CN101584866A - 聚乙二醇修饰的人白介素-2、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种聚乙二醇修饰的人白细胞介素－2，以此改善白细胞介素－2自身的理化特性和生物活性，特别是Y型聚乙二醇NHS酯修饰的白介素－2，与现有技术相比，Y型聚乙二醇NHS酯在结构与性能上与用于PEGasys上的聚乙二醇NHS相似，但具有更好的化学稳定性。本发明优选总分子量为40kDa的Y型聚乙二醇，用以提高分子量，从而降低肾小球滤过率，提高药物半衰期；采用的分枝型聚乙二醇可增加蛋白药物分子的空间位阻，从而显著降低蛋白分子的免疫原性。

Description

聚乙二醇修饰的人白介素-2、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质药物的聚乙二醇修饰，具体为一种利用分枝型聚乙二醇修饰白细胞介素-2。

背景技术

聚乙二醇是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇即PEG具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。聚乙二醇类修饰剂的药物动力学性质因它们的相对分子量和注射给药方式而异，分子量越大，半衰期越长。经过细胞色素P450系统的氧化作用，PEG分解成小分子的PEG，经胆汁排泄。

药物的聚乙二醇修饰即PEG化，是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上。其中研究得最多的是蛋白质的PEG修饰，始于是20世纪70年代。蛋白质的免疫原性是由于其分子表面的抗原簇所决定的，应用线性亲水惰性的高分子与蛋白质的非活性必需基团结合在其表面形成屏蔽，使其不被识别，不产生相应抗体从而抑制相应的免疫反应，而连接大分子聚合物后药物的分子量显著增大，不易被肾小球所过滤，从而延长在体内的半衰期，另外由于大分子亲水性，聚合物的表面遮蔽作用在一定程度上减少了蛋白药物与蛋白酶的相互作用，使药物的稳定性进一步提高。

PEG修饰后，往往会具有以下优点：1、更长的半衰期2、较低的最大血药浓度3、血药浓度波动较小4、较少的酶降解作用5、较少的免疫原性及抗原性6、较小的毒性7、更好的溶解性8、用药频率减少9、提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用9、脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用。修饰途径对蛋白和多肽主要有氨基修饰(包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰)、羧基修饰、巯基修饰，还有其它如控制pH实现SC-mPEG选择性修饰蛋白质中的组氨酸侧链的咪唑基团和用谷氨酰胺转氨酶将mPEG-NH2转移到蛋白质的谷氨酰胺侧链上，实现对谷氨酰胺的选择性修饰，其中主要是对N末端或赖氨酸侧链氨基进行酰化修饰，因为蛋白或许多多肽结构中存在多个氨基，所以控制和确定修饰位点及修饰程度一直是蛋白和多肽的聚乙二醇修饰中的难点，肽类化合物的合成中可以通过采用适当的保护策略来实现对氨基的定点修饰，而有机小分子药物的PEG修饰途径主要是将PEG与这些小分子药物上的-OH，-NH2，-COOH相偶联，如待修饰的小分子药物不具备这些功能基团，可通过化学方法引入。

PEG修饰的相关技术主要是以下三个方面：1、PEG的相对分子量的选择现在普遍采用的是分子量大于20000的高分子量的PEG作为修饰剂。分子量的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。已有的研究证明，修饰的蛋白药物在体内的作用时间与藕联的PEG数量和相对分子量成正比，在体外的生物活性与偶联的PEG数量和相对分子量成反比，应用分子量过大的PEG修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性。以往采用低分子量(<20000>的PEG修饰蛋白药物结果显示出修饰后的蛋白药物较原型药物在生物活性和药代动力学性质上没有本质的改变，修饰时具体的PEG分子量的选择要根据实验确定，一般选择分子量在40000~60000范围内的PEG作为修饰剂。2、修饰位点的选择蛋白质PEG修饰时要根据蛋白质构效关系的分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。有机小分子药物的修饰位点与生物活性无关。理想的PEG修饰技术是根据要修饰的位点选择适当的PEG得到均一性的产品。3、其它化学因素PEG修饰反应需要高度的特异性和温和的反应条件，为得到高产率的、均一的目的修饰产物，实验过程中要控制反应体系的pH值、药物浓度、反应物间的计量关系、反应时间、反应温度。

蛋白药物的PEG修饰已卓有成效，国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药物的PEG修饰，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG-干扰素、PEG-GSF、PEG-生长抑素。目前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种，处于临床实验的有：超氧化物歧化酶(即将上市，Enzon公司)、白介素-2(II期，Chiron公司)、水蛭素(II期，BASF AG公司)、抗-TNFα抗体片段(III期，Pharmacia公司)、牛血红蛋白(I期，Enzon公司)、抗-PDGF抗体片段(II期，Celltech公司)

肽类化合物PEG修饰的研究晚于蛋白质的相关研究，近年来也取得了一些进展，如畦降钙素、表皮生长因子的PEG修饰产物的半衰期和生物活性显著高于原型药物。尤其是肽类化合物在聚乙二醇定点修饰方面较蛋白质更易于实现。在肽类化合物的PEG修饰研究中应用最普遍的是mPEG，先在mPEG的末端引入羧基、氨基或其它活性基团，或者制备经mPEG修饰的氨基酸衍生物，再利用固相或液相法将其偶联到肽序列中去，实现对多肽的N端，C端及某些氨基酸侧链的聚乙二醇化修饰。

PEG修饰脂质体，PEG修饰后的阿霉素脂质体较原型药物相比：降低了心脏毒性，增强了病人的耐受性，在体内发挥控释和靶向药物的作用

PEG修饰有机小分子药物，PEG修饰的喜树碱已进入I期临床试验，适当的PEG修饰后的紫杉醇较修饰前有更好的治疗效果、溶解性、选择性和半衰期。

随着PEG化学的高速发展以及许多PEG衍生化试剂的商品化、PEG修饰药物的优越性和PEG修饰蛋白药物的陆续上市，可以预测药物的PEG修饰研究将得到越来越广泛和深入的重视，特别在提高蛋白、多肽药物的稳定性、延长半衰期，降低抗肿瘤药、抗真菌药、抗生素、免疫抑制剂的毒副作用和提高这些药物的靶向性，PEG修饰更具有持续的魅力和非常广阔的前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种分枝型聚乙二醇修饰的重组人白细胞介素-2其制备方法。

本发明的具体技术方案如下：

一个重组人白细胞介素-2上连接一个Y-NHS-40K、Y-O-NHS-40K或Y-2-NHS-40K，聚乙二醇连接在IL-2的氨基上，连接到蛋白药物分子上的PEG，通过对蛋白分子包裹缠绕，屏蔽蛋白的抗原决定簇，从而降低修饰后药物的免疫原性，同时由于屏蔽作用也可防止酶解，此外由于蛋白表观分子量的提高降低了肾小球通过率，增加药时曲线下面积。修饰后药物蛋白通过S-300纯化获得性质均一的纯品，经过检验达到预期的修饰效果。

其特征在于：

所用白介素-2为重组的人白介素-2，其125位氨基酸突变为Ala，人白介素-2含有133个氨基酸残基，分子量为15.5kDa，天然白介素-2在N端含有糖基，但糖基对白介素-2生物活性无明显影响，等电点在6.6-8.2。白介素-2分子含有3个半胱氨酸，分别位于第58，105和125位氨基酸，其中58位和105位半胱氨酸之间所形成的链内二硫键对于保持白介素-2生物学活性起重要作用，在白介素-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低白介素-2的活性，现利用基因重组技术将白介素-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸，改构后白介素-2比活性比天然白介素-2明显增加。

所用聚乙二醇优选的分子量40KD的Y型聚乙二醇NHS酯。

每个白介素-2上连接一个PEG为目标产物。

修饰反应中Y-PEG-NHS的用量与白介素-2的摩尔比范围是10∶1-2∶1，较多的PEG可导致多修饰物产率增加，而太少的PEG使PEG与白介素-2碰撞几率减小，不利于修饰产物生成，因而本发明优选的Y-PEG-NHS的用量与白介素-2的摩尔比范围是4∶1-2∶1；反应的pH范围应控制在6.0-8.5，聚乙二醇与Y-PEG-NHS反应条件为弱碱性，但较低的PH更有利于N端氨基修饰，本发明优选PH6.0-7.0，以磷酸盐为缓冲体系；反应的温度范围在4-37℃，较低的温度更有利于蛋白质活性的保持且更利于形成单修饰产物，所以本发明优选4-25℃；同时较长的反应时间更增加了多修饰产物的产率，所以本发明更优选16-25℃，反应6-12h。

附图说明

图1、Y型聚乙二醇NHS酯修饰的白介素-2及其纯化

1道为反应混合物，2、3、4、5、6、7、8为经S-300纯化分部收集的样品。

具体实施方式

实施例1

100mg生长激素纯品，溶于20ml 20mMPH6.0PB中，加入Y-PEG-NHS酯400mg，25℃反应6h，加入2M甘氨酸终止反应。反应混合物用S-300分离，250nm检测，分部收集样品，可将多修饰物与单修饰物和未修饰的生长激素分离。

7.5％还原型SDS-PAGE检测，纯度大于95％。依2005年中国药典检测，活性降低60％。

免疫动物采集抗体血清，测定免疫血清抗体效价，结果发现修饰后的白介素-2抗体滴度降低，说明修饰后的白介素-2免疫原性降低。

Y-PEG-NHS修饰的IL-2药物致豚鼠全身过敏试验

豚鼠60只，雌雄各半，体重250-300g，均分为两组，将IL-2与Y-PEG-IL-2按人用剂量的三倍腹腔给药，隔日一次，给药三次，使其致敏，将IL-2与Y-PEG-IL-2按人用剂量的六倍与致敏后的第14天，21天分别于豚鼠小腿胫静脉注射激发，30min内观察并记录结果。

表1豚鼠全身过敏试验级数判断标准

注：过敏反应达到2级以上，过敏反应为阳性

豚鼠过敏反应结果说明，IL-2有较强的全身过敏反应，Y-PEG-IL-2具有较低的过敏反应。

Claims (6)

1、一种聚乙二醇共价修饰的人白介素-2，其特征在于：采用分枝型聚乙二醇对白介素-2进行修饰。

2、如权利要求1所述聚乙二醇共价修饰的人白介素-2，其特征在于：所述人IL-2是天然人IL-2、基因重组人IL-2或具有天然人IL-2功能的基因突变产物。

3、如权利要求1、2所述的聚乙二醇共价修饰的人白介素-2，其中的分枝型聚乙二醇为Y-NHS-40K、Y-O-NHS-40K、Y-2-NHS-40K。

4、如权利要求1、2、3所述的聚乙二醇共价修饰的人白介素-2，其特征在于Y型聚乙二醇NHS酯可在碱性条件下与人白介素-2的自由氨基键连接。

5、如权利要求1、2、3、4所述的聚乙二醇共价修饰的人白介素-2，其特征在于Y型聚乙二醇NHS酯平均分子量为40KD。

6、如权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的人白介素-2，可以通过但不仅限于下述方法制备，该方法主要特征为：聚乙二醇与白介素-2用量比(mol/mol)范围是10∶1-1∶5；反应体系的pH范围是6.0-8.5；反应的温度范围是4-37℃。

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