CN102266550A - 一种聚乙二醇-集成干扰素变异体注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇-集成干扰素变异体注射剂，所述注射剂包括每毫升50-500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体蛋白，以及包括保持pH在4.5-7.5的缓冲体系、稀释剂和稳定剂，本发明聚乙二醇-集成干扰素注射剂稳定，适合长期储存。

Description

一种聚乙二醇-集成干扰素变异体注射剂

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇-集成干扰素变异体注射制剂，属于药物制剂领域。

背景技术

早在1957年，lssacs等人发现病毒感染的细胞产生一种因子，可抵抗病毒的感染，干扰病毒的复制，因而命名为干扰素（interferon,IFN）。干扰素是由灭活的或活的病毒作用于易感细胞后，由易感细胞基因组编码而产生的一组糖蛋白。其活性及抗原性皆取决于分子中的蛋白质，而与其糖基无关。根据其来源和结构，可将IEN分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ，它们分别由白细胞、纤维母细胞和活化T细胞产生。IFN-α为多基因产物，有十余种不同亚型，但它们的生物活性基本相同。IFN除有抗病毒作用外，还有抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖及引起发热等作用。目前临床上使用的干扰素大多是通过基因重组技术得到的。

IFN是慢性病毒性肝炎经临床验证有效的一线治疗药物。临床使用较多的是天然结构的IFNα-2a和IFNα-2b。二者均属于短效干扰素，半衰期短(4～16 h)，血清浓度在注射24 h后已经很低。其在体内的药代动力学过程影响了其抗病毒治疗的远期疗效。按照目前3~6MU/kg，每周3次的用药方法，在体内干扰素水平呈现出典型的“峰-谷曲线”。干扰素血清水平大幅度波动容易使病毒水平反跳，产生耐药性，降低治疗效果。同时，短效干扰素存在毒副反应大，人长期使用耐受性差，免疫原性强等不足。因此，对短效干扰素进行修饰，延长其在体内的半衰期，维持体内血药浓度的稳定，将有助于提高其治疗病毒性肝炎的有效性，并减轻毒副作用。

为提高天然干扰素的活性，美国Amgen公司首次合成了一种非天然的干扰素（Consensus interferon,集成干扰素，商品名为干复津）。干复津是一种经计算机优化组合的非天然的重组α-干扰素，其序列由20种天然α-干扰素亚型序列优化组合而成，其抗病毒活性比天然干扰素提高了5～10倍。1997年，FDA批准干复津应用于丙型肝炎的治疗，研究结果显示疗效明显优于普通干扰素。美国专利US4695623、US4897471、US5372808公开了复合干扰素具有广谱的干扰素活性，有较强的抗病毒和抗肿瘤以及激活NK细胞的活性。但是干复津和天然α干扰素相同，具有稳定性差、体内半衰期短、免疫原性强等缺点。同时N端第一位的半胱氨酸需与99位半胱氨酸形成二硫键，不能有效的进行N末端修饰。虽然Amgen公司的美国专利US005985265 A公开了和干复津蛋白的N端修饰的方法，但无论在修饰率和修饰后保留的生物活性均明显低于其它蛋白的N末端修饰（重组人粒细胞集落刺激因子G-CSF和重组人生长激素GH等）。

在干复津基础上，根据同源序列最高原则，发明人设计了全新的集成干扰素序列，命名为集成干扰素变异体（super antiviral interferon,简称IFN-SA），现根据干扰素的命名原则改为重组集成干扰素变异体（或称重组复合干扰素变异蛋白）。由171氨基酸组成，在N末端专门设计引入Gly Ser Gly Gly Gly五个氨基酸序列，可实现N末端的专一位点PEG修饰。该结构与干复津结构不同，同时体外抗病毒活性提高了50%。本新型结构及其重组制备和在抗病毒性疾病中的应用，已获中国发明专利授权，专利号：ZL01102915.3。

然而，与其它蛋白质一样，使用集成干扰素变异体作为药物通常也会受到一些缺点的限制，包括免疫原性和半衰期短，其免疫原性导致中和抗体的形成以及临床治疗效果的损失，半衰期短则意味着需要对患者频繁给药以维持蛋白的有效治疗浓度。

聚乙二醇(polyetnylene glycol， PEG)是一种安全无毒、无活性的聚合物，常用于蛋白质药物修饰。修饰后的蛋白抗酶解、水溶性增加、半衰期延长、免疫原性和毒性降低（Inada,et al.,J.Bioact .And Compatible Polymers,5:343(1990). Delgalo,et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems,  9:249 (1992)    katre,Advanced Drug Delivery Systems,10:91(1993)）。

然而，尽管干扰素-聚合物缀合物在临床上有效，但是该类缀合物在临床实践中的广泛使用，需要能够在生产和分发给医疗机构期间的一段延长期内储存的制剂，不同的干扰素，由于其本身理化性质的差异，比如对pH值、温度敏感性等的不同，制成稳定的制剂时，其在赋形剂的选用上也会不同。

目前，上市的聚乙二醇集成干扰素变异体制剂仍然没有，因此，需要提供一种稳定的、可供临床方便使用、并且适宜储存的制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定的并适合长期储存的聚乙二醇-集成干扰素变异体制剂，尤其是一种注射剂。

本发明所述聚乙二醇-集成干扰素变异体注射剂，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，以及包含保持pH在4.5-7.5的缓冲体系、一定量的稀释剂和稳定剂，其中，所述的集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶。

本发明中，所述的保持pH值在4.5-7.5的缓冲体系可以是醋酸盐缓冲体系、碳酸盐缓冲体系、枸橼酸盐缓冲体系或磷酸盐缓冲体系。

本发明中，优选的缓冲体系为磷酸盐缓冲体系，优选的pH值范围为6.5-7.5。

所述的稀释剂可以是甘露醇、蔗糖或山梨醇，所述的稳定剂可以是吐温-80或Pluronic F86。

本发明中，以重量计，稀释剂的量为1%-10%，稳定剂的量为0.001%-0.01%。

作为聚乙二醇-集成干扰素变异体缀合蛋白，所用的聚乙二醇，可以是直链聚乙二醇，也可以是支链聚乙二醇，优选为直链聚乙二醇，更为具体地，偶联本发明集成干扰素变异体的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇（mPEG）醛，如可以是单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛、单甲氧基聚乙二醇丁醛，以实现对集成干扰素N末端的定点修饰，所用的mPEG的分子量范围可以选自是5000-50000，优选为10000-20000的范围，如可以是mPEG₁₂₀₀₀，mPEG₂₀₀₀₀。

本发明在作为一种注射液时，在用水配制后，它含有下列组分：

50至500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，其中所述集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶；

保持pH为6.5-7.5的NaH₂PO₄.2H₂O-Na₂HPO₄.12H₂O缓冲体系；

重量比为1%-10%的山梨醇；

重量比为0.001%-0.01%的吐温-80；

注射用水。

注射液中，聚乙二醇-集成干扰素为在N末端GlySerGlyGlyGly上进行单一修饰的单甲氧基聚乙二醇-集成干扰素变异体。

修饰集成干扰素的聚乙二醇，为分子量为12kDa或20kDa的mPEG。

作为注射液，本发明所述注射液，其半成品可以装入安瓿瓶中，也可以装入西林瓶中，装量大小，依临床需要设定，如可以是规格为1ml、2ml、3ml、5ml、10ml等。

在一个优选的例中，作为本发明的一个液体注射剂型，为更为方便医护人员用药，本发明所述注射剂的液体剂型，还可以装入预充式注射器中，制成预充式聚乙二醇集成干扰素变异体注射剂，装量大小，可以根据需要来确定，这些，按临床及医护人员的需求，本领域技术人员很容易就实现，比如可以装成每单位预充式注射器装0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml等。

作为一种液体注射液，当将所得的稳定的液体注射液进行冻干后，可以得到更利于储存是冻干粉针型注射剂。

本发明的一个实施例中，对比了本发明制备所得的mPEG-IFN-SA原液与缓冲剂制成注射液半成品，与加入稳定剂如吐温80以及稀释剂如山梨醇后制成的注射液半成品，其稳定性比较，结果表明，加入稳定剂后，所得半成品的稳定性明显要强于原液直接配成注射剂。

本发明的一个实施例中，给出了不同的缓冲剂对聚乙二醇-集成干扰素变异体稳定性可能的作用，分别比较了磷酸盐缓冲系统、碳酸盐缓冲系统、醋酸盐缓冲系统、枸橼酸盐缓冲系统，其中以磷酸盐缓冲剂（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲体系）作为稳定体系，发现对聚乙二醇-集成干扰素变异体有较好的稳定作用，可明显增加蛋白的沉淀温度和降低沉淀速度，能很好地稳定制剂中的聚乙二醇-集成干扰素变异体。

本发明的再一实施例中，给出了本发明不同缓冲体系制成的制剂的稳定性研究，用磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液，制成注射剂成品后，均可获得合格的制剂，研究人员意外地发现，用磷酸盐缓冲液调节pH，可以获得较其他缓冲液更好的稳定性。

具体实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例1  制备mPEG_20kDa-IFN-SA

IFN-SA溶液（3.5mg/ml）溶于磷酸钠浓度为100mM，pH5.3内含20mM NaCNBH₃的溶液中，4℃冷却后充分混匀，加入超出4倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇醛（mPEG-丙醛，平均分子量为20kDa）。

在反应过程中蛋白质的修饰程度用反相HPLC来监测，HPLC以多聚（苯乙烯/二乙烯基苯）进行装柱。

10小时后，反相HPLC分析结果表明，80%的N-末端具有未封闭的α氨基的蛋白质转变成mPEG-IFN-SA衍生物。

在10小时时间点，反应混合物用水稀释5倍，mPEG-IFN-SA衍生物的纯化用离子交换层析来完成，其所用的柱为Hiload 16/10 S Sepharose HP柱，以20mM的醋酸钠缓冲液pH5.5加以平衡，反应混合物以1ml/min的流速装入柱内，未反应的mPEG醛以3倍于柱体积的相同缓冲液加以洗脱，然后在4℃条件下进行蛋白质-聚合物连接分子的洗脱，以0%-75%的20mM醋酸钠缓冲液进行线性洗脱420min，缓冲液pH为5.5，含有1M NaCl，合并mPEG-IFN-SA衍生物的流份，经浓缩后再过滤。

实施例2  mPEG-IFN-SA原液中加入稳定剂前后制成半成品制剂稳定性比较

    基本处方：mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

              Na₂HPO₄.12H₂O           2.58mg/ml

              NaH₂PO₄.2H₂O            0.44mg/ml

    配制成注射液半成品。

在上述处方的基础上，分别加入

山梨醇：40mg/ml，吐温80：0.04mg/ml，配制成注射液半成品。

在4℃条件下，放置3个月，测定其活性下降情况，结果见表1。

表1 加入稳定剂前后mPEG-IFN-SA 4℃放置稳定性比较

从上表结果可以看出，mPEG-IFN-SA原液不加稳定剂直接配成注射液半成品，在4℃保存1、2个月时，活性和纯度未受影响，3个月后纯度下降约10%，生物活性下降约40%，而加入T-80和山梨醇后，在同样的条件下，放置3个月，其纯度和活性均未受影响。   

实施例3

我们测定不同的缓冲剂对mPEG-IFN-SA稳定性可能的作用，所测定的缓冲剂包括醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液，所用的缓冲剂为20mM、包括160μg/ml的mPEG-IFN-SA、40μg吐温-80、40mg山梨醇的干扰素溶液。将这些样品以每分钟1℃的速度从25℃加热到95℃同时通过UV/VIS分光光度计监测。与醋酸盐、碳酸盐或枸橼酸盐相比，磷酸盐通过增加沉淀温度和降低沉淀速度明显地稳定mPEG-IFN-SA，表2显示在这四种缓冲剂存在下的mPEG-IFN-SA的起始沉淀温度。起始沉淀温度任意地定义为350nm下的光密度（OD₃₅₀）达到某种水平（在OD₃₅₀的情况下为0.2和1.0）时的温度，在磷酸盐存在下，mPEG-IFN-SA的沉淀温度比其它缓冲剂存在下高几度，该实例证明，磷酸盐缓冲剂具有更好地稳定药液mPEG-IFN-SA的作用。

表2  mPEG-IFN-SA在不同缓冲剂中的沉淀温度（OD₃₅₀=0.2和OD₃₅₀=1.0）

缓冲剂	沉淀温度(OD350=0.2)	沉淀温度(OD350=1.0)
			醋酸盐	63℃	65℃
枸橼酸盐	61℃	63℃
			碳酸盐	64℃	67℃
磷酸盐	68℃	73℃

实施例4

制备不同缓冲剂的mPEG-IFN-SA溶液，

制剂A

     mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

     Na₂HPO₄.12H₂O           2.58mg/ml

     NaH₂PO₄.2H₂O            0.44mg/ml

     山梨醇                   40mg/ml

     吐温-80                  0.04mg/ml

制备方法和过程：

按以下稀释液配方准确配制稀释液，配制后用于稀释原液，所用器皿需经过无热原处理，全过程无菌条件操作。稀释液配方：山梨醇40.00 g，吐温-80 0.04 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.58 g ，NaH₂PO₄·2H₂O 0.44 g，注射用水准确定容至1 L，稀释液pH到7.2左右。

取检定合格的聚乙二醇重组集成干扰素变异体原液，精密量其体积，加入4%山梨醇、0.004%吐温-80溶解混匀后，用稀释液稀释至蛋白浓度为0.16mg/ml，无菌过滤，得半成品，保存于2～8℃。

按《生物制品规程（2010年版）》《生物制品分批规程》分批，取样进行细菌内毒素限量及细菌检查，检定合格后进行下一步操作。

将2 ml西林瓶及胶塞进行无菌无热原处理，于半成品直接接触的分装机器的管道及分装针头等无菌无热原处理，无菌条件下分装半成品，每瓶装量1ml半成品溶液。

制剂B

     mPEG_20kDa-IFN-SA         300μg/ml

     Na₂HPO₄- NaH₂PO₄         适量

     甘露醇                   40mg/ml

     吐温-80                  0.04mg/ml

制备工艺同上，磷酸盐缓冲体系调节pH至6.8

制剂C

     mPEG_20kDa-IFN-SA         300μg/ml

     Na₂HPO₄- NaH₂PO₄         适量

     甘露醇                   40mg/ml

     吐温-80                  0.04mg/ml

制备工艺同上，磷酸盐缓冲体系调节pH至6.5

制剂D

     mPEG_20kDa-IFN-SA         100μg/ml

     醋酸-醋酸钠              适量

     山梨醇                   10mg/ml

     吐温-80                  0.08mg/ml

按上述工艺，药液pH值以醋酸-醋酸钠缓冲剂调至pH为5.5。

制剂E

     mPEG_20kDa-IFN-SA         200μg/ml

     碳酸-碳酸氢钠            适量

     蔗糖                     60mg/ml

     吐温-80                  0.06mg/ml

按上述工艺，药液pH值以碳酸-碳酸氢钠缓冲剂调至pH为6.5。

制剂F

     mPEG_20kDa-IFN-SA         500μg/ml

     枸橼酸-枸橼酸钠            适量

     蔗糖                     60mg/ml

     吐温-80                  0.06mg/ml

按上述工艺，药液pH值以枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂调至pH为6.0。

实施例5  注射液稳定性考察

分析样品溶液的蛋白质的含量、游离干扰素的含量（%），结果见表3

表3  室温4℃条件下放置18个月的稳定性考察

从表3的数据可以看出，室温放置18个月后，注射液中降解mPEG-IFN-SA降解成游离的IFN-SA的含量均低于10%，室温放置均相对稳定，其中，以磷酸盐作为缓冲剂，降解成游离的IFN-SA的含量较其它缓冲剂更少，可以获得更为稳定的效果。

实施例6

处方：mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

             山梨醇                40mg/ml

         吐温-80               0.04mg/ml

按照不同的缓冲体系，制备三个制剂，缓冲体系分别是：(1)磷酸盐缓冲体系（Na₂HPO₄·12H₂O 2.58 g ，NaH₂PO₄·2H₂O 0.44 g）调节pH范围在6.8-7.2；(2)醋酸盐缓冲体系（醋酸-醋酸钠）调节pH为约5.5；（3）枸橼酸缓冲系统（枸橼酸-枸橼酸钠）调节pH为约6.0。制成的制剂，每支装量为1ml。

分别检测三个制剂成品4℃存放18个月后的质量标准，见表4

表4 聚乙二醇化重组集成干扰素变异体注射液检定 

从表4结果可以看出，用磷酸盐作为mPEG-IFN-SA的缓冲体系，较醋酸盐缓冲体系、枸橼酸盐缓冲体系具有更好的稳定性，4℃下存放18个月后，其效价仍可达到标示量的95%，而醋酸盐或枸橼酸盐不到90%，但也都符合要求。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇集成干扰素变异体注射剂，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，以及包含保持pH在4.5-7.5的缓冲体系、稀释剂、稳定剂的混合物，其中所述集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶。

2.权利要求1所述的注射剂，其中所述保持pH在4.5-7.5的缓冲体系为磷酸盐缓冲体系、醋酸盐缓冲体系或枸橼酸盐缓冲体系；所述稀释剂为甘露醇、蔗糖或山梨醇；所述稳定剂为吐温80或Pluronic F86。

3.权利要求1或2所述的注射剂，其中所述缓冲体系的pH值为6.5-7.5。

4.权利要求1或2所述的注射剂，其中以重量计，稀释剂的量为1%-10%，稳定剂的量为0.001%-0.01%。

5.权利要求1所述的注射剂，其中聚乙二醇-复合干扰素为在N末端GlySerGlyGlyGly上进行单一修饰的单甲氧基聚乙二醇-集成干扰素变异体。

6.权利要求5所述的注射剂，其中所述的单甲氧基聚乙二醇为mPEG_12kDa或mPEG_20kDa的单甲氧基聚乙二醇醛。

7.一种复合干扰素注射液，在用水配制后，它含有下列组分：

50至500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，其中所述集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶；

保持pH为6.5-7.5的NaH₂PO₄.2H₂O-Na₂HPO₄.12H₂O缓冲体系；

重量比为1%-10%的山梨醇；

重量比为0.001%-0.01%的吐温-80；

注射用水。

8.权利要求7所述的注射液，其中所述的聚乙二醇-集成干扰素为在N末端GlySerGlyGlyGly上进行单一修饰的单甲氧基聚乙二醇-集成干扰素变异体。

9.权利要求8所述的注射液，其中所述的单甲氧基聚乙二醇为mPEG_12kDa或mPEG_20kDa单甲氧基聚乙二醇醛。

10.权利要求7-9中任意一权利要求所述的注射液，经进一步冻干处理可得冻干剂。