CN103933577B - 重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物及其制备方法和应用，其特征为：它是以分子量为10KD-40KD的醛基活化聚乙二醇分子对重组集成干扰素变异体进行氨基末端的单一位点化学修饰。修饰后的重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物具有体内半衰期延长，免疫原性降低和体内长时相的抗病毒活性等特性。本发明还公开了重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物的制备方法，同时提供了其组合药物治疗和预防病毒性感染或增生性疾病或调节免疫功能的用途。

Description

重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术及制药领域，特别是涉及一种重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶合物及其制备方法和应用。本发明是发明名称为“抗病毒活性的人α干扰素衍生物”(专利号为ZL01102915.3)发明专利的延伸。

背景技术

早在1957年，lssacs等人发现病毒感染的细胞产生一种因子，可抵抗病毒的感染，干扰病毒的复制，因而命名为干扰素(interferon，IFN)。干扰素是由灭活的或活的病毒作用于易感细胞后，由易感细胞基因组编码而产生的一组糖蛋白。其活性及抗原性皆取决于分子中的蛋白质，而与其糖基无关。根据其来源和结构，可将IEN分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ，它们分别由白细胞、纤维母细胞和活化T细胞产生。IFN-α为多基因产物，有十余种不同亚型，但它们的生物活性基本相同。IFN除有抗病毒作用外，还有抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖及引起发热等作用。目前临床上使用的干扰素大多是通过基因重组技术得到的。

IFN是慢性病毒性肝炎经临床验证有效的一线治疗药物。临床使用较多的是天然结构的IFNα-2a和IFNα-2b。二者均属于短效干扰素，半衰期短(4～16h)，血清浓度在注射24h后已经很低。其在体内的药代动力学过程影响了其抗病毒治疗的远期疗效。按照目前3～6MU/kg，每周3次的用药方法，在体内干扰素水平呈现出典型的“峰-谷曲线”。干扰素血清水平大幅度波动容易使病毒水平反跳，产生耐药性，降低治疗效果。同时，短效干扰素存在毒副反应大，人长期使用耐受性差，免疫原性强等不足。因此，对短效干扰素进行修饰，延长其在体内的半衰期，维持体内血药浓度的稳定，将有助于提高其治疗病毒性肝炎的有效性，并减轻毒副作用。

聚乙二醇(polyetnylene glycol，PEG)是一种安全无毒、无活性的聚合物，常用于蛋白质药物修饰。修饰后的蛋白抗酶解、水溶性增加、半衰期延长、免疫原性和毒性降低(Inada，et al.，J.Bioact.And Compatible Polymers，5：343(1990).Delgalo，et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems，9：249(1992)kate，Advanced Drug Delivery Systems，10：91(1993))。霍夫曼-拉罗齐公司的中国专利：ZL93116479.6和ZL97105433.9公开了聚乙二醇-干扰素结合物的制备，先灵公司的中国专利200580032850.2公开了稳定的聚乙二醇化干扰素的制剂的制备。目前，已有两种PEG修饰的人α干扰素(霍夫曼-拉罗齐的PEGASYS和先灵公司的PEGINTRON)用于慢性丙型和乙型肝炎的治疗。两者聚乙二醇化后肾脏清除率明显降低，半衰期延长(30～16h)、免疫原性降低，每周仅需给药1次。在清除HCV/HBV病毒方面明显优于短效干扰素。治疗丙型肝炎HCV-RNA近期反应率可达69％，持续反应率达39％，而常规干扰素仅为7％。治疗乙型肝炎HBeAg转阴率可达37％，综合应答率(即HBeAg转阴、HBV DNA抑制和ALT正常化)为35％，61％的病人伴随HBVDNA转阴(＜400copies/mL)，7％出现了HBsAg转阴。而常规干扰素治疗乙肝后三项指标仅为(15％、25％、12％)。无HBsAg转阴的病人(ReddyKR，etal.Hepatology，2001，33：433-438.Jessner W，et al.J Viral Hepat.2003，10：37-42.Shiffman ML，et al.Hepatology，2004；40(4，suppl1)：314A.Davis GL，et al.Hepatology，2003；38：645-52.Janssen HL，et al.Lancet，2005；365：123-129.Cooksley WG et al..J Viral Hepat，2003；10：298-305.)。

PEG修饰的重组人α干扰素2a(PEGASYS)修饰位点为赖氨酸，PEG修饰的重组人a干扰素2b(PEG-Intron)修饰位点为组氨酸。文献报道(Miller DL，et al.Science，1982，215：689-690.Radhakrishnan R，et al.Structure，1996；4(12)：1453-1463.Karpusas M，et al.Proc.Natl.Acad.sci.USA1997，94：11813-11818)，IFN-α的受体结合区主要包括AB loop(Arg22，Leu26，Phe27，Leu30，Lys31，Arg33，His34)，helixB(Ser68)，helixC(Thr79，Lys83，Tyr85，Tyr89)，helix D(Arg120，Lys121，Gln124，Lys131，Glu132)和helixE(Arg144，Glu146)。PEGASYS修饰的赖氨酸以及PEG-Intron修饰的组氨酸均在上述受体结合区，不利于干扰素与其受体的结合。此外，按二者PEG修饰后终产物均非特异性单一定点修饰，如PEGASYS以修饰L_ys131为主的混合物(共有7个修饰位点)，PEG-Intron是以修饰His34为主的混合物(共有4个修饰位点)。

单一位点的PEG修饰可同时实现分子量和结构的均一性，提高修饰后的生物活性和体内安全性。已有多种方法可实现PEG对干扰素的单一位点特异性修饰。(1)WO2006/004959公开了一种利用IFNα-1b氨基酸序列中地86位自由半胱氨酸(Cys86)特异性偶联马来酰胺PEG(PEG maleimide)的方法及其产物；(2)WO2008/074230中公开了将IFNα中第85或86为氨基酸突变为Cys，再利用马来酰胺PEG进行特异性定点修饰。(3)还可选择含与N端氨基特异性结合活性基团的PEG对干扰素进行N末端修饰(如中国专利CN1229388C，CN100478359C和CN101381409A)。

N末端的修饰PEG远离干扰素受体结合区，从结构分析应是理想的修饰位点。但天然α干扰素N端的第1位为半胱氨酸，其与99位半胱氨酸形成一对二硫键(此二硫键对生物活性十分关键)。采用对α干扰素N末端的专一位点PEG修饰，修饰率很低且对生物活性影响大。

为提高天然干扰素的活性，美国Amgen公司首次合成了一种非天然的干扰素(Consensus interferon，集成干扰素，商品名为干复津)。干复津是一种经计算机优化组合的非天然的重组α-干扰素，其序列由20种天然α-干扰素亚型序列优化组合而成，其抗病毒活性比天然干扰素提高了5～10倍。1997年，FDA批准干复津应用于丙型肝炎的治疗，研究结果显示疗效明显优于普通干扰素。美国专利US4695623、US4897471、US5372808公开了复合干扰素具有广谱的干扰素活性，有较强的抗病毒和抗肿瘤以及激活NK细胞的活性。但是干复津和天然α干扰素相同，具有稳定性差、体内半衰期短、免疫原性强等缺点。同时N端第一位的半胱氨酸需与99位半胱氨酸形成二硫键，不能有效的进行N末端修饰。虽然Amgen公司的美国专利US005985265A公开了和干复津蛋白的N端修饰的方法，但无论在修饰率和修饰后保留的生物活性均明显低于其它蛋白的N末端修饰(重组人粒细胞集落刺激因子G-CSF和重组人生长激素GH等)。

为实现干扰素的N端修饰，同时根据同源序列最高原则，本发明人设计了全新的集成干扰素序列，命名为集成干扰素变异体(super antiviral interferon，简称IFN-SA)，现根据干扰素的命名原则改为重组集成干扰素变异体。由171氨基酸组成，在N末端专门设计引入Gly Ser Gly Gly Gly五个氨基酸序列，可实现N末端的专一位点PEG修饰。该结构与干复津结构不同，同时体外抗病毒活性提高了50％。本新型结构及其重组制备和在抗病毒性疾病中的应用，已获中国发明专利授权，专利号：ZL01102915.3。

本发明提供了一种重组集成干扰素变异体(IFN-SA)聚乙二醇偶联物(简称PEG-IFN-SA)的制备方法和应用。本发明优选能与N端氨基特异性结合的丙醛基团的20KD聚乙二醇(PEG-ALD)为修饰剂，选择pH4.5～6条件修饰，成功获得了聚乙二醇化重组集成干扰素变异体偶联物(PEG-IFN-SA)。本制备方法N端单一位点化学修饰物，有效提高了该蛋白质的稳定性、延长了半衰期、降低了免疫原性和毒副反应。可望成为新型的长效干扰素预防和治疗病毒性感染性疾病、增生性疾病、增强免疫功能等疾病的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于N端定点化学修饰的重组集成干扰素变异体(IFN-SA)聚乙二醇偶联物的制备方法。该偶联物具有稳定性好、半衰期长、免疫原性和毒副反应低等特征，可用于制备治疗预防和治疗病毒性感染性疾病、增生性疾病、增强免疫功能以及其他疾病的药物。

本发明涉及的一种化学修饰的IFN-SA的聚乙二醇偶联物。

IFN-SA表示重组集成干扰素变异体，其特征在于，所述IFN-SA的氨基酸序列为SEQ ID No：1所示：

Gly Ser Gly Gly Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn

151015

Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe

202530

Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe

354045

Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu

505560

Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala

65707580

Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

859095

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu

100105110

Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr

115120125

Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys

130135140

Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser

145150155160

Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Asp

165170

IFN-SA聚乙二醇偶联物，其特征在于聚乙二醇是以酰胺键与重组集成干扰素变异体N末端甘氨酸的α的氨基共价连接。

与IFN-SA的N端连接的聚乙二醇其特征在于，所述聚乙二醇为醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子。

醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子，其特征在于，包括但不限于单甲氧基聚乙醇丙醛(mPEG-ALD)、单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇戊醛。优选单甲氧基聚乙二醇丙醛。聚乙二醇分子根据偶联度不同，可以是分子量为10KDa～40KDa的任一分子，其中优选分子量为20KD的聚乙二醇分子。聚乙二醇分子可以是直链型或分支型，可以是单链、双链或多链。优选直链型单链聚乙二醇分子。

本发明还提供了IFN-SA聚乙二醇偶联物的制备方法。所属领域技术员根据常识可以选择聚乙二醇的结构类型、分子量和反应所需的用量。通过本申请所提供的制备方法，根据修饰后蛋白分子的结构和性质，选择修饰条件：修饰酸碱度、反应体系，蛋白和聚乙二醇的摩尔比等。

以本发明优选的20KDa的mPEG定点N末端修饰IFN-SA为例，说明偶联物的制备方法。

IFN-SA的制备，具体见专利ZL01102915.3。

本领域熟知的，在硼氰化钠存在条件下，带醛基的PEG会和伯胺发生还原氨化反应。醛基和其他的亲电活性基团不同，它只和胺基反应。虽然醛基的反应活性比NHS活性低，但它具有反应条件温和，易于使PEG和蛋白质或其它材料的表面连接。因此，在低的pH下，mPEG-醛会对蛋白质的N端进行选择性反应。该反应条件在pH值4.0～7.0，10～100mmol/L盐浓度的缓冲体系下，温度在4～25℃，反应时间为1～72小时，反应摩尔比PEG∶蛋白在1∶2～1∶10。一般情况下，选择低温、低pH、反应时间适宜条件下得到的N-末端修饰产物均一性强，且反应转换率较高。

本发明专利所述偶联物的制备步骤：将IFN-SA的磷酸盐缓冲液与20KD的mPEG-ButyrALD在加入20mM硼氰化钠条件下反应，然后采用常规方法进行分离纯化，过滤除菌，获得本发明的IFN-SA的偶联物。所用磷酸盐缓冲液优选pH4.0-6.0，浓度为50-100mmol/L，温度优选4-10℃，反应时间优选24～48小时，反应摩尔比PEG∶IFN-SA为1∶2～1∶5，修饰率达到50％以上。修饰条件的选择和修饰方法在实例中详细说明。

本发明偶联物的纯化方法为：IFN-SA与聚乙二醇聚合物经反应后的的样品，用5×DDW透析后上SPSepharose F.F.，经10mM乙酸-乙酸钠(pH5.5)，平衡液平衡后，用1MNacl的盐离子逆度洗脱，穿透和洗脱样品分别用电泳、RP-HPLC检测纯度。含聚乙二醇偶联物组份再经Superdex75分子筛(或SephacrylS-200)，10mM PB，(pH7.4)条件下分离除去高分子聚合物。结构和质量分析方法包括质谱、质量肽图、RP-HPLC，Gel-HPLC和SDS-PAGE。

采用20KD分子量的丙醛活化的聚乙二醇分子(ALD-mPEG20K)作为修饰物，经过至少10批的中试工艺试验，每批可获得1克以上纯度大于95％的IFN-SA聚乙二醇偶联物(代号：

PEG20-IFN-SA)，修饰率约50％，非N端修饰物低于3％，抗病毒比活性≥1.2×10⁷IU/mg。

药代动力学表明在食蟹猴体内半衰期为34.5小时，明显长于IFN-SA3小时的半衰期。食蟹猴6月长毒表明，免疫原性显著低于IFN-SA。在水溶液状态4℃条件下可稳定24个月。因此，本发明所述IFN-SA聚乙二醇偶联物具备长效、稳定、低免疫原性的特征。

另根据上述制备方法，选择10KD的单甲氧基聚乙二醇丁醛与IFN-SA的N端氨基进行偶联获得PEG10-IFN-SA。选择40KD的PEG-NHS与IFN-SA的N端氨基进行偶联获得PEG40-IFN-SA。PEG10-IFN-SA的体外抗病毒活性为≥7.0×10⁷U/mg，半衰期为15.3小时。PEG40-IFN-S A的体外抗病毒活性为≥4.0×10⁶U/mg，半衰期为42.29小时。表明随着偶联PEG分子量的增加，半衰期延长，但外抗病毒活性显著下降。本发明发现，直链型PEG修饰对IFN-SA体外活性的影响明显小于支链型PEG的修饰。因此，本发明优选20KD直链型单链PEG偶联修饰IFN-SA。

由上述方法制备的PEG-IFN-SA，通过相应的制剂技术制备成注射液或冻干粉针、外用型的膏剂或乳剂或喷雾剂以及口服型的含化片或胶囊、片剂。

IFN-SA的聚乙二醇偶联物的另一特征在于，该偶联物可用于临床治疗的药物组合，含有有效剂量的任一偶联物和药用稀释剂、佐剂和载体。

本发明所涉及的PEG-IFN-SA分子为临床药用制剂的有效成分，该制剂包括但不限于：稀释剂、稳定剂、防腐剂、溶解剂、乳化剂、佐剂和载体等。1)稀释液：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等缓冲液；2)pH值和离子强度；3)去污剂和促溶剂：山梨醇、Tween-20、Tween-80；4)充填剂：山梨醇、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油。PEG-IFN-SA制剂优选10mM PB(pH7.2)、山梨醇、Tween-80。有效成分的有效剂量是指考虑到表观分子量和病人体重、年龄等因素的有效治疗或预防剂量。本发明涉及的PEG-IFN-SA其有效剂量为0.5ug～9ug/kg/次。

PEG-IFN-SA临床药用制剂给药方式肠道外给药，包括但不限于皮下、肌肉、静脉、腹腔注射、吸入、舌下或透皮给药。给药周期为3～14天/次。

本发明同时还公开了IFN-SA与聚乙二醇偶联物用于预防和治疗病毒性感染性疾病、增生性疾病、增强免疫功能以及其他疾病的方法。

在一实施方式中，所述病毒感特征在于包括而不限于肝炎病毒感染，人乳头状病毒感染，单纯性疱疹病毒感染、人免疫缺陷病毒感染、EB病毒感染、SARS感染和流感病毒感染。所述的肝炎病毒感染特征在于包括而不限于丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。优选丙型肝炎、乙型肝炎病毒感染。优选丙型肝炎、乙型肝炎病毒感染。

在另一实施方式中，所述的增生性疾病特征在于包括而不限于恶性肿瘤，恶性肿特征在于包括而不限于慢性髓原性白血病、黑色素瘤、肾癌、肝癌。

还提供了药物组合联合用药方式包括而不限于利巴韦林、拉米夫定。抗丙型肝炎病毒与能抑制病毒DNA和RNA合成的广谱抗病毒类药物如利巴韦林组合运用；抗乙型肝炎病毒与核苷类抗病毒类药物如拉米夫定组合运用；治疗恶性肿瘤与其他化疗药物组合运用。

至此已对本发明进行了详细的描述，通过参考下列实例，能够对本发明有更清楚地理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。

附图说明

附图1：IFN-SA与PEG的摩尔比对修饰反应的影响SDS-PAGE电泳图，其中1：为1∶2比例，2：为1∶3

附图2：IFN-SA修饰前后的SDS-PAGE电泳图。其中1：为修饰前IFN-SA，2：为修饰后产物，3：为纯化后的PEG20-IFN-SA，M：蛋白分子量标准。

比例，3：为1∶4比例，4：为1∶5比例，5：为1∶6比例，M为蛋白分子量标准。

附图3：不同分子量PEG修饰的IFN-SA的SDS-PAGE电泳图。其中M为marker，1为PEG10K-IFN-SA，2为PEG20K-IFN-SA，3为PEG40K-IFN-SA。图中三种PEG化的IFN-SA蛋白因迁移率变慢而比理论值偏大。

附图4：PEG20-IFN-SA的RP-HPLC色谱图。图中PEG20-IFN-SA呈单一吸收峰，纯度为98.7％。

附图5：PEG20-IFN-SA和IFN-SA的胰蛋白酶酶切后还原质量肽图分析色谱图。其中图A为IFN-SA的肽图，图B为PEG20-IFN-SA肽图。二者间仅有二个肽段峰的差异，差异分析说明见实例3。

图6：PEG20-IFN-SA在食蟹中皮下注射不同剂量(10ug/kg，30ug/kg和90ug/kg)后体内抗病毒生物活性随时间变化曲线图。其中●为10ug/kg，○为30ug/kg，▲为90ug/kg。横坐标为时间(小时)，纵坐标为每毫升血液中抗病毒活性单位(IU/ml)。

具体实施方式

实例1、重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物(PEG20-IFN-SA)的修饰条件

IFN-SA溶液(浓度为10mg/mL，缓冲为100mM PB，pH7.0)由重庆富进生物医药有限公司制备，mPEG-ButyrALD-20KD(纯度＞95％，相对分子质量为20×10³)购自北京键凯科技有限公司，氰基硼氢化钠(CH3BrNa)溶液购自Sigma公司，SDS-PAGE相关试剂及溶液和各种分析纯均为上海生工产品。恒温磁力搅拌仪(江苏中大仪器厂)、电泳仪、SP Sepharose F.F.、Superdex75分子筛、AKTA explore层析系统、SDS-PAGE电泳系统均为Pharmacia公司产品。

1、反应pH值对修饰产物的影响

IFN-SA溶液分别用100mmol/L PB(pH4.0、pH5.0和pH5.5)缓冲液配成2mg/mL，各取一份加入1mol/LCH3BNNa母液至终浓度为20mmol/L。按摩尔比1∶4(IFN-SA：mPEG-ButyrALD-20KD)称取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反应溶液中，4℃条件下100r/min搅拌反应24h。分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定PEG20-IFN-SA的修饰率。

实验结果表明：pH值在4.0、5.0、5.5的条件下，PEG1-IFN-SA所占比例分别为18％，31％，40％。说明pH4.0的修饰率最低，pH5.5的条件下修饰率最高。

2、IFN-SA与PEG的修饰比例对修饰产物的影响

IFN-SA溶液用100mmol/LPB pH5.5缓冲液配成2mg/mL，补入1mol/L CH3BNNa母液至终浓度为20mmol/L。按IFN-SA与mPEG-ButyrALD-20KD摩尔比为A(1∶2)、B(1∶3)、C(1∶4)、D(1∶5)、E(1∶6)分别称取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反应溶液中，4℃条件下100r/min搅拌反应24hr，分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定PEG20-IFN-SA的修饰率。

实验结果表明(图1)：在IFN-SA与mPEG-ButyrALD-20KD摩尔比为A(1∶2)、B(1∶3)、C(1∶4)、D(1∶5)、E(1∶6)时，PEGI-IFN-SA所占比例分别为18％，27％，39％，40％，41％。当PEG修饰物的摩尔比达到1∶4后，不能进一步提高修饰率，反应会造成PEG修饰的多聚体增加。

3、反应温度和时间对修饰产物的影响

IFN-SA溶液用100mmol/L PB pH5.5缓冲液配成2mg/mL，补入1mol/L CH3BNNa至终浓度为20mmol/L。取IFN-SA与mPEG-ButyrALD-20KD质量比1∶4，分别在4℃反应48hr，25℃反应24hr不同时间点，分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定PEG20-IFN-SA的修饰率。实验结果表明：4℃条件下通过延长反应时间，同样达到反应25℃反应的修饰率。但4℃条件修饰更利于IFN-SA的活性和结构稳定。

4、IFN-SA浓度对修饰产物的影响

IFN-SA溶液用100mmol/L PB pH5.5缓冲液配成为1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL，4.0mg/mL，共4份，按IFN-SA与mPEG-ButyrALD-20KD质量比1∶4的比例加入mPEG-ButyrALD-20KD，4℃，100r/min搅拌反应24hr，分别取样进行SDS-PAGE电泳分析，确定PEG20-IFN-SA的修饰率。

实验结果表明，IFN-SA浓度在1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL，4.0mg/mL时，PEG20-IFN-SA所占比例分别为28％，40％，45％，48％。但随着蛋白浓度提高时，PEG20-IFN-SA的修饰有所增加，达到3.0～4.0mg/mL时为合适浓度。

实例2、重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物(PEG20-IFN-SA)的分离纯化

修饰后样品PEG-IFN-SA，用5×DDW透析过夜，透析后样品上SP Sepharose F.F层析柱。SP Sepharose F.F层析柱用BufferA(10mM乙酸-乙酸钠pH5.5平衡)平衡后上样，分别用洗脱1(10mM乙酸-乙酸钠0.15M NaCl pH5.5)、洗脱2(10mM乙酸-乙酸钠0.2M NaCl pH5.5)、洗脱3(10mM乙酸-乙酸钠0.25M NaCl pH5.5)、洗脱4(10mM乙酸-乙酸钠0.35M NaCl pH5.5)、洗脱5(10mM乙酸-乙酸钠0.45MNaCl pH5.5)进行洗脱，分别收集穿透峰及各个洗脱峰，并取样分别进行SDS-PAGE电泳分析。收集SPSepharose F.F层析纯化后的PEG-IFN-SA样品，上Superdex75分子筛。Superdex75凝胶分子筛用10mmol/LPB，pH7.4平衡，平衡好后上样，再用10mmol/L PB，pH7.4等梯度分离，随后收集含PEG20-IFN-SA主峰。分别取样进行SDS-PAGE电泳分析(见图2)。

实验结果表明，经SP Sepharose和SuperdexG75柱能有效将修饰1个PEG和修饰2个PEG的IFN-SA和游离IFN-SA分离。

实例3、10KD和40聚乙二醇修饰重组集成干扰素变异体

分别选择10KD的单甲氧基聚乙二醇丁醛和40KD的分枝链单甲氧基聚乙二醇丙醛(均为北京健凯生物公司产品)按照实例1和实例2的方法对IFN-SA进行N端单一位点特异性修饰，经分离和纯化获得PEG10-IFN-SA和PEG40-IFN-SA(见图3)。

实例4、重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物(PEG20-IFN-SA)的理化性质

1、纯度

分析型RP-HPLC的分析柱为C18(Waters Symmestry)，流动相A液(0.1％三氟乙酸、5％乙腈)，流动相B液(0.1％三氟乙酸、95％乙腈)。上样量20μl，流速为1mL/min，梯度洗脱70min(A液从100％至30％，B液从0至70％)，检测波长为214nm。实验结果表明(图4)，PEG20-IFN-SA纯度达95％以上。

2、PEG20-IFN-SA修饰位点确定

经中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组分析中心用氨基酸序列分析仪测定PEG20-IFN-SA的N端氨基酸序列为SGG GCD LPQ THS LGN。未修饰前的N末端第一位Gly未能测出，证明该位点被PEG修饰。

3、PEG20-IFN-SA修饰位点均一度分析

本品mPEG-ALD修饰为专一N末端氨基修饰，但在基硼氰化钠的存在下，可能因修饰条件的不同产生部分mPEG-ALD修饰在赖氨酸的ε-NH₂残基上。为证明PEG20-IFN-SA中PEG仅修饰在N末端，通过选用专一性强的胰蛋白酶(Sigma公司，蛋白组学级)特异性酶解赖氨酸和精氨酸的C端肽键，由于空间位阻作用的影响，经PEG修饰后的赖氨酸位点不能被胰蛋白酶识别和酶切。比较修饰前后的IFN-SA质量肽图，可获得本样品中的N末端PEG修饰均一度。

将IFN-SA和PEG20-IFN-SA二种样品冻干除盐后用1％NH₄HCO₃溶解成2mg/ml，每个样品取0.9ml，补入50uL牛胰蛋白酶(质量比1∶50)，37℃反应24小时后，再补入0.1ml的0.1MoL/L DTT还原处理(37℃，1hr)经RP-HPLC和质谱分析二者的质量肽图。

由图5A和图5B比较可见：未修饰IFN-SA样品肽图中13.5min肽段峰在PEG20-IFN-SA中消失，而在PEG20-IFN-SA肽图中出现37.9min新的肽段峰，其余肽段峰形和峰面积两者完全一致。在PEG20-IFN-SA消失的13.5min肽段经过质谱测定分子量为1655，即IFN-SA的第一肽段(序列为GSGGGCDLPQTHSLGNR)，而出现的37.9min肽段为PEG化的该肽段。比较两者质量肽图，未见其余被PEG修饰的片段。证明，IFN-SA经本专利方法的PEG修饰仅位于N末端。

实例5、不同分子量聚乙二醇修饰的IFN-SA体外生物活性测定

采用Wish/VSV细胞病变抑制法测定体外抗病毒活性。人α-干扰素生物学活性测定的国家标准品(中检所)复溶后，用测定培养液稀释至1000IU/mL。在96孔细胞培养板中，做4倍梯度系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。分别将PEG10-IFN-SA，PEG20-IFN-SA和PEG40-IFN-SA用测定培养液稀释成0.1μg/mL，用测定培养液稀释成将IFN-SA稀释为1.0ng/mL，记录预稀释倍数。在96孔细胞培养板中，再做4倍梯度系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。按活性标准品计算样品的抗病毒体外活性。

PEG10-IFN-SA体外抗病毒活性保留了IFN-SA约8.01％的活性，PEGG20-IFN-SA保留了1.24％，PEG40-IFN-SA保留了0.43％。采用NIBSC来源的国际重组人集成干扰素活性标准品作参照，四者其体外抗病毒活性均提高50％左右。

	体外抗病毒活性（IU/mg）	保留活性（%）
			IFN-SA	9.64×108
PEG10-IFN-SA	7.72×107	8.01
			PEG20-IFN-SA	1.29×107	1.34
PEG40-IFN-SA	4.14×106	0.43

实例6、IFN-SA与PEG20-IFN-SA药代动力学比较研究

食蟹猴12只，雌雄各半，分为2组，分别单次给予10μg/kg的IFN-SA或50μg/kg的PEG20-IFN-SA，采用本公司研制的IFN-SA放射免疫(RIA)试剂盒测定皮下注射IFN-SA或PEG20-IFN-SA后的血药浓度，实验数据用3P97药动程序拟合并计算药动参数。实验动物从前肢肘肝素抗凝静脉取血，每次1.5ml。IFN-SA的取血时间点为0h30min，1hr、2h、4h、8h、12h、16h和24h。PEG-IFN-SA的为0h1hr，2hr，4、6、12、24、48、72、96、120、144和168h。血液在室温放置30min后于4000rpm离心10min，分离出血清，-20℃保存用于血药浓度的测定。

经拟合优度比较，未修饰的IFN-SA的药代符合一房室消除模型，平均达峰时间T_peak(实测值)为5.33±1.63h，平均消除半衰期(t_1/2e)为3.06±1.19h；PEG20-IFN-SA平均达峰时间T_peak(实测值)为13.33±2.07h；平均消除半衰期(t_1/2e)为34.43±4.77h。比IFN-SA的半衰期延长10倍以上。

种类	平均达峰时间Tpeak	平均消除半衰期（t1/2）
			IFN-SA	5.33+1.63h	3.06+1.19h

PEG20-IFN-SA

13.33+2.07h

34.43+4.77h

实例7、PEG20-IFN-SA体内生物活性测定

食蟹猴18只，随机分为3组，每组6只，雌雄各半。分别皮下一次注射PEG-IFN-SA10μg/kg、30μg/kg、90μg/kg后于0，3，12，24，48，72，96，120，144hr共9个时间点，取血1.0ml，4℃3000rpm，10min离心后取不少于0.4ml血清样品于-70℃保存。采用Wish/VSV细胞病变抑制法测定体内抗病毒生物活性，各时相点血清样品从1∶45按三倍稀释，共6个稀释度。测定结果用活性标准品计算相应时间点的体内抗病毒活性(IU/ml)。

结果如图6所示，10、30和90ug/kg三个剂量的相应时间点从3～144hr范围内，体内干扰素抗病毒活性呈剂量反应关系。三者的体内活性均随时间延长而逐渐降低，最高活性维持在12～24hr之间。30ug/kg剂量注射后在12hr出现最高体内活性达15000IU/ml以上，24小时为11000IU/ml，48hr为6500IU/ml，72hr为4000IU/ml，96hr为2500IU/ml，144小时为500IU/ml。

实例8、PEG20-IFN-SA与IFN-SA免疫原性比较研究

IFN-SA设1.0μg/kg/d组、5μg/kg/d组、25μg/kg/d组皮下注射，连续4周。PEG-IFN-SA设10.0μg/kg/周组、30.0μg/kg/周组、90.0μg/kg/周组皮下注射，连续4周。每组6只食蟹猴，不同时间点采血检测抗IFN-SA的抗体滴度，并计算抗体滴度的几何均数(为抗体滴度倒数的反对数的平均值)。

结果表明：PEG20-IFN-SA显著降低了IFN-SA的体内免疫原性。

实例9、PEG20-IFN-SA对食蟹猴免疫功能的促进作用

设PEG20-IFN-SA10μg/kg、30μg/kg、90μg/kg低、中、高三个剂量组，皮下注射，每周一次。给药后30、58、175、180天进行外周血淋巴细胞增殖试验和NK细胞杀伤活性检测。

结果显示，给药2个月后，三个剂量组与对照组相比，ConA诱导外周血淋巴细胞增殖能力和NK细胞杀伤活性检测均显著增高(P＜0.05)。提示，PEG-IFN-SA有增强免疫功能的作用。

实例10、PEG20-IFN-SA体外抗乙型肝炎病毒的活性

选用乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2)的2.2.15细胞系，观察PEG20-IFN-SA和集成干扰素(商品名干复津或IFN(一)Con₁)在体外对HBsAg和HBeAg分泌、HBV DNA拷贝数的影响。设无药细胞对照组和不同药物浓度的给药组，PEG20-IFN-SA的终浓度为1.0×10⁶到0.0032×10⁶IU/ml五倍梯度稀释，每四天换一次液，再重新加药。样品与细胞总共作用9天后，取上清测定HBsAg、HBeAg浓度和HBV的DNA拷贝数，余下细胞加入MTT检测细胞增殖。通过获得细胞毒性TC₅₀和抑制HBsAg、HBeAg的IC₅₀，计算相应的治疗指数(TI)即TC₅₀/IC₅₀。如TI越大，表明抗HBV的作用越显著。采用荧光定量PCR测定HBV-DNA的拷贝数，上清和胞内HBV DNA拷贝数与对照组相比PEG20-IFN-SA最大降低率分别为94％和83％，而干复津为84％和76％。

	HBsAg的TI	HBeAg的TI	对细胞毒性TC50（IU/ml）
				PEG20-IFN-SA	5.2±0.8	1.9±0.6	1.02×106
IFN-con1	4.4±0.4	<1.0	6.2×106

结果表明：PEG20-IFN-SA具有较强的体外抗乙型肝炎病毒的活性。

实例11、PEG20-IFN-SA体外对肿瘤细胞株的抑制作用

选择四株肿瘤细胞株：肝细胞癌(HepG2)，乳腺癌(MCF-7)，急性早幼粒细胞性白血病(HL60)，肾癌(ACHN)。设无药细胞对照组和不同药物浓度的给药组，PEG20-IFN-SA终浓度为4.0×10⁵到0.001×10⁵IU/ml，四倍梯度稀释，共8个浓度梯度，作用48小时后MTT检测细胞增殖状况。

实验结果表明：PEG20-IFN-SA对四株肿瘤细胞均有明显抑制作用，提示PEG20-IFN-SA对肝细胞癌、乳腺癌、急性早幼粒细胞性白血病、肾癌有潜在的治疗作用。

实例12、PEG20-IFN-SA体内抗肿瘤作用

选择肾癌(ACHN)细胞株，传代生长至80％融合时，消化成单细胞悬液，以6.0×105个/200ul，皮下注射在雌性裸鼠的背部皮下，观察4～5天待皮下长出瘤块后，用数字测径仪检测肿瘤大小，随机分为模型组和PEG-IFN-SA治疗组，每组10只。PEG20-IFN-SA按106IU/kg，皮下注射，每周2次，模型组注射相同体积的生理盐水。第5次给药后24小时，处死裸鼠，手术剥离肿块，数字测径仪检测肿瘤大小。结果表明，PEG20-IFN-SA给药后肿瘤大小比模型组减小33％左右，具有一定的体内抗肿瘤生长的作用。

Claims (12)

1.重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物在制备用于治疗HBV感染性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的重组集成干扰素变异体氨基酸序列为SEQ ID No：1，聚乙二醇分子以酰胺键与重组集成干扰素变异体N末端甘氨酸的α氨基共价连接，而且所述聚乙二醇为分子量20KDa的醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物用于抑制HBeAg。

3.根据权利要求1所述的应用，其中醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子是单甲氧基聚乙二醇丙醛、单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛或单甲氧基聚乙二醇戊醛。

4.根据权利要求3所述的应用，其中醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子是单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇戊醛。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述重组集成干扰素变异体简称为IFN-SA，其氨基酸序列为SEQ ID No：1，所述重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物简称为PEG20-IFN-SA，其特征在于，所述重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物的制备方法包括如下步骤：

(1)IFN-SA溶液用100mmol/L pH5.5的PB缓冲液配成2mg/mL，加入1mol/L氰基硼氢化钠母液至终浓度为20mmol/L，按IFN-SA:mPEG-ButyrALD-20KD的摩尔比1∶4称取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反应溶液中，4℃条件下100r/min搅拌反应24h，取样进行SDS-PAGE电泳，确定PEG20-IFN-SA的修饰率；

(2)修饰后样品PEG20-IFN-SA，用5×DDW透析过夜，透析后样品上用BufferA平衡后的SP Sepharose F.F层析柱，分别用洗脱1、洗脱2、洗脱3、洗脱4、洗脱5进行洗脱，分别收集穿透峰及各个洗脱峰，并取样分别进行SDS-PAGE电泳分析，其中，所述BufferA的配方为10mM pH5.5的乙酸-乙酸钠，所述洗脱1的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.15M NaCl，所述洗脱2的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.2M NaCl，所述洗脱3的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.25M NaCl，所述洗脱4的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.35M NaCl，所述洗脱5的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.45MNaCl；

(3)收集SPSepharose F.F层析纯化后的PEG20-IFN-SA样品，上Superdex75分子筛，所述分子筛用10mmol/L pH7.4的PB平衡，平衡好后上样，再用10mmol/L pH7.4的PB等梯度分离，随后收集含PEG20-IFN-SA主峰，分别取样进行SDS-PAGE电泳分析。

6.一种重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物，其特征在于，所述的重组集成干扰素变异体氨基酸序列为SEQ ID No：1，聚乙二醇分子以酰胺键与重组集成干扰素变异体N末端甘氨酸的α氨基共价连接，而且所述聚乙二醇为分子量20KDa的醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子。

7.根据权利要求6所述的重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物，其中醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子是单甲氧基聚乙二醇丙醛、单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛或单甲氧基聚乙二醇戊醛。

8.根据权利要求7所述的重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物，其中醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子是单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇戊醛。

9.根据权利要求6～8之任一所述的重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中肿瘤是肾癌。

11.根据权利要求10所述的应用，其中肿瘤是ACHN细胞株引发的肾癌。

12.根据权利要求6所述的重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物，所述重组集成干扰素变异体简称为IFN-SA，其氨基酸序列为SEQ ID No：1，所述重组集成干扰素变异体的聚乙二醇偶联物简称为PEG20-IFN-SA，其是由包括如下步骤的制备方法制备的：

(1)IFN-SA溶液用100mmol/L pH5.5的PB缓冲液配成2mg/mL，加入1mol/L氰基硼氢化钠母液至终浓度为20mmol/L，按IFN-SA:mPEG-ButyrALD-20KD的摩尔比1∶4称取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反应溶液中，4℃条件下100r/min搅拌反应24h，取样进行SDS-PAGE电泳，确定PEG20-IFN-SA的修饰率；

(2)修饰后样品PEG20-IFN-SA，用5×DDW透析过夜，透析后样品上用BufferA平衡后的SP Sepharose F.F层析柱，分别用洗脱1、洗脱2、洗脱3、洗脱4、洗脱5进行洗脱，分别收集穿透峰及各个洗脱峰，并取样分别进行SDS-PAGE电泳分析，其中，所述BufferA的配方为10mM pH5.5的乙酸-乙酸钠，所述洗脱1的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.15M NaCl，所述洗脱2的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.2M NaCl，所述洗脱3的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.25M NaCl，所述洗脱4的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.35M NaCl，所述洗脱5的配方为pH5.5的10mM乙酸-乙酸钠和0.45MNaCl；

(3)收集SPSepharose F.F层析纯化后的PEG20-IFN-SA样品，上Superdex75分子筛，所述分子筛用10mmol/L pH7.4的PB平衡，平衡好后上样，再用10mmol/L pH7.4的PB等梯度分离，随后收集含PEG20-IFN-SA主峰，分别取样进行SDS-PAGE电泳分析。