CN1997666A

CN1997666A - 聚乙二醇修饰的干扰素组合物及其使用方法

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Publication number: CN1997666A
Application number: CNA2004800087851A
Authority: CN
Inventors: P·范瓦拉西拉; M·J·罗伯特; G·维索; S·A·查尔斯
Original assignee: Intermune Inc
Current assignee: Intermune Inc
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2007-07-11
Also published as: JP2006519235A; EP1597278A4; WO2004076474A3; CA2516552A1; EP1597278A2; WO2004076474A2

Abstract

本发明提供与具有名义分子量约30kD的线形聚乙二醇(PEG)分子相连的干扰素α(IFN－α)和含有相同成分的组合物。本发明进一步提供了用主题PEG修饰的IFN－α治疗病毒感染的方法。

Description

聚乙二醇修饰的干扰素组合物及其使用方法

发明领域

本发明涉及治疗肝炎病毒感染的抗病毒药物领域。

发明背景

C型肝炎病毒(HCV)感染是美国最普遍的慢性血液传播感染。虽然新的感染人数下降了，但慢性感染的负担相当大，疾病控制中心估计在美国有三千九百万(1.8％)感染者。慢性肝病在美国成年人的死亡原因中排名第十，每年导致大约25,000人死亡，或占总死亡人数的约1％。研究表明，40％的慢性肝病与HCV有关，估计每年导致8,000到10,000人死亡。HCV相关的终末期肝病是成年肝移植患者中最频繁的指征。

干扰素-α(IFN-α)治疗是治疗C型肝炎病毒感染的选择之一。然而，约50％的患者未能达到持续的病毒学应答。因为IFN-α的血清半衰期为8到8.5个小时，要维持较高的血清水平就要反复给药IFN-α。例如，可接受的剂量方案是每周给药IFN-α三次(TIW)，持续24-48周。已设想与如此反复给药相关的药物水平的峰和谷会在治疗期间造成干扰素的严重副作用。

在本领域中需要一种具有IFN-α的优异抗病毒活性的药学制剂，它有期望的药代动力学性质，可降低给药方案的频率，在血液中维持足够高的药物浓度而同时可以降低病毒负荷)。

引用的文献

美国专利号，5,252,714；5,382,657；5,539,063；5,559,213；5,672,662；5,747,646；5,766,581；5,792,834；5,795,569；5,798,232；5,824,784；5,834,594；5,849,860；5,928,636；5,951,974；5,595,732；5,981,709；5,985,265；6,005,075；6,180,096；6,250,469；6,277,830。PCT公布号WO 99/37779。Chamov等.(1994)Bioconj.Chem.5：133-140；Harris等.(2001)Clin.Pharmacokinet.40：539-551；Reddy(2000)Ann.Pharmacother.34：915-923；Bailon等.(2001)Bioconj.Chem.12：195-202；Reddy等.(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54：571-586。

发明概述

本发明提供了连接到具有平均分子量约30kD的线形聚乙二醇(PEG)分子的干扰素-α(IFN-α)和含有同样部分的组合物。本发明还提供了用主题PEG-修饰的IFN-α治疗病毒感染的方法。

附图说明

图1描述了共有干扰素IFN-αcon1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2是描述命名为PEG-Alfacon的聚乙二醇化(pegylated)的共有干扰素-α进行体积排阻色谱的色谱图。

图3是描述命名为PEG-Alfacon的PEG化的共有干扰素-α的SDS-PAGE电泳(还原性和非还原性)分析的结果的照片。

图4是描述PEG-Alfacon、CIFN(Infergen)和两个化合物的混合物的反相HPLC色谱的色谱图。

图5是描述用PEG化的干扰素-α类似物(IM-001，IM-003，IM-005和IM-006)，Pegasys和PEG-Intron对大鼠皮下注射给药的血清浓度-时间曲线图。

图6是用PEG-Alfacon(制备号IM-006)对大鼠皮下注射给药的血清浓度-时间曲线的半对数图。

图7是用PEG-Alfacon对猕猴进行皮下(Sub-Q)给药的药代动力学分布的半对数图。

图8是以A549细胞/EMCV测定测量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的对数图，活性以每毫克国际单位的活性表示，使之符合世界卫生组织(WHO)提供的人类白细胞衍生的干扰素-α的参考标准。图8描述了A549细胞所得结果进行的分析。

图9是以HeLa细胞/EMCV测定测量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的对数图，活性以每毫克国际单位的活性表示，使之符合世界卫生组织(WHO)提供的人类白细胞衍生的干扰素-α的参考标准。图9描述了用HeLa细胞所得结果进行的分析。

图10是以ME180细胞/EMCV试验测量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的对数图，活性以每毫克国际单位的活性表示，使之符合世界卫生组织(WHO)提供的人类白细胞衍生的干扰素-α的参考标准。图10描述了用ME180细胞所得结果进行的分析。

图11描述了六个受试者/组的平均PEG-alfacon血清药代动力学分布。

图12A和B描述了以剂量组的剂量校正C_max(pg/ml；图12A)和AUC_0-最终(pg*h/ml；图12B)对体重指数(BMI)值作的图。

图13描述了4-6个受试者的平均药代动力学分布和相应的用1-区室模型得到的配合曲线。

图14A-14G描述了各种剂量方案的模拟血清药代动力学分布。在图14A-14G中的每组使用不同的适合于1-区室模型的数据表。图14A描述了每10天给药60μg的剂量方案的模拟血清药代动力学分布。图14B描述了每10天给药100μg的剂量方案的模拟血清药代动力学分布。图14C描述了每10天给药150μg的剂量方案的模拟血清药代动力学分布。图14D描述了每10天给药200μg的剂量方案的模拟血清药代动力学分布。图14E描述了每7天给药100μg的剂量方案的模拟血清药代动力学分布。图14F描述了每7天给药150μg的剂量方案的模拟血清药代动力学分布。图14G描述了每7天给药200μg的剂量方案的模拟血清药代动力学分布。

图15描述了6个受试者/剂量组的血清2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的平均百分率(％)的变化。每个剂量组接受的皮下PEG-alfacon的剂量图符号中确定。以15μg皮下Infergen^干扰素alfacon-1治疗组在图符号中确定为“对照”。

图16描述了以基线(预处理)值百分率表示，测量和预测的OAS血清值的百分率(％)变化，它来自使用最小应答固定在在0的Emax模型对平均血清分布的药代动力学/药效学(PK-PD)建模。

发明特征

本发明的特征在于单PEG化的共有干扰素(CIFN)分子由单个CIFN多肽和单个聚乙二醇(PEG)部分组成，其中聚乙二醇部分是线形、分子量约30kD并直接或间接地通过一稳定的共价键连接到CIFN多肽中的N-末端残基或CIFN多肽中的赖氨酸残基。

在一些实施方案中，PEG部分既可连接到CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基也可连接到CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基上。在其它实施方案中，连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在另外的实施方案中，连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成，从而在PEG部分和CIFN多肽之间形成水解稳定的连接。

在一些实施方案中，PEG部分连接到CIFN多肽中的N-末端残基。在其它实施方案中，PEG部分连接到CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基。在另外的实施方案中，连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽的N-末端残基的α-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，PEG部分连接到CIFN多肽中的赖氨酸残基上。在其它实施方案中，PEG部分连接到CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基。在另外的实施方案中，连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的赖氨酸基的ε-氨基之间的酰胺键。还有其它一些实施方案中，连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的赖氨酸基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，PEG部分与CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基相连。在其它实施方案中，PEG部分与CIFN多肽增加表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基相连。在另外的实施方案中，连接包括在PEG部分与CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸残基的ε-氨基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在另外的实施方案中，连接包括在PEG部分与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸的ε-氨基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在另外的实施方案中，连接包括在PEG部分与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸的ε-氨基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在另外的实施方案中，连接包括在PEG部分与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在上述的单PEG化的CIFN分子方面，本发明考虑了每个这样的分子的实施方案，其中CIFN多肽是选自干扰素-α-con1，干扰素-α-con2和干扰素-α-con3，CIFN多肽的氨基酸序列披露于美国专利号4,695,623。

本发明的特征也在于含有一群单PEG化的共有干扰素(CIFN)分子的组合物，其中这群分子由一种或多种分子组成，其中每种分子由单个CIFN多肽和单个PEG部分组成，其中PEG部分为线形、分子量约30kD并直接或间接地通过共价键连接到CIFN多肽中的N-末端残基或赖氨酸残基。在其它实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种分子组成，其中每种分子由单个CIFN多肽和单个PEG部分组成，其中PEG部分为线形、分子量约30kD并直接或间接地通过共价键连接到CIFN多肽中的N-末端残基或表面暴露的赖氨酸残基。在其它实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种分子组成，其中每种分子由单个CIFN多肽和单个PEG部分组成，其中PEG部分为线形、分子量约30kD并直接或间接地通过共价键连接到CIFN多肽中的N-末端残基或选自下列的赖氨酸残基：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种分子组成，其中每种分子由单个CIFN多肽和单个PEG部分组成，其中PEG部分为线形、分子量约30kD并直接或间接地通过共价键连接到CIFN多肽中的N-末端残基或选自下列的赖氨酸残基：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种分子组成，其中每种分子由单个CIFN多肽和单个PEG部分组成，其中PEG部分为线形、分子量约30kD并直接或间接地通过共价键连接到CIFN多肽中的N-末端残基或选自下列的赖氨酸残基：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种单PEG化的CIFN组成，其中PEG部分连接到CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基。在其它实施方案中，在该群分子的每一种分子中，PEG部分连接到CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基上。在另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端残基的α-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽的N-末端残基的α-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种单PEG化的CIFN组成，其中PEG部分连接到CIFN多肽中的赖氨酸残基。在其它实施方案中，在该群分子的每一种分子中，PEG部分连接到CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基上。在另外的实施方案中，在该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽的赖氨酸残基的ε-氨基上之间的酰胺键。还有其它一些实施方案中，在该群分子中每一类分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，在该群分子中每一类分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种单PEG化的CIFN组成，其中PEG部分与CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基相连。在其它实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽这中表面暴露的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种单PEG化的CIFN组成，其中PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，在该群分子的每一种分子中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸的ε-氨基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在更另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种单PEG化的CIFN组成，其中PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸残基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，在该群分子的每一种分子中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸残基的ε-氨基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。还有其它一些实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在一些实施方案中，该群分子由一种或多种单PEG化的CIFN组成，其中PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸残基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在其它实施方案中，在该群分子的每一种分子中，PEG部分与CIFN多肽中选自下列的赖氨酸残基的ε-氨基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在另外的实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。还有其它一些实施方案中，该群分子中每一种分子的连接包括在PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。在额外的实施方案中，该群分子中每一种分子的酰胺键是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中选择的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成。

在上述的每一种由包含与CIFN多肽的N-末端残基或赖氨酸残基相连的PEG部分的单聚乙二醇化CIFN分子组成的分子群方面，本发明考虑了以下分子群的实施方案：即该分子群由第一个和第二个单PEG化的CIFN分子组成，其中第一个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第一个CIFN多肽中的N-末端残基相连，而第二个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第二个CIFN多肽中的赖氨酸残基相连，并且其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同。

在上述的每一种由包含与CIFN多肽的N-末端残基或赖氨酸残基相连的PEG部分的单聚乙二醇化CIFN分子组成的分子群方面，本发明考虑了以下分子群的实施方案：即该分子群由第一个、第二个和第三个单PEG化的CIFN分子组成，其中第一个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第一个CIFN多肽中的N-末端残基相连，第二个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第二个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基相连，第三个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第三个CIFN多肽中的第二个赖氨酸残基相连，其中第一个、第二个和第三个CIFN多肽可以相同或不同，而第二个CIFN多肽中连接点的位置与第三个CIFN多肽中连接点的位置不相同。

在上述的每一种由包含与CIFN多肽的N-末端残基或赖氨酸残基相连的PEG部分的单聚乙二醇化CIFN分子组成的分子群方面，本发明考虑了以下分子群的实施方案：即该分子群由第一个、第二个、第三个和第四个单PEG化的CIFN分子组成，其中第一个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第一个CIFN多肽中的N-末端残基相连，第二个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第二个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基相连，第三个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第三个CIFN多肽中的第二个赖氨酸残基相连，第四个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第四个CIFN多肽中的第三个赖氨酸残基相连，其中第一个、第二个、第三个和第四个CIFN多肽可与任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二个、第三个和第四个CIFN多肽中连接点的位置也与任何其它CIFN多肽中的连接点的位置不相同。

在上述的每一种由包含与CIFN多肽的N-末端残基或赖氨酸残基相连的PEG部分的单聚乙二醇化CIFN分子组成的分子群方面，本发明考虑了以下分子群的实施方案：即该分子群由第一个、第二个、第三个、第四个和第五个单PEG化的CIFN分子组成，其中第一个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第一个CIFN多肽中的N-末端残基相连，第二个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第二个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基相连，第三个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第三个CIFN多肽中的第二个赖氨酸残基相连，第四个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第四个CIFN多肽中的第三个赖氨酸残基相连，第五个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第五个CIFN多肽中的第四个赖氨酸残基相连，其中第一个、第二个、第三个、第四个和第五个CIFN多肽可与任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二个、第三个、第四个和第五个CIFN多肽中连接点的位置也与任何其它CIFN多肽的连接点的位置不相同。

在上述的每一种由包含与CIFN多肽的N-末端残基或赖氨酸残基相连的PEG部分的单聚乙二醇化CIFN分子组成的分子群方面，本发明考虑了以下分子群的实施方案：即该分子群由第一个、第二个、第三个、第四个、第五个和第六个单PEG化的CIFN分子组成，其中第一个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第一个CIFN多肽中的N-末端残基相连，第二个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第二个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基相连，第三个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第三个CIFN多肽中的第二个赖氨酸残基相连，第四个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第四个CIFN多肽中的第三个赖氨酸残基相连，第五个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第五个CIFN多肽中的第四个赖氨酸残基相连，第六个单PEG化的CIFN分子所含的PEG部分与第六个CIFN多肽中的第五个赖氨酸残基相连，其中第一个、第二个、第三个、第四个、第五个和第六个CIFN多肽可与任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二个、第三个、第四个、第五个和第六个CIFN多肽中连接点的位置也与任何其它CIFN多肽的连接点的位置不相同。

在上述的每一中包含与CIFN多肽的赖氨酸残基相连的PEG部分的单聚乙二醇化CIFN分子组成的分子群方面，本发明考虑的实施方案的特征在于许多种类的单聚乙二醇化、赖氨酸衍生的CIFN分子，其中每一种的特征在于连接点与其它任何种类的连接点不相同，该方式与上述包括单聚乙二醇化、N-末端衍生的CIFN分子的群体的实施方案类似。尤其是本发明的实施方案的特征在于许多种类的单聚乙二醇化、赖氨酸衍生的CIFN分子可通过修改与上述包括单聚乙二醇化、N-末端衍生的CIFN分子的群体有关的实施方案，去除其中所含的N-末端衍生种类得到。

在上述的每一种单聚乙二醇化CIFN分子群体方面，本发明考虑的实施方案在于每个分子群体中的分子含有选自干扰素α-con1、干扰素α-con2和干扰素α-con3的CIFN多肽。

本发明另外的特征在于用CIFN多肽与线形、分子量约为30kD的α-甲氧基、ω-丙酰基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯(mPEGspa)反应的方法产生的产物，其中反应物最初以CIFN∶mPEGspa的摩尔比为约1∶1到1∶5存在，反应在pH约7到9进行，然后回收反应的单PEG化的CIFN产物。在一实施方案中，反应物最初以CIFN∶mPEGspa的摩尔比为约1∶3存在，反应在pH约8进行。在另一实施方案中，本发明产品由需要毒理学和临床研究的、放大的方法生产，反应物最初以CIFN∶mPEGspa的摩尔比为约1∶2存在，反应在pH约8.0进行。

在上述的产物生产方法方面，本发明考虑的实施例在于CIFN反应物是选自：干扰素α-con1、干扰素α-con2和干扰素α-con3。

在一些方面，本发明的单PEG化的CIFN分子或群体表现出比批准的治疗慢性丙型肝炎的市场产品PEGASAYS^PEG-干扰素-α2a至少大10倍的抗病毒活性。在其它方面，本发明的单PEG化的CIFN分子或群体表现出与INFERGEN^的Alfacon-1大致相同的抗病毒活性。

本发明额外的特征在于含有上述的这种分子的任何单PEG化的CIFN分子或分子群体的药学组合物和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，该药学组合物包含本发明单PEG化的CIFN分子或群体的量可在患者中有效地治疗病毒疾病。在其它实施方案中，该药学组合物包含本发明单PEG化的CIFN分子或群体的量可在患者中有效地治疗肝炎病毒疾病。在其它实施方案中，该药学组合物包含的本发明单PEG化的CIFN分子或群体的量可在患者中有效地治疗丙型肝炎病毒(HCV)疾病。

定义

用于文中的术语“治疗”“治疗的”等指获得所需要的药理或生理学效果。按照完全或部分阻止疾病或症状，该效果是预防性的和/或按照部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的负作用，该效果是治疗性的。用在文中的“治疗”包含在哺乳动物，特别是在人中治疗疾病，并且包括：(a)阻止疾病或在易患疾病但尚未诊断出现的疾病症状(例如包括与原发性疾病相关或由其导致的疾病(如可导致慢性HCV感染的肝纤维变性))；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即导致疾病消退。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可在文中互换使用，并指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(包括猿和人)。

用在文中的术语“药代动力学分布”指在向受试者给予IFN-α后，将IFN-α的血清浓度对时间作图得到的曲线分布。“曲线下的面积”或“AUC”指在向受试者给予IFN-α后，将IFN-α的血清浓度对时间作图产生的曲线下的积分面积。

术语“肝炎病毒感染”指甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒中一种或多种的感染，血液传播的肝炎病毒感染是尤其令人感兴趣的，特别是丙型肝炎病毒感染。

在进一步描述本发明之前，要了解的是本发明并不限于所描述的特定的实施方案，这种实施方案当然是可以变化的。还需要了解的是既然本发明的范围仅受附加的权利要求限制，用在文中的术语仅是为了描述特定的实施方案而非限制性的。

在提供值的范围的地方，应了解在该范围上下限之间的每个插入值(除非文中另有明确规定，该插入值到下限单位的十分之一)和在所述范围中任何其它规定的值或插入值均包括在本发明内。以在规定的范围内任何具体的排它性限制为条件，这些小范围的上下限可以独立地包括在该小范围内并包括于本发明。在规定的范围包括限制的一个或两个时，排除包括限制的一个或两个的范围也包括在本发明内。

除非另有定义，所有文中所用的技术和科学术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的意思相同。虽然任何类似或等同于于文中所描述的方法和材料均可用于实践和测试本发明，优选的方法和材料是现在描述的。文中提及的所有出版物均纳入本文作为参考来披露和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。

必须注意的是，除非文中另有明确规定，用在文中和附加的权利要求中的单数形式“一个”、“和”与“该”均包括复数对象。因此，例如“一修饰的IFN-α多肽”包括许多这种多肽，“一PEG分子”包括参考一个或多个PEG分子和本领域技术人员所知道的其等效物等等。

文中提供讨论的出版物仅是因为其公开早于本申请的提交日。不应认为由于在先发明而使本发明不具资格先于这种出版物。此外，所提供的出版物日期可能与实际发表日期不符，这需要独立地证实。

发明详述

本发明提供线形聚乙二醇(PEG)修饰的IFN-α。特别是本发明提供与单个PEG分子相连的IFN-α多肽(即，IFN-α多肽是“单PEG化的”)。本发明的PEG修饰的IFN-α的药代动力学分布是其有效地治疗病毒感染，特别是肝炎病毒感染。因此，本发明进一步提供了治疗肝炎病毒感染的方法。这些方法一般包括向感染或易于感染肝炎病毒的个人施用加有效量的PEG-修饰的IFN-α。

PEG-修饰的IFN-α

本发明提供用平均分子量小于约40kD的聚乙二醇(PEG)分子修饰的IFN-α。本发明特别提供与小于约40kD的PEG单分子相连的IFN-α多肽，与约30kD的PEG分子相连是尤其有兴趣的，更特别是线形30kD的PEG分子与IFN-α相连，与CIFN相连也是特别令人感兴趣的。

IFN-α

用在文中的术语“干扰素-α”指抑制病毒复制、细胞增殖和调节免疫应答的相关多肽的一族。术语“IFN-α”包括天然产生、非天然产生IFN-α多肽和保留亲本天然产生或非天然产生IFN-α的抗病毒活性的天然产生、非天然产生IFN-α类似物。

合适的α干扰素包括，但不限于天然产生的IFN-α(包括，但不限于自然存在的IFN-α2a、IFN-α2b)；重组干扰素-α2b，例如获得自Schering公司(Kenilworth，N.J.)的Intron^A干扰素；重组干扰素-α2a，例如获得自Hoffmann-La Roche(Nutley，N.J.)的Roferon^干扰素；重组干扰素-α2c，例如获得自Boehringer IngelheimPharmaceutical，Inc.(Ridgefield，Coma.)的Berofor^α2干扰素；干扰素-αn1，即天然α干扰素的纯化混合物，例如获得自Sumitomo(Japan)的Sumiferon或Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain的WellferonS^干扰素α-n1(INS)；和由Interferon Sciences生产获得自Purdue Frederick Co.，Norwalk，Conn.商品名为Alferon^的天然α干扰素的干扰素α-n3混合物。

用在文中的术语“IFN-α”也包括共有IFN-α。用在文中的术语“共有IFN-α”指非天然产生的多肽，包括对所有天然产生的人白细胞IFN-α亚型序列而言常见的那些氨基酸残基和包括主要出现在一个或多个不存在对于所有亚型常见的氨基酸的位置的氨基酸，只要该多肽在不存在对所有亚型常见的氨基酸的位置排斥任何不存在于至少一种天然产生的亚型中的氨基酸残基。对所有天然产生的人白细胞IFN-α亚型序列常见的氨基酸残基(“常见氨基酸残基”)和主要出现在非常见残基的氨基酸残基(“共有氨基酸残基”)是本领域已知的。图1为IFN-αcon1的氨基酸序列。因此，共有干扰素是全合成的I型干扰素，它是通过扫描几个干扰素-α非等位亚型并将最频繁观察到的氨基酸安排在各位置而开发的。

共有IFN-α(也指“CIFN”、“IFN-con”和“IFN-αcon”)包括，但不限于命名为IFN-con1(有时指“CIFN-αcon1”、“IFN-αcon1”或“IFN-con1”或“αcon”)，IFN-con2和IFN-con3(见美国专利号4,695,623和4,897,471)和Infergen^(Amegen，ThousandOaks，Calif.)的氨基酸序列。共有干扰素一般通过确定天然产生的干扰素α的共有序列来限定。在一些实施方案中，PEG-修饰的CIFN，特别是Infergen^是特别有兴趣的。

IFN-α多肽可用任何已知的方法生产。编码IFN-con的DNA序列可由上述专利或其它标准方法合成。在许多实施方案中，IFN-α多肽是转化或转染入细菌宿主例如大肠杆菌或真核宿主细胞(例如，酵母菌、哺乳动物细胞，例如CHO细胞等)的制造DNA序列的表达产品。在这些实施方案中，IFN-α是“重组IFN-α”。当宿主细胞是细菌宿主细胞时，IFN-α修饰为含有N-末端甲硫氨酸。在大肠杆菌中生产的IFN-α一般通过本领域技术人员已知的过程纯化，IFN-con1的纯化一般描述于Klein等((1988)J.Chromatog.454：205-215)。

细菌产生的IFN-α可含有与N-末端氨基酸残基有关的同种型的混合物。例如，纯化的IFN-con可含有与N-末端甲硫氨酸状况有关的同种型的混合物。例如，在一些实施方案中，IFN-con含有N-末端甲硫氨酰IFN-con，N末端未封闭的脱甲硫氨酰IFN-con和具有封闭的N末端的脱甲硫氨酰IFN-con的混合物。含有甲硫氨酰IFN-con₁，脱甲硫氨酰IFN-con₁和具有封闭的N末端的脱甲硫氨酰IFN-con₁的混合物的纯化的IFN-con1作为一非限制性例子，Klein等((1990)Arch.Biochemistry &Biophys.276：531-537)。此外，IFN-con可含有特定的、分离的同种型。IFN-con的同种型可用本领域技术人员所已知的技术，例如等电聚焦来相互分离。

需要了解的是文中描述的IFN-α含有一种或多种修饰的氨基酸残基，例如糖基化，化学修饰等。

连接位点

PEG既可直接偶合(即，无连接基团)，也可通过一接头(如下所详述的)偶合到IFN-α多肽上的氨基基团。

在一些实施方案中，PEG化的IFN-α是在IFN-α多肽的氨基末端(N-末端)或接近氨基末端PEG化的，例如，PEG部分结合到IFN-α多肽的从氨基酸1到氨基酸4的氨基酸残基上，或从氨基酸5到约10。

在其它的实施方案中，PEG化的IFN-α是在氨基酸残基从约10到28PEG化的。

在其它的实施方案中，PEG化的IFN-α是在氨基酸残基从100到114PEG化的。

在感兴趣的特定实施方案中，当IFN-α是CIFN时，PEG分子连接到CIFN多肽的NH₂末端氨基酸残基。在这些实施方案中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

在一些实施方案中，PEG化的IFN-α含有在赖氨酸残基的ε-氨基PEG化的CIFN。图1是显示了赖氨酸残基的位置的示范性的IFN-α的氨基酸序列。

PEG部分一般连接到表面暴露的赖氨酸(“lys”)残基。赖氨酸是否暴露于表面可用任何已知的方法确定。一般而言，亲水性分析(例如，Kyte-Doolittle和Hoppe-Woods分析)和/或用合适的计算机程序对表面形成区域进行预测(例如，Emini表面形成概率分析)是本领域技术人员所熟知的。合适的计算机程序包括PeptideStructure等。此外，由于在NMR图谱中特定官能团的质子的化学位移，NMR研究可鉴定表面可接近的残基和它们是如何受包括的“移位试剂”的影响。在其它情况中，残基与溶剂或环境的不可接近性或可接近性可由荧光来评估。还有在其它的情况中，可接近赖氨酸的表面暴露情况可由其与水溶性试剂(例如，三硝基苯磺酸酯或TNBS)的化学反应性来确认。

在一些实施方案中，本发明提供PEG-修饰的CIFN，其中PEG部分与选自下列的赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在这些实施方案中，PEG部分是平均分子量约30kD的线形PEG部分。

在其它的实施方案中，本发明提供PEG-修饰的CIFN，其中PEG部分与选自下列的赖氨酸残基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在这些实施方案中，PEG部分是平均分子量约30kD的线形PEG部分。

在其它的实施方案中，本发明提供PEG-修饰的CIFN，其中PEG部分与选自下列的赖氨酸残基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在这些实施方案中，PEG部分是平均分子量约30kD的线形PEG部分。

IFN-α的群体

本发明进一步提供含有单PEG化的IFNα分子群体的组合物，其中该群体由一种或多种上述的单PEG化的IFNα分子组成。如上所述，本发明的PEG修饰的IFNα在每个IFN-α多肽分子中含有单个PEG分子。在一些实施方案中，一主题组合物含有修饰的IFN-α多肽群体，各具有连接到多肽的单个氨基酸残基的单个PEG分子。

在这些实施方案中，该群体含有在与第一个氨基酸残基上的PEG分子相连的第一个IFN-α多肽和至少一个在第二个氨基酸残基上的PEG分子相连的第二个IFN-α多肽的混合物，其中第一个和第二个IFN-α多肽可以相同或不同，并且在第一个IFN-α多肽的氨基酸序列中的第一个氨基酸残基的位置不同于在第二个IFN-α多肽的氨基酸序列中的第二个氨基酸残基的位置。含有在其氨基末端连接有线形PEG分子的PEG-修饰的IFN-α多肽群体和在其赖氨酸残基上连接有PEG分子的IFN-α多肽的主题组合物可作为非限制性例子。

总体上，一给定的修饰的IFN-α种类代表在一群体中的所有单PEG化的IFNα多肽分子群中约占0.5％到99.5％，例如一给定的修饰的IFN-α种类代表在一群体中所有单PEG化的IFN-α多肽分子群约占0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施方案中，主题组合物含有单PEG化的IFN-α多肽群体，该群体含有至少约70％、80％、90％、95％或至少99％IFN-α多肽在同一部位连接PEG，例如在N-末端氨基酸。

在感兴趣的特殊实施方案中，主题组合物含有单PEG化的CIFN分子群，群体由一种或多种分子组成，其中每种分子是单个CIFN多肽直接或间接地共价连接到分子量约30kD的单个线形PEG部分，并且既可以连接到CIFN多肽中的赖氨酸残基又可连接到CIFN多肽的N-末端氨基酸残基。

在许多实施方案中，与PEG相连的氨基酸残基是N-末端氨基酸残基。在其它实施方案中，PEG部分是连接(直接或通过接头)到表面暴露的赖氨酸残基。在另外的实施方案中，PEG部分是连接(直接或通过接头)到选自下列的CIFN多肽的赖氨酸残基：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在进一步的实施方案中，PEG部分是连接(直接或通过连接物)到选自下列的CIFN多肽的赖氨酸残基上：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。在另外的的实施方案中，PEG部分是连接(直接或通过接头)到选自下列的CIFN多肽的赖氨酸残基：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。

作为例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽的N-末端氨基酸残基相连，而具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽的第一个赖氨酸残基相连，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同。主题组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与CIFN多肽中的赖氨酸残基相连，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不相同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个例子，主题组合物含有的单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽的N-末端氨基酸残基相连，而具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽的第一个表面暴露的赖氨酸残基相连，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同。主题组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与CIFN多肽的暴露于表面的赖氨酸残基相连，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不相同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽的N-末端氨基酸残基相连，而具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽的选自下列之一的第一个赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同。主题组合物可进一步含有具有PEG部分的第三种单PEG化的CIFN多肽与第三个CIFN多肽中的选自下列之一的第二个赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，而第三个CIFN多肽可以与第一个和第二个CIFN多肽相同或不相同，其中第三个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸残基的位置与第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第一个赖氨酸残基的位置不同。主题组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与选自下列之一的赖氨酸相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽的N-末端氨基酸残基相连，而具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中的选自下列之一的第一个赖氨酸残基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同。主题组合物可进一步含有具有PEG部分的第三种单PEG化的CIFN多肽与第三个CIFN多肽中的选自下列之一的第二个赖氨酸残基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，而第三个CIFN多肽可以与第一个和第二个CIFN多肽相同或不相同，其中第三个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸残基的位置与第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第一个赖氨酸残基的位置不相同。主题组合物可进一步含有至少一个额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与选自下列之一的赖氨酸相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽的N-末端氨基酸残基相连，而具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中的选自下列之一的第一个赖氨酸残基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同。主题组合物可进一步含有具有PEG部分的第三种单PEG化的CIFN多肽与第三个CIFN多肽中的选自下列之一的第二个赖氨酸残基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，而第三个CIFN多肽可以与第一个和第二个CIFN多肽相同或不相同，其中第三个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸残基的位置与第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第一个赖氨酸残基的位置不相同。主题组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与选自下列之一的赖氨酸相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个非限制性例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基相连，具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中的第二个赖氨酸残基相连，第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同，其中在第一个CIFN多肽的氨基酸序列中的第一个赖氨酸的位置与第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸的位置不向同。主题组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN与CIFN多肽的赖氨酸残基相连，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不相同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个非限制性例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽中的选自下列之一的第一个赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中的选自下列之一的第二个赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸残基的位置与第一个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基的位置不相同。组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与选自下列之一的赖氨酸相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个非限制性例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽中的选自下列之一的第一个赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中的选自下列之一的第二个赖氨酸残基相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸残基的位置与第一个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基的位置不相同。组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与选自下列之一的赖氨酸相连：lys³¹，lys⁵⁰，lys⁷¹，lys⁸⁴，lys¹²¹，lys¹²²，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不相同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个非限制性例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽中的选自下列之一的第一个赖氨酸残基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中的选自下列之一的第二个赖氨酸残基相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸残基的位置与第一个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基的位置不相同。组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与选自下列之一的赖氨酸相连：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不相同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个非限制性例子，主题组合物含有的单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽中的选自下列之一的第一个赖氨酸残基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中的选自下列之一的第二个赖氨酸残基相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二个CIFN多肽的氨基酸序列中的第二个赖氨酸残基的位置与第一个CIFN多肽中的第一个赖氨酸残基的位置不相同。组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN多肽与选自下列之一的赖氨酸相连：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不相同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

作为另一个非限制性例子，主题组合物含有单PEG化CIFN多肽分子群由第一种和第二种单PEG化的CIFN多肽组成，其中具有PEG部分的第一种单PEG化的CIFN多肽与第一个CIFN多肽中表面暴露的第一个赖氨酸残基相连，具有PEG部分的第二种单PEG化的CIFN多肽与第二个CIFN多肽中表面暴露的第二个赖氨酸残基相连，第一个和第二个CIFN多肽可以相同或不同，其中在第一个CIFN多肽的氨基酸序列中暴露于表面的第一个赖氨酸的位置与第二个CIFN多肽的氨基酸序列中暴露于表面的第二个赖氨酸的位置不相同。对象组合物可进一步含有至少一种额外的具有PEG部分的单PEG化的CIFN与CIFN多肽表面暴露的赖氨酸残基相连，其中在每种额外的单PEG化的CIFN多肽中连接位点的位置与任何其它种类的连接位点的位置不相同。该例子的所有种类中，PEG部分是具有平均分子量约30kD的线形PEG部分。

连接基团

在一些实施方案中，PEG经由连接基团与IFN-α相连。连接基团是任何生物相容的连接基团，其中“生物相容”表明该混合物或基团基本上是无毒的并可在体内使用而不给受试者造成明显的不良应答，例如损伤、患病、疾病、不期望的免疫应答或死亡。PEG可通过，例如醚键、酯键、硫醚键或酰胺键与连接基团相连。合适的生物相容连接基团包括，但不限于酯基团，酰胺基团，亚胺基团，氨基甲酸基团，羧基，羟基，糖类，琥珀酰亚胺基团(包括，例如琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺丙酸活化酯(SPA)、琥珀酰亚胺丁酸(SBA)、琥珀酰亚胺羧甲酸酯(SCM)、琥珀酰亚胺琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))，环氧化物基团，氧羰基咪唑基团(包括例如碳酰二咪唑(CDI))，硝基苯基团(包括，例如硝基苯碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))，甲苯磺酸酯(trysylate)基团，醛基，异氰酸酯基团，乙烯砜基团，酪氨酸基团，半胱氨酸基团，组氨酸基团或伯胺。

在许多实施方案中，PEG是与IFN-α多肽上的伯胺基团反应的单甲氧基PEG分子。通过还原性烷基化用单甲氧基PEG修饰多肽的方法是本领域已知的。见，例如，Chamow等(1994)Bioconj.Chem.5：133-140。

在非限制性例子中，PEG经SPA连接基团与IFN-α相连。PEG的SPA酯和制备相同物质的方法描述于美国专利号5,672,662。SPA连接在IFN-α多肽上提供游离胺基团的连接。

例如，PEG分子通过包括酰胺键的连接共价相连，该酰胺键在PEG部分的丙酰基和IFN-α多肽中的表面暴露的赖氨酸残基的ε氨基之间。该键，例如可以通过PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯(mPEGspa)的形成。

作为非限制性例子，单PEG化CIFN有约30kD的线形PEG部分通过共价键连接到CIFN多肽，其中共价连接是在PEG部分的丙酰基和CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε氨基之间的酰胺键，其中表面暴露的赖氨酸残基是选自下列：lys⁵⁰，lys⁷¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，酰胺键是通过PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯的缩合形成的。

作为另一个非限制性例子，单PEG化CIFN有约30kD的线形PEG部分通过共价键连接到CIFN多肽，其中共价键是在PEG部分的丙酰基和CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε氨基之间的酰胺键，其中表面暴露的赖氨酸残基是选自下列：lys¹²¹，lys¹³⁴，lys¹³⁵和lys¹⁶⁵，酰胺键是通过PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯的缩合形成的。

将PEG分子连接到IFN-α多肽的方法是本领域已知的，并且可使用任何已知的方法。见，例如Park等，Anticancer Res.，1：373-376(1981)；Zaplipsky和Lee，《聚乙二醇化学：生物技术和生物医学的应用》(Polyethylene GlycolChemistry：Biotechnical and Biomedical Applications)，J.M.Harris编.，Plenum出版社，NY，21章(1992)和美国专利号5,985,265。

聚乙二醇

聚乙二醇于室温溶于水，其通用结构式为R-O-(CH₂-CH₂O)_n-R，其中R是氢或保护基团(例如烷基或烷醇基团)，n是从1到1000的整数。R是保护基团，其一般有1到8个碳。

在许多实施方案中，PEG有至少一个羟基(例如末端羟基)，该羟基经修饰产生与氨基反应的功能性基团，例如，赖氨酸残基的ε氨基、多肽N-末端的游离氨基或任何其它的氨基，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或组氨酸的氨基。

在其它的实施方案中，PEG衍生以致它能与IFN-α多肽中的游离羧基反应，例如IFN-α多肽的羧基末端的游离羧基。合适的与IFN-α的羧基末端的游离羧基反应的PEG衍生物包括，但不限于PEG-胺和PEG的肼衍生物(例如，PEG-NH-NH₂)。

在其它实施方案中，PEG衍生以致它含有末端硫代羧酸基团-COSH，该基团可选择性地与氨基反应产生酰胺衍生物。由于硫代酸的反应性质，可以获得某些氨基而跳过其它氨基的选择性。例如，在适当的pH条件下，-SH在与N-末端氨基反应中表现出充分的离去基团能力使得赖氨酸残基中的ε氨基被质子化并维持非亲核性。另一方面，在合适的pH条件下进行的反应可以选择性地使一些可接近的赖氨酸残基反应。

在其它的实施方案中，PEG包括反应性酯，例如在PEG链的末端的N-羟基琥珀酰亚胺。这种含有N-羟基琥珀酰亚胺的PEG分子在特定的pH条件下(例如，中性pH6.5-7.5)与选择的氨基反应。例如，可在中性pH条件下选择性地修饰N-末端氨基。然而，如果试剂的反应性是极端的，可接近的赖氨酸-NH₂基团也可反应。

在其它的实施方案中，PEG在其链的末端含有充足活性的N-羟基琥珀酰亚胺酯，由于在PEG链的末端和酯之间有合适的间隔物(例如丙酰基)使得该酯不能快速水解并在特定的pH条件下(从中性到碱性，即pH7.0-9.0)更加选择性地反应。例如，多肽链中的某些赖氨酸的ε氨基可用N-羟基琥珀酰亚胺丙酸酯活化的PEG选择性地修饰。选择使用具体的方法以产生确定的组合物和活性的产物。

PEG可直接或通过一接头与IFN-α多肽接合。在一些实施方案中，向IFN-α多肽加入接头以形成接头修饰的IFN-α多肽。这样的接头可提供各种功能度(例如，反应基团例如巯基、氨基或羧基)将PEG试剂偶合到接头修饰的IFN-α多肽。

在一些实施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是线形的。在其它的实施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是支链的。支链的PEG衍生物例如那些描述于美国专利号5,643,575，“star-PEG’s”和多臂PEG’s例如描述于Shearwater Polymers，Inc.目录“聚乙二醇衍生物1997-1998”(Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998)。Star PEGs在技术上的描述包括，例如，美国专利号6,046,305。

在特别感兴趣的实施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是线形的。

本发明的PEG修饰的IFN-α多肽含有分子量低于40kD的单个PEG分子。在文中使用并且是本领域熟知的“30kDa”PEG的平均分子量为30kDa。一般使用平均分子量约为2kDa到30kDa的PEG。例如，线形PEG分子的分子量约为20kD到40kD，22kD到28kD，24kD到36kD，26kD到34kD或28kD到32kD。在特定的实施方案中，PEG的分子量约为30kD并且是线形的。

PEG分子的分子量可使用合适的分子量标记由凝胶过滤柱层析来确定，或通过MALDI-TOF质谱来确定。

PEG修饰的IFN-α

本发明的PEG修饰的IFN-α的分子量低于与支链的40kDaPEG的单个分子相连的IFN-α2a的分子量。Pegasys^是与支链的40kDaPEG单个分子相连的示范性的IFN-α2a(Reddy等(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54：571-586)。PEG修饰的IFN-α多肽的分子量小于Pegasys^的分子量，约为5kDa到20kDa，6kDa到15kDa，8kDa到12kDa或7kDa到10kDa。在许多实施方案中，PEG修饰的IFN-α多肽的分子量小于Pegasys^的分子量，约为8kDa到12kDa。

PEG修饰的IFN-α的分子量是否小于Pegasys^的分子量可用测定蛋白质分子量的标准方法方便地确定。这样的方法包括，但不限于高效液相色谱(HPLC)，反相HPLC，体积排阻色谱，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，HPLC体积排阻色谱(SEC)，HPLC/SEC/激光扫描和基质辅助的激光吸收离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。要确定PEG修饰的IFN-α的分子量是否低于Pegasys^的分子量，优选使二者在同样的条件下经体积排阻HPLC。

本发明的PEG修饰的IFN-α多肽的分子量小于约60kDa，一般约为40kDa到55kDa或45kDa到50kDa。在一些实施方案中，PEG修饰的IFN-α多肽的分子量约为50kDa，例如约从48kDa到52kDa。

制备PEG-IFN-α结合物

如上所述，PEG部分可直接或通过一接头连接到N-末端或接近N-末端的氨基酸残基，或在内部(例如，在表面暴露的赖氨酸残基)。接合可在溶液或固相中进行。

将PEG部分连接IFN-α多肽的N-末端或接近N-末端的氨基酸残基的方法是本领域已知的。见美国专利号5,985,265。

在一些实施方案中，使用了选择性获得N-末端化学修饰的IFN-α的已知方法。例如，通过还原性烷基化进行蛋白质修饰的方法是可用的，该方法利用不同类型的伯胺基团(赖氨酸对N-末端)的差别反应性在特定的蛋白质中衍生。在合适的反应条件下，用含有聚合物的羰基基团在N-末端达到基本上选择性衍生的蛋白质。反应在利用赖氨酸的ε-氨基和蛋白质的N-末端的α-氨基之间的pK_a差别的pH条件下进行。通过这种选择性衍生作用可以控制PEG部分与IFN-α的连接：聚合物的接合主要发生在IFN-α的N-末端且其它反应基团(例如，赖氨酸侧链氨基基团)不发生显著的修饰作用。

如果需要，可用任何已知的方法将PEG化的IFN-α和未PEG化的IFN-α分开，这些方法包括，但不限于离子交换色谱，体积排阻色谱和其联合使用。例如，当PEG-IFN-α结合物是单PEG化的IFN-α，产物首先用离子交换色谱分离得到具有电荷特征的单PEG化物质的物质(其它具有相同表观电荷的多PEG化物质也可能存在)，然后使用体积排阻色谱分离单PEG化物质。

在一些实施方案中，修饰的IFN-α通过将IFN-α多肽与α-甲氧基、ω-丙酰基聚乙二醇(mPEgspa)的琥珀酰亚胺酯反应来制备。一般而言，用IFN-α和mPEGspa的摩尔比约为1∶1到1∶5进行反应。反应通常在pH约为7到9的溶液中进行。

在特定的实施方案中，CIFN与分子量约为30kDa的线形mPEGspa反应，其中用CIFN∶mPEGspa的摩尔比约为1∶1到1∶5进行反应，反应的pH约为7到9。在一特定的实施方案中，CIFN∶mPEGspa的摩尔比约为1∶2并且反应的pH约为8。

在一些实施方案中，本发明提供的修饰的CIFN是通过将CIFN与分子量约为30kDa的线形α-甲氧基、ω-丙酰基聚乙二醇(mPEgspa)的琥珀酰亚胺酯反应的方法生产的，其中用CIFN∶mPEGspa的摩尔比约为1∶1到1∶5进行反应，反应的pH约为7到9。在一特定的实施方案中，本发明提供的修饰的CIFN是通过将CIFN与线形、分子量约为30kDa的α-甲氧基、ω-丙酰基聚乙二醇(mPEgspa)的琥珀酰亚胺酯反应的方法生产的，其中用CIFN∶mPEGspa比率约为1∶3进行反应，反应的pH约为8。

PEG修饰的IFN-α的药代动力学性质

本发明的PEG修饰的IFN-α多肽具有至少约8小时、10小时、12小时、15小时、17小时、20小时或25小时或更长的血清半衰期(例如平均血清滞留时间)。

PEG修饰的IFN-α的血清清除率与未修饰的IFN-α的血清清除率相比降低了，例如，PEG修饰的IFN-α的血清清除率比具有相同的氨基酸序列的未修饰的IFN-α的血清清除率至少低约20％、50％、75％或90％。

本发明的PEG修饰的IFN-α在曲线的面积(AUV；以hr×mg/ml表示)示于图5、6或7。

在许多实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α多肽具有和与分子量为40kDa的支链PEG分子相连的干扰素-α2a基本上相似的药代动力学分布。因此，例如，在48周期间将本发明的PEG修饰的IFN-α以180μg剂量每周给药一次产生与在48周期间将Pegasys^以180μg剂量每周给药一次相同的药代动力学分布。

PEG修饰的IFN-α的抗病毒和抗增殖性质

在一些实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主题群体)表现出比PEGASYS^Peg-干扰素-α2a大至少5倍的抗病毒活性。在一些实施方案中，本发明的单PEG化的IFN-α分子或群体表现出比PEGASYS^Peg-干扰素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗病毒活性。在一些实施方案中，单PEG化的CIFN分子或群体表现出比PEGASYS^Peg-干扰素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗病毒活性。比较抗病毒活性的基础可是任何已知的测定，包括，但不限于实施例1所描述的MDBK/VSV测定。

在一些实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主题群体)保留至少5％、7％、10％、12％、15％、20％或更多的亲本(非PEG化的)IFN-α多肽的抗病毒活性。在一些实施方案中，PEG-Alfacon1分子保留至少5％、7％、10％、12％、15％、20％或更多的INFERGEN^Alfa-1的抗病毒活性。比较抗病毒活性的基础可以是任何已知的测定，包括，但不限于实施例1所描述的MDBK/VSV测定。

在一些实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主题群体)表现出比PEGASYS^Peg-干扰素-α2a大至少5倍的抗增殖活性。在一些实施方案中，本发明的单PEG化的IFN-α分子或群体表现出比PEGASYS^Peg-干扰素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗增殖活性。在一些实施方案中，单PEG化的CIFN分子或群体对象表现出比PEGASYS^Peg-干扰素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗增殖活性。比较抗增殖活性的基础可是任何已知的测定，包括，但不限于实施例1所描述的Daudi细胞测定。

制剂

上述组合物可用熟知的试剂和方法配制。组合物可以具有药学上可接受的赋形剂的制剂提供。种类繁多的药学上可接受的赋形剂是本领域已知的且无需在此详细讨论。各种出版物详细描述了药学上可接受的赋形剂，包括，例如A.Gennaro(2000)《雷明顿：药剂学的科学与实践》(Remington：The Science and Practice ofPharmacy)，第二十版，Lipplncott，Williams和Wilkins；《药物剂型和给药体系》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)(1999)H.C.Ansel等编.，第七版.，Lippincott，Williams&Wilkins；和《药用辅料手册》(Handbook ofPharmaceutical Excipients)(2000)A.H.Kibbe等编.，第三版.Amer.Pharmaceutical Assoc。

药学上可接受的赋形剂(例如载体、佐剂、运载体或稀释剂)是方便地公开可用的。此外，药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调整剂、稳定剂、湿润剂等是方便地公开可用的。

在一些实施方案中，PEG化的IFN-α配制在水性缓冲液中。合适的水性缓冲液包括，但不限于乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液，其强度从5mM到10mM不等。在一些实施方案中，水性缓冲液包括用作等渗溶液的试剂。这种试剂包括，但不限于氯化钠和糖，例如甘露醇、右旋糖、蔗糖等。在一些实施方案中，水性缓冲液可进一步包括非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯20或80。制剂可任选进一步包括防腐剂。合适的防腐剂包括，但不限于苯甲醇、苯酚、氯丁醇、苯扎氯胺等。在许多情况下，制剂保存于2-8℃。制剂也可冻干，在这种情况下制剂一般包括防冻剂，例如蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等。冻干的制剂即使在环境温度中也可保存更长的时期。

在主题方法中，活性药物可以任何可导致所期望的治疗效果的方便方式向宿主给药。因此，药剂可掺入各种用于治疗性给药的制剂中。更特别的是，本发明的药剂可与合适的、药学上可接受的运载体或稀释剂联合配制入药学组合物，并可制成固体、半固体、液体或气体形式，例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏剂、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。

给药可以各种方式实现，包括口服、含服、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、经皮、气管内等。

在药物剂型中，药剂可以其药学上可接受的盐形式给药，或者也可单独使用或与其它的药学活性化合物关联使用和联合使用。以下的方法和赋形剂仅是例子而非限制。

对口服制剂而言，药物可以单独使用或与合适的添加剂联合使用来制成片剂、粉剂、颗粒或胶囊，例如，常规的添加剂(例如蔗糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉)；粘合剂(例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)；崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠)；润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)；如果需要可以与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和矫味剂联合使用。

将药剂溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂中配制成用于注射的制剂，这些溶剂为，例如植物油或其它类似的油、合成的脂肪族酸甘油酯、高级脂肪酸或丙二醇的酯；如果需要可与常规的添加剂，例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂联合使用。

此外，将药物与各种基质(base)，例如乳化基质或水溶性基质混合制成栓剂。本发明的化合物经栓剂进行直肠给药。栓剂可以包括载体，例如可可奶油、carbowax(聚乙二醇制剂的商品名)和聚乙二醇，这些载体在体温下溶解，而在室温下是固化的。

也可提供用于口服或直肠给药的单位剂型，例如糖浆、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位(例如茶匙、汤匙、片剂或栓剂)含有预定量的组合物，而组合物中含有一种或多种抑制剂。类似地用于注射或静脉内给药的单位剂型可含有组合物中的抑制剂作为无菌水、常规的盐水或其它药学上可接受的运载体中的溶液。

用在文中的术语“单位剂型”指适用于人和动物受试者的单一剂量的物理上离散单位，每个单位含有预定量的本发明化合物，其量经计算可充分地与药学上可接受的稀释剂、运载体或载体结合产生所期望的效果。本发明新颖的单位剂型的规格取决于所采用的特定的化合物、欲达到的效果和宿主中每个化合物相关的药效学。

主题PEG修饰的IFN-α的有效剂量约为每剂量50μg到300μg、或90μg到180μg。主题PEG修饰的IFN-α的有效剂量约为每剂量0.5μg/公斤体重到3.5μg/公斤体重。

治疗肝炎病毒感染的方法

本发明提供治疗肝炎病毒感染的方法。方法一般包括向个体施加有效剂量的本发明PEG修饰的IFN-α多肽。

在一些实施方案中，主题PEG修饰的IFN-α的“有效量”是指一段时期内有效地达到在个体的血清中病毒滴定度降低1.5-log、2-log、2.5-log、3-log、3.5-log、4-log、4.5-log或5-log，该时期指在开始剂量方案之后的约12到48小时、约48小时到3天、约3到7天、约7天到2周、约2到4周、约4到8周、约8到12周、约12到16周、约16到24周或约24到48周。

慢性丙型肝炎患者一般具有10⁵-10⁷基因组拷贝/ml水平的循环病毒。主题PEG修饰的IFN-α的有效量是有效地将HCV滴定度降至约5×10⁴到10⁵、约10⁴到5×10⁴或约5×10³到10⁴基因组拷贝/ml血清的量。

在一些实施方案中，主题PEG修饰的IFN-α的有效量是在开始剂量方案之后的12到48小时或16到24小时的时期内可有效地将HCV滴定度降至约5×10⁴到10⁵、约10⁴到5×10⁴或5×10³到10⁴基因组拷贝/ml血清的量。

在一些实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α的有效量是将病毒的滴定度降至检测不到的水平的量，例如降至约1000到5000、约500到1000或约100到500基因组拷贝/ml血清。在一些实施方案中，主题PEG修饰的IFN-α多肽的有效量是将病毒的滴定度降至低于100基因组拷贝/ml血清的量。

在一些实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α的有效量是达到维持病毒应答的量，例如在停止治疗之后的至少约1、2、3、4、5个月或更优选至少6个月时间在患者的血清内无可检测到的HCV RNA(例如，低于约500、400、200或100基因组拷贝/ml血清)。

本发明的PEG修饰的IFN-α提供了PEG修饰的IFN-α在血清中的血清浓度。本发明的PEG修饰的IFN-α的血清浓度维持约24到48小时、约2到4天、约4到7天、约1到2周、约2到4周、约4到6周、约6到8周、约8到12周、约12到16周、约16到24周或约24到48周。

在一些实施方案中，主题PEG修饰的IFN-α提供PEG修饰的IFN-α的血清浓度为或接近患者可耐受的最大水平。所达到的血清浓度约为10到1000、约10到500、约20到250、约30到100或约50到75国际单位(IU)/ml。血清浓度维持约24到48小时、约2到4天、约4到7天、约1到2周、约2到4周、约4到6周、约6到8周、约8到12周、约12到16周、约16到24周或约24到48周。

在一些实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α以有效达到并维持主题PEG修饰的IFN-α的血清浓度的剂量给药，该浓度为最大耐受剂量(MTD)的约65％到70％、约70％到75％、约75％到80％、约80％到85％、约85％到90％、约90％到95％或约95％到100％。因此，从剂量方案开始的约6到12小时、约12到24小时或24到48小时内，达到的主题PEG修饰的IFN-α的血清浓度为最大耐受剂量(MTD)的约65％到70％、约70％到75％、约75％到80％、约80％到85％、约85％到90％、约90％到95％或约95％到100％。所达到的血清浓度可维持约7天到2周、约2到4周、约4到6周、约6到8周、约8到12周、约12到16周、约16到24周或约24到48周。

PEG修饰的IFN-α的给药剂量范围为约50μg到300μg，例如约50μg到70μg、约70μg到90μg、约90μg到100μg、约100μg到120μg、约120μg到150μg、约150μg到170μg、约170μg到200μg、约200μg到230μg、约230μg到270μg或约270μg到300μg。

如上所述，PEG修饰的IFN-α的给药量以微克表示。此外，剂量也可以单位或国际单位(IU)活性来表示。体外测定单位或IU作为干扰素抑制合适的病毒(例如，心内膜心肌炎病毒(EMC)、疱疹性口炎病毒和Semliki森林病毒)在感染适当的细胞系(例如，人类肺癌细胞系，A549；HEP/C等)后的细胞病变效应的能力。抗病毒活性以如WHO提供的人干扰素α为参考标准来测定。这些方法在许多参考文献中详述，包括下列的：Familletti，P.C.，Rubinstein，S和Pestka，S.(1981)“一种方便和快速地用于干扰素的细胞病变效应测定方法”(A convenient and rapid cytopathic effectinhibition assay for interferon)，Methods in Enzymol，第78卷(S.Pestka编)，Academic Press，New York，第387-394页。

在一些实施方案中，本发明提供治疗肝炎病毒感染的方法，该方法包括施用有效量的主题PEG修饰的IFN-α来降低病毒负荷。

本发明的PEG修饰的IFN-α可以每日给药、一周两次、一周一次、每两周一次或每周三次给药进行约24小时到48小时、约2到4天、约4到7天、约1到2周、约2到4周、约4到6周、约6到8周、约8到12周、约12到16周、约16到24周或约24到48周。

在特定的实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α可以每周一次给药频率进行约2到4周、约4到6周、约6到8周、约8到12周、约12到16周、约16到24周或约24到48周。

在一些实施方案中，本发明的PEG修饰的IFN-α可以每周约45μg到270μg或约180μg或约120μg的剂量皮下给药约2到4周、约4到6周、约6到8周、约8到12周、约12到16周、约16到24周或约24到48周。每周的剂量可以用快速灌注剂注射给药或用泵控制的连续输注系统给药。

在一些实施方案中，主题PEG修饰的IFN-α以联合治疗的方式给药，例如，施用另一种抗病毒药剂或其它的治疗剂：(1)基本上是同时和以不同的制剂给药；(2)基本上是同时和以同一制剂给药；(3)以不同的制剂在不同的时间给药。以下将详细讨论联合治疗。

联合治疗

在一些实施方案中，提供联合治疗的方法包括施用本发明的组合物和一种额外的治疗剂(例如IFN-γ和/或利巴韦林)。

在一些实施方案中，额外的治疗剂可以在PEG修饰的IFN-α治疗的全程给药，治疗开始和结束阶段相符。在其它的实施方案中，额外的治疗剂可以在与PEG修饰的IFN-α治疗相重叠的时间给药，例如用额外的治疗剂治疗在PEG修饰的IFN-α治疗开始之前开始并在PEG修饰的IFN-α治疗结束之前结束；用额外的治疗剂治疗在PEG修饰的IFN-α治疗开始之后开始并在PEG修饰的IFN-α治疗结束之后结束；用额外的治疗剂的治疗在PEG修饰的IFN-α治疗开始之后开始并在PEG修饰的IFN-α治疗结束之前结束或用额外的治疗剂治疗在PEG修饰的IFN-α治疗开始之前开始并在PEG修饰的IFN-α治疗结束之后结束。

在其它的实施方案中，额外的治疗剂治疗在PEG修饰的IFN-α治疗开始之前施用并在PEG修饰的IFN-α治疗开始之时结束，例如，额外的治疗剂用在“引发”剂量方案中。

利巴韦林和其它的抗病毒药物

利巴韦林，l-β-D-核糖呋喃基-lH-1，2，4-三唑-3-氨甲酰(获得自ICNPharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，Calif.)描述于Merck索引，化合物号8199，第十一版。其生产和制剂描述于美国专利号4,211,771。本发明也考虑了使用利巴韦林的衍生物(见，例如美国专利号6,277,830)。利巴韦林口服的剂量约为每天400、约800或约1200mg。

其它的抗病毒剂可以在本发明治疗方法中给药。例如，抑制肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)的化合物可能具有潜在的直接施加抗病毒的活性，这种化合物可与文中所述的IFN-α组合物联合给药。有效抑制丙型肝炎N53蛋白酶的药物可与文中所述的IFN-α组合物联合给药。丙型肝炎NS3蛋白酶抑制剂可抑制病毒的复制。其它药物，例如HCV NS3解螺旋酶的抑制剂也是用于联合治疗的有吸引力的药物，并且也考虑了用在文中所述的联合治疗。核酶(例如Heptazyme^TM)和硫代磷酸寡核苷酸是与HCV蛋白质序列互补的并且抑制病毒核心蛋白的表达，二者也适合用于文中所述的联合治疗。此外，利巴韦林的合适的类似物，包括对映异构体和免疫增强剂例如Zadaxin^也适用于文中所述的联合治疗。

确定疗效

主题方法是否有效治疗肝炎病毒感染，特别是HCV感染可通过测量病毒负荷或测量与HCV感染相关的参数来确定，该参数包括，但不限于肝纤维变性。

病毒负荷可通过测量血清中病毒的滴定度或水平来测定。这些方法包括，但不限于定量聚合酶链式反应(PCR)和分支DNA(bDNA)测试。例如，已开发了用于测定HCVRNA的病毒负荷(滴定度)的定量测定。许多这样的测定是可市售的，包括定量反转录PCR(RT-PCR)(Amplicor HCV Monitor^TM，Roche Molecular Systems，New Jersey)；和分支DNA(脱氧核糖核酸)信号扩增测定(Quantiplex^TMHCV RNA测定(bDNA)，ChironCorp.，Emeryville，California)。见，例如Gretch等(1995)Ann.Intern.Med.123：321-329。

如上所注明的，主题方法是否有效治疗肝炎病毒感染，例如HCV感染中可通过测量与肝炎病毒感染相关的参数来确定，例如肝纤维变性。肝纤维变性的降低通过分析肝活检样品来测定。肝活检的分析包括对两种主要成分的评价：以“级”评价的炎症坏死(necroinflammation)作为测定严重性和正在进行的疾病活性，和以“阶段”评价的纤维病变的损伤和实质或血管重塑作为长期疾病进展的反映。见，例如Brunt(2000)Hepatol.31：241-246；和METAVIR(1994)Hepatology.20：15-20。以肝活检分析为基础给予评分。许多标准化的评分系统提供定量评价纤维变性的程度和严重性。这些包括METAVIR，Knodell，Scheuer，Ludwig和Ishak评分系统。

肝纤维变性的血清标记也可作为主题治疗方法的效果的指示来测定。肝纤维变性的血清标记包括，但不限于透明质酸盐，N-末端前胶原III肽，IV型胶原的7S结构域，C-末端前胶原I肽和层粘连蛋白。其它肝纤维变性的生化标记包括α-2-巨球蛋白，触珠蛋白，γ球蛋白，载脂蛋白A和γ谷氨酰转肽酶。

作为非限制性例子，用标准测定法测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。总体上，ALT水平低于每ml血清约45国际单位认为是正常的。在一些实施方案中，IFNα的有效量是将ALT水平降至低于约45IU/ml血清的有效量。

适合治疗的受试者

临床诊断为感染肝炎病毒(例如HAV、HBV、HCV、δ等)，特别是HCV的个体适合用本发明的方法治疗。感染HCV的个体在其血液中鉴定出HCV RNA和/或在其血清中鉴定出抗HCV抗体。这样的个体包括未经治疗的个体(例如，以前未治疗过HCV的个体，特别是未接受过基于IFN-α或利巴韦林治疗的个体)和之前治疗HCV失败的个体(“治疗失败”患者)。治疗失败患者包括无应答者(例如，以前治疗HCV未明显或充分降低HCV滴定度的个体，特别是以前用IFN-α的单一形式进行的IFN-α单药治疗)；和复发者(例如，以前治疗过HCV的个体(特别是以前用IFN-α的单一形式进行的IFN-α单药治疗)，其HCV滴定度显著降低了，接着又增加了)。

在感兴趣的特定实施方案中，个体的HCV滴定度至少约为10⁵、5×10⁵或10⁶HCV基因组拷贝/ml血清。患者可感染任何HCV基因型(基因型1、包括1a和1b、2、3、4、6、7、8、9等和亚型(例如，2a、2b、3a等))，特别是难于治疗的基因型，例如HCV基因型1和特定的HCV亚型和准种(quasispecies)。

HCV-阳性的个体(如上所述)也是感兴趣的，这些个体是由于慢性HCV感染而表现出严重的纤维变性或早期肝硬化(非失代偿性的A型Child’s-Pugh或轻一些)，或更晚期的肝硬化(失代偿性的B或C类Child’s-Pugh)和尽管之前进行过基于IFN-α疗法的抗病毒治疗但还是病毒血症的，或不能耐受基于IFN-α的疗法或对这样的疗法有禁忌症的个体。在感兴趣的特定实施方案中，依照METAVIR评分系统具有3或4期肝纤维变性的HCV-阳性个体是适用本发明的方法治疗的。在其它实施方案中，适用本发明方法治疗的个体是临床表现出失代偿性肝硬化的患者，包括很晚期的肝硬化患者(包括那些等待肝移植的)。在其它的实施方案中，适用本发明方法治疗的患者包括中度纤维变性的患者，其中包括那些早期纤维变性(在METAVIR，Ludwig和Scheuer评分系统中评为1和2期的；或在Ishak评分系统中评为1、2或3期的)的患者。

在某些实施方案中，用于治疗HCV患者的特定的药物治疗方案按照患者所表现出来的某些疾病参数来选择，例如初始病毒负荷，患者感染的HCV的基因型，患者的抗病毒治疗史，肝脏组织学和/或患者肝纤维变性的期。在一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)通过Knodell评分3或4测定来鉴定具有晚期或严重期肝纤维变性的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周，或约30周到1年，或约36到50周，或约40到48周，或至少约24周，或至少约30周，或至少约36周，或至少约40周，或至少约48周，或至少约60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)通过Knodell评分3或4测定来鉴定具有晚期或严重期肝纤维变性的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约40到50周，或约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷大于2百万病毒基因组拷贝/ml患者血清，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周，或约30周到1年，或约36到50周，或约40到48周，或至少约24周，或至少约30周，或至少约36周，或至少约40周，或至少约48周，或至少约60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷大于2百万病毒基因组拷贝/ml患者血清，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约40到50周，或约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型1感染同时初始病毒负荷大于2百万病毒基因组拷贝/ml患者血清并且通过Knodell评分0、1或2测定无肝纤维变性或早期肝纤维变性，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周，或约30周到1年，或约36到50周，或约40到48周，或至少约24周，或至少约30周，或至少约36周，或至少约40周，或至少约48周，或至少约60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷大于2百万病毒基因组拷贝/ml患者血清并且通过Knodell评分0、1或2测定是无肝纤维变性或是早期阶段，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约40到50周，或约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒负荷小于或等于2百万病毒基因组拷贝/ml患者血清，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约20到50周，或约24到48周，或约30到40周，或高至约20周，或高至约24周，或高至约30周，或高至约36周，或高至约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型1感染同时初始病毒负荷小于或等于2百万病毒基因组拷贝/ml患者血清，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约20到24周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型1感染同时初始病毒负荷小于或等于2百万病毒基因组拷贝/ml患者血清，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周，或约30周到1年，或约36到50周，或约40到48周，或至少约24周，或至少约30周，或至少约36周，或至少约40周，或至少约48周，或至少约60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约20到50周，或约24到48周，或约30到40周，或高至约20周，或高至约24周，或高至约30周，或高至约36周，或高至约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约20到24周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约至少24周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有HCV基因型4感染，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周，或约30周到1年，或约36到50周，或约40到48周，或至少约24周，或至少约30周，或至少约36周，或至少约40周，或至少约48周，或至少约60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有特征在于任何HCV基因型5、6、7、8和9的HCV感染，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约20到50周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定患者具有特征在于任何HCV基因型5、6、7、8和9的HCV感染，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药至少约24周和高至约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定未经抗病毒治疗的患者具有HCV基因型1感染，，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定未经抗病毒治疗的患者具有HCV基因型1感染，，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定未经抗病毒治疗的患者具有HCV基因型1感染，并且初始病毒负荷大于2百万HCV RNA基因组/ml血清，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定未经抗病毒治疗的患者具有HCV基因型1感染，并且初始病毒负荷小于或等于2百万HCV RNA基因组/ml血清，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定未经抗病毒治疗的患者具有HCV基因型2或3感染，，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约12到24周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定未经抗病毒治疗的患者具有HCV基因型4感染，，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定HCV感染并且抗病毒治疗早期阶段失败的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定HCV感染并且IFN-α治疗早期阶段失败的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定HCV感染并且用IFN-α2a或2b治疗早期阶段失败的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定HCV感染并且用PEGASYS^peg干扰素α-2a或PEG-INTRON^peg干扰素α-2b治疗早期阶段失败的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定HCV感染并且用共有干扰素治疗早期阶段失败的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到60周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定基因型2或3HCV感染并且在对IFN-α治疗早期阶段应答之后复发的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约24到48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定基因型1或4HCV感染并且在对IFN-α治疗早期阶段应答之后复发的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约48周。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，包括步骤(1)鉴定HCV感染并且对IFN-α治疗早期阶段无应答的患者，和(2)以治疗有效量的主题PEG修饰的IFN-α向患者给药约48到60周。

关于每个方法适合疾病参数和/或上述病人的其它特征，本发明也考虑了在所需的PEG修饰的IFN-α治疗过程以有效量的利巴韦林向患者协同给药。在一实施方案中，主题方法包括在所需的PEG修饰的IFN-α治疗过程每天向患者给药约800到1200mg利巴韦林，每天的剂量任选分为两个剂量。在另一实施方案中，主题方法包括在所需的PEG修饰的IFN-α治疗过程，如果患者体重小于75kg每天向患者给药(a)1000mg利巴韦林，或如果患者体重大于或等于75kg则每天向患者给药(b)1200mg利巴韦林，每天的剂量任选分为两个剂量。

提供了具有单位剂量的主题PEG修饰的IFN-α(例如，口服或注射剂量)的试剂盒。除了含有单位剂量的容器，在这些试剂盒中有描述治疗肝炎药物的用途和附带的益处的信息性包装说明书。优选的药物和单位剂量如上所述。

在一些实施方案中，主题试剂盒包括含有溶液的容器和每周单位剂量给药一次的说明书，该溶液含有单位剂量的主题PEG修饰的IFN-α和药学上可接受的赋形剂。说明书可印在贴于容器的标签上或可以是容器附有的包装说明书。

实施例

提供以下的实施例是向本领域普通技术人员完全披露和描述如何制造及使用本发明，而非限制发明人所认为的其发明的范围，也非表示以下的实验是所做的全部或仅有的实验。发明人保证所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但一些实验错误和偏差应该说明。除非另有说明，份是份(按重量计算)，分子量是平均分子量，温度是摄氏温度，压力是大气压的或接近大气压。

实施例1：PEG修饰的CIFN的制备及药理学特性简述

用超过2倍摩尔的线形30kDa MPEG(mSPA 30K PEG)的琥珀酰亚胺丙酰基衍生物于20℃处理在含有100mM氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液中的CIFN(其中约三分之一的蛋白质作为N-封闭的变体，3mg/ml)1小时。原始混合物用SEC分析显示单PEG化的产物在混合物中约占52％。主要组分在阳离子交换柱上纯化得到97％或更高纯度的单PEG化CIFN。该物质(30K的MPEG-单PEG化CIFN)保留了亲本CIFN显著量的抗病毒活性。

按照美国专利号5,985,265中实施例3所描述的方法对CIFN进行N-末端修饰得到N-末端单PEG化CIFN(30K的MPEG-α-氨基-单PEG化的CIFN)，但其中是用30kD(线形)甲氧基聚乙二醇醛代替12kD(直链)甲氧基聚乙二醇醛。该物质(30K的MPEG-α-氨基-单PEG化的CIFN)保留了亲本CIFN显著量的抗病毒活性。与下述的酰化反应不同，N-末端的衍生需要超过8倍摩尔的甲氧基PEG-丙醛和氰基硼氢化钠作为还原剂来实施pH4.0时的烷基化反应。

当在使用大量表达IFN受体的Daudi细胞的体外抗增殖活性模型中测试时，30KMPEG-单PEG化CIFN和30KMPEG-α-氨基-单PEG化CIFN分子显示基本保留了亲本分子(CIFN)的活性并且表现出比Peg-干扰素α-2a(Pegasys^)高20-30倍的活性。评价了30KMPEG-单PEG化的CIFN和30KMPEG-α-氨基-单PEG化的CIFN化合物在大鼠体内的药代动力学特性。两种单PEG化的CIFN化合物出人意料地表现出与PEG化的干扰素α-2a(Pegasys^)相似的循环分布。

材料与方法

CIFN和PEG

CIFN由Amgen生产并纯化，收到的终产品作为具有分析证书的浓度为0.2mg/ml的药物。所得到的琥珀酰亚胺丙酰基甲氧基PEG(线形30kD)产自Shearwater公司，Huntsville，AL，既是研究级(research grade)的也是GMP产品。

用于小规模生产PEG化的CIFN之一的典型方案如下：

0.2mg/ml的主体蛋白(～750mg)用膜面积为0.038cm²进行超滤。然后产物渗滤入pH调至8.00的含有100mM氯化钠的25mM磷酸钠缓冲液。浓缩的物质调整到蛋白质浓度为3mg/ml。CIFN溶液然后在2mMHCl中与超过2摩尔的mSPA 30K PEG试剂混合并于21℃孵育1小时。加入超过试剂量3摩尔的甘氨酸终止反应。然后将反应混合物用pH4.5、50mM乙酸钠稀释10倍，并以2.0mg总蛋白/ml树脂的量上Fractogel柱。柱首先用平衡缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.5)洗涤，接着用含有100mM氯化钠的50mM乙酸缓冲液和含有250mM氯化钠的乙酸缓冲液洗涤。单PEG化的产物经超滤/渗滤(UF/DF)，用制剂缓冲液(含有100mM氯化钠的25mM磷酸钠，pH7.0)平衡，然后浓缩调整至填充-完成(fill-finish)活性所需要的量。

PEG修饰的IFN-α的生产

产生了各种PEG修饰的CIFN制剂。这些具有30kDaPEG单PEG化的CIFN制剂用以下的产品代码表示，例如IM-002或有时加一前缀，例如IM-396-002。

制剂1(IM-002)：浓度为3.02mg/ml的纯化的共有α-干扰素[通过用足够量的100mM磷酸钠缓冲液稀释溶液A(含有100mM氯化钠、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液)中的蛋白达到最终pH为6.5来制备]于环境温度、pH6.5条件下用SPA-线形30kD的mPEG以摩尔比5∶1处理5.5小时。SEC色谱分析显示单PEG化的产物混合物占原始混合物的47％。该实验在接近生理条件下进行。反应条件、产物的抗病毒活性和早期小规模材料的样品概括于表1和2。早期小规模产物所得的初步抗增殖活性概括于表3。

制剂2(IM-003)：浓度为2.73mg/ml的CIFN[通过用足够量的50mM磷酸钠二元溶液稀释溶液A(含有100mM氯化钠、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液)中的蛋白达到pH为7.4来制备]于环境温度和PEG试剂以摩尔比1∶3搅拌3.5小时，然后置于2-8℃约15小时。产物分析显示单PEG化的产物约占46％(表1)并且保留14.5％的抗病毒活性(表2)。该实验在生理条件下进行并且产物保留显著量的亲本IFN活性。制剂2保留了CIFN分子60％的抗增殖活性。

制剂3(IM-004)：在含有100mM氯化钠、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液中，浓度为3.0mg/ml的CIFN于环境温度用超过5倍摩尔的PEG试剂处理1.8小时。此反应也可在生理pH条件下进行产生占原始混合物47.1％产量的单PEG化化合物的混合物(表1)并且该物质的抗病毒活性(表2)和抗增殖活性(表3)显示该化合物也是可与上述的其它化合物相比的。

制剂4(IM-005)：浓度为2.57mg/ml的CIFN[通过用足够量的15mMNaOH溶液稀释含有100mM氯化钠、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液中的蛋白达到pH为8.0来制备]]于2-8℃、pH8.0±0.2用超过3倍摩尔的PEG试剂处理约15小时。产物混合物的分析显示单PEG化的化合物产量占47.0％并且产物保留了亲本分子显著量的抗病毒(CIFN的13.8％，见表2)和抗增殖活性(在早期实验中CIFN活性的150％，见表3)。该产物最优化的反应条件显示通过使用摩尔比为1∶2的蛋白与试剂并且接合反应在20度(“℃”)进行1小时可得到相同的产物。产物的产量略有增加(47到52％)。

制剂5(IM-006；也称为IM-396-006)：浓度为2.55mg/ml的CIFN[通过用足够量的20mMNaOH溶液稀释含有100mM氯化钠、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液中的蛋白达到pH为9.4来制备]]于2-8℃、pH9.4用超过3倍摩尔的PEG试剂处理3小时。单PEG化产物的产量为47.2％(表1)并且保留抗病毒(表2)和抗增殖活性(表3)与上述例子类似。

制剂6(IM-007)：浓度为2.57mg/ml的CIFN[通过用足够量的20mMNaOH溶液稀释含有100mM氯化钠、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液中的蛋白达到pH为8.8来制备]于2-8℃、pH8.8用超过3倍摩尔的PEG试剂处理6小时。该产物所得的结果见表1、2和3。

在以上引用的所有情况中，PEG试剂立刻加入蛋白质溶液并在Roto Mix的平台上维持混合速率为60-70rpm。

PEG-Alfacon1的按比例扩大生产

在接下来需要提供毒理学和临床研究(用约1g干扰素药物开始)的工作中，对上述使用条件进行略微修改来生产PEG-Alfacon1药物。因此，CIFN先用超滤/渗滤步骤达到约3mg/ml蛋白浓度浓缩入反应缓冲液(25mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH8.0)。接合反应使用摩尔比为2∶1的PEG试剂与蛋白质于pH8.0进行并于环境温度孵育1小时。加入过量的甘氨酸终止反应，然后在填充-完成之前使用阳离子交换色谱纯化、阴离子交换并配制。这些步骤后得到纯度＞90％的单PEG化产物(区域异构体的混合物)。大量不同的产物的纯度为93-97％。

阳离子交换色谱

反应产物的分离通过将混合物上样于预先用pH4.5的乙酸缓冲液平衡的Fractogel柱实现。通过用不同盐浓度的缓冲液洗涤分离产物。单PEG化的异构体作为一个组分分离，然后产物使用含有100mM氯化钠、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液进行超滤/渗滤。最终缓冲液交换和稀释在预先用制剂缓冲液平衡的Q Sepharose柱上通过阴离子交换进行。

联合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，反相高效液相色谱(RP-HPLC)和体积排阻色谱(SEC)分析单PEG化的产物混合物。

SDS-PAGE

4-12％Bis-Tris NuPaGE丙烯酰胺凝胶用于进行电泳。牛血清白蛋白连同分子量标记用作标准品。条带通过胶态蓝染色法目测。在上样于凝胶之前还原蛋白质。与CIFN标准品相比，产物如高分子量条带展开，表现出PEG化。

RP-HPLC

分析用Phenomenex Synergi 4μMAX-RP柱。产物用各不相同的TFA-乙腈组合洗脱。检测在214nm处的DAD1紫外(uv)吸光度和波长为280nm的DAD2来目测个体峰。主峰对应于单PEG化的产物并用作产物的参考峰特征。该方法用来描述上述制剂1-6。当鉴定最佳的PEG化的产物用于进一步扩大生产时，要修改HPLC分析方法。测试物注射在Zorbax 300 SB-C3柱(4.6×150mm，Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上。使用两种溶液作为流动相(A：0.1％的TFA水溶液；B：含有0.1％TFA的80％乙腈溶液)。产物用两种流动相组成的梯度洗脱26分钟。使用流速1.0mL/分钟并且以214nm处的uv吸光度检测样品。PEG-Alfacon1作为主峰洗脱，保留时间为11.2分钟(见图4)。

SEC-HPLC

用体积排阻HPLC方法进行PEG化干扰素的鉴定、纯度和强度分析。在早期鉴定制剂1-6中串联使用Shodex KW-803和Shodex KW-804柱。柱在5mM磷酸钠缓冲液，于pH7.25，以1ml/分钟的流速展开。以214nm处的吸收检测峰。以分子量和流体半径为基础判断异构体的混合物的峰分配，其中该混合物对应于单PEG化产物以单峰洗脱。在PEG-Alfacon1的按比例扩大生产期间，要修改该方法。制剂缓冲液中的产物注射在连接HP型1100HPLC系统的Superose 12HR 10/30柱上。流速调节至0.5ml/分钟，并在214和280nm处通过紫外吸光度检测产物。在这些条件下，PEG化的CIFN于19.5分钟洗脱。

PEG化的产物的分子量用基质辅助的激光吸收离子化飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进一步分析。

产物的生物学特征以抗病毒测定、抗增殖活性测定和在大鼠中的药代动力学进行评价。

30K MPEG-α-氨基-单PEG化的CIFN

除了用30kD的线形PEG试剂(活性醛)替代实施例3中特定的12kD的线形PEG试剂外，基本上按照美国专利号5,985,265的实施例3中所描述的方法用30kD线形单甲氧基聚乙二醇醛还原性烷基化CIFN。如美国专利号5,985,265所述，从烷基化反应混合物中回收30K MPEG-α-氨基-单PEG化的CIFN并纯化。该制剂(IM-001)以下称为N-末端PEG-CIFN。

抗病毒试验

Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞用疱疹性口炎病毒(VSV)感染并用CIFN或Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN治疗。活性以抑制病毒复制为基础并以个体蛋白的摩尔浓度标准化。抑制百分率用以下公式计算：抑制百分率＝(Test-VC)/(CC-VC)，其中Test表示在测试物存在时观察到的细胞染色，VC表示在病毒而非测试物存在时的细胞染色，CC表示在无病毒情况下的细胞染色。当用MDBK细胞系测试抗病毒活性时，Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN表现出剂量依赖的对VSV病毒的抗病毒活性。类似的抗病毒活性也在用心内膜心肌炎(EMC)病毒感染的人肺癌(A549)细胞中测定到。

抗增殖测定

用预定浓度的CIFN或Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN处理人Burkitt淋巴瘤细胞或Daudi细胞3天，并用掺入氚化的胸腺嘧啶的方法测定细胞增殖。抑制百分率用以下公式计算：抑制百分率＝1-(测试cpm/总cpm)]×100，其中测试每分钟计数(cpm)表示测试化合物在指示浓度时测量的值，总cpm表示无测试化合物时测量的细胞增殖的值。当用Daudi细胞系测试抗增殖活性时，Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN表现出剂量依赖抗增殖活性并且结果也显示了单PEG化的异构体混合物保留了显著量的亲本CIFN活性。

大鼠药代动力学

在3只雄性Sprague-Dawley大鼠中研究PEG化CIFN产物的体内清除率。PEG化的干扰素经皮下途径向大鼠给药(20-250μg/kg)。1周后测量血清浓度。利用药代动力学分析确定Cmax、AUC和排除时间t_1/2。用所有的单PEG化的CIFN混合物看到半衰期有显著的增加。因此，Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN证明血浆暴露有显著的增加。类似的研究也在猕猴中进行，并在皮下注射Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN10天后检测了PK参数和2’-5’寡腺苷酸合成酶(OAS)的水平。OAS是α干扰素能效的代替标记。

结果和讨论

PEG-修饰的CIFN

表1.各种PEG化的CIFN分子的制备方法和产量的概略结

用含有250mM氯化钠、pH4.5的50mM乙酸钠缓冲液洗脱得到纯度为97％或更高的作为混合物的PEG-Alfacon单PEG化产物。纯度以SEC-HPLC和SDS-PAGE凝胶电泳测定。得到的数据示于图2和3。反相HPLC分析(图4)显示纯化的产物在保留时间12分钟以单个主峰出现。PEG化CIFN的平均分子量用MALDI-TOF质谱测定。观察到的52260的质量与通过凝胶渗透色谱(GPC)连接一个分子的CIFN测量到的一个单位的名义30kdPEG(平均分子量为32700Da)一致。

抗病毒活性

表2.PEG化的α干扰素的抗病毒活性

在使用MDBK/VSV系统进行的细胞病变效应抑制测定中，PEG化的CIFN产物(制剂号IM-002，IM-003，IM-004，IM-005，IM-006和IM-007中的任何一个)和N-末端PEG-CIFN产物(制剂号IM-001)表现出约10％的亲本分子(CIFN)的抗病毒活性。在这些产物中，IM-005选为先导选择物(lead candidate)用于进一步开发并命名为PEG-Alfacon。抗病毒活性的测量依赖于实际使用的细胞系和感染病毒的联合。在使用A549/EMC病毒系统进行的细胞病变效应抑制测定中，PEG-Alfacon产物和N-末端PEG-CIFN产品表现出保留了略微小于10％的CIFN抗病毒活性。

当在MDBK/VSV系统中测定时，Roferon^干扰素-alfa2a表现出比Infergen^-alfacon-1低5-10倍的抗病毒活性[Ozes ON等.J Interferon Res12：55-59(1992)]。从上表2的数据推断，明显的是，当在MDBK/VSV系统中测定时，Pegasys^peg-干扰素-alfa2a保留了约1.5-3.0％的Roferon^干扰素-alfa2a(与Infergen^或干扰素Alfacon-1的0.3％抗病毒活性比较)的抗病毒活性。因此，PEG化的共有干扰素分子保留亲本干扰素分子(Infergen^-alfacon-1)的抗病毒活性的百分率大于Pegasys^peg-干扰素-alfa2a保留亲本干扰素分子(Roferon^干扰素-alfa2a)的抗病毒活性的百分率约10倍。PEG-Alfacon的参考标准品(PEG化的CIFN或Infergen)与其它商业化产品例如PEG-Intron或PEGASYS(见下表4和5)在几个细胞系中使用不同的感染病毒也进行了类似的比较。得到的结果支持了上述PEG化的CIFN产物的早期抗病毒数据。以这些CPE测定系统为基础，PEG-Alfacon与PEGASYS相比似乎具有优异的抗病毒效力，并具有可与PEG-Intron相比的效力。因此可预期它用于治疗慢性并型肝炎中有充足的抗病毒活性。

抗增殖活性

表3.PEG化的α干扰素的抗增殖活性

另一个测量干扰素生物学活性指标的抗增殖活性受PEG化的影响较小。PEG-alfacon产物表现出约40-150％亲本分子(CIFN)的抗增殖活性。N-末端PEG-CIFN产物表现出约45％亲本分子(CIFN)的抗增殖活性。然而在基于Daudi细胞的抗增殖测定中，PEG化的共有干扰素分子比PEGASYS^PEG-干扰素-alfa2a高5-15倍的抗增殖活性。

药代动力学

对各种合成的类似物的比较作为本发明的一部分在大鼠PK模型中评价并证明显著较长的循环时间(图5)。在图5中，IM-001表示N-末端PEG-CIFN，IM-003、IM-005和IM-006分别表示PEG化的CIFN制剂2、4和5。图6显示命名为IM-006的这些类似物之一的血清浓度-时间分布的半对数图。PEG化的共有干扰素分子表现出与PEG化的干扰素α-2a(Pegasys^)很相似的药代动力学分布。因此，Cmax在24小时后达到，Cmax为633ng/ml。排除半衰期约为27小时，而CIFN的清除率t_1/2值约为6小时。有趣地发现所有PEG化CIFN分子(即N-末端修饰的(IM-001)或内部赖氨酸衍生的类似物(IM-003、IM-005和IM-006))均表现出很相似的药代动力学(PK)分布。在猕猴中进行的相似研究显示PEG化的CIFN分子(IM-005)在血液中持续高达1周(图7)并且在所有时间点检测血清均诱发2’-5’OAS活性。可观察到血液中的药效标记上升了至少5天。在猕猴中Peg-Alfacon1末端排除的半衰期计算为约30小时。因此，由线形30kd的PEG试剂产生所得的PEG化的CIFN出人意料地得到体内每周给药一次所期望的PK特征。

实施例2：PEG修饰的CIFN和其它PEG化的α-干扰素的抗病毒活性鉴定

为全面表征本发明PEG化的CIFN在其它人细胞系中的抗病毒活性并与其它相似的产品作比较，在A549、HeLa和ME180细胞中使用相同的感染病毒(例如VSV和EMCV)进行了筛选这种分子的实验。

材料和方法

HeLa或ME180细胞生长在DMEM或RPMI-1640培养基中，该培养基补充了10％热灭活的血清(小牛或胎儿视需要而定)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，UT)，L-谷氨酰胺(2mM)，链霉素(100μg/ml)和青霉素(100μ/ml)。细胞于37℃生长在5％CO₂加湿的孵育箱内。在加入病毒之前用IFN处理HeLa或ME180细胞(在96-孔微滴定板中，2×104细胞/孔)24小时。疱疹性口炎病毒(VSV)或心内膜心肌炎病毒(EMCV)以MOI为0.1加入，板再孵育48小时。在此时，用含0.5％结晶紫的20％(体积/体积)甲醇溶液对细胞单层染色。所有的细胞病变效应(CPE)抑制测定进行双份。抑制50％细胞病变效应的IFN的量定义为IFN的一个单位。所有IFN的活性对照NIH标准人IFN-α(Namalwa/Sendai)(Ga23-901-532)测量。

A549/EMCV CPE测定按照文献描述的标准方法进行。

结果

在最初的筛选中，CIFN或Intergen与PEG-Alfacon1(也是称为PEG-CIFN或PEG化的干扰素)在细胞病变效应(CPE)抑制测定中用VSV在不同的细胞系中进行比较。该项研究所得的结果示于表4。通过测试干扰素的活性与NIH标准品(GA23-902-530)进行比较计算比活性。

表4：IFN-Alfacon-1和PEG-Alfacon-1的抗病毒活性的比较

干扰素	细胞类型	比活性	标准误差
干扰素	细胞类型	比活性	标准误差	IFN-Alfacon-1	ME180	1×10⁹	2×10⁸
IFN-Alfacon-1	A549	3.4×10⁹	1×10⁹	IFN-Alfacon-1	ME180	1×10⁹	2×10⁸
IFN-Alfacon-1	A549	3.4×10⁹	1×10⁹	IFN-Alfacon-1	HeLa	2.5×10⁹	6×10⁸
PEG-Alfacon-1	ME180	6×10⁷	3×10⁷	IFN-Alfacon-1	HeLa	2.5×10⁹	6×10⁸
PEG-Alfacon-1	ME180	6×10⁷	3×10⁷	PEG-Alfacon-1	A549	1.5×10⁹	1×10⁹
PEG-Alfacon-1	HeLa	7×10⁷	2×10⁷	PEG-Alfacon-1	A549	1.5×10⁹	1×10⁹

比较细胞系ME180和HeLa的比活性显示Intergen或干扰素Alfacon-1对表4所有结果均有显著较高的抗病毒活性(P＜0.01)。相反，当使用A549细胞时，干扰素Alfacon-1和PEG-Alfacon-1的比活性很相似。

在不同的细胞系中比较了本发明产品与亲本分子和其它市场产品的抗病毒活性。这些研究所得的实验数据用单向Anova统计学分析程序(one way Anovastatistical analysis program)分析。显示于图8-10的结果的图示表明数据的统计学意义。表5一概括了使用EMC病毒在A549、HeLa和ME180细胞系中进行比较研究得到的比活性数据。

表5.平均抗病毒比活性

细胞类型	Intergen	PEG-Alfacon1	PEG-Intron	pegasys
细胞类型	Intergen	PEG-Alfacon1	PEG-Intron	pegasys	A549	2.4×10¹¹	1.5×10¹⁰	2.4×10⁹	2.4×10⁸
HeLa	3.4×10⁹	4.8×10⁷	1.4×10⁸	5.8×10⁶	A549	2.4×10¹¹	1.5×10¹⁰	2.4×10⁹	2.4×10⁸
HeLa	3.4×10⁹	4.8×10⁷	1.4×10⁸	5.8×10⁶	ME180	1×10⁹	8×10⁷	9×10⁷	4×10⁶

从该实施例中的数据清楚地发现PEG-Alfacon1保留了亲本Intergen分子显著量的抗病毒活性。在头对头比较中，很明显PEG-Alfacon1保留了可与PEG-Intron相比的活性水平并显著高于Pegasys的活性水平。然而根据药代动力学性质(图5)，PEG-Alfacon1比PEG-Intron好得多并且药物的末端排除半衰期可与Pegasys相比。因此在联合抗病毒活性和药代动力学性质的基础上，可期待PEG-Alfacon具有优异的体内活性。在A549、HeLa和ME180细胞系统(上述表4和5)中得到的Infergen^(干扰素Alfacon-1)、PEG-alfacon-1、Pegasys^(peg-干扰素-alfa2a)和PEG-Intron^(peg-干扰素-alfa2b)的抗病毒活性测定数据与在MDBK细胞系统(上述表2)中得到的几个PEG化的CIFN分子、Infergen^(干扰素Alfacon-1)和Pegasys^(peg-干扰素-alfa2a)的抗病毒活性测定数据一致。两组数据均表明PEG-alfacon-1(和其它的PEG化的CIFN分子)表现出比Pegasys^peg-干扰素-alfa2a大至少10倍的抗病毒活性。此外，表2中的MDBK测定数据与表4和5中的A549和ME180数据表明PEG-alfacon-1保留了约10％的亲本干扰素分子(CIFN)的抗病毒活性，而在以本文中和文献中发表的数据为基础的相同测定系统中，Pegasys^peg-干扰素-alfa2a保留了约1.0％的亲本干扰素分子的活性(即Roferon^干扰素-alfa2a的活性)，这些数据重复显示Infergen比Roferon活性大5-10倍。因此，PEG-alfacon-1保留亲本干扰素分子的抗病毒活性(即Infergen^alfacon-1的抗病毒活性)的百分率大于Pegasys^peg-干扰素-alfa2a保留亲本干扰素分子的抗病毒活性(即Roferon^干扰素-alfa2a的抗病毒活性)的百分率约10倍。

实施例3：PEG-alfacon的药代动力学和药效学分析

以下概括了使用PEG-alfacon单剂量研究的结果对药代动力学和药效学数据进行分析的结果。检测了单个和平均PK分布以及血清2’5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)活性的平均PD分布。此外，使用PK分布模拟血清药物分布为以10天间隔的多剂量PEG-Alfacon进行预测。

药代动力学数据取自PEG-alfacon的单剂量，范围发现临床研究。6组健康的男性和女性志愿者以逐步上升的剂量设计给予单剂量皮下注射PEG-alfacon，其剂量范围是15到210μg。选择来自接受60μg和更高剂量的志愿者的样品进行该分析。最后处理组接受在增加阶段鉴定为最高耐受剂量的210μg剂量。在两个情况(120μg剂量组的受试者531和受试者532)中给药前5分钟获得的样品血清的PEG-alfacon基线值是可测量的。基线值从随后的样品中扣除以得到这两个情况的基线校正值并且数据显示有基线校正和无基线校正。

单个数据进行非区室和区室药代动力学分析。平均数据在市售的Kinetic^TM软件的帮助下进行三个步骤的分析：非区室药代动力学分析、区室药代动力学分析和区室药代动力学/药效学分析。

表6概括了对血清药物浓度进行非区室药代动力学分析的结果。在皮下给药后36到72小时内达到峰浓度，并且峰浓度随剂量从60μg剂量给药之后的平均665pg/ml增加到210μg剂量给药之后的约3600pg/ml。平均分布示于图11。表6显示从单个分布计算得到的平均PK参数和从平均血清分布计算得到的PK参数。总体上，虽然每个组内受试者之间有很大的差异并且这些差异不能方便地以性别、体重指数(BMI；kg/m²)或股与腹部注射位置不同比较来解释，但方法之间有合理的一致。作为例子，受试者424在给药90μg剂量后有可定量的值并且其它样品测定检测不到，而受试者425给予同样剂量的PEG-alfacon后的样品浓度均在6000pg/ml以上。

表6比较了用非区室方法计算得到的各剂量组的平均药代动力学参数和相应的对各剂量组的平均血清浓度进行区室分析计算得到的参数。用非区室方法为受试者318、423、425、529和747计算参数的数据不充分。两种方法得到的计算参数总体上与AUC参数值(反映一段时间后的总药物暴露)和排除半衰期(t_1/2)一致，这显示了每个方法有相似的值。与单个最大浓度的平均值相比，平均数据的血清峰浓度倾向于略微低一点。在具有％CV的各组内有很大的可变性，所有参数的范围约为30到70％。

各剂量组的平均血清分布适合于使用市售的软件的1-区室体模型。单个血清分布也适合于1-区室体模型。36个单个数据集的药物分布的6个中，数据不足以进行1-区室体模型的计算(受试者315、318、321、425、529和747)。

表6

平均非区室药代动力学参数^*
平均非区室药代动力学参数^*								60μg	90μg	120μg^*	150μg	180μg	210μg
n/剂量	5	4	6	6	6	5		60μg	90μg	120μg^*	150μg	180μg	210μg
n/剂量	5	4	6	6	6	5	Cmax[pg/ml]	665±274[580]	1454±467[1090]	2979±1829[2203]	2608±1492[2441]	2298±1065[2150]	3610±1179[2938]
t_max[h]	72±0[72]	70±43[72]	49±36[48]	37±23[48]	54±28[48]	62±27[72]	Cmax[pg/ml]	665±274[580]	1454±467[1090]	2979±1829[2203]	2608±1492[2441]	2298±1065[2150]	3610±1179[2938]
t_max[h]	72±0[72]	70±43[72]	49±36[48]	37±23[48]	54±28[48]	62±27[72]	AUC_0-最终	57.9±34.2	156.2±52.9	2420.5±156.0	296.8±203.2	250.3±117.2	537.6±253.7
[ng/ml^*h]	(59.1)	[136.1]	[214.6]	[320.0]	[277.5]	[474.3]	AUC_0-最终	57.9±34.2	156.2±52.9	2420.5±156.0	296.8±203.2	250.3±117.2	537.6±253.7
[ng/ml^*h]	(59.1)	[136.1]	[214.6]	[320.0]	[277.5]	[474.3]	t_1/2[h]	119±133[39.8]	44±9[38.5]	23±8[30]	40±17[62]	51±29[65]	75±28[87]
平均区室药代动力学参数							t_1/2[h]	119±133[39.8]	44±9[38.5]	23±8[30]	40±17[62]	51±29[65]	75±28[87]
平均区室药代动力学参数							Cmax[pg/ml]	877±257[619]	1364±654[1288]	2752±1425[2572]	2656±1529[2557]	2306±971[2116]	3819±1333[3027]
t_max[h]	48±19[65]	72±59[44]	34±16[44]	35±22[44]	47±118[43]	50±18[44]	Cmax[pg/ml]	877±257[619]	1364±654[1288]	2752±1425[2572]	2656±1529[2557]	2306±971[2116]	3819±1333[3027]
t_max[h]	48±19[65]	72±59[44]	34±16[44]	35±22[44]	47±118[43]	50±18[44]	AUC_0-∞	95.2±29.8	149.6±102.4	278.8±189.3	329.6±222.2	290.0±133.4	620.7±269.6
[ng/ml^*h]	[53.2]	[153.9]	[341.3]	[333.0]	[293.5]	[526.2]	AUC_0-∞	95.2±29.8	149.6±102.4	278.8±189.3	329.6±222.2	290.0±133.4	620.7±269.6
[ng/ml^*h]	[53.2]	[153.9]	[341.3]	[333.0]	[293.5]	[526.2]	t_1/2[h]	38±17[27]	38±29[29]	30±22[51]	38±20[47]	39±14[57]	68±40[85]

^*由单个血清分布±标准差[由平均血清分布计算得到]计算

^a使用受试者531和532的基线校正值计算

期望药物的剂量校正Cmax和AUC值依照线形动力学是恒定的。如表7所示，两组剂量校正的参数有很大的差异。在各剂量中无一致的趋势，提示组内的差异可以解释来自与剂量成比例增加的偏差。

表7.由单个平均值和用非区室方法确定值的平均分布计算得到的剂量校正的Cmax和AUC参数

剂量[μg] Cmax[pg/ml] AUC_0-最终[pg/ml^*h]

60 11 964

90 16 1735

120^* 25 2017

150 17 1979

180 13 1390

210 17 2560

平均60 10 986

平均90 12 1512

平均120^* 18 1789

平均150 16 2133

平均180 12 1542

平均210 14 2258

^*使用受试者531和532的基线校正值计算

基线校正的AUC_0-最终和C_max值对体重指数(BMI)作图来测定体重对从皮下注射的药物吸收的潜在效果。结果示于图12A和12B，表明药物吸收与BMI变化无一致的趋势。

平均血清浓度数据配合1-区室模型得到剂量从60到210μg的单剂量皮下给药是合理曲线，如图13所示平均分布。

模拟试验使用从配合曲线到多剂量方案之后的血清药物分布模型计算得到的药代动力学参数。图14A显示了使用从各剂量组计算得到的平均参数模拟每10天给药60μg的给药方案所期望的血清情况。所有的模拟试验使用受试者531和532的基线校正值来计算120μg剂量组的平均参数。总体上，各模拟试验中有良好的一致性。在第一个给药间隔期间达到稳态并且谷水平跌至测定定量限制的300pg/ml以下。基于60μg剂量组的平均数据的模拟试验的峰浓度是由给与150μg PEG-alfacon剂量受试者的平均数据计算得到的模拟试验的峰浓度的约50％。因为在模拟图表中没有明显的与治疗组(剂量)有关的变化，所以差异可归因于治疗组中的易变性。每10天和每7天给药100、150和200μg剂量的额外模拟试验示于图14B-G。这些图谱显示了随着剂量增加所期望的变化模式。将给药间隔缩短至7天有小的效果。

平均血清OAS应答分布示于图15，其中PD应答以从基线的％变化显示。在很多情况中，标准偏差与平均值是可比的，这反映了在每个治疗组中有很大的易变性。

图16显示了PK/PD模型的结果。计算的EC₅₀值(反应导致50％最大效果的药物的浓度)在剂量中变化很大。类似地，如表8所示，计算的Emax值随剂量有很大的差别。

表8

剂量(mcg) Emax(％OAS变化) EC50(pg/ml)

60 313 127

90 7932 27701

120 791 1046

150 470 202

180 717 591

210 441 212

尽管参考实施方案描述了本发明，应该理解的是本领域的技术人员可作出各种变化和等效物可替换而不脱离本发明的真正精神和范围。此外，可以进行许多修改使特定的情况、材料、物质的组合物、方法、方法的步骤或步骤适合于本发明的目的、精神和范围。所有的这些修改均在附属的权利要求范围内。

Claims

1.包含单个CIFN多肽和单个聚乙二醇(PEG)部分的单PEG化的共有干扰素(CIFN)分子，其中，所述PEG部分是线形的、分子量约30kD并直接或间接地通过共价键与CIFN多肽中的赖氨酸残基相连。

2.如权利要求1所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述PEG部分与CIFN多肽表面暴露的赖氨酸残基相连。

3.如权利要求1所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基选自CIFN多肽的lys³¹、lys⁵⁰、lys⁷¹、lys⁸⁴、lys¹²¹、lys¹²²、lys¹³⁴、lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。

4.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys³¹。

5.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys⁵⁰。

6.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys⁷¹。

7.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys⁸⁴。

8.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys¹²¹。

9.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys¹²²。

10.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys¹³⁴。

11.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys¹³⁵。

12.如权利要求3所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述赖氨酸残基是CIFN多肽的lys¹⁶⁵。

13.如权利要求1-12中任一项所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述共价键包括PEG部分的丙酰基和CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键。

14.如权利要求1-13中任一项所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述共价键包括由PEG部分的α-甲氧基、ω-丙酸活化酯和CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成的酰胺键。

15.含有单PEG化的共有干扰素(CIFN)分子群体的组合物，其中，所述群体由两种或多种分子组成，其中每个这样的种类由单个CIFN多肽和单个PEG部分组成，且PEG部分是线形的、分子量约为30kD并直接或间接地通过共价键连接到CIFN多肽的赖氨酸残基或CIFN多肽的N-末端残基，前提是在至少第一个这样的种类中PEG部分与CIFN多肽中的赖氨酸残基共价相连，并且在第二个这样的种类中PEG部分与CIFN多肽中的N-末端残基共价相连。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，在第一个这样种类中PEG部分与CIFN多肽表面暴露的赖氨酸残基共价连接。

17.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述群体由两种或多种单PEG化的CIFN组成，其中的PEG部分与CIFN多肽中的赖氨酸残基相连，前提是在任何这样的种类中连接点的位置不同于在任何其它种类中连接点的位置。

18.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述赖氨酸残基选自CIFN多肽的lys³¹、lys⁵⁰、lys⁷¹、lys⁸⁴、lys¹²¹、lys¹²²、lys¹³⁴、lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。

19.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述在任何这样的种类中的连接点的赖氨酸残基选自CIFN多肽的lys³¹、lys⁵⁰、lys⁷¹、lys⁸⁴、lys¹²¹、lys¹²²、lys¹³⁴、lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。

20.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述在任何这样的种类中的连接点的赖氨酸残基是CIFN多肽表面暴露的赖氨酸残基。

21.如权利要求15-20中任一项所述的组合物，其特征在于，所述在第一个这样的种类中的共价键包括PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰胺键，并且在第二个这样的种类中的共价键包括PEG部分的丙酰基与CIFN多肽中的N-末端氨基酸残基的α-氨基之间的酰胺键。

22.如权利要求15-20中任一项所述的组合物，其特征在于，所述在第一个这样的种类中的共价键包括由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基缩合形成的酰胺键，并且在第二个这样的种类中的共价键包括由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯与CIFN多肽的N-末端残基的α-氨基缩合形成的酰胺键。

23.含有单PEG化的共有干扰素(CIFN)分子群体的组合物，其特征在于，所述群体由两种或多种分子组成，其中每种这样的分子由单个CIFN多肽和单个PEG部分组成，并且PEG部分是线形的、分子量约为30kD且直接或间接地通过共价键与CIFN多肽中的赖氨酸残基相连，前提是任何这样的种类中的连接点的位置与在任何其它这样的种类中连接点的位置不相同。

24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述任何这样的种类中连接点的赖氨酸残基选自CIFN多肽的lys³¹、lys⁵⁰、lys⁷¹、lys⁸⁴、lys¹²¹、lys¹²²、lys¹³⁴、lys¹³⁵和lys¹⁶⁵。

25.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述任何这样的种类中连接点的赖氨酸残基是CIFN多肽表面暴露的赖氨酸残基。

26.如权利要求15-25中任一项所述的组合物，其特征在于，所述CIFN多肽是干扰素α-con1。

27.如权利要求1-14中任一项所述的单PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述CIFN多肽是干扰素α-con1。

28.由下述方法生产的产品：

(a)使共有干扰素(CIFN)与线形、分子量约为30kD的α-甲氧基、ω-丙酰基聚乙二醇的琥珀酰亚胺酯(mPEGspa)以CIFN：mPEGspa的摩尔比约为1∶1到1∶5，于pH约7到9进行反应；和

(b)回收步骤(a)的单PEG化的反应产物。

29.如权利要求28所述的产品，其特征在于，所述步骤(a)中CIFN：mPEGspa的比值约为1∶3，pH约为8。

30.如权利要求28所述的产品，其特征在于，所述步骤(a)中CIFN：mPEGspa的比值约为1∶2，pH约为8.0。