RU2575796C9 - Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение - Google Patents
Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575796C9 RU2575796C9 RU2013119183/10A RU2013119183A RU2575796C9 RU 2575796 C9 RU2575796 C9 RU 2575796C9 RU 2013119183/10 A RU2013119183/10 A RU 2013119183/10A RU 2013119183 A RU2013119183 A RU 2013119183A RU 2575796 C9 RU2575796 C9 RU 2575796C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ifn
- polyethylene glycol
- interferon
- peg20
- variant
- Prior art date
Links
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 68
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims abstract description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 66
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 14
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 12
- 108010068999 PEG-IFN-SA Proteins 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 9
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 8
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N propionic aldehyde Chemical group CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 6
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N Sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 5
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 claims description 4
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 claims description 4
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 1-butanal Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- -1 pentanal monomethylene glycol Chemical compound 0.000 claims description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims 1
- 239000005426 pharmaceutical component Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 48
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 52
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 51
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 21
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 12
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 12
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 9
- 229940090438 Infergen Drugs 0.000 description 8
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 6
- 101700052274 HBEAG Proteins 0.000 description 5
- 208000002672 Hepatitis B Diseases 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 4
- 229940002988 Pegasys Drugs 0.000 description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 4
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000002390 hyperplastic Effects 0.000 description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 230000037217 Elimination half-life Effects 0.000 description 3
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 101700046422 IFNA Proteins 0.000 description 3
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 3
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 230000000275 pharmacokinetic Effects 0.000 description 3
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 4-amino-1-[(2R,5S)-2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl]-1,2-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 206010001019 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 229960001627 Lamivudine Drugs 0.000 description 2
- 208000005749 Leukemia, Promyelocytic, Acute Diseases 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- 229960000329 Ribavirin Drugs 0.000 description 2
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 101710017807 his-44 Proteins 0.000 description 2
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 230000036868 Blood Concentration Effects 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101700036312 CONA Proteins 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000006154 Chronic Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 230000037250 Clearance Effects 0.000 description 1
- 229940121657 Clinical Drug Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 210000003194 Forelimb Anatomy 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 108009000423 Hepatitis B infection Proteins 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 101700070228 IFN Proteins 0.000 description 1
- 101700066403 IFNA1 Proteins 0.000 description 1
- 102100008765 IFNA1 Human genes 0.000 description 1
- 101700011451 IFNB1 Proteins 0.000 description 1
- 102100015720 IFNB1 Human genes 0.000 description 1
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 1
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 1
- 101700023446 IFNT Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940047124 Interferons Drugs 0.000 description 1
- 208000008456 Leukemia, Myelogenous, Chronic, BCR-ABL Positive Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 210000004693 NK cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 229940106366 Pegintron Drugs 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 230000036045 Renal clearance Effects 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N carbodiimide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 201000006934 chronic myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 230000035512 clearance Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940000425 combination drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- WEMXGZLXCDDUSY-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;pyrrole-2,5-dione Chemical compound OCCO.O=C1NC(=O)C=C1 WEMXGZLXCDDUSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000004904 long-term response Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000003176 severe acute respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000004905 short-term response Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить лекарственный препарат против HBV на основе интерферона, в котором активированная молекула ПЭГ через короткий линкер присоединена к α-аминогруппе глицина на N-конце варианта рекомбинантного консенсусного интерферона. Изобретение позволяет получить лекарственный препарат против HBV с повышенной растворимостью в воде и сниженной токсичностью и иммуногенностью по сравнению с природным интерфероном. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 12 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к областям биотехнологии и фармацевтики, в частности относится к пегилированному конъюгату варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способам его получения, и применению. Настоящее изобретение является продолжением патента на изобретение под названием “Производное человеческого α-интерферона с противовирусной активностью” (№ патента ZL01102915.3).
Предшествующий уровень техники
Еще в 1957 году Issacs и др. открыли фактор, вырабатываемый при вирусной инфекции для сопротивления инфекции вирусом и препятствования размножению вируса, который назвали интерфероном (IFN). Интерфероны являются группой гликопротеинов, вырабатываемых посредством экспрессии генома пермиссивной клетки после воздействия на пермиссивную клетку инактивированного или активного вируса. Активность и антигенность молекул зависят от белка и не связаны с гликозильной группой. На основе источника и структуры IFN классифицируют на IFN-α, IFN-β и IFN-γ, которые продуцируются лейкоцитами, фибробластами и активированными Т-клетками. IFN-α является мультифакторным продуктом с более 10 подтипами, которые обладают практически одинаковой биологической активностью. В дополнение к осуществлению противовирусной функции IFN обладает функциями противоопухолевой активности, иммунной регуляции и контроля пролиферации клеток, повышения температуры тела и т.д. Большая часть лекарственных препаратов, которые применяются в клинической практике, получена посредством генетической рекомбинации.
IFN является лекарственным препаратом первой линии лечения с клинически подтвержденной эффективностью применительно к хроническому вирусному гепатиту. Включаются те, которые имеют природные структуры, в том числе IFNα-2a и IFNα-2b. Оба из них являются интерфероном с краткосрочными эффектами, характеризующимся коротким периодом полувыведения (4~16 часов), а концентрация в сыворотке понижается через 24 часа после инъекции. Фармакокинетический процесс в организме человека влияет на долгосрочные эффекты, эффекты лечения в отношении противовирусного лечения. На основе 3~6 млн Ед./кг и введения 3 раза в неделю in vivo уровень интерферона наблюдается в виде обычной “кривой пик-впадина”. Значительное колебание уровня интерферона в сыворотке делает возможным восстановление уровня вируса и приводит к устойчивости к лекарственному средству со снижением эффектов лечения. При этом интерферон с краткосрочными эффектами характеризуется сильными неблагоприятными эффектами, плохой переносимостью организмом человека на основе долгосрочных эффектов, сильной иммуногенностью и другими недостатками. Следовательно, интерферон с краткосрочными эффектами модифицируют для продления периода полувыведения из организма человека, поддержания стабильности концентрации в крови в организме человека, улучшения эффективности лечения вирусного гепатита и ослабления побочных эффектов.
Полиэтиленгликоль (PEG) представляет собой вид полимера, который является безопасным, нетоксичным и неактивным и обычно применяется для модификации белковых лекарственных препаратов. После модификации белок становится устойчивым к ферментативному гидролизу, имеет повышенную растворимость в воде и сниженную иммуногенность и токсичность (Inada et al., J. Bioact. And Compatible Polymers, 5:343(1990). Delgalo et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems, 9:249 (1992) katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91(1993)). В патентах Китая, выданных Hoffman La Roche, ZL93116479.6 и ZL97105433.9 раскрывается получение рекомбинантного PEG-интерферона, а в патенте Китая, выданном Schering Company, с номером 200580032850.2 раскрывается получение реагента для стабильного PEG-интерферона. В настоящее время существуют два вида человеческого α-интерферона, модифицированного при помощи PEG (PEGASYS от Hoffman La Roche и PEGINTRON от Schering), которые применяют для лечения хронического гепатита C и гепатита B. После пегилирования обоих скорость почечного клиренса снижалась при продленном периоде полувыведения (30~16 часов) и сниженной иммуногенности, причем необходимым является только одно введение каждую неделю. Они намного превосходят краткосрочные эффекты применительно к клиренсу вируса HCV/HBV. Показатель ближнесрочной реакции применительно к лечению гепатита C (РНК HCV) достигает 69%, а показатель продолжительного ответа достигает 39%, причем в отношении обычного интерферона он составляет только 7%. Отрицательный показатель после лечения гепатита HBeAg достигает 37%, комплексный показатель ответа (а именно: HBeAg-отрицательный, ингибирование ДНК HBV и нормализация ALT) составляет 35%, и 61% пациентов являются HBV-ДНК-отрицательными (<400 копий/мл), а 7% пациентов являются HbsAg-отрицательными. После лечения гепатита при помощи обычного интерферона 3 показателя составляют только (15%, 25% и 12%). Не наблюдали HBsAg-отрицательных пациентов (Reddy KR et al. Hepatology, 2001,33:433-438. Jessner W. et al. J Viral Hepat.2003, 10:37-42. Shiffman ML et al. Hepatology, 2004; 40(4, suppl 1):314A. Davis GL et al. Hepatology, 2003;38:645-52. Janssen HL et al. lancet, 2005; 365:123-129. Cooksley WG et al. J Viral Hepat, 2003; 10:298-305.).
Точкой модификации рекомбинантного человеческого α-интерферона 2a (PEGASYS), модифицированного при помощи PEG, является лизин, а точкой модификации рекомбинантного человеческого α-интерферона 2b (PEG-Intron), модифицированного при помощи PEG, является гистидин. Как описано в документах (Miller DL et al. Science, 1982, 215:689-690; Radhakrishnan R. et al. Structure, 1996; 4(12): 1453-1463; Karpusas M. et al. Proc. Natl. Acad. sci. USA 1997, 94:11813-11818), зоны образования соединения IFN-α с рецепторами включают AB-петлю (Arg22, leu26, Phe27, leu30, lys31, Arg33, His34), спираль B (Ser68), спираль C (Thr79, lys83, Tyr85, Tyr89), спираль D (Arg120, lys121, Gln124, lys131, Glu132) и спираль E (Arg144, Glu146). Лизин, модифицированный в PEGASYS, и гистидин, модифицированный в PEG-Intron, находятся в пределах рецепторных зон, неблагоприятных в отношении соединения интерферона и рецепторов. Помимо того, конечный продукт, модифицированный при помощи PEG, модифицируют в одной точке исходя из отсутствия специфики. К примеру, PEGASYS представляет собой смесь, модифицированную в основном по Lys131 (7 точек модификации), а PEG-Intron представляет собой смесь, модифицированную в основном по His34 (4 точки модификации).
Посредством модификации при помощи PEG в одной точке воплощается однородность молекулярного веса и структуры для повышения биологической активности и безопасности in vivo. Применяли несколько подходов для воплощения специфики модификации интерферона в одной точке при помощи PEG. (1) В WO 2006/004959 раскрывается способ со спецификой связывания аминокислотной последовательности IFNα-1b с PEG-малеимидом и его продуктами по 86-му свободному цистеину (Cys86); (2) в WO 2008/074230 раскрывается IFNα с 85-й или 86-й аминокислотой, мутированной в Cys, а EG-малеимид (этиленгликоль-малеимид) применяют для модификации со спецификой в фиксированной точке; (3) PEG со спецификой по N-концу, связанный с активной группой, применяют для модификации N-конца интерферона (например, патенты Китая CN1229388C, CN100478359C и CN101381409A).
Модифицированный PEG на N-конце находится на большом расстоянии от зоны соединения интерферона с рецепторами, что обеспечивает анализ идеальной точки модификации в структуре. Однако в 1-м положении на N-конце природного α-интерферона находится цистеин, который образует пару дисульфидных связей с цистеином в 99-м положении (дисульфидная связь является крайне важной для биологической активности). Модификация при помощи PEG в фиксированной точке применяется по отношению к N-концу α-интерферона, при этом с низкой степенью модификации и значительной биологической активностью.
Для улучшения активности природного интерферона в America Amgen Company синтезировали искусственный интерферон с наименованием продукта INFERGEN. INFERGEN является искусственным рекомбинантным α-интерфероном, оптимизированным и объединенным с помощью компьютера, причем его последовательность составлена из 20 видов подтипов природного α-интерферона посредством оптимизации группирования, а его противовирусная активность увеличивается в 5~10 раз по сравнению с таковой природного интерферона. В 1997 году FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США) одобрило INFERGEN для лечения гепатита C, а результаты исследования указывают на то, что эффекты лечения намного превосходят таковые обычного интерферона. В патентах США US4695623, US4897471 и US5372808 раскрывается, что консенсусный интерферон обладает широким спектром интерфероновой активности, причем характеризуется относительно сильными противовирусной, противоопухолевой активностями и активацией NK-клеток. Однако так же, как и природный α-интерферон, INFERGEN имеет недостатки, заключающиеся в слабой стабильности, коротком in vivo периоде полувыведения и сильной иммуногенности. При этом в 1-м положении на N-конце природного α-интерферона находится цистеин, который образует пару дисульфидных связей с цистеином в 99-м положении, что не позволяет эффективно модифицировать N-конец. Несмотря на то что в патенте США US005985265 A, выданном Amgen Company, раскрывается подход к модификации N-конца белка INFERGEN, степень модификации и биологическая активность после модификации намного ниже по сравнению с модификацией N-конца другого белка (рекомбинантного колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека G-CSF и рекомбинантного гормона роста человека GH и т.д.).
Для осуществления модификации N-конца интерферона и исходя из принципа максимума последовательности из одного и того же источника, изобретатель сконструировал совершенно новую последовательность интерферона, именуемого (суперпротивовирусным интерфероном, кратко называемым IFN-SA) и переименованного в вариант рекомбинантного консенсусного интерферона в соответствии с принципом присвоения названий интерферону. Содержит 171 аминокислоту, причем на N-конец вводятся последовательности из пяти аминогрупп Gly Ser Gly Gly Gly и осуществляется модификация в фиксированной точке на N-конце. Структура отличается от таковой INFERGEN, а in vitro противовирусная активность увеличилась на 50%. Новая структура и ее рекомбинантное получение, а также применение против вирусных заболеваний были запатентованы в качестве изобретения в Китае, номер патента ZL01102915.3.
Настоящее изобретение предоставляет способ получения и применение полиэтиленгликолевого конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (IFN-SA) (кратко называемого PEG-IFN-SA). В настоящем изобретении выбирают PEG-ALD, 20 кДа, с группой пропионового альдегида, связанной с аминокислотой со спецификой по N-концу, в качестве модификатора для модификации при условиях pH 4,5~6 и получают пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного интерферона (PEG-IFN-SA). При помощи этого способа получения химический модификатор одной точки по отношению к N-концу повышает стабильность белка, продлевает период полувыведения и снижает иммуногенность и побочные эффекты и т.д. Ожидается, что это будет лекарственный препарат для долгосрочных эффектов интерферона в отношении предупреждения и лечения вирусного инфекционного заболевания, гиперпластических заболеваний, повышения иммунитета и т. д.
Описание изобретения
Настоящее изобретение предоставляет способ получения полиэтиленгликолевого конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (IFN-SA) с химической модификацией в фиксированной точке по отношению к N-концу. Конъюгат характеризуется хорошей стабильностью, длительным периодом полувыведения, сниженными иммуногенностью и неблагоприятными эффектами и применяется для получения лекарственного препарата для предупреждения и лечения вирусного инфекционного заболевания, гиперпластических заболеваний, повышения иммунитета и т.д.
Настоящее изобретение относится к виду полиэтиленгликолевого конъюгата химически модифицированного IFN-SA.
IFN-SA является вариантом рекомбинантного консенсусного интерферона, отличающимся аминокислотной последовательностью указанного IFN-SA, представленной в SEQ ID No: 1:
Полиэтиленгликолевый конъюгат IFN-SA характеризуется тем, что полиэтиленгликолевое производное-модификатор соединено с α-аминогруппой на N-конце производного варианта рекомбинантного интерферона при помощи амидной связи.
Указанное полиэтиленгликолевое производное-модификатор характеризуется активацией при помощи альдегидной группы на одном конце полиэтиленгликолевого производного-модификатора, а другой конец полиэтиленгликолевого производного представляет собой монометокси.
Монометоксиполиэтиленгликоль с активацией при помощи альдегидной группы характеризуется тем, что включает без ограничения пропионовый альдегид монометоксиполиэтиленгликоля (mPEG-ALD), масляный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля, уксусный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля и пентаналь монометоксиполиэтиленгликоля. Предпочтительным является пропионовый альдегид монометоксиполиэтиленгликоля (mPEG-ALD). В зависимости от степени связывания молекула полиэтиленгликоля может быть любой молекулой с молекулярным весом, находящимся в диапазоне 10 кДа~40 кДа, а предпочтительный молекулярный вес молекулы полиэтиленгликоля равен 20 кДа. Молекула полиэтиленгликоля может быть с прямой цепью или с разветвленными вариантами и может быть с одной цепью, с двумя цепями или с несколькими цепями. Предпочтительной является одноцепочечная молекула полиэтиленгликоля с прямой цепью.
Настоящее изобретение предоставляет способ получения полиэтиленгликолевого конъюгата IFN-SA. Специалист в соответствующей области может выбрать тип структуры, молекулярный вес и необходимый расход полиэтиленгликоля. В соответствии со способом получения, предоставленным в данной заявке, в зависимости от структуры и свойств белковой молекулы после модификации осуществляется модификация кислотности-основности, реакционной системы и молярного соотношения полиэтиленгликоля.
Объясняется способ получения конъюгата, принимая IFN-SA, модифицированный в фиксированной точке на N-конце при помощи mPEG, 20 кДа, в качестве предпочтительного.
Что касается получения IFN-SA, смотри патент ZL01102915.3.
Как известно в данной области техники, при условиях в присутствии цианоборгидрида натрия PEG с альдегидной группой реагирует с первичным амином в реакциях восстановительного аминирования. Альдегидная группа отличается от другой электрофильной активной группы лишь тем, что реагирует с цианамидом. Хотя активность альдегидной группы ниже, чем реакционная активность NHS, необходимыми являются лишь мягкие условия реакции, легко обеспечивающие соединение PEG с поверхностями белка или других материалов. Следовательно, при низких значениях pH mPEG-альдегид селективно реагирует с N-концом белка. Условия реакции являются следующими: значение pH 4,0~7,0, содержание соли в буферной системе 10~100 ммоль/л и температура 4~25°С, причем время реакции составляет 1~72 часа, а молярное соотношение в реакции PEG:белок составляет 1:2~1:10. При обычных условиях продукт модификации N-конца, полученный при низкой температуре, низком pH и времени реакции, обеспечивается с большой однородностью и высокой степенью превращения в реакции.
Методика получения указанного конъюгата описывается в настоящем изобретении, причем добавляется раствор IFN-SA в фосфатном буфере и mPEG-ButyrALD, 20 кДа, к 20 мМ цианоборгидрида натрия для осуществления реакции, применяются обычные способы для разделения и очистки, фильтрации, стерилизации и получения конъюгата IFN-SA по настоящему изобретению. Предпочтительный фосфатный буферный раствор характеризуется pH 4,0-6,0, концентрацией 50-100 ммоль/л, предпочтительной температурой 4-10°С, причем время реакции составляет 24~48 часов, молярное соотношение в реакции PEG:IFN-SA составляет 1:2~1:5, а степень модификации достигает более 50%. Выбор условий модификации и подходы к модификации подробно описываются в примере.
Способ очистки конъюгата по настоящему изобретению: образец после осуществления реакции IFN-SA и полиэтиленгликоля диализируют при помощи 5xDDW и загружают в SP Sepharose F.F. После уравновешивания с помощью 10 мM уксусной кислоты - ацетата натрия (pH 5,5) и уравновешивания раствора осуществляют элюирование с помощью ионов соли 1M NaCl и тестирование чистоты прошедших и элюированных образцов при помощи электрофореза и RP-HPLC (обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии). Соединения с полиэтиленгликолем удаляют из высокомолекулярного полимера при помощи молекулярного сита Superdex75 (или Sephacryl S-200), при условиях 10 мМ PB, pH 7,4. Качественные подходы на основе структуры и массы включают масс-спектрометрию, пептидное картирование при помощи масс-спектрометрии, RP-HPLC, Gel-HPLC (ВЭЖХ с гель-фильтрацией) и SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия).
Молекулу полиэтиленгликоля (ALD-mPEG20K) с активацией при помощи пропионового альдегида и молекулярным весом 20 кДа применяют в качестве модификатора. На протяжении по меньшей мере 10 серий экспериментов в лабораторном масштабе можно получить более 1 г полиэтиленгликолевого конъюгата IFN-SA с чистотой более 95% (код: PEG20-IFN-SA), степенью модификации приблизительно 50%, причем для соединений, немодифицированных по N-концу, она составляет менее 3%, а степень противовирусной активности составляет ≥1,2x10 7 МЕ/мг. При помощи фармакокинетики показано, что период полувыведения у яванского макака равен 34,5 часа, причем он намного более длительный, чем период полувыведения IFN-SA, равный 3 часа. При помощи токсичности у яванского макака в течение 6 месяцев показано, что иммуногенность намного ниже, чем IFN-SA. В условиях водного раствора и при температуре 4°С конъюгат может быть стабильным в течение 24 месяцев. Следовательно, полиэтиленгликолевый конъюгат IFN-SA, описанный в настоящем изобретении, характеризуется долгосрочными эффектами, стабильностью и низкой иммуногенностью.
В соответствии с описанным способом получения выбирается масляный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля, 10 кДа, и связывается с аминогруппой на N-конце IFN-SA с получением PEG10-IFN-SA. Выбирается PEG-NHS, 40 кДа, и связывается с аминогруппой на N-конце IFN-SA с получением PEG40-IFN-SA. In vitro противовирусная активность PEG10-IFN-SA должна составлять ≥7,0x107 Ед./мг, при этом период полувыведения равен 15,3 часа. In vitro противовирусная активность PEG40-IFN-SA составляет ≥4,0x106 Ед./мг, при этом период полувыведения равен 42,29 часа. При увеличении молекулярного веса PEG для связывания период полувыведения продлевается, а in vitro противовирусная активность намного понижается. В настоящем изобретении установлено, что влияния PEG с прямой цепью на in vitro активность IFN-SA намного меньше, чем модификации при помощи PEG с разветвленной цепью. Следовательно, модификация IFN-SA при помощи связывания с одноцепочечной PEG с прямой цепью, 20 кДа, является предпочтительной.
PEG-IFN-SA, производимый в соответствии с описанными выше способами, получают в виде раствора для инъекций или лиофилизированного порошка для инъекций, мази, эмульсии или аэрозоля для наружного применения, и таблетки для растворения в щечном кармане, капсулы и таблетки для перорального применения при помощи соответствующей методики получения.
Другой характеристикой полиэтиленгликолевого конъюгата IFN-SA является то, что конъюгат получают в виде комбинации с лекарственным препаратом для клинического лечения, эффективной дозой любого конъюгата и разбавителем, вспомогательным средством или носителем для применения лекарственного препарата.
Настоящее изобретение относится к молекуле PEG-IFN-SA, которая применительно к клиническому лекарственному препарату является эффективной в композиции фармацевтического препарата, а фармацевтический препарат включает без ограничения: разбавитель, стабилизатор, консервант, растворяющее средство, эмульгатор, вспомогательное средство, носитель и т.д. 1) Разбавление раствора: фосфатный, ацетатный, цитратный и другие буферные растворы; 2) значение pH и ионная сила; 3) детергент, агент, вызывающий диссоциацию комплексов: сорбит, Tween-20, Tween-80; 4) наполнители: сорбит, глюкоза, сахароза, маннит и глицерин. 10 мM PB (pH 7,2), сорбит и Tween-80 являются предпочтительными для фармацевтического препарата PEG-IFN-SA. Эффективная доза эффективной композиции относится к эффективной дозе для лечения или предупреждения с учетом фактора наблюдаемого молекулярного веса и веса пациента, и других факторов. Эффективная доза согласно настоящему изобретению составляет 0,5 мкг~9 мкг/кг за один раз.
Способом введения фармацевтического лекарственного препарата PEG-IFN-SA является парентеральное введение, в том числе без ограничения подкожная инъекция, внутримышечная инъекция, внутривенная инъекция, люмбальная инъекция, ингаляция, подъязычное или трансдермальное введение. Цикл введения представляет собой один раз в 3~14 дней.
В настоящем изобретении раскрываются способы применения IFN-SA и полиэтиленгликолевого конъюгата для предупреждения и лечения вирусных инфекционных заболеваний, гиперпластических заболеваний, усиления иммунитета и предупреждения и лечения других заболеваний.
В одном варианте осуществления характеристика указанной вирусной инфекции включает без ограничения инфекцию вирусом гепатита, инфекцию папилломавирусом человека, инфекцию вирусом простого герпеса, инфекцию вирусом иммунодефицита человека, инфекцию вирусом EB, инфекцию SARS и инфекцию вирусом гриппа. Характеристика указанной инфекции вирусом гепатита включает без ограничения инфекцию вирусом гепатита C, вирусом гепатита B, вирусом гепатита A, вирусом гепатита D и вирусом гепатита E. Предпочтительными являются инфекции вирусом гепатита C и вирусом гепатита B.
В другом варианте осуществления указанные гиперпластические заболевания характеризуются тем, что включают без ограничения доброкачественную опухоль и злокачественную опухоль. Злокачественная опухоль включает без ограничения хронический миелоидный лейкоз, опухоль меланинобразующей ткани, рак почки и рак печени.
Также предлагается введение комбинированного лекарственного препарата, включая без ограничения рибавирин и ламивудин. При применении полученных противовирусных лекарственных препаратов широкого спектра против вируса гепатита C ингибируется синтез ДНК и РНК вируса, например, при комбинированном введении с рибавирином; при этом против вируса гепатита B обеспечивается применение с нуклеозидным противовирусным лекарственным препаратом, например комбинированное введение с ламивудином; для лечения злокачественной опухоли применяется вместе с другими лекарственными препаратами для лечения при помощи других химических веществ.
Предоставлено подробное описание изобретения, которое является хорошо понятным с учетом примеров, приведенных ниже. Примеры, описанные в данном документе, используются для объяснения, а не для ограничения настоящего изобретения.
Описание прилагаемых графических материалов
Прилагаемая фигура 1: фигура SDS-PAGE электрофореза применительно к реакции модификации при молярном соотношении IFN-SA и PEG, 1: соотношение 1:2 и 2: соотношение 1:3.
Прилагаемая фигура 2: фигура SDS-PAGE электрофореза перед и после модификации IFN-SA; из них: 1: IFN-SA перед модификацией, 2: продукты после модификации, 3: PEG20-IFN-SA после очистки; M: стандарт молекулярного веса белка.
Соотношение: 3: соотношение 1:4, 4: соотношение 1:5, 5: соотношение 1:6, M представляет собой стандарт молекулярного веса белка.
Прилагаемая фигура 3: фигура SDS-PAGE электрофореза IFN-SA, модифицированного при помощи PEG с различным молекулярным весом; M представляет собой маркер, 1 представляет собой PEG10K-IFN-SA, 2 представляет собой PEG20K-IFN-SA, а 3 представляет собой PEG40K-IFN-SA. На фигуре пегилированный белок IFN-SA, расположенный 3-им, имеет размер больше теоретического значения вследствие низкой скорости миграции.
Прилагаемая фигура 4: фигура RP-HPLC хроматограммы PEG20-IFN-SA; причем на фигуре PEG20-IFN-SA представлен в форме отдельного пика поглощения, при этом чистота составляет 98,7%.
Прилагаемая фигура 5: фигура редукционного анализа масс-спектрометрии после ферментативного расщепления трипсином PEG20-IFN-SA и IFN-SA; причем фигура A представляет собой фигуру, на которой представлен пептид IFN-SA, а фигура B представляет собой фигуру, на которой представлен пептид PEG20-IFN-SA. Между ними существует только различие по пикам пептидов. Сведения, которые касаются анализа различий, смотри в примере 3.
Прилагаемая фигура 6: кривая in vivo противовирусной биологической активности в зависимости от времени после дозирований (10 мкг/кг, 30 мкг/кг и 90 мкг/кг) посредством подкожной инъекции PEG20-IFN-SA; при этом ● представляет собой 10 мкг/кг, ○ представляет собой 30 мкг/кг и ▲ представляет собой 90 мкг/кг. По оси абсцисс отложено время (часы), а по оси ординат отложены единицы противовирусной активности в каждом мл крови (МЕ/мл).
Описание предпочтительных вариантов осуществления
Пример 1. Условия модификации варианта рекомбинантного консенсусного интерферона PEG20-IFN-SA
Раствор IFN-SA (концентрация 10 мг/мл, буфер 100 мM PB, pH 7,0) получен Chongqing Fujin Biology Medicine Co., Ltd., mPEG-ButyrALD-20 кДа (чистота >95%, относительный молекулярный вес 20x103), приобрели от Beijing Jiankai Science & Technology Co., Ltd. раствор цианоборгидрида натрия (NaBH3(CN), причем то, что находится в скобках, не является тем же, что и описание за скобками), приобрели от Sigma Company, соответствующие реактивы и растворы для SDS-PAGE, а также для анализа чистоты являются продуктами Shanghai Sangon. Магнитные мешалки с постоянной температурой (Jiangsu Zhongda Instrument Plant), прибор для электрофореза, SP Sepharose F.F., молекулярное сито Superdex75, хроматографическая система AKTA Explore и SDS-PAGE являются продуктами Pharmacia.
1. Влияния значения pH реакции на модификацию продуктов
Раствор IFN-SA получают с концентрацией 2 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB (pH 4,0, pH 5,0 и pH 5,5). Отбирают по 1 образцу каждого и добавляют к 1 моль/л исходному раствору NaBH3(CN) до конечной концентрации 20 ммоль/л. Взвешивают mPEG-ButyrALD-20 кДа в соответствии с молярным соотношением 1:4 (IFN-SA: mPEG-ButyrALD-20 кДа), добавляют в реакционный раствор IFN-SA при температуре 4°С, перемешивают при 100 об/мин и осуществляют реакцию в течение 24 часов. Осуществляют SDS-PAGE электрофорез образца и определяют степень модификации PEG20-IFN-SA.
Результаты эксперимента указывают на то, что в условиях pH 4,0, 5,0 и 5,5 показатели PEG1-IFN-SA составляют 18%, 31% и 40%. Степень модификации при pH 4,0 является минимальной, а степень модификации при pH 5,5 является максимальной.
2. Влияние на модификацию продуктов соотношения IFN-SA к PEG при модификации
Раствор IFN-SA получают с концентрацией 2 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB, pH 5,5. Добавляют 1 моль/л исходный раствор NaBH3(CN) до конечной концентрации 20 ммоль/л. Отмеряют mPEG-ButyrALD-20 кДа в соответствии с молярным соотношением IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа A (1:2), B (1:3), C (1:4), D (1:5) и E (1:6). Перемешивают при температуре 4°С и 100 об/мин и осуществляют реакцию в течение 24 часов, осуществляют SDS-PAGE электрофорез образца и определяют степень модификации PEG20-IFN-SA.
Результаты эксперимента указывают на то, что если молярные соотношения IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа составляют A (1:2), B (1:3), C (1:4), D (1:5) и E (1:6), то показатели PEG1-IFN-SA составляют 18%, 27%, 39%, 40% и 41% (фигура 1). Если молярное соотношение PEG к модифицированному продукту достигает 1:4, то степень модификации не увеличивается, а реакция приводит к увеличению количества полимера, модифицированного при помощи PEG.
3. Влияния температуры и времени на модификацию продуктов
Раствор IFN-SA получают с концентрацией 2 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB, pH 5,5. Добавляют 1 моль/л NaBH3(CN) до конечной концентрации 20 ммоль/л. При массовом соотношении IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа 1:4 осуществляют реакцию в течение 48 часов при температуре 4°С и в течение 24 часов при температуре 25°С. Осуществляют SDS-PAGE электрофорез соответствующих образцов и определяют модификацию PEG20-IFN-SA. Результаты эксперимента указывают на то, что при температуре 4°С путем продления времени реакции достигают степени модификации, наблюдаемой при температуре 25°С. Однако модификация при температуре 4°С является более преимущественной в отношении активности и структуры IFN-SA.
4. Влияния IFN-SA на модификацию продуктов
Раствор IFN-SA получают с концентрацией 1,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл, 4,0 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB, pH 5,5; в общей сложности 4 образца. Добавляют в mPEG-ButyrALD-20 кДа в соответствии с массовым соотношением IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа 1:4, перемешивают при температуре 4°С и скорости вращения 100 об/мин и осуществляют реакцию в течение 24 часов, осуществляют SDS-PAGE электрофорез для анализа соответствующих образцов и определяют степень модификации PEG20-IFN-SA.
Результаты эксперимента указывают на то, что если концентрации IFN-SA составляют 1,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл и 4,0 мг/мл, то показатели PEG20-IFN-SA составляют 28%, 40%, 45% и 48%. При повышении концентрации белка модификация PEG20-IFN-SA увеличивается, и подходящей концентрацией является 3,0~4,0 мг/мл.
Пример 2. Разделение и очистка варианта рекомбинантного консенсусного интерферона PEG20-IFN-SA
Образец PEG-IFN-SA после модификации подвергают диализу при помощи 5xDDW, а после диализа образец загружают в хроматографическую колонку SP Sepharose F.F. Уравновешивают хроматографическую колонку SP Sepharose F.F при помощи буфера A (уравновешивают 10 мМ уксусной кислотой - ацетатом натрия, pH 5,5) и загружают образец. Элюируют с осуществлением элюирования 1 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,15 M NaCl, pH 5,5), элюирования 2 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,2 M NaCl, pH 5,5), элюирования 3 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,25 M NaCl, pH 5,5), элюирования 4 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,35 M NaCl, pH 5,5) и элюирования 5 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,45 M NaCl, pH 5,5), получают пик прохождения и пик элюирования, осуществляют SDS-PAGE электрофорез для анализа образца. Отбирают образец PEG-IFN-SA после хроматографии на SP Sepharose F.F и очистки и загружают на молекулярное сито Superdex 75. Молекулярное сито для гель-фильтрации Superdex 75 уравновешивают при помощи 10 ммоль/л PB, pH 7,4. После уравновешивания загружают образцы, разделяют при помощи 10 ммоль/л PB, pH 7,4, при постоянном градиенте и получают основной пик, включающий PEG20-IFN-SA. Отбирают образец для осуществления анализа при помощи SDS-PAGE электрофореза (см. фигуру 2).
Результаты эксперимента указывают на то, что при помощи колонок SP Sepharose и Superdex G75 осуществляется разделение IFN-SA, модифицированного при помощи 1 PEG и модифицированного при помощи 2 PEG, и отдельного IFN-SA.
Пример 3. Полиэтиленгликоли, 10 кДа и 40 кДа, для модификации варианта рекомбинантного консенсусного интерферона
Соответственно, выбирают масляный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля, 10 кДа, и пропионовый альдегид монометоксиполиэтиленгликоля с разветвленной цепью, 40 кДа (продукты Beijing Jiankai Biology Company), для модификации со спецификой в одной точке по N-концу IFN-SA при помощи способов, описанных в примере 1 и примере 2, и получения PEG10-IFN-SA и PEG40-IFN-SA (см. фигуру 3).
Пример 4. Физические и химические свойства пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (PEG20-IFN-SA)
1. Чистота
Колонка для анализа при помощи анализирующей RP-HPLC представляет собой C18 (Waters Symmestry), при этом жидкость A подвижной фазы (0,1% TFA, 5% ацетонитрил) и жидкость B подвижной фазы (0,1% TFA, 95% ацетонитрил). Загруженный объем равен 20 мкл, скорость потока равна 1 мл/мин, градиент элюирования за 70 мин (количество жидкости A уменьшается от 100% до 30%, а количество жидкости B увеличивается от 0% до 70%), и длина волны при тестировании равна 214 нм. Результаты эксперимента указывают на то, что чистота PEG20-IFN-SA достигает более 95% (фигура 4).
2. Определение точек модификации PEG20-IFN-SA
Аминокислотная последовательность на N-конце PEG20-IFN-SA, определенная Proteome Analysis Center of Shanghai Institute for Biological Sciences of China Academy of Sciences (Центр протеомного анализа Шанхайского института биологических наук Китайской академии наук) при помощи оборудования для аминокислотного анализа, представляет собой SGG GCD LPQ THS LGN. Gly, находившийся в 1-м положении на N-конце до модификации, не обнаружили, что доказывает то, что точка была модифицирована при помощи PEG.
3. Анализ однородности точек модификации PEG20-IFN-SA
Модификацию продукта mPEG-ALD осуществляют исключительно по аминогруппе на N-конце. Однако в присутствии цианоборгидрида натрия вследствие различных условий модификации при помощи mPEG-ALD осуществляется модификация остатка лизина по ε-NH2. Чтобы доказать, что в PEG20-IFN-SA при помощи PEG модифицирован только N-конец, выбирают исключающий частичный ферментативный гидролиз при помощи трипсина (Sigma Company, протеомный класс) пептидной связи лизина и аргинина на C-конце, на который оказывает влияние пространственное стерическое препятствие, при этом точка после модификации лизина в этом положении при помощи PEG не распознается трипсином и не расщепляется при помощи фермента. Сравнивают фигуры масс-спектрометрии пептидов из IFN-SA до и после модификации и получают однородность модификации при помощи PEG на N-конце образца.
Лиофилизируют и обессоливают IFN-SA и PEG20-IFN-SA, и растворяют до концентрации 2 мг/мл при помощи 1% NH4HCO3. Отбирают 0,9 мл каждого продукта, добавляют 50 мкл бычьего трипсина (массовое соотношение 1:50), после осуществления реакции в течение 24 часов при температуре 37°С добавляют 0,1 мл 0,1 моль/л DTT в качестве обработки для восстановления (37°С, 1 час) и получают фигуру масс-спектров пептидов после RP-HPLC и анализа при помощи масс-спектрометрии.
При сравнении фигуры 5A и фигуры 5B можно видеть, что пик пептида на 13,5 мин. на фигуре пептидов из образца немодифицированного IFN-SA отсутствует в PEG20-IFN-SA, при этом новый пик пептида на 37,9 мин обнаруживается на фигуре пептидов из PEG20-IFN-SA, а остальные пептидные пики и площади пиков являются практически одинаковыми. Молекулярный вес пептида на 13,5 мин, который отсутствует в PEG20-IFN-SA, а именно 1-го пептида IFN-SA (последовательность представляет собой GSGGGCDLPQTHSLGNR), равен 1655, а на 37,9 мин обнаруживается пегилированный пептид. Сравнивают фигуры масс-спектрометрии пептидов, причем не обнаруживаются другие фрагменты, модифицированные при помощи PEG. Доказано, что запатентованная модификация IFN-SA при помощи PEG расположена на N-конце.
Пример 5. Измерение in vitro биологической активности IFN-SA, модифицированного при помощи полиэтиленгликоля с различным молекулярным весом
Тестируют in vitro противовирусную активность с применением подхода ингибирования патологических изменений в клетках Wish/VSV. После растворения образца национального стандарта (Национального института по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств) измеряют биологическую активность человеческого α-интерферона, измеряют культуральную среду и разбавляют до 1000 МЕ/мл. На 96-луночном культуральном планшете осуществляют разбавление при 4-кратных градиентах, 8 разбавлений и 2 лунки для каждого разбавления. Разбавляют PEG10-IFN-SA, PEG20-IFN-SA и PEG40-IFN-SA до 0,1 мкг/мл при помощи культуральной среды, разбавляют IFN-SA до 1,0 нг/мл при помощи культуральной среды и записывают кратности предварительного разбавления. На 96-луночном культуральном планшете осуществляют разбавление при 4-кратном градиенте, всего 8 разбавлений и 2 лунки для каждого разбавления. Рассчитывают in vitro противовирусную активность образца исходя из активности стандартных образцов.
Применительно к in vitro противовирусной активности PEG10-IFN-SA сохраняет приблизительно 8,01% активности IFN-SA, PEGG20-IFN-SA сохраняет 1,24%, а PEG40-IFN-SA сохраняет 0,43%. При применении международного стандарта активности рекомбинантного интерферона, полученного из NIBSC в качестве источника, in vitro противовирусная активность четырех образцов увеличивалась приблизительно на 50%.
In vitro противовирусная активность, (МЕ/мг) | Сохраненная активность, (%) | |
IFN-SA | 9,64×108 | |
PEG10-IFN-SA | 7,72×107 | 8,01 |
PEG20-IFN-SA | 1,29×107 | 1,34 |
PEG40-IFN-SA | 4,14×106 | 0,43 |
Пример 6. Сравнительное исследование фармакокинетики IFN-SA и PEG20-IFN-SA
12 Яванским макакам, половина из которых самцы, а половина - самки, разделенным на 2 группы, однократно вводят путем инъекции 10 мкг/кг IFN-SA или 50 мкг/кг PEG20-IFN-SA. Разработанный и изготовленный компанией набор для радиоиммуноанализа (RIA) IFN-SA применяют для тестирования концентрации в крови после подкожной инъекции IFN-SA или PEG20-IFN-SA, а экспериментальные данные объединяют при помощи фармакокинетической программы 3P97 для расчета фармакокинетических параметров. С применением гепарина забирают кровь из локтевой вены передней конечности, причем каждый раз объем равен 1,5 мл. Применительно к IFN-SA время забора крови составляет 0 часов 30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов, 16 часов и 24 часа, а применительно к PEG-IFN-SA - 0 часов, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 120 часов, 144 часа и 168 часов. Кровь хранят при комнатной температуре в течение 30 мин и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин. Отделяют сыворотку и хранят при температуре -20°С для определения концентрации в крови.
При сравнении с помощью критерия согласия фармакокинетика немодифицированного IFN-SA соответствует однокамерной модели элиминации, причем среднее время достижения пика Tпик. (фактическое значение) равно 5,33±1,63 часа, среднее значение для элиминационного периода полувыведения (t1/2e) составляет 3,06±1,19 часа; среднее время достижения пика для PEG20-IFN-SA представляет собой Tпик. (фактическое значение), равное 13,33±2,07 часа; при этом среднее время элиминационного периода полувыведения (t1/2e) составляет 34,43±4,77 часа. Период полувыведения IFN-SA продлевается более чем в 10 раз.
Категория | Среднее время достижения пиков Tпик. | Среднее время элиминационного периода полувыведения (t1/2e) |
IFN-SA | 5,33±1,63 часа | 3,06±1,19 часа |
PEG20-IFN-SA | 13,33±2,07 часа | 34,43±4,77 часа |
Пример 7. Измерение in vivo биологической активности PEG20-IFN-SA
18 Яванских макаков произвольно распределяют на 3 группы, по 6 особей в каждой группе, поровну самцов и самок. PEG20-IFN-SA вводят путем подкожной инъекции по 10 мкг/кг, 30 мкг/кг и 90 мкг/кг, забирают 1,0 мл крови в моменты времени 0, 3, 12, 24, 48, 72, 96, 120 и 144 часа, всего 9 моментов времени, центрифугируют при температуре 4°С и при скорости вращения 3000 об/мин в течение 10 мин. Отбирают 0,4 мл образца сыворотки крови и хранят при температуре -70°С. Измеряют in vivo противовирусную биологическую активность с помощью способа ингибирования биологических патологических изменений в Wish/VSV. Полученные в определенные моменты времени образцы сыворотки разбавляют при соотношении 1:45 при 6 разбавлениях. Результаты измерений применяют для расчета in vivo противовирусной активности (МЕ/мл) в соответствующий момент времени с учетом активности стандартного образца.
Как показано на фигуре 6, соответствующие моменты времени для доз 10 мкг/кг, 30 мкг/кг и 90 мкг/кг находятся в диапазоне 3~144 часа, а в отношении in vivo противовирусной активности интерферона обнаруживается зависимость доза-эффект. In vivo активность для трех концентраций снижается с течением времени, причем максимальная активность поддерживается 12~24 часа. После инъекции дозы 30 мкг/кг максимальная активность через 12 часов составляет более 15000 МЕ/мл, через 24 часа - 11000 МЕ/мл, через 48 часов - 6500 МЕ/мл, через 72 часа - 4000 МЕ/мл, через 96 часов - 2500 МЕ/мл, а через 144 часа - 500 МЕ/мл.
Пример 8. Сравнительное исследование иммуногенности PEG20-IFN-SA и IFN-SA
Обеспечивают подкожные инъекции IFN-SA в группе 1,0 мкг/кг в день, в группе 5 мкг/кг в день и в группе 25 мкг/кг в день в течение 4 недель. Обеспечивают подкожные инъекции PEG20-IFN-SA в группе 10,0 мкг/кг в неделю, в группе 30,0 мкг/кг в неделю и в группе 90,0 мкг/кг в неделю в течение 4 недель. В каждой группе, состоящей из 6 яванских макаков, в различные моменты времени забирают кровь для тестирования титра антител к IFN-SA и рассчитывают среднее геометрическое титра антител (среднее значение обратного логарифма реципрокного титра антител).
Титр сывороточных антител (среднее геометрическое) | ||||||
Время | Группы IFN-SA | Группы PEG20-IFN-SA | ||||
1,0 мкг/кг в день | 5,0 мкг/кг в день | 25,0 мкг/кг в день | 10,0 мкг/кг | 30,0 мкг/кг | 90,0 мкг/кг | |
Введение в течение 2 недель | 10,0±1,0 | 50,0 ±1,0 | 111,8±3,8 | 2,1±0,2 | 5,6±0,3 | 8,7±0,6 |
Введение в течение 4 недель | 74,8±4,7 | 1869,2±4,7 | 2137,5±5,3 | 5,1±0,9 | 10,0±1,1 | 21,2±2,7 |
Результаты указывают на то, что при применении PEG20-IFN-SA in vivo иммуногенность IFN-SA значительно снижается.
Пример 9. Стимулирующее действие PEG20-IFN-SA на иммунитет у яванского макака
Обеспечивают подкожные инъекции по 10 мкг/кг, 30 мкг/кг и 90 мкг/кг PEG20-IFN-SA в группах с низкой, средней и высокой дозой один раз в неделю. Тестирование пролиферации лимфоцитов периферической крови и тестирование активности киллинга NK-клетками осуществляют через 30, 58, 175 и 180 дней после введения.
Результаты указывают на то, что через 2 месяца после введения при сравнении 3 групп дозирования с контрольной группой пролиферация лимфоцитов периферической крови, индуцированная при помощи Con A, и активность киллинга NK-клетками статистически значимо увеличиваются (p<0,05). Следует отметить, что PEG-IFN-SA оказывает воздействие в отношении усиления иммунитета.
Пролиферация лимфоцитов (OD) | Активность киллинга NK-клетками, (%) | |||||||
Время | Контрольная группа, растворитель | Группа 10 мкг/кг |
Группа 30 мкг/кг |
Группа 90 мкг/кг |
Контрольная группа, растворитель | Группа 10 мкг/кг |
Группа 30 мкг/кг |
Группа 90 мкг/кг |
58 дней после введения | 0,27±0,12 | 0,49±0,06 | 0,47±0,11 | 0,50±0,15 | 59,34+13,41 | 75,88±11,28 | 77,56±10,92 | 78,25±13,96 |
135 дней после введения | 0,40±0,06 | 0,62±0,08 | 0,75±0,13 | 0,83±0,10 | 55,40+15,73 | 76,58±12,63 | 75,71±9,33 | 79,33±13,10 |
180 дней после введения | 0,41±0,09 | 0,59±0,06 | 0,71±0,16 | 0,79±0,07 | 58,41±12,09 | 75,99±13,57 | 78,22±11,11 | 73,52±14,03 |
Пример 10. In vitro активность PEG20-IFN-SA против вируса гепатита B
Выбирают ДНК вируса гепатита B (HBV) для клонирования и трансфекции линии клеток 2.2.15, полученной из клеток рака печени человека (HepG2), и наблюдают влияния PEG20-IFN-SA и интерферона (наименование продукта INFERGEN или IFN-con1) на секрецию HBsAg и HBeAg и число копий ДНК HBV in vitro. Обеспечивают контрольную группу клеток без применения лекарственного препарата и группы с применением такового в различных концентрациях. Конечная концентрация PEG20-IFN-SA составляет от 1,0x106 МЕ/мл до 0,0032x106 МЕ/мл, причем разбавление осуществляют при 5-кратных градиентах, заменяют жидкость каждые 4 дня и восполняют лекарственный препарат. После осуществления реакции между образцом и клетками в течение 9 дней измеряют концентрации HBsAg и HBeAg и число копий ДНК HBV в супернатанте с образцом и добавляют MTT к оставшимся клеткам для тестирования пролиферации клеток. При помощи полученных токсичности для клеток TC50 и ингибирования HBsAg и HBeAg IC50 рассчитывают соответствующий терапевтический индекс (TI), а именно TC50/IC50. Если TI больше, то действие против HBV является более значительным. Применяют флуоресцентную количественную ПЦР для измерения числа копий ДНК HBV. По сравнению с контрольной группой число копий ДНК HBV в клеточном супернатанте уменьшается на 94% и на 83% применительно к PEG20-IFN-SA и на 84% и на 76% применительно к INFERGEN.
TI в отношении HBsAg | TI в отношении HBeAg | Токсичность для клеток TC50 (МЕ/мл) | |
PEG20-IFN-SA | 5,2±0,8 | 1,9±0,6 | 1,02×106 |
IFN-con1 | 4,4±0,4 | <1,0 | 6,2×106 |
Результаты указывают на то, что PEG20-IFN-SA обладает относительно сильной in vivo активностью против вируса гепатита B.
Пример 11. Ингибирующее действие PEG20-IFN-SA в отношении линии опухолевых клеток
Выбирают 4 линии опухолевых клеток: клетки рака печени (HepG2), рака молочной железы (MCF-7), острого промиелоцитарного лейкоза (HL60) и рака почки (ACHN). Обеспечивают контрольную группу клеток без применения различных концентраций и группы с применением таковых, причем конечная концентрация PEG20-IFN-SA составляет от 4,0x105 МЕ/мл до 0,001x105 МЕ/мл, при этом осуществляют разбавление при 4-кратных градиентах, при 8 градиентах концентраций. После осуществления реакции в течение 48 часов тестируют пролиферацию клеток при помощи MTT.
Результаты экспериментов указывают на то, что PEG20-IFN-SA обладает значительным действием в отношении 4 линий опухолевых клеток, и при этом PEG20-IFN-SA обладает потенциальным терапевтическим эффектом в отношении клеток рака печени, рака молочной железы, острого промиелоцитарного лейкоза и рака почки (ACHN).
HepG2 | MCF-7 | HL60 | ACHN | ||
PEG20-IFN-SA | IC50 | 5253 МЕ/мл | 4875 МЕ/мл | 2394 МЕ/мл | 3157 МЕ/мл |
Максимальная степень ингибирования | 52% | 65% | 78% | 75% |
Пример 12. In vivo противоопухолевое действие PEG20-IFN-SA
Выбирают линию клеток рака почки (ACHN), после пассирования выращивают до 80% конфлюэнтности, обрабатывают с получением суспензии отдельных клеток в жидкости, вводят инъекцией при 6,0x105 клеток на 200 мкл под кожу самок голых мышей путем подкожной инъекции, затем наблюдают в течение 4~5 дней, а после того, как опухоль вырастет под кожей, измеряют размер опухоли при помощи цифрового прибора для измерения диаметра, при этом мышей произвольно распределяют на модельную группу и группу лечения при помощи PEG-IFN-SA, в каждой группе n=10. Применительно к группе с PEG20-IFN-SA осуществляют подкожную инъекцию по 106 МЕ/кг два раза в неделю, а модельной группе вводят путем инъекции такой же объем физиологического раствора. Умерщвляют голых мышей через 24 часа после 5-го введения, извлекают опухоль хирургическим путем и измеряют ее размер при помощи цифрового прибора для измерения диаметра. Результаты указывают на то, что после введения размер опухоли в группе с PEG20-IFN-SA уменьшается приблизительно на 33% по сравнению с таковым в модельной группе, причем наблюдается противодействие in vivo росту опухоли.
Claims (3)
1. Лекарственный препарат против HBV, который отличается тем, что активный фармацевтический компонент представляет собой полиэтиленгликолевый конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, где аминокислотная последовательность указанного варианта рекомбинантного консенсусного интерферона представляет собой SEQ ID No: 1, и активированная молекула полиэтиленгликоля соединена с α-аминогруппой глицина на N-конце варианта рекомбинантного консенсусного интерферона посредством ковалентной связи, где молекулярный вес молекулы полиэтиленгликоля составляет 20 кДа, где указанная активированная молекула полиэтиленгликоля активирована альдегидной группой на одном конце полиэтиленгликоля, и указанная альдегидная группа соединена с α-аминогруппой глицина на N-конце посредством ковалентной связи, где другой конец активированной молекулы полиэтиленгликоля представляет собой монометокси-группу.
2. Лекарственный препарат против HBV по п. 1, где указанное полиэтиленгликолевое производное выбрано из пропионового альдегида монометоксиполиэтиленгликоля, масляного альдегида монометоксиполиэтиленгликоля, уксусного альдегида монометоксиполиэтиленгликоля и пентаналя монометоксиполиэтиленгликоля, и молекулы полиэтиленгликолевого конъюгата имеют цепи линейного или разветвленного типов.
3. Способ получения лекарственного препарата по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный полиэтиленгликолевый конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона по п. 1 или 2 получают путем выполнения следующих этапов, на которых:
(1) проводят реакцию связывания, которая представляет собой восстановительное аминирование альдегидной группы в присутствии цианоборгидрида натрия, где молярное соотношение варианта рекомбинантного консенсусного интерферона к альдегиду монометоксиполиэтиленгликоля составляет 1:4 и рН фосфатного буфера составляет 5,5, ионная сила составляет 10-100 ммоль/л, температура реакции составляет 4°С, время реакции составляет 24 часа,
(2) осуществляют разделение и очистку конечного продукта при помощи хроматографии: продукт реакции связывания подвергают диализу при помощи 5×DDW, а после диализа образец загружают в хроматографическую колонку SP Sepharose F.F; уравновешивают хроматографическую колонку SP Sepharose F.F при помощи буфера А (уравновешивают 10 мМ уксусной кислотой - ацетатом натрия, рН 5,5) и загружают образец; элюируют с осуществлением элюирования 1 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,15 М NaCl, рН 5,5), элюирования 2 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,2 М NaCl, рН 5,5), элюирования 3 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,25 М NaCl, рН 5,5), элюирования 4 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,35 М NaCl, рН 5,5) и элюирования 5 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,45 М NaCl, рН 5,5), получают пик прохождения и пик элюирования, осуществляют SDS-PAGE электрофорез для анализа образца, затем отбирают образец полиэтиленгликолевого конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (PEG-IFN-SA) после хроматографии на SP Sepharose F.F и очистки и загружают на молекулярное сито Superdex 75, уравновешенное при помощи 10 ммоль/л РВ, рН 7,4, затем основной пик, включающий PEG20-IFN-SA, отделяют при помощи 10 ммоль/л РВ, рН 7,4 при постоянном градиенте и отбирают.
(1) проводят реакцию связывания, которая представляет собой восстановительное аминирование альдегидной группы в присутствии цианоборгидрида натрия, где молярное соотношение варианта рекомбинантного консенсусного интерферона к альдегиду монометоксиполиэтиленгликоля составляет 1:4 и рН фосфатного буфера составляет 5,5, ионная сила составляет 10-100 ммоль/л, температура реакции составляет 4°С, время реакции составляет 24 часа,
(2) осуществляют разделение и очистку конечного продукта при помощи хроматографии: продукт реакции связывания подвергают диализу при помощи 5×DDW, а после диализа образец загружают в хроматографическую колонку SP Sepharose F.F; уравновешивают хроматографическую колонку SP Sepharose F.F при помощи буфера А (уравновешивают 10 мМ уксусной кислотой - ацетатом натрия, рН 5,5) и загружают образец; элюируют с осуществлением элюирования 1 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,15 М NaCl, рН 5,5), элюирования 2 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,2 М NaCl, рН 5,5), элюирования 3 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,25 М NaCl, рН 5,5), элюирования 4 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,35 М NaCl, рН 5,5) и элюирования 5 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,45 М NaCl, рН 5,5), получают пик прохождения и пик элюирования, осуществляют SDS-PAGE электрофорез для анализа образца, затем отбирают образец полиэтиленгликолевого конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (PEG-IFN-SA) после хроматографии на SP Sepharose F.F и очистки и загружают на молекулярное сито Superdex 75, уравновешенное при помощи 10 ммоль/л РВ, рН 7,4, затем основной пик, включающий PEG20-IFN-SA, отделяют при помощи 10 ммоль/л РВ, рН 7,4 при постоянном градиенте и отбирают.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010516710.1A CN102453089B (zh) | 2010-10-25 | 2010-10-25 | 重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用 |
CN201010516710.1 | 2010-10-25 | ||
PCT/CN2011/071952 WO2012055205A1 (zh) | 2010-10-25 | 2011-03-18 | 聚乙二醇化的重组集成干扰素变异体偶联物及其制备方法和应用 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013119183A RU2013119183A (ru) | 2014-12-10 |
RU2575796C2 RU2575796C2 (ru) | 2016-02-20 |
RU2575796C1 RU2575796C1 (ru) | 2016-07-20 |
RU2575796C9 true RU2575796C9 (ru) | 2016-07-20 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1365983A (zh) * | 2001-01-19 | 2002-08-28 | 重庆富进生物医药有限公司 | 超强抗病毒活性的人α干扰素衍生物 |
CN1139932C (zh) * | 1998-02-19 | 2004-02-25 | 日本先锋公司 | 信息记录装置和方法 |
RU2311930C2 (ru) * | 2004-04-30 | 2007-12-10 | Закрытое акционерное общество "ВЕРОФАРМ" | Пэгилированный интерферон для борьбы с вирусной инфекцией |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1139932C (zh) * | 1998-02-19 | 2004-02-25 | 日本先锋公司 | 信息记录装置和方法 |
CN1365983A (zh) * | 2001-01-19 | 2002-08-28 | 重庆富进生物医药有限公司 | 超强抗病毒活性的人α干扰素衍生物 |
RU2311930C2 (ru) * | 2004-04-30 | 2007-12-10 | Закрытое акционерное общество "ВЕРОФАРМ" | Пэгилированный интерферон для борьбы с вирусной инфекцией |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BAKER D. et al., N-terminally PEGylated human interferon- β-1a with improved pharmacokinetic properties and in vivo efficacy in a melanoma angiogenesis model, Bioconjugate Chem., 2006, v. 17, p. 179-188. * |
LI L. et al., Pegylated interferon alpha-2a (40 kDa) in the treatment of chronic hepatitis B, Int. J. of Nanomedicine, v. 1, p. 255-262. TOVEY M. et al., Safety, Tolerability and Immunogenicity of Interferons, Pharmateuticals, 2010, v. 3, p. 1162-1186. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications | |
KR101502645B1 (ko) | 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2b, 이의 제조 방법 및 용도 | |
US8901277B2 (en) | Interferon alpha mutant and its polyethylene glycol derivative | |
JP2008543304A (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子イソ型(HumanGranulocyte−ColonyStimulatingFactorIsoforms) | |
KR101483814B1 (ko) | 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2a, 이의 합성 방법 및 용도 | |
RU2488598C2 (ru) | Гормон роста, модифицированный двухцепочечным полиэтиленгликолем, способ его получения и применение | |
CN103923209B (zh) | 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物 | |
CN102453089B (zh) | 重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用 | |
TWI491410B (zh) | 水溶性聚合物修飾的g-csf偶聯物 | |
CN105085658B (zh) | 一种白细胞介素29突变体及聚乙二醇衍生物 | |
RU2575796C9 (ru) | Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение | |
RU2575796C2 (ru) | Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение | |
JP2003500334A (ja) | 抗hiv作用を有するrantes由来ペプチド | |
CN103933577B (zh) | 重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用 | |
KR100353392B1 (ko) | 높은 생체 활성도를 갖는 생체 활성 단백질과 peg의결합체 제조방법 | |
KR20030062467A (ko) | 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제 |