CN102145178A

CN102145178A - Peg化白介素15

Info

Publication number: CN102145178A
Application number: CN2011100956416A
Authority: CN
Inventors: 侯建华; 张春丽; 杨璐
Original assignee: BEIJING KAWIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; BEIJING KAWIN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Furui Tiancheng Biotechnology Co ltd; Beijing Kawin Technology Share Holding Co ltd
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: CN102145178B

Abstract

本发明涉及一种PEG白介素15偶联物，即PEG化白介素15，所述PEG与白介素15通过或不通过小肽连接子连接于N末端氨基上，得到均一的PEG白介素15偶联物，在体内可以至少保留原有白介素15的活性，并具有更长的半衰期和平均达峰时间。

Description

PEG化白介素15

技术领域

本发明涉及一种化学修饰的聚乙二醇白介素15偶合物，属于生物制药领域。

背景技术

白细胞介素15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种约为12-14kD的细胞因子，天然人白介素15成熟肽含有114个氨基酸，包括4个半胱氨酸残基，Cys35与Cys85、Cys42与Cys88连接，形成的两对分子内二硫键对于保持IL-15的空间构象和生物学活性起重要作用。

与大多数细胞因子相似，IL-15可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞的发育等，IL-15还可对免疫系统外的多种组织和细胞发挥广泛而多效的作用。体外研究显示IL-15与IL-2由于共有的受体组分共有几种生物学活性，在T细胞上存在的IL-15受体包括一种特有的α链，IL-15Rα，但是与IL-2R共有β链和γ链，结果，两种受体都利用相同的Jak/STAT信号传递元件，不过，基于IL-2和IL-15及其受体的复杂调控和不同表达，已经报道了体内功能的显著差异（Kirman等，1998；Waldmann and Tagaya，1999；Waldmann等，2001）。IL-15和IL-2的抗肿瘤效应应受到重视，比较IL-15与IL-2对肺腺癌转移模型的疗效时，它诱导的NK杀伤活性比IL-2诱导的高3-4倍，此外，6倍剂量的IL-15才能引起肺血管渗漏等毒副作用的出现，在大鼠的结肠癌模型中也发现，IL-15能显著降低化疗英气的胃肠道毒性，增强药物的最大耐受剂量。朱法良等（朱法良，孙汭，田志刚，等. IL-15和rhIL-2诱生的LAK细胞特性比较. 中国免疫学杂志[J]. 2002,18(4):252-258）在研究重组人白细胞介素15和重组人白介素2诱导的粘附性自然杀伤细胞（LAK）时发现，IL-15诱生的LAK细胞杀伤K562细胞的能力强于rhIL-2，同时，IL-15诱生的LAK细胞的CD3^-CD56⁺细胞、CD94⁺细胞百分率均要高于rhIL-2，证明IL-15在体内对NK细胞功能可能具有较强的调节作用。

尽管，白介素15较白介素2有着更高的安全性及活性，作为蛋白类药物，且由于其分子量较小，体内应用后半衰期较短，因此临床应用时，为维持其在体内的有效血浆浓度，需要多次给药，患者依从性较差。

为解决白介素15体内半衰期短的问题，中国专利CN200410067182.0公开了一种人白介素15与Fc的融合蛋白，通过将Fc片段与白介素15连接，形成融合蛋白，在体内可获得更长的半衰期，但由于给药时引入了外援蛋白或多肽片段，容易引起机体免疫反应。

其它治疗蛋白的研究已经表明，通过使蛋白质与聚合物例如聚乙二醇（PEG）缀合，通过治疗蛋白和PEG两者共价结合的连接部分可以显著延长治疗蛋白在血浆中的半衰期。

对于聚乙二醇分子来说，可通过多种方法将其加到蛋白质上。总的来说，聚乙二醇分子是通过一个在蛋白质分子上发现的反应基团而联到蛋白质分子上。氨基，如赖氨酸残疾上的或N-末端上的氨基通常用于这类附着，例如，Royer（US4002531）认为可利用还原性烷基化反应将聚乙二醇分子附着到酶上。Wright于1993年4月28日公开的EP0539167，“Peg Imidates and Protein Derivates Thereof”中认为带有自由氨基酸的肽及有机复合物可被PEG的直接衍生物或有关的水溶性有机多聚体所修饰。Shaw在1990年2月27日公开的美国专利号US4904584中涉及修饰蛋白质中用于通过反应性氨基基团附着聚乙二醇分子的赖氨酸残疾的数目。

通常，这些偶联物包括每个蛋白质分子结合的PEG分子数从0到蛋白质中氨基基团数变化的偶联物，对于已经单独修饰的蛋白质分子，PEG单元可以结合在许多不同的胺位点上。

欧洲专利申请EP593868描述了PEG-IFN-α的制备，然而，PEG化反应不是位点特异性的，并因此获得了PEG-IFN-α偶联物位置异构体的混合物（也见Monkarsh等，ACS. Symp. Ser.，680:207-216,1997）。

Kinstler等在欧洲专利申请EP675201中演示了用mPEG-丙醛对巨核细胞生长和发育因子（MGDF）的N-末端残基的选择性修饰，这考虑到批次之间可重复性PEG化合物的代谢动力学。Gilbert等在美国专利5711944中证明能产生具有最适合水平；活性IFN-α的PEG化，在该例中需要费力的纯化步骤来获得最适偶联物。

在PCT/US2004/025864中公开了一种IL28和IL29的均一化制剂，在该申请中，IL-28和IL-29的PEG化是在其N-末端上的氨基进行PEG化，反应在使其能利用蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基和N-末端的α氨基之间的pKa差异的pH下进行，通过该选择性衍生作用，可控制诸如醛（如甲氧基聚乙二醇丙醛）等反应性基团的水溶性聚合物与蛋白质连接，与聚合物的缀合主要发生在蛋白质的N-末端上，而不显著修饰其它反应性基团，如赖氨酸侧链氨基。

由于蛋白或多肽分子中存在多个氨基，因此得到的偶合物是多种交联产物的混合物，而且，不同分子大小及分子结构的PEG对活性位点的修饰，在特异性、被修饰后的蛋白空间结构、产物稳定性及产物活性等反面存在很大差别。白细胞介素15的PEG偶联聚合物，目前还没有相关研究。

发明内容

本发明涉及一种白细胞介素15与聚乙二醇的偶联物，所述聚乙二醇白细胞介素15偶联物，较未PEG偶联的白介素15相比，所得的PEG-IL-15具有可溶性、稳定性提高、免疫原性减弱，体外可保留天然白介素15约10%的活性，活性留存率较高，且其在体内与天然的白介素15比较，具有更长的体内半衰期和平均达峰时间、过敏反应更轻、用药更为安全、并具有更为长效的功能。

天然IL-15含有6个赖氨酸残基，其中Lys36、Lys41、Lys85与IL-15分子中半胱氨酸残基相邻，在此处进行PEG偶联时，修饰后将对其生物活性产生较大影响，在Lys上进行修饰时，也不利于得到均一的PEG-IL-15偶联产物。

因此，具体地，本发明在于提供一种在IL-15的N末端进行PEG化的PEG-IL-15，所述的PEG-IL-15具有如下通式：

RO-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_pCO-NH-(AA)_m-IL-15

式中，R为H或C1-C4烷基，优选为甲基；

n为20到2000整数值，优选为100-1000之间的整数值，更优选为200-500之间的整数，聚乙二醇的分子量在1kDa~100kDa之间，优选为5-40kDa之间，更优选为10-20kDa。

p为1-3的整数，优选为2或3；

AA为N末端的L-氨基酸残基，m为0-5之间的整数，优选直接在N末端进行PEG偶联，即m为0。

本发明中，所述与IL-15偶联的聚乙二醇为醛基活化的单甲氧基聚乙二醇，醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子，包括但不限于单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-ALD）、单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇戊醛。优选单甲氧基聚乙二醇丙醛。聚乙二醇分子根据偶联度不同，可以是分子量为10KDa～40KDa的任一分子，其中优选分子量为20KD的聚乙二醇分子。聚乙二醇分子可以是直链型或分支型，可以是单链、双链或多链。优选直链型单链聚乙二醇分子。

白介素15可以是天然的、重组蛋白或同样具有天然IL-15功能的基因突变产物，当然，也包括通过组织培养、蛋白质合成、细胞培养（天然、重组细胞活突变体）方法得到的产品。

本发明中，聚乙二醇白介素15偶联物、PEG-IL-15、PEG-rhIL-15之间，在定义上，可互换使用，均是指PEG化的白介素15，重组的人白介素15（rhIL-15）与天然的人白介素15相比，在N末端多一个Met。

聚乙二醇与IL-15的偶联方式，可以是直接与IL-15的N末端氨基相连，也可以在IL-15的N末端设计一连接肽，该连接肽为小于5个L-氨基酸的小分子肽，如在IL-15的N末端设计3个甘氨酸，然后将PEG通过甘氨酸的NH2端与IL-15分子偶联。

本发明还提供了IL-15聚乙二醇偶联物的制备方法。所属领域技术员根据常识可以选择聚乙二醇的结构类型、分子量和反应所需的用量。通过本申请所提供的制备方法，根据修饰后蛋白分子的结构和性质，选择修饰条件：修饰酸碱度、反应体系，蛋白和聚乙二醇的摩尔比等。

以本发明优选的20KDa的mPEG定点N末端修饰白介素15为例，说明偶联物的制备方法。

本领域熟知的，在硼氰化钠存在条件下，带醛基的PEG会和伯胺发生还原氨化反应。醛基和其他的亲电活性基团不同，它只和胺基反应。虽然醛基的反应活性比NHS活性低，但它具有反应条件温和，易于使PEG和蛋白质或其它材料的表面连接。因此，在低的pH下，mPEG-醛会对蛋白质的N端进行选择性反应。该反应条件在pH值4.0～7.0，10～100mmol/L盐浓度的缓冲体系下，温度在4～25℃，反应时间为1～72小时，反应摩尔比PEG:蛋白在1：2～1：10。一般情况下，选择低温、低pH、反应时间适宜条件下得到的N-末端修饰产物均一性强，且反应转换率较高。

本发明专利所述偶联物的制备步骤：将rhIL-15的磷酸盐缓冲液与20KD的mPEG-ALD在加入20mM硼氰化钠条件下反应，然后采用常规方法进行分离纯化，过滤除菌，获得本发明的PEG-rhIL-15的偶联物。所用磷酸盐缓冲液优选pH4.0-6.0，浓度为50-100mmol/L，温度优选4-10℃，反应时间优选24～48小时，反应摩尔比PEG:rhIL-15为1：2～1：5，修饰率达到50%以上。修饰条件的选择和修饰方法在实例中详细说明。

本发明偶联物的纯化方法为：IL-15与聚乙二醇聚合物经反应后的的样品，用5×DDW透析后上Q Sepharose F.F.，经10 mM乙酸-乙酸钠（pH5.5），平衡液平衡后，用1M Nacl的盐离子逆度洗脱，穿透和洗脱样品分别用电泳、RP-HPLC检测纯度。含聚乙二醇偶联物组份再经Superdex75 分子筛，10mM PB，（pH7.4）条件下分离除去高分子聚合物。结构和质量分析方法包括质谱、质量肽图、RP-HPLC，Gel-HPLC和SDS-PAGE。

本发明的一个实施例中，公开了不同分子量大小的mPEG-ALD修饰rhIL-15后的体外活性保留率。

在本发明的再一实施例中，公开了mPEG-ALD-rhIL-15与rhIL-15的体内药代动力学研究，rhIL-15的聚乙二醇偶联物在体内具有更长的半衰期和更长的平均达峰时间。

本发明的再一实施例中，还公开了rhIL-15与rhIL-15的PEG偶联物对豚鼠的过敏性试验研究，研究发现，rhIL-15的聚乙二醇偶联物具有较低的过敏反应。

本发明的还一实施例中，公开了聚乙二醇白介素15偶联物对荷瘤小鼠的免疫自然杀伤细胞（NK细胞）的影响，聚乙二醇白介素15偶联物可以显著延长荷瘤小鼠NK细胞活性的持续周期，在给药结束后一周内，NK细胞的活性仍然保持着与给药结束时的水平。

对于治疗用途，技术人员可容易地确定合适的剂量、给药频率和给药途径。做出这些决定的因素包括，但不限于，所施用的蛋白质的特性，所需治疗的病症，潜在的病人应变性，病人的年龄、体重以及个体反应等。本发明的化合物也可用作传递载体增强所附着的治疗剂的血浆循环半衰期或指导向体内特异性靶的传递。

本发明PEG- IL-15，结合适合的药用载体或赋形剂，以用于治疗各种病症，在这些药物组合物中所用的特定载体可以采取各种形式，其取决于所希望的给药类型。适当的给药途径包括，但不限于，肠道（例如，口服）、局部、栓剂、吸入、以及非胃肠道，优选为非胃肠道给药，如皮下、肌肉、或静脉注射。

在制备口服液体剂型（例如，混悬剂、酊剂、胶体或溶液）的组合物时，可以采用典型的药物介质，如水、乙二醇、丙三醇、油、乙醇、增味剂、防腐剂、着色剂等。类似地，当制备口服固体剂型（如片剂、胶囊剂等）时，可采用诸如淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。

用于非胃肠道给药的药物组成可以制备成包括有效成分和适当载体的注射剂型。为了非胃肠道给药，载体通常包括无菌注射水，也可包括一些其它可用的助溶剂或防腐剂组分，此外也可制备注射型混悬剂，在这种情况下，将采用合适的液体载体、悬浮剂等。用于非胃肠道给药的载体在本技术领域是熟知的并且包括，水、盐溶液、林格氏液、和/或葡萄糖，该载体可以包含少量的赋形剂以便保持药剂的稳定性和等渗性，这些溶液可以按照通常的方法制备。

为了局部给药，本发明的PEG-IL-15可用温和的含水基质进行配制，如软膏或乳膏，适用软膏基质的如凡士林、羊毛脂、以及油包水乳剂如Eucerin^TM，其可获自Beiersdorf（Cincinnati，Ohio）；冷霜（USP）；Purpose Cream^TM，可获自Johnson & Johnson（New Brunswick，New Jersey）等。

本发明的PEG-IL-15一般以单位剂量的形式给药，本发明的化合物通常以每日、每周、以及每月剂量给药，从约0.01μg/kg体重至约50mg/kg体重，优选为从约0.1μg/kg体重至约25mg/kg体重，更优选为从约1μg/kg体重至约5mg/kg体重。对于75kg的平均体重，剂量可以在每日10μg和1mg之间，更优选为20μg到200μg之间。对经修饰的PEG-IL-15，其给药周期可延长，例如，每周、或每两周给药方案。例如，每人每周剂量可以是10μg至约500μg，在某些具体的实施例中，每人每周剂量可以是约50μg至约250μg，在某些其它的实施例中，每人每周剂量可以是约100至约200μg。如本领域技术人员所明了的，根据本发明的药物组成的特定量取决于若干因素，包括但不限于所希望的生物活性、患者的状态、以及对药物的耐受性等。

附图说明

图1a为rhIL-15的诱导表达情况电泳图，图1b为rhIL-15的样品和标准品Western Blot杂交图，从图中可以看出在大约13kDa的位置出现明显的目的蛋白条带，Western Blot试验表明该目的条带出现明显的印迹反应，说明白介素15获得了正确高效表达。

图2为rhIL-15样品纯化前、后的电泳情况图，纯化后的重组rhIL-15经Tricine-SDS-PAGE电泳检测，结果在大约13kDa的位置出现一条带。

附图3：不同分子量PEG修饰的IFN-SA的 SDS-PAGE电泳图。其中M为marker，1为mPEG_10K-rhIL15，2为mPEG_20K-rhIL15，3为mPEG_40K-rhIL15。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例1 制备rhIL-15

试验材料：DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶均为GIBCO公司产品；大肠杆菌宿主菌DH5a，BL21（DE3）菌株（购自Invotrogen公司）；pVB220载体（购自Novagen公司）

1引物的设计与合成：根据报道的hILl-15的基因序列设计一对引物，上游引物P1:5’-C ctcgagTTCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3’，包括起始密码子ATG，外设Xho I酶切位点；下游引物P2: 5’-CGGATCCttaTTAAGAAGTGTTGATGAAGATTTG-3’，将终止密码子变成原核系统高频使用的强终止子TAA，外设BamH I酶切位点，引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。

2 富含rhIL-15mRNA单个核细胞的制备及总RNA提取，采用常规密度梯度离心方法分离正常人外周血白细胞，培养与含10%小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中，加入细菌脂多糖5μg/ml和干扰素-γ500u/ml，培养4h，弃去悬浮细胞，收获帖壁的单个核细胞，经异硫氰酸胍法提取细胞总RNA，采用甲醛变形琼脂糖凝胶水平电泳鉴定RNA。

3 RT-PCR反应：逆转录反应：取细胞总RNA 5-10μg作为模板，加入DTT10mmol、M-MLV200u、4 x dNTP（每种）0.5mmol、下游引物250pmol，总反应体积20μl、37℃作用1h，95℃10min灭活M-MLV；PCR反应：在RT反应物20μl中，加入MgCl₂2mmol、4 x dNTP 0.1mmol、上游引物150pmol、95℃、5min，加入TaqDNA聚合酶2u。PCR反应条件：94℃1min、58℃1min、72℃1min，循环35次，72℃延长7min。扩增得到rhIL-15 cDNA序列。

4 rhIL-15重组表达载体构建将RT-PCR扩增后的rhIL-15cDNA用XhoI和BamHI双酶切后，经低熔点琼脂糖电泳纯化回收片段，再在T₄DNA连接酶的作用下与同样酶切的pKW2载体连接，转化入DH5α大肠杆菌，在含氨苄青霉素的选择性培养基上筛选阳性克隆。

5 将rhIL-15表达载体转化大肠杆菌宿主菌BL21（DE3），筛选阳性转化子，将阳性的克隆菌株接种于2ml含氨苄青霉素的LB培养液中，30℃活化后，1:100接种，扩增至OD₆₀₀=0.4-0.6时，于37℃诱导培养4h，5000r/min离心5min收集菌体，超声波破碎菌体，收集包涵体，然后通过变性-复性-层析的方法纯化rhIL-15，最后获得95%以上纯度的rhIL-15。纯化的rhIL-15经氨基酸分析，其N端的10个氨基酸序列结果表明，样品中除部分N端多出1个甲硫氨酸外（转录时的起始密码子），氨基酸序列与天然的人rhIL-15相同，纯化后的rhIL-15的比活为2×10⁷U/mg.

实例2、重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物（mPEG ₂₀ -rhIL-15）的修饰条件

rhIL-15溶液（为rhIL-15，浓度为10 mg/mL，缓冲为100 mM PB，pH7.0）由北京凯因科技股份有限公司制备，mPEG-ALD-20KD（纯度>95%，相对分子质量为20×10³）购自北京凯正生物工程发展有限公司，氰基硼氢化钠（CH3BrNa）溶液购自Sigma公司，SDS-PAGE相关试剂及溶液和各种分析纯均为上海生工产品。恒温磁力搅拌仪（江苏中大仪器厂）、电泳仪、Q Sepharose F.F.、Superdex75 分子筛、AKTA explore 层析系统、SDS-PAGE 电泳系统均为Pharmacia公司产品。

1 、反应pH值对修饰产物的影响

rhIL-15溶液分别用100 mmol/L PB（pH4.0、pH5.0和pH5.5）缓冲液配成2 mg/mL，各取一份加入1 mol/L CH3BNNa母液至终浓度为20 mmol/L。按摩尔比1：4（rhIL-15:mPEG-ALD-20KD）称取mPEG-ALD-20KD加入rhIL-15反应溶液中，4℃条件下100r/min搅拌反应24 h。分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定mPEG20-rhIL-15的修饰率。

实验结果表明：pH值在4.0、5.0、5.5的条件下，mPEG20-rhIL-15所占比例分别为18%，31%，40%。说明pH4.0的修饰率最低，pH5.5的条件下修饰率最高。

2 、rhIL-15与PEG的修饰比例对修饰产物的影响

rhIL-15溶液用100 mmol/LPB pH5.5缓冲液配成2 mg/mL，补入1 mol/L CH3BNNa母液至终浓度为20 mmol/L。按rhIL-15与mPEG-ALD-20KD摩尔比为A（1:2）、B（1:3）、C（1:4）、D（1:5）、E（1:6）分别称取mPEG-ALD-20KD加入rhIL-15反应溶液中，4℃条件下100 r/min搅拌反应24 hr，分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定PEG20-rhIL-15的修饰率。

实验结果表明：在rhIL-15与mPEG-ALD-20KD摩尔比为A（1:2）、B（1:3）、C（1:4）、D（1:5）、E（1:6）时，PEG1-IL-15所占比例分别为18%，27%，39%，40%，41%。当PEG修饰物的摩尔比达到1：4后，不能进一步提高修饰率，反应会造成PEG修饰的多聚体增加。

3 、反应温度和时间对修饰产物的影响

rhIL-15溶液用100 mmol/L PB pH5.5缓冲液配成2 mg/mL，补入1 mol/L CH3BNNa至终浓度为20 mmol/L。取rhIL-15与mPEG-ALD-20KD质量比1:4，分别在4℃反应48hr，25℃反应24hr不同时间点，分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定mPEG₂₀-rhIL-15的修饰率。实验结果表明：4℃条件下通过延长反应时间，同样达到反应25℃反应的修饰率。但4℃条件修饰更利于rhIL-15的活性和结构稳定。

4、rhIL-15浓度对修饰产物的影响

rhIL-15溶液用100 mmol/L PB pH5.5缓冲液配成为1.0 mg/mL，2.0 mg/mL，3.0 mg/mL，4.0 mg/mL，共4份，按rhIL-15与mPEGALD-20KD质量比1:4的比例加入mPEG-ALD-20KD，4℃，100 r/min搅拌反应24hr，分别取样进行SDS-PAGE电泳分析，确定mPEG20-rhIL-15的修饰率。

实验结果表明，rhIL-15浓度在1.0 mg/mL，2.0 mg/mL，3.0 mg/mL，4.0 mg/mL时，PEG20-rhIL-15所占比例分别为28%，40%，45%，48%。但随着蛋白浓度提高时，PEG20-rhIL-15的修饰有所增加，达到3.0～4.0 mg/mL时为合适浓度。

实施例3 mPEG-rhIL-15纯化

反应混合液先对50mM Tris-HCl缓冲液（pH 6.5）透析，再将样品上样于同样缓冲液平衡好的Q Sepharose FF阳离子交换柱。用0-1M氯化钠梯度洗脱吸附蛋白。PEG-干扰素进一步经Superdex 75纯化，流动相为含0.15M 氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液（pH 6.5）。收集洗脱活性组分，SDS-PAGE检测结果显示，PEG-白介素已被纯化至电泳单一条带。

用10kDa、40kDa偶合rhIL-15的工艺同上，纯化所得PEG白介素的电泳为单一条带，见附图3。

实例4、不同分子量聚乙二醇修饰的rhIL-15体外生物活性测定

采用rhIL-15依赖细胞株（CTLL-2）/MTT法测定rhIL-15及其PEG偶联的rhIL-15的生物学活性。以人血清白蛋白为标准蛋白，用Lowry法测定蛋白质含量，测定比活性（IU/mg）。用测定培养液稀释至1000IU/mL，在96孔细胞培养板中，做4倍梯度系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。分别将mPEG₁₀-rhIL-15，mPEG₂₀-rhIL-15和mPEG₄₀-rhIL-15用测定培养液稀释成0.1μg/mL，用测定培养液稀释成将rhIL-15稀释为1.0ng/mL，记录预稀释倍数。在96孔细胞培养板中，再做4倍梯度系列稀释，共８个稀释度，每个稀释度做2孔。

mPEG₁₀-rhIL-15体外抗活性保留了rhIL-15 约12.61%的活性，mPEG₂₀-rhIL-15保留了9.25%，mPEG₄₀-rhIL-15保留了3.61%。

	比活（U/mg）	保留活性（%）
			rhIL-15	2.0×10⁷	—
mPEG₁₀-rhIL-15	2.12×10⁶	12.61
			mPEG₂₀-rhIL-15	1.25×10⁶	9.25
mPEG₄₀-rhIL-15	0.72×10⁶	4.61

实例5、rhIL-15与PEG20-rhIL-15药代动力学比较研究

大鼠12只，雌雄各半，分为2组，分别单次给予I₁₂₅标记的10μg/kg 的rhIL-15或50μg/kg 的mPEG20-rhIL-15，采用rhIL-15放射免疫（RIA）试剂盒测定皮下注射rhIL-15或mPEG10-rhIL-15后的血药浓度尾静脉取血，每次1.5ml。rhIL-15的取血时间点为 0 h 30min，1hr、2h、4h、8h、12h、16h和24h。mPEG₂₀-rhIL-15的为 0h 1hr，2hr，4、6、12、24、48、72、96、120、144和168h。血液在室温放置30min后于4000rpm离心10min，分离出血清，-20℃保存用于血药浓度的测定。

经拟合优度比较，未修饰的rhIL-15的药代符合一级消除动力学二房室模型，平均达峰时间T_peak（实测值）为8.4±1.63 min，平均消除半衰期(t_1/2e)为22.1±1.19 min； mPEG₂₀-rhIL-15平均达峰时间T_peak（实测值）为13.33±2.07h；平均消除半衰期(t_1/2e)为34.43±4.77 h。比rhIL-15的半衰期延长大约100倍以上。

种类	平均达峰时间T_peak	平均消除半衰期(t_1/2e)
			rhIL-15	8.4±1.63min	22.1±1.19min
mPEG20-rhIL-15	13.33±2.07h	34.43±4.77h

实例6、rhIL-15、mPEG ₂₀ -IL-15对荷瘤Balb/c小鼠NK细胞活性的影响

实验材料：Balb/c小鼠，购自北京大学医学院动物实验中心，雌性，周龄6-8周，体质量20g左右；rhIL-15、mPEG₂₀-rhIL-15凯因科技股份公司制备。

细胞与培养：SP2/0细胞购自中国科学院北京细胞库，作为CTLL实验靶细胞；YAC-1细胞由本公司实验室保存，作为NK实验靶细胞，常规培养。RPMI1640培养基购自Sigma公司，Hepes购自美国GIBCO BRL公司，FCS购自杭州四季青生物制品研究所。

试剂：MTT购自Sigma公司，IFN-γ测定ELISA试剂盒购自晶美公司，肿瘤标本病理却片制备相关试剂（10%甲醛、乙醇、石蜡等）由本公司自行制备。

SP2/0细胞肿瘤模型的建立和细胞免疫治疗：将60只Balb/c小鼠右侧皮下接种SP2/0细胞，1×10⁶细胞计数/只，形成皮下实体瘤（约12d），然后随机分为成6组，每组10只，分别为空白模型组（腹腔注射等体积的生理盐水）、rhIL-15组（腹腔注射0.1μg /次）、mPEG₂₀-rhIL-15组（腹腔注射0.5μg/次）。给药方式为：rhIL-15组1次/天，每周连续5天停药2天，连续给药5周；mPEG₂₀-rhIL-15组，每周给药一次，连续给药5周。给药后第21、28、35、40天进行NK细胞杀伤活性检测。

1、MTT法检测NK细胞活性

靶细胞制备：生长24-48h的YAC-1细胞离心洗两次，计数后以10%的FCS-1640（完全1640）调整浓度为2×10⁵/ml。

效应细胞制备：小鼠血液用Tris-NH₄Cl溶解红细胞后，离心，洗3次，计数，用10%的FCS-1640调整浓度为8×10⁶/ml。

杀伤实验：取效应细胞接种细胞板100μl/孔，每份标本接种六孔，其中3孔再各加100μl/孔为靶细胞试验孔，其余3孔加完全1640液100μl/孔，为效应细胞对照孔。37℃、5%CO₂孵箱杀伤2h掺入MTT 2h，加助溶剂过夜，用酶联仪选用波长570nm测定OD值。

NK细胞活性计算方法：分别求出效应试验孔、效应细胞对照孔和靶细胞对照孔的均值，按下述公式计算NK细胞活性，杀伤%表示，结果见表1和附图1。

结果表明，经rhIL-15、mPEG₂₀-rhIL-15治疗后，NK活性均得到显著提高（与模型对照组相比），差异具有显著性，但五周后（第38天），rhIL-15治疗组的所致小鼠的NK细胞活性开始出现明显下降，至第40天后，其NK活性与模型对照都相比，差异不具有显著性，而mPEG₂₀-rhIL-15组治疗，在第42天（也即给药结束后第7天），NK细胞仍然有较高活性，与给药结束后（第35天）水平相当，下降不明显。

Claims

1.聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与人白介素-15连接形成的偶合物。

2.权利要求1所述的偶合物，所述偶合物具有式I所示的连接形式：

RO-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_pCO-NH-(AA)_m-IL15

其中，R为H或C1-C4烷基；

n为20到2000的整数值；

p为1-3的整数；

AA为N末端的L-氨基酸残基；

m为0-5之间的整数。

3.权利要求2所述的偶合物，所述偶合物具有式I所示的连接形式：

RO-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_pCO-NH-(AA)_m-IL15

其中，R为甲基；

n为100到1000的整数值；

p为2或3；

AA为N末端的L-氨基酸残基；

m为0。

4.权利要求1-3任意一项权利要求所述的偶合物，其中所述偶合物具有均一的分子量。

5.一种制备权利要求1至4中任意一权利要求所述偶联物的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1) 偶合反应中，白介素15与醛基化单甲氧基聚乙二醇的摩尔比为1:2~1:10;

(2) 偶合反应体系为磷酸盐缓冲液pH4.0-8.0，离子强度为10-100mmol/L;

(3) 柱色谱层析法分离反应所得的聚乙二醇白介素15偶合物。

6.权利要求5所述的方法，其中所述醛基化单甲氧基聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛。

7.权利要求5或6所述的方法，其中所述的醛基化单甲氧基聚乙二醇的分子量为10-50kDa。

8.一种药用组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1至4中任意一权利要求所述偶联物作为活性组分，和药物学上可接受的载体、赋形剂或辅料。

9.权利要求1至4中任意一权利要求所述偶合物在制备具有抗肿瘤药物中的用途。

10.权利要求8所述组合物在制备具有抗肿瘤药物中的用途。