CN101352573A - 聚乙二醇单修饰的重组人集落细胞刺激因子赖氨酸缺陷体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(PEG－rhG－CSF－LysD)。通过噬菌体展示技术表达所有赖氨酸突变的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG－CSF－LysD)，然后利用重组人粒细胞集落刺激因子受体筛选出具有高活性的rhG－CSF－LysD。最后，高活性的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG－CSF－LysD)经聚乙二醇氨基反应试剂定点化学修饰，获得N端定点修饰结构均一的PEG－rhG－CSF－LysD产物。该产物可以用来治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症。
Description
技术领域
本发明涉及了蛋白质聚乙二醇化修饰领域，更具体地说，涉及了一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(PEG-rhG-CSF-LysD)的制备和鉴定。
发明背景
天然人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)成熟蛋白具有174个氨基酸，分子量为19KDa，可诱导造血干细胞的增值和分化，导致血液中的中性粒细胞数增加；另外还能刺激成熟中性粒细胞数从骨髓中释出，并激活中性粒细胞的功能。因此自1991年起rhG-CSF已经广泛用于治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症，可以显著改善中性粒细胞减少症的严重性和持续时间。
但是和许多分子量小于30kDa的蛋白质药物一样，rhG-CSF在其代谢过程中易由肾小球滤过，在通过肾小管时又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而半衰期短。rhG-CSF血清半衰期只有2-4小时，为维持一定的疗效需要每天注射，持续注射5-7天，不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应(Welte K等，Proc Nat Acad Sci，82：1526-1530(1985)；Frampton JE等，Drugs，48(5)：731-60(1994))，这不仅增加了病人的痛苦，也增加了医疗费用。
聚乙二醇(PEG)化学修饰是延长蛋白类药物半衰期的一个有效途径。聚乙二醇(简称PEG)是一种惰性、两亲、不带电荷的柔性长链高分子聚合物，化学式为HO(CH2CH2O)nCH2CH2OOH，n为聚合单元的个数。PEG分子量随n的增加可由1kDa增至50kDa，有线性和分支两种构型，已经作为多种药物的安全载体用于临床应用。PEG通过共价键与蛋白质连接，可与蛋白质分子中的氨基(位于N末端的氨基或赖氨酸残基)或者巯基(位于半胱氨酸)反应对蛋白质分子进行修饰。该修饰可以有效地改变蛋白类药物在体内的分布和药物学特性，延长蛋白质药物的血药浓度，同时还可降低免疫原性。目前已经有多种聚乙二醇药物应用于临床，如聚乙二醇单修饰重组人干扰素α2a(PEG-IFNα2a)(Bailon P等，BioconjugateChem.，12：195-202(2001))、聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(Harris JM等，Clin Pharmacokinet，40：539-551(2001))等。
聚乙二醇(PEG)分子必须通过一个活化基团活化，才能与蛋白质表面的反应基团反应，以共价键形式连接到蛋白质分子上。但是，由于蛋白质分子量巨大，因此其潜在的可以与活性PEG反应的基团也是数目众多。在不同的位点结合PEG，其产物的稳定性，生物学活性等性质都是不同的。Yu-Sen Wang(Advanced DrugDelivery Reviews 54：547-570(2002))研究重组人干扰素α2a(IFNα2a)的PEG修饰时，就对此问题进行了详细阐述。当用12KD succinimidyl carbonate PEG(SC-PEG)修饰时，IFNα2a分子中包括N端氨基，Lys，His等共有14个基团可能被修饰，对于单修饰的PEG-IFNα2a，最终分析证明修饰制备所得的PEG-IFNα2a是由14种不同位点结合有一个PEG分子组成的混合物，而且这14种PEG-IFNα2a的活性是不一致的，其相对生物学活性最高保留了37％，最低仅保留了6％。OlafBKinstler等(美国专利US5985265，1999年公开)研究重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修饰时就发现，当采用20KD的mPEG-SCM(N-hydroxysuccinimidyl ester of carboxymethyl methoxy polyethylene glycol)修饰时，最终制备获得的单一修饰的PEG-rhG-CSF是由N端，Lys35，Lys41分别结合有一个PEG分子组成的混合物。进一步分析这三种不同的PEG-rhG-CSF分子，发现N端修饰的PEG-rhG-CSF活性最高，保留了原有活性的68％，Lys35和Lys41修饰产物活性分别为56％和21％，而且Lys35修饰产物是不稳定的，在体外很容易被降解。为了达到特定修饰于某个位点，从而获得相对均一的产物，该专利方法提供了另外一种特别的低pH修饰方法，使PEG能定向结合于rhG-CSF的N端，从而获得均一，稳定而且高活性的PEG-rhG-CSF。其原理是利用蛋白质中不同伯氨基团的化学反应性差异：α-氨基与ε-氨基的pKa(解离常数)不同，α-氨基(位于N端)的pKa为7.8，ε-氨基(位于赖氨酸残基)的pKa为10.1。如果以醛基化的PEG(mPEG-aldehyde)进行氨基修饰，pKa低的α-氨基比ε-氨基更具有反应优势，优先进行反应，可以实现蛋白质N端的优势反应。因此在低pH下(pH 5.0)用mPEG-丙醛对rhG-CSF的修饰，大于70％的修饰产物为N端特异性修饰。但这种方法仍存在缺点：
(1)在低pH下rhG-CSF虽然倾向于与N端的α-氨基反应，但其反应的选择性只是相对的，rhG-CSF结构中其余的四个Lys残基的氨基还是有少量副反应，因而最终获得只是N-端修饰占大多数的PEG-rhG-CSF混合物。
(2)所获得最终产物可能是不同修饰位点的混合物，还可能有多修饰产物，这些对于PEG-rhG-CSF的后续纯化及临床应用等都是不利的。我们按照该专利的方法反复进行了试验，最终产物始终有二修饰的PEG-rhG-CSF的存在，证明在该条件下除N端的α-氨基外，其余的四个Lys残基确实也参加了反应，参见实例2的结果。
(3)由于是在低pH条件下反应，因此反应时间很长，反应效率低。
基于以上说明，因此，如果能找到一种方法能制备一种真正定点修饰的结构均一的单PEG化rhG-CSF产物，具有很重要的临床和经济意义。
发明内容
本发明的一个目的是避免现有PEG修饰重组人粒细胞集落刺激因子技术存在的缺陷，提供一种聚乙二醇(PEG)单修饰的结构均一的重组人粒细胞集落刺激因子突变体。
本发明的另一个目的是提供一种聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种包含上述聚二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的药物制剂及其在制备治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症药物中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现最终目的：通过基因突变技术，将重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)一级结构中的4个赖氨酸残基Lys17，Lys24，Lys35和Lys41分别突变为除Lys外的其它19种人体天然氨基酸之一。通过噬菌体展示技术表达所有不含赖氨酸的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(recombinanthuman granulocyte colony stimulating factor Lysine deficient，rhG-CSF-LysD)，然后利用重组人粒细胞集落刺激因子受体筛选出具有基本保留rhG-CSF原有的生物学活性的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)。突变后的rhG-CSF-LysD仅保留有N端一个α-氨基，当与聚乙二醇(PEG)氨基反应试剂反应时，PEG特异性结合于rhG-CSF-LysD其N端的α-氨基，从而获得N端定点修饰结构均一的PEG-rhG-CSF-LysD产物。
重组人重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)一级结构中有4个赖氨酸残基，分别为Lys17，Lys24，Lys35和Lys41。通过基因突变技术，可以将这4个赖氨酸残基分别突变为除Lys外的其它19种人体天然氨基酸之一，并且突变后的不含赖氨酸的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(recombinant human granulocytecolony stimulating factor Lysine deficient，rhG-CSF-LysD)要基本保留rhG-CSF原有的生物学活性，所谓基本保留rhG-CSF原有的生物学活性是指突变后的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体的生物学活性至少在rhG-CSF原有活性的80％以上。生物学活性的测定可参照2005年版《中国药典》第三部附录58所示的方法。
为了得到用其他合适的氨基酸取代赖氨酸又基本保留了rhG-CSF活性的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)，需要利用噬菌体展示技术对突变后的rhG-CSF-LysD进行筛选。噬菌体展示技术是目前一种广泛使用的高亲和力和高活性蛋白质筛选技术，该技术能够在丝状噬菌体表面上表达多种随机的蛋白质，再经过与特定配基结合、洗脱和重复筛选，最后得到与受体或者配体有高亲和力蛋白质。
本发明中，为了构建4个赖氨酸全被替换的具有生物活性的rhG-CSF-LysD，首先我们利用PCR法创建一个4个Lys编码被随机替代的rhG-CSF-LysD cDNA文库(具体方法见实例1)，然后通过噬菌体展示技术，用重组人粒细胞集落刺激因子受体作为配体，通过多轮筛选后得到了4个活性基本保留的rhG-CSF-LysD，其氨基酸序列见表1，其体外活性和rhG-CSF相当(见表2)。
表14个高活性rhG-CSF-LysD的赖氨酸取代氨基酸(表中字母为氨基酸缩写)
| 克隆编号 | K17 | K24 | K35 | K41 |
| 19 | M | R | L | R |
| 53 | A | H | R | V |
| 124 | R | I | R | R |
| 137 | T | G | R | S |
表2rhG-CSF和各种rhG-CSF-LysD修饰前后的活性
| G-CSF突变蛋白 | Lys突变位点 | 活性×108IU/mg | 相对值(以rhG-CSF活性为标准) | mPEG-ALD20000修饰后×108IU/mg | 相对值(以rhG-CSF活性为标准) |
| rhG-CSF | 无lys突变 | 0.82 | 100％ | 0.58* | 71％ |
| rhG-CSF-LysD(19号克隆) | rhG-CSF第17、24、35、41的K突变为，M、R、L、R | 0.78 | 95％ | 0.57 | 70％ |
| rhG-CSF-LysD(53号克隆) | rhG-CSF第17、24、35、41的K突变为A、H、R、V | 0.82 | 100％ | 0.60 | 73％ |
| rhG-CSF-LysD(124号克隆) | rhG-CSF第17、24、35、41的K突变为R、I、R、R | 0.81 | 99％ | 0.54 | 66％ |
| rhG-CSF-LysD(137号克隆) | rhG-CSF第17、24、35、41的K突变为T、G、R、S | 0.76 | 93％ | 0.58 | 71％ |
*修饰在N端
筛选到的rhG-CSF-LysD蛋白可以通过原核生物或真核生物宿主基因重组技术表达外源性DNA序列而得到，合适的原核生物宿主包括各种细菌(如E coli.)；合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)。依据所用的宿主的不同，rhG-CSF-LysD表达产物可能会被哺乳动物或其它真核细胞中的碳水化合物所糖基化修饰。对于本发明所用的人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)，优选的采用原核表达系统或酵母表达系统的产物，例如E.coli或甲醇酵母表达系统。
这些改构的rhG-CSF-LysD，由于蛋白序列中只存在一个α-氨基，不存在ε-氨基。因此，这些突变体用聚乙二醇氨基反应试剂修饰，在不同pH，不同PEG摩尔比条件下，所的的产物均是定点单修饰的，而没有二修饰或多修饰产物的存在，实例2的结果表明rhG-CSF-LysD确实仅存在N端α-氨基一个反应位点。所述的带聚乙二醇氨基反应试剂为有氨基反应基团的聚乙二醇分子，详细可参考StevenM(Modification of CD4 Immunoadhesin with Monomethoxypoly(ethylene glycol)aldehyde via Reductive Alkylation，Bioconjugate.Chem，1994，5：133-140)论文中第134页表1中列举的PEG种类以及姜忠义等(蛋白质和肽类分子的聚二醇化化学，《有机化学》2003年第23卷12期：1340-1347)论文中所描述的那些PEG衍生物，包括但不局限于：PEG琥珀酰亚胺碳酸酯，PEG对硝基苯碳酸酯，PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯，PEG碳酰咪唑，PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)，PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯，甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate，mPEG-SC)，甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)、甲氧聚乙二醇丁醛等，以及将两个线性的BTC-PEG或mPEG-SC链连到赖氨酸的α-氨基和ε-氨基形成的分支状的PEG衍生物等。聚乙二醇氨基反应试剂可以和rhG-CSF-LysD的α-氨基基团特异性的结合，获得聚乙二醇定点单修饰的产物。这些活性聚乙二醇可以是分子量大于5kDa的任意大小的PEG，其形状可以是单链或者分支状，其中优选分子量在5kDa到40kDa之间的线性或分枝PEGs，更优选分子量为20kDa的单链聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD20000)。
如前所述，由于rhG-CSF-LysD的蛋白序列中只存在一个反应氨基(α-氨基)，因此，带有氨基反应基团的PEG只能和rhG-CSF-LysD的N-端的α-氨基基团特异性的结合，获得聚二醇定点单修饰的产物，这克服了背景技术中PEG修饰的多氨基修饰所带来的反应位点不一和多修饰产生等缺陷，简化了后续纯化过程，提高了蛋白收率。
本发明还提供一种聚乙二醇(PEG)单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)的制备方法，其包括如下步骤：
(1)在含水介质中，带有氨基反应基团的聚乙二醇分子与重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)中的α-氨基反应；
(2)任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)的产物。
较合适的修饰反应条件是rhG-CSF-LysD浓度大于1毫克/毫升，蛋白质∶PEG分子的比例在1∶1-1∶20之间，pH条件为酸性、中性或碱性，优选为pH7-9.5。带有氨基反应基团的聚乙二醇分子可为甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯，如甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate，mPEG-SC)或甲氧聚乙二醇醛，如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)。经修饰反应后获得的为含有PEG-rhG-CSF-LysD的混合物，其中含有PEG-rhG-CSF-LysD、未反应的活性PEG分子和rhG-CSF-LysD等。需要通过合适的分离纯化方法，例如通过离子交换层析和分子筛层析的组合来纯化上述混合物体系，最终获得的制品含有至少90％以上的PEG-rhG-CSF-LysD和至多10％的未发生聚乙二醇化的rhG-CSF-LysD，优选制品含有至少95％以上的PEG-rhG-CSF-LysD和至多5％的未发生聚乙二醇化的rhG-CSF-LysD，更优选制品含有至少99％以上的PEG-rhG-CSF-LysD。
本发明所制备的PEG-rhG-CSF-LysD，与以前的方法相比，由于采用不含赖氨酸的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)，仅保留了N端α-氨基一个反应位点与聚乙二醇氨基反应形式相结合的技术方案，因而在蛋白质修饰方面获得了显著的有益效果，对采用上述方法形成的蛋白分子进行检验，得到如下结果：(1)定点修饰结构均一，均为蛋白质N末端的α-氨基连接一个PEG分子，没有一个蛋白分子连接几个PEG的产物，也没有其他位点连接PEG的异构现象；(2)反应效率高，最高可以达到95％-99％；反应时间短，反应时间在2-4h内完成；(3)体外比活性降低很少(见表2)；(4)体内活性实验明显长效，动物实验证实，其体内半衰期延长到了14.6小时，比未修饰的G-CSF(T1/2＝2.2小时)提高了7倍，达到了长效、减少给药次数的目的。
本发明还提供了一种含有聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(PEG-rhG-CSF-LysD)的药用组合物，该药物制剂含有上述的有效量的生物制品和药用稀释剂、佐剂或载体等。该药剂可用于治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症，由于半衰期延长，因此可实现每周只给药1次。优选制剂为注射水针，每毫升含6mg mPEG-rhG-CSF-LysD，0.35mg乙酸钠，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化钠，pH为4.0。
以下实例将进一步说明本发明。
附图说明
图1为重组人粒细胞集落刺激因子通过PCR定点突变获得赖氨酸缺陷体的示意图，其中N和S分别代表G/A/T/C和G/C。
图2为rhG-CSF和rhG-CSF-LysDPEG修饰和纯化的SDS-PAGE电泳图，其中1为marker，从上到下分子量分别为97KD，66KD，43KD，31KD，21KD和14KD；2为纯化的rhG-CSF；3为rhG-CSF PEG修饰反应混合物；4为纯化的rhG-CSF-LysD；5为rhG-CSF-LysD PEG修饰反应混合物；6为Resource S洗脱峰1；7为浓缩的Resource S洗脱峰2。
图3为Source S分离纯化PEG-rmhG-CSF的层析图
图4为小鼠皮下给药后rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD的血药浓度-时间图
图5为小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rhG-CSF-LysD和空白对照的白细胞总数变化情况
具体实施方式
实例1高活性重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)的获得
a.展示人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)的噬菌体文库构建
为了构建4个赖氨酸全被替换的具有生物活性的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)，我们用随机序列替代4个Lys的编码序列来创建一个重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)的cDNA文库。用NNS序列通过3步PCR随机的取代Lys的编码序列(附图1)。
首先我们要先构建pUC118-rhG-CSF质粒。rhG-CSF基因的克隆方法可参考中国专利CN96106418.8实施例1。以获得的cDNA为模板，设计引物如下：
上游引物：5‘-GAATTCATGACACCATTAGGC-3’；
下游引物：5’-GGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3’(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，用常规PCR方法进行目的基因的扩增。PCR产物经回收、纯化，装到pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，将阳性克隆送测序检测。将测序正确的克隆基因用EcoR I和BamH I从pGEM-T上切割回收，然后装到经同样酶切处理的pUC118上，T4DNA连接酶，12.5℃连接过夜，同样转化DH5α感受态细胞，经筛选鉴定，获得pUC118-rhG-CSF质粒。然后以此pUC118-rhG-CSF质粒为模板经过三轮PCR反应：即第一轮PCR反应是以质粒pUC118-rhG-CSF为模板，以Oligo-1和Oligo-2作为引物的，通过标准PCR方法，获得长度为88bp的PCR产物，用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收第一轮的PCR产物；第二轮PCR仍然以质粒pUC118-rhG-CSF为模板，但是反应的引物对是第一轮的PCR产物和Oligo-3，通过标准PCR方法，获得长度为130bp的PCR产物，用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收第二轮的PCR产物；第三轮PCR反应还是以质粒pUC118-rhG-CSF为模板，但是反应的引物对是第二轮的PCR产物和Oligo-4，通过标准PCR方法，获得长度为537bp的PCR产物，用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收第三轮的PCR产物。最终的PCR产物回收后用限制性内切酶EcoR I和BamH I切割，将一部分回收的酶切产物用DNA连接酶和同样用EcoR I和BamH I切割的噬菌粒载体pUC118连接，将连接产物转化TG1感受态细胞，转化后的感受态细胞涂布含有Amp和IPTG及X-gal的2×YT平板(配方见分子克隆第2版附录，冷泉港出版社)，37℃培养过夜，挑取白色的单克隆扩增培养后少量提取质粒，进一步酶切鉴定证实已获得重组的噬菌粒pUC118-重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)(具体的操作参见分子克隆)。Oligo 1-4序列如下，其中Oligo 1-3设计含有NNS序列，(N和S分别代表G/A/T/C和G/C，来取代编码G-CSF中的Lys17，Lys25，Lys34，Lys41序列)。
Oligo-1：
5’-GAATTCATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCNNSTGCTTA-3’
Oligo-2：5’-CATCGCCCTGGATSNNCCTCACTTG-3’
Oligo-3：5’-ACAGSNNGTAGGTGGCACACAGSNNCTC-3’
Oligo-4：5’-GGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3’
含重组噬菌粒的大肠杆菌TG1培养液以10mL/L接种于含Amp的2×YT培养基中，37℃摇床培养至A600nm值为0.6，加入辅助噬菌体M13K07继续培养1h，4000g离心15min，收集的菌体加入到新鲜的含Amp，Kan的2×YT培养基中，30℃摇床培养14~18h。将上述培养物10800g，4℃离心10min，收集上清。加入1/6体积PEG/NaCl(200g/L PEG8000，2.5mol/L NaCl)，充分混匀后4℃静置1h，10800g，4℃离心30min，TBS溶解，加入1/6体积的PEG/NaCl，充分混匀后0℃放置20min，10800g，4℃离心30min，TBS溶解，10800g，4℃离心10min，吸取上清，即为表面呈现重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)的重组噬菌体。
b.高活性的人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)文库筛选
取提前配制好含0.1g/L叠氮钠的封闭液14mL稀释PEG沉淀的16ml重组噬菌体，室温下孵育10~15min后，取20mL加入G-CSF受体(R&D公司)包被的锥形培养瓶中，37℃孵育2h。PBS，PBST洗培养瓶，然后将10mL培养至对数生长期的TG1细胞加入上述免疫吸附后的培养瓶内，37℃孵育1h，让吸附的重组噬菌体感染TG1细胞，完成第一轮筛选。将10mL感染了重组噬菌体的TG1细胞转移至50mL细菌培养管中，加氨苄青霉素至100mg/L、葡萄糖至终浓度20g/L，再加入辅助噬菌体M13K07，37℃，250r/min震荡培养1h，同前述方法一样进行又一轮筛选.用相同方法完成第3、第4轮筛选，再感染TG1细胞，得到富集的噬菌体克隆。
随机挑选经筛选后的单克隆400个，利用NFS-60细胞的生长对G-CSF的依赖性进行体外生物活性检测，以天然的G-CSF为对照，MTT色素还原法测定样品的生物学活性。结果显示在这些克隆中有165个克隆的生物活性和天然的G-CSF相似。对这些阳性克隆进行DNA序列分析发现，其中有4个克隆，4个lysine完全被其他氨基酸取代(表3)，其体外生物学活性和G-CSF相当(表4)。
表34个高活性rhG-CSF-LysD的赖氨酸取代氨基酸及其核苷酸序列
| 克隆编号 | K17 | K24 | K35 | K41 |
| 19 | M(ATG) | R(CGC) | L(CTC) | R(CGG) |
| 53 | A(GCC) | H(CAC) | R(AGG) | V(GTC) |
| 124 | R(CGG) | I(ATC) | R(CGC) | R(AGG) |
| 137 | T(ACG) | G(GGG) | R(AGG) | S(TCC) |
表4.G-CSF和rhG-CSF-LysD的体外生物学活性比较
c.高活性的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)在原核系统中的表达、纯化和性质鉴定
取隆编号为19、53、124和137的高活性的人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体(rhG-CSF-LysD)，参照中国专利(96106418.8)进行克隆表达、纯化和性质鉴定，最后获得纯度、和活性等都符合要求的rhG-CSF-LysD进行修饰，以下实例部分仅取19号的rhG-CSF-LysD进行PEG修饰、纯化和性质鉴定。，
实例2PEG-rhG-CSF-LysD的制备
a.rhG-CSF和rhG-CSF-LysD的PEG修饰
rhG-CSF的PEG修饰：准备5ml 5mg/ml的rhG-CSF，100mM NaAc(pH5.0)，然后加入平均分子量为20KDa的MPEG-ALD(聚乙二醇-丙醛，直链)和20mM NaCNBH4，在4度下轻轻搅动16h后，SDS-PAGE分析结果表明16个小时后rhG-CSF的修饰率已经达到90％以上，包括单修饰和多修饰的PEG-rhG-CSF(图2，泳道3)。
rhG-CSF-LysD的PEG修饰：准备5ml 2mg/ml的rhG-CSF-LysD(19号)，100mM PBS(Ph7.5)，然后加入平均分子量为20KDa的MPEG-ALD(聚乙二醇-丙醛，直链)和20mM NaCNBH4，在25度下轻轻搅动4h后，SDS-PAGE分析结果表明4个小时后rmhG-CSF的修饰率已经达到95％以上，而且只有单修饰的PEG-rhG-CSF-LysD(图2，泳道5)。因此，利用rhG-CSF-LysD进行PEG修饰有以下两个优点：
(1)修饰后的PEG-rhG-CSF-LysD均是单修饰的(图2，泳道5)，没有rhG-CSF进行PEG修饰后产生的多修饰和不定点修饰问题。这为后续的纯化和规模法生产提供了方便；
(2)反应效率高，最高可以达到95％-99％；反应时间短，反应时间在4h内完成。
b.PEG-rhG-CSF-LysD的制备
然后用注射用水把反应液稀释到1mg/ml，pH以稀盐酸调至4.0，过source 30S离子交换柱(16×10)，在0-0.5MNaCl，20mMNaAc(pH4.0)中梯度洗脱，其中单修饰的PEG-rhG-CSF-LysD在20％梯度洗脱下。收集和合并峰(图3)，SDS-PAGE电泳显示该峰为单条带，收率达到50％以上
实例3PEG-rhG-CSF-LysD等生物学活性的分析
体外生物活性的测定：采用MTT方法((Welte K等，Proc Nat Acad Sci，82：1526-1530(1985))。具体步骤为：在96孔细胞培养板中接种一定浓度的细胞悬液(50μL/孔)，将rhG-CSF标准品(中国药品生物制品检定所)和修饰rhG-CSF样品系列对倍稀释，各取50μL加入培养板相应孔中。设阳性对照、阴性对照(不含rhG-CSF)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％CO2培养36-48h，加MTT溶解液100μL/孔，次日测定各孔A570/A630值。
经生物学活性测定显示(表5)修饰前的rhG-CSF和rhG-CSF-LysD分别为0.82×108IU/mg和0.78×108IU/mg，两者活性相当，说明我们筛选到高活性的rhG-CSF-LysD；而修饰后的PEG-rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD分别为0.58×108IU/mg和0.57×108IU/mg，两者活性还是相当，说明rhG-CSF和rhG-CSF-LysD的PEG修饰过程和性质是相似的，而且PEG修饰的rhG-CSF-LysD更定点和专一。
表5.各种G-CSF体外生物学活性比较
实例4PEG-rhG-CSF-LysD体内药物代谢动力学和药效动力学的分析
药代动力学的测定：采用双抗体夹心ELISA法检测样品中rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD的血药浓度。每组三只18~22g雄性SPF级ICR小鼠，参照表6进行注射和采集血样后，再将血样离心30min后分离血清，-20℃保存待测。用双抗体夹心ELISA法检测样品中rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD的血药浓度，具体操作参见Human G-CSF DuoSet试剂盒(R&D Systems)的操作手册。得到标准品的数据用MicroCal Origin软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线，并求回归方程及相关统计参数；用Microsoft Excel 2003软件将样品数据代入标准曲线的回归方程计算相关数值并作图；最后用3P87软件进行曲线拟合并计算主要药代动力学参数。
表6皮下给药和取样方法
*SC＝subcutaneous；D1＝first day
结果：rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD小鼠皮下给药(subcutaneous，SC)后的血药浓度-时间数据主要药动学参数见表7，PEG-rhG-CSF-LysD与rhG-CSF在小鼠体内的血药浓度-时间曲线比较见图4。从表7中可看到：rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD血清中药物的半衰期(T1/2)分别为2.2h和14.6h，后者是前者的7倍；PEG-rhG-CSF-LysD的AUC值为14400ng·h·ml-1，是rhG-CSF的16倍；从图4的血药浓度-时间曲线图可直观看出，达峰时间PEG-rhG-CSF-LysD明显大于rhG-CSF，并且在70h后在血液中可以检测到PEG-rhG-CSF-LysD的血药浓度，血药浓度的波动显著减少。从上述药代参数对比来看，PEG修饰技术确实可以延长rhG-CSF的半衰期，从而达到长效的目的。
表7小鼠皮下给药后rhG-CSF和PEG-rhG-CSF-LysD的药代参数
Abbreviations：SC＝subcutaneous；T1/2＝terminal half-life；T(peak)＝time of maximum concentration；C(max)＝maximum concentration；AUC＝area under the curve；CL/f(s)＝clearance over bioavailability；V/f＝volume ofdistribution using the terminal phase.
药效动力学的分析：自中科院上海实验动物中心购入19~23gICR小鼠245只(125只雄性，120只为雌性)，除正常对照组注射等量的生理盐水外，其余小鼠注射环磷酰胺1mg/10g体重，连续3天，随机取正常和造模小鼠5只，经测试造模成功。将造模成功小鼠随机分成3组，分组和给药见下表8，给药剂型为水针，每毫升含6mg的mPEG-rhG-CSF-LysD，0.35mg乙酸钠，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20，和0.02mg的氯化钠，pH为4.0。采集各组给药后D2、D4、D6、D8天各5只小鼠血样进行血细胞计数和白细胞分类计数和评价。
表8分组和给药
结果如下：表9、图5分别为小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rhG-CSF-LysD和对照的白细胞总数表和图。从中可看出PEG-rhG-CSF-LysD对环磷酰胺引起的小鼠白细胞减少症有升白作用，其5天一次注射的效果与每天注射的rhG-CSF效果相当。
表9小鼠皮下给药后rhG-CSF、PEG-rhG-CSF-LysD和对照的的白细胞总数
| 组别 | 剂量 | WBC(k/ul)(第2天) | WBC(k/ul)(第4天) | WBC(k/ul)(第6天) | WBC(k/ul)(第8天) |
| rhG-CSF | 0.1mg/kg*5 | 2.56±132 | 2.78±1.31 | 10.36±9.33 | 4.53±277 |
| PEG-rhG-CSF-LysD | 0.5mg/kg | 1.46±0.63 | 13.18±3.33 | 12.56±13.32 | 4.20±1.52 |
| NS组 | 0.1ml/10g | 1.30±0.50 | 2.45±133 | 3.36±1.12 | 3.56±1.20 |
序列表
<110>杭州九源基因工程有限公司
<120>聚乙二醇单修饰的重组人集落细胞刺激因子赖氨酸缺陷体
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>Seq ID No.1
<211>175
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>Seq ID No.1
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Met Cys Leu Glu Gln Val Ary Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu leu Leu Cys Ala Thr Tyr Arg Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170 175
<210>Seq ID No.2
<211>175
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>Seq ID No.2
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ala Cys Leu Glu Gln Val Ary His Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
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Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Val Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
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Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp val Ala
100 105 110
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130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170 175
<210>Seq ID No.3
<211>175
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>Seq ID No.3
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Arg Cys Leu Glu Gln Val Ary Ile Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Arg Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
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Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp val Ala
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Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
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Phe Leu Glu val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>Seq ID No.4
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130 135 140
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Phe Leu Glu val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170 175
Claims (10)
1、一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体，其特征在于：
(1)所述的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体为将重组人粒细胞集落刺激因子一级结构中的Lys17、Lys24、Lys35和Lys41这4个赖氨酸残基分别突变为除Lys外的其它19种人体天然氨基酸之一，并且突变后的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体基本保留重组人粒细胞集落刺激因子原有的生物学活性；
(2)聚乙二醇定点结合于重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体的N-端。
2、根据权利要求1所述的聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体，其特征在于：所述的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体氨基酸序列与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示的序列一致。
3、根据权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体，其特征在于：所述的聚乙二醇为带有氨基反应基团的聚乙二醇分子。
4、根据权利要求3所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为PEG琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG对硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)、PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate，mPEG-SC)、甲氧聚乙二醇醛或将两个线性的BTC-PEG或mPEG-SC链连到赖氨酸的α-氨基和ε-氨基形成的分支状的PEG衍生物等。
5、一种含有如权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体的生物制品，其特征在于：所述制品含有至少90％以上的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体和至多10％的未发生聚乙二醇化的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体。
6.权利要求1-5中任一项的生物制品在制备治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症药物中的应用。
7、一种制备如权利要求1所述的聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体的方法，其包括如下步骤：
(1)在含水介质中，带有氨基反应基团的聚乙二醇分子与重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体中的α-氨基反应；
(2)任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体的产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：重组人粒细胞集落刺激因子赖氨酸缺陷体蛋白浓度大于1毫克/毫升，蛋白质∶PEG分子的比例在1∶1-1∶20之间。
9、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：含水介质的pH条件为酸性、中性或碱性。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇分子为PEG琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG对硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)、PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate，mPEG-SC)、甲氧聚乙二醇醛或将两个线性的BTC-PEG或mPEG-SC链连到赖氨酸的α-氨基和ε-氨基形成的分支状的PEG衍生物等。
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