타낸다.
이하 표 8은 huIFN-알파 2b에 대한 항바이러스 활성 (EC50 huIFN-알파 2b/EC50 샘플)으로 표현되는, 동일 조건 하에서 검정된 IFN-알파 Conl 및 인간 IFN-알파 2b 대비의, 수개의 예시적 본 발명의 폴리펩티드의 상대적 증식억제 활성을 나타낸다.
실시예 5: 인터페론-알파 폴리펩티드의 PEG화
이하는 본 발명의 접합체를 제조하기 위한 일부 예시적 절차를 제공한다.
Cys-PEG화
유리 시스테인을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드 (예컨대, 예를 들어, 위치 164에 시스테인을 포함하는 B9x14CH06 (서열번호 49))는 하기와 같은 시스테인-PEG화일 수 있다. 폴리펩티드를 먼저 50 mM MES, 100 mM NaCl, pH 6.0에서 30분 동안 4℃에서 동몰 농도의 TCEP (트리카르복시에틸포스핀)으로 부분적으로 환원시킨다. 이어서 환원된 폴리펩티드를 동일한 조건 하에서 4℃에서 1시간 동안 (PEG 부분기, 예컨대 20 kDa 또는 30 kDa 선형 mPEG, 또는 40 kDa 분지형 mPEG2을 갖는) 4배 몰과량의 mPEG-MAL 시약과 반응시킨다. PEG화 반응 혼합물을 50 mM MES, pH 6.0, lOO mM NaCl로 평형화한 SP-세파로스 HP 칼럼 상에 로딩한다. 10 CV (칼럼 체적) 세척 단계 후에, 0에서 600 mM로의 NaCl 구배를 적용하여, PEG화 및 비PEG화 분획을 분획화한다. 분획을 수집하여, 분취량을 SDS-PAGE으로 분석한다. 모노PEG화 종을 포함하는 분획을 풀링하고, 상기한 바와 같이, 인터페론-알파 활성에 대해 검정하기 위해 제형화한다.
Lys-PEG화
리신-PEG화를 [Foser 등 (2003) 단백질 발현 & 정제(Protein Expression & Purification) 30: 78-87]에 기재된 바에 기초하는 절차를 이용하여 달성할 수 있다. 간략히 말해, 4℃에서 2시간 동안 50 mM 붕산염 완충액에서, 폴리펩티드를 mPEG-NHS 시약 (예컨대, 20 kDa 또는 30 kDa 선형 mPEG, 또는 40 kDa 분지형 mPEG2)과 폴리펩티드:PEG 몰비 1:3으로 반응시킨다. 접합체를 SP-세파로스 HP를 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리한다. 모노PEG화 종을 포함하는 분획을 풀링하고, 상기한 바와 같이, 인터페론-알파 활성에 대해 검정하기 위해 제형화하며, 아미노산 분석 및/또는 MALDI-TOF 질량분석에 의해 추가 확인될 수 있다.
N-말단 PEG화
mPEG-부티르알데히드 또는 mPEG-NHS (이 둘 중 하나는 PEG 부분기, 예컨대 20 kDa 또는 30 kDa 선형 mPEG, 또는 40 kDa 분지형 mPEG2를 가짐)를 이용한 N-말단 PEG화를 50 mM MES, pH 5.5, 100 mM NaCl 중, 또는 50 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.5, 100 mM NaCl 중에서 4 내지 8 시간 동안, 5배 몰과량의 PEG 시약:폴리펩티드를 이용하여, 4℃에서 수행한다. mPEG-부티르알데히드와의 반응도 또한 20 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드를 포함한다. 접합체를 100에서 600 mM로의 NaCl 구배를 이용하여, 50 mM MES pH 5.5, 100 mM NaCl에서 평형화된 50 mM MES pH 5.5에서, SP-세파로스 HP 칼럼 상의 크로마토그래피로써 단리한다. 모노PEG화 종을 포함하는 분획을 풀링하고, 상기한 바와 같이, 인터페론-알파 활성에 대해 검정하기 위해 제형화한다.
실시예 6: 생체내 검정
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체의 반감기의 측정
생물학적 또는 혈청 반감기의 측정을 문헌에 기재된 수많은 방식들로 수행할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 반감기를 예컨대, 피하 또는 근육내 투여 후, 인터페론-알파의 혈청 수준을 검출하기 위한 ELISA 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 피하 투여된 인터페론-알파의 약물동력학적 성질을 결정하기 위한 ELISA 방법의 이용은 예컨대, [Rostaing 등 (1998), J. Am. Soc. Nephrol. 9 (12): 2344-48]에 기재되어 있다. [Merimsky 등 (1991), Cancer Chemother. Pharmacol. 27(5); 406-8]은 피하 투여된 인터페론-알파의 혈청 수준의 결정을 기재하고 있다.
생체외 면역원성 결정
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체의 감소된 면역원성은 기준 분자 또는 제제, 전형적으로는 공지된 인터페론-알파 단백질에 대한 분자의 면역반응성을 측정하는 ELISA 방법을 이용함으로써 결정될 수 있다. ELISA 방법은 기준 단백질로 처리된 환자로부터의 항체에 기초한다. 면역원성은 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체가, 검정에서의 반응이 기준 분자 또는 제제보다 통계학적으로 유의하게 낮을 때, 감소된 것으로 간주된다.
상기 본 발명은 보다 명료히 하면서 이해시키기 위한 목적 하에 다소 상세하게 기재하였으나, 당업자는 이 개시내용을 숙독함으로써 본 발명의 진정한 범주를 벗어나지 않는 한, 형태 및 상세 내용에 있어 각종 변화를 가할 수 있음이 명백할 것이다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 그것의 당 취지의 각종 변형 또는 변화가 당업자에게 제시되며, 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해한다. 예를 들어, 상기 모든 기술 및 장치는 각종 조합으로 사용될 수 있다. 본원에 인용된 모든 공보들, 특허들, 특허 출원들 및/또는 다른 문헌들은, 각기 개별적 공보, 특허, 특허 출원 및/또는 다른 문헌이 개별적으로 본원에 전체적으로 모든 목적을 위해 참고 인용되는 것으로 나타나있더라도, 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 동일한 정도로 인용된다.
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Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 97 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNalpha B9x25Ep12 <400> 97 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe 35 40 45 Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met 100 105 110 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 98 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNalpha B9x25Ep13 <400> 98 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe 35 40 45 Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met 100 105 110 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 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His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met 100 105 110 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 102 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNalpha B9x25Ep17 <400> 102 Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln 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Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165

Claims (40)

  1. 0 내지 16 아미노산 위치에서, 서열번호 3, 서열번호 12, 서열번호 47, 서열번호 53, 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15로부터 선택된 서열과 상이한 서열을 포함하고, 항바이러스 활성을 나타내는 단리 또는 재조합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 0 내지 16 아미노산 위치에서 서열번호 3과 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 0 내지 8 아미노산 위치에서 서열번호 3과 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 0 내지 16 아미노산 위치에서 서열번호 12와 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 0 내지 8 아미노산 위치에서 서열번호 12와 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 폴리펩티드의 항바이러스 활성이 huIFN-알파 2b 또는 huIFN-알파 2a의 항바이러스 활성과 동등하거나 그보다 큰 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 폴리펩티드의 항바이러스 활성이 huIFN-알파 2b 또는 huIFN-알파 2a의 항바이러스 활성보다 2배 이상 큰 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, huIFN-알파 2b 또는 huIFN-알파 2a에 의해 나타내어지는 항바이러스 활성/증식억제 활성의 비보다 2배 이상 큰 항바이러스 활성/증식억제 활성의 비를 나타내는 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, huIFN-알파 2b 또는 huIFN-알파 2a에 의해 나타내어지는 항바이러스 활성/증식억제 활성의 비보다 4배 이상 큰 항바이러스 활성/증식억제 활성의 비를 나타내는 폴리펩티드.
  10. (a) 제1항의 폴리펩티드; 및
    (b) 그 폴리펩티드의 결합기에 공유 결합된 비폴리펩티드 부분기
    를 포함하는 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 2개 이상의 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체.
  12. 제10항에 있어서, 시스테인 잔기에 공유 결합된 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체.
  13. 제10항에 있어서, 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기에 공유 결합된 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체.
  14. 제10항에 있어서, 리신 잔기에 공유 결합된 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체.
  15. 제10항에 있어서, N-말단 아미노기에 결합된 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체.
  16. 제10항에 있어서, 리신 잔기에 결합된 비폴리펩티드 부분기 및 N-말단 아미노기에 결합된 비폴리펩티드 부분기를 포함하는 접합체.
  17. 제10항에 있어서, 비폴리펩티드 부분기가 중합체인 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 접합체.
  19. 제10항에 있어서, 비폴리펩티드 부분기가 당인 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 당이 N-글리코실화 부위에 결합된 접합체.
  21. 제1항의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  22. 제25항의 접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  23. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 또는 재조합 핵산.
  24. 제23항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  25. 제23항의 핵산을 포함하는 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 또는 바이러스의 단편을 포함하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하는 발현 벡터인 벡터.
  28. 제27항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  29. 제23항의 핵산 및 부형제를 포함하는 조성물.
  30. 제1항의 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    숙주 세포를 포함하는 배양물을 제공하는 단계 [상기 숙주 세포는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함함];
    폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건 하에서 배양물을 배양하는 단계, 및
    폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 숙주 세포가 글리코실화 숙주 세포 또는 세균 숙주 세포인 방법.
  32. (i) 제1항의 폴리펩티드를 제공하는 단계, 및
    (ii) 하나 이상의 비폴리펩티드 부분기를 폴리펩티드의 결합기에 결합시키는 단계
    를 포함하는 접합체의 제조 방법으로서, 생성되는 접합체가 항바이러스 활성을 나타내는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 폴리펩티드를 제공하는 단계가,
    숙주 세포를 포함하는 배양물을 제공하는 것 [상기 숙주 세포는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함함];
    폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건 하에서 배양물을 배양하는 것; 및
    폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 숙주 세포가 글리코실화 숙주 세포 또는 세균 숙주 세포인 방법.
  35. 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제하는 방법으로서, 세포에서 바이러스의 복제를 억제하는 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제10항의 접합체를 세포에 투여함으로써, 상기 세포에서 바이러스의 복제를 억제하는 것을 포함하는 방법.
  36. 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복사체의 수를 감소시키는 방법으로서, 세포에서 바이러스의 복사체의 수를 감소시키는 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제10항의 접합체를 세포에 투여함으로써, 상기 세포에서 바이러스의 복사체의 수를 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  37. 의약으로서 사용하기 위한 제1항의 폴리펩티드 또는 제10항의 접합체.
  38. 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 억제하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항의 폴리펩티드 또는 제10항의 접합체의 용도.
  39. 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스의 복사체의 수를 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항의 폴리펩티드 또는 제10항의 접합체의 용도.
  40. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 HCV 또는 HBV인 용도.
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