CN104745564A - 一种聚乙二醇修饰的l-门冬酰胺酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种聚乙二醇修饰的l-门冬酰胺酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用聚乙二醇修饰药物，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶及其制备方法和应用。聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，该L-门冬酰胺酶采用支链化聚乙二醇对其进行修饰；支链化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点，各个聚乙二醇分支链链段的数均分子量在5000-100000之间；所述的R为源自醇类化合物的烷基；所述的L-门冬酰胺酶亚基上的1-8个伯氨基被相同数目的PEG修饰。本发明用支链化的聚乙二醇进行修饰，降低了药物失活的比例，进一步减少药物在生物体内失活的程度，不仅降低了制作药物的成本，还减少了临床给药的频率和次数，将为患者减轻药费负担，带来福音。

Description

一种聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及用聚乙二醇修饰药物，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶及其制备方法和应用。
背景技术
L-门冬酰胺酶(L-ASNase,L-asparaginase,EC.3.5.1.1),又名L-天冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，其目前主要用于临床上治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)。其对儿童的完全缓解率可达57.8％，有效率为85.2％；对成人的完全缓解率为32.8％，有效率为64.3％。同时，对单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病均有一定疗效。
1974年，国内就已经将L-门冬酰胺酶投入生产(天津生化制药厂等.医药工业，1974,4 ⅩⅣ8.)，后因菌种退化等原因而退出市场，现基本依赖进口。
由于L-门冬酰胺酶是以大肠杆菌为主要来源的一种异源蛋白质,存在半衰期短,稳定性低,具有较强的免疫原性等缺点,易于诱导产生过敏反应,形成中和抗体,缩短半衰期以及难以维持有效的血药浓度等缺陷。虽然与其它化疗药物相比，其具有选择性杀伤癌细胞的优点，并且对骨髓的抑制作用较小，但该酶在血液循环系统中会由于胰蛋白酶的消化作用而很快失活，因此相对地就需要较高浓度、大剂量的酶来维持疗效，而这种大剂量又会引起更大范围的毒副作用。因而，如何获得低免疫原性，低毒副作用L-门冬酰胺酶用于临床给药，一直是研究的重点。
聚乙二醇(PEG)是一种中性，无毒，具有良好生物相容性的高分子聚合物(分子量几百到几万)，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。对蛋白质药物进行适当的化学修饰研究中应用最多，成功率最高的也是PEG化修饰技术。
PEG化原理是将PEG末端羟基转化成高反应活性基团，与蛋白质的巯基、氨基、羧基或是羟基进行偶联反应，生成PEG-蛋白质偶联物。PEG化蛋白质药物在临床用药上具有改善多肽类药物的稳定性及可溶性，降低其免疫原性，提高生物利用度等优点。经PEG修饰的L-门冬酰胺酶除了降低免疫原性与延长半衰期外还有效增加了其稳定性，使临床上的用药频率降低，最终降低了治疗费用。
中国专利CN1498965A公开了一种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法，该专利使用聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)对其进行修饰。而后对修饰产物使用中空纤维柱超滤进行分离。由于SS-PEG属于第一代活化的聚乙二醇修饰剂，其修饰产物具有易水解及稳定性低的缺点。且水解后会有琥珀酸尾巴作为半抗原残留在生物体内从而增加了L-门冬酰胺酶的免疫原性。而通过超滤手段无法彻底的将单点和多点修饰产物分开，从该公开专利的附图1中可以发现这种药物实际为一种多种修饰的混合产物，其缺点显而易见。
中国专利CN101082043B也公开了一种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法。该专利使用线性单甲氧基聚乙二醇对其进行修饰。而后使用离子交换层析和凝胶树脂过滤层析对修饰后产物进行分离。但由于采用线性的聚乙二醇修饰，为了降低免疫原性，就需要多点修饰。而多点修饰存在使修饰后的药物活性被大幅度降低，无法更好的满足临床应用的需求。
因而本专利迫切需要提供一种由新一代的聚乙二醇修饰剂修饰的L-门冬酰胺酶，同时达到降低免疫原性与活性损失的目的，已更好的满足临床应用方面的要求。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明有以下几个目的：第一、提供一种新型的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，该酶具有更低的免疫原性，活性损失更少，半衰期更长等特点，更适合临床应用；第二、提供上述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶的制备方法；第三、提供上述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶的医药用途。
为实现上述第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，该L-门冬酰胺酶采用支链化聚乙二醇对其进行修饰；支链化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点，所述的含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇的结构式如下：
所述的n1、n2、n3分别为大于等于1的正整数,表示各分支链的聚合度，各个聚乙二醇分支链链段的数均分子量在5000-100000之间；所述的R为源自醇类化合物的烷基；所述的X为修饰L-门冬酰胺酶的活性功能基团；所述的L-门冬酰胺酶亚基上的1-8个伯氨基被相同数目的PEG修饰。
作为优选，所述的L-门冬酰胺酶亚基上的1-3个伯氨基被相同数目的PEG修饰。
作为优选，上述含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇的分子量为5kDa-40kDa。
作为优选，上述活性功能基团选自氰基、羧基、氨基、醛基、琥珀酸基碳酸酯、琥珀酸基琥珀酸酯、硝基苯酯和琥珀酰亚胺酯中的一种。作为再优选，上述的活性功能基团选用琥珀酸基碳酸酯。
作为优选，上述R选自醇类化合物的烷基。作为再优选，上述的R基选用甲基。
作为优选，上述的L-门冬酰胺酶与含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇采用单点或多点修饰构成。
在另一优选例中，所述的L-门冬酰胺酶是天然或重组的。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种制备上述任意一种技术方案所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶的方法，该方法中含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇与L-门冬酰胺酶发生共价结合反应的重量比例为1：0.5～20,缓冲液的pH值为4-10，反应温度为4℃～37℃，反应时间为2～36小时；在修饰反应结束后，分离纯化采用离子交换层析，凝胶过滤层析和Hitrap-Desalting柱脱盐。
作为优选，所说的离子交换层析使用的介质可以是阴离子交换层析，也可以是阳离子交换层析；所使用离子交换层析介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如QSepharose系列、SPSepharose系列，DEAE Sepharose系列、CM Sepharose系列，DEAE Sephacel系列、CM Sephacel系列，QAE Sephadex系列、SP Sephadex系列，DEAE Sephadex系列、CM Sephadex系列，SOURCEQ系列、SOURCE S系列等。作为再优选，选择使用SOURCE Q系列。洗脱方式采用梯度洗脱。
作为优选，所说的凝胶过滤层析使用的介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如Sepharose系列、Sephacel系列、Sephadex系列、Superdex系列和Superose系列等。作为再优选，使用Sephacryl-300作为层析介质进行分离。
为了实现第三个目标，本发明采用了以下技术方案：
上述任意一个技术方案所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶用于制备治疗单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病的药物中的应用。
本发明由于采用了上述的技术方案，使用支链化的聚乙二醇对门冬酰胺酶进行修饰。与传统的线性聚乙二醇修饰相比，在同样降低免疫原性的情况下，可以有效的减少修饰位点的个数。用支链化的聚乙二醇进行修饰，降低了药物失活的比例，而其Y型结构可以将药物分子完全包裹起来，更充分有效地保护药物分子，从而进一步减少药物在生物体内失活的程度，不仅降低了制作药物的成本，还减少了临床给药的频率和次数，将为患者减轻药费负担，带来福音。
增加蛋白质或酶的修饰程度能增加修饰物的循环半衰期，然而增加修饰程度却会减少蛋白或酶的比活性，因而需要在这两者之间达成平衡。本发明中，通过调节活化的PEG或其衍生物与L-门冬酰胺酶的摩尔比，以及控制反应时间，可以控制修饰程度。本发明优选的修饰条件下L-门冬酰胺酶亚基上的1-8个伯氨基被相同数目的PEG修饰，更优选的只有1-3个伯氨基被PEG修饰。
PEG修饰的蛋白通常是不均一的，蛋白质分子可连接数量不等的PEG分子，有时需要分离纯化出更为均一的部分。本发明中，一种优选的组分是每个L-ASP亚基平均连接约1-8个活化的PEG或其衍生物分子的复合物。例如用甲基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯修饰L-门冬酰胺酶产物，随后用柱层析方法，分离分子量为150,000Da左右的组分，即每个L-门冬酰胺酶亚基平均连接约1-3个活化的PEG或其衍生物分子。
发明的化合物的治疗有效剂量是能有效的抑制肿瘤生长的剂量，一般的治疗以小剂量开始，以便不断增加剂量直到此条件下的最适。在注射前，PEG-L-ASP可与磷酸盐缓冲液或为本领域的熟练人员所熟知的任何其他适合的溶液混合。PEG-L-ASP制剂可如需求的那样以固体(冷冻干燥)或液体制剂形式给药。
本发明的优点在于：
1、使用该方法制备获得的化合物成分均一；
2、使用支链化的聚乙二醇对门冬酰胺酶进行修饰。与传统的线性聚乙二醇修饰相比，在同样降低免疫原性的情况下，可以有效的减少修饰位点的个数。用支链化的聚乙二醇进行修饰，降低了药物失活的比例，而其Y型结构可以将药物分子完全包裹起来，更充分有效地保护药物分子，从而进一步减少药物在生物体内失活的程度，不仅降低了制作药物的成本，还减少了临床给药的频率和次数，将为患者减轻药费负担，带来福音。
附图说明
图1为支链化的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的SDS-PAGE电泳图(1为门冬酰胺酶，2为支链化的聚乙二醇5kDa修饰的L-门冬酰胺酶，3为支链化的聚乙二醇10kDa修饰的L-门冬酰胺酶，4为支链化的聚乙二醇40kDa修饰的L-门冬酰胺酶)
具体实施方式
实施例1
甲基Y型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(YPEG-SMB-5000)对L-门冬酰胺酶修饰条件的选择
反应pH值的选择：各取10mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液0.5ml,置于13支带塞试管中，分别加入1ml的磷酸缓冲液，调节pH值为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10，再加入YPEG-SMB-5000固体15mg，溶解并混匀，10℃反应2h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。
结果表明：在这些条件下均能获得聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，其中pH值为9.5时修饰率最高。
反应温度的选择：各取10mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液0.5ml,置于4支带塞试管中，分别加入1ml的磷酸缓冲液，调节pH值为9.5，再加入YPEG-SMB-5000固体15mg，溶解并混匀，分别置于4℃、10℃、25℃和37℃反应2h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。
结果表明：在这些条件下均能获得聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，其中4℃的修饰率最高。
反应时间的选择：各取10mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液0.5ml,置于8支带塞试管中，分别加入1ml的磷酸缓冲液，调节pH值为9.5，再加入YPEG-SMB-5000固体15mg，溶解并混匀，置于4℃分别反应0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h和36h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。
结果表明：在这些条件下均能获得聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，其中2h后修饰率没有明显提高。
L-门冬酰胺酶和YPEG-SMB-5000反应质量比的选择：各取10mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液0.5ml,置于7支带塞试管中，分别加入1ml的磷酸缓冲液，调节pH值为9.5，再分别加入YPEG-SMB-5000固体5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、50mg和100mg(相当于YPEG-SMB-5000与L-门冬酰胺酶的质量比在1-20)，溶解并混匀，分别置于4℃反应2h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。
结果表明：在这些修饰条件下都能获得聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，当YPEG-SMB-5000和L-门冬酰胺酶的质量比在3时修饰率已达到饱和了，此后再增加YPEG-SMB-5000的量修饰率也没有明显提高。
实施例2
制备YPEG-SMB-5000修饰的L-门冬酰胺酶
修饰反应：
取10mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液0.5ml,加入1ml的磷酸缓冲液，调节pH值为9.5，再加入YPEG-SMB-5000固体15mg，溶解并混匀，分别置于4℃反应2h后加入20mg甘氨酸终止反应终止反应。
离子交换层析：
预处理：取上述反应液，用0.02M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.5缓冲液超滤三次，充分平衡，然后上柱分离。
色谱条件如下：
层析填料：Source 15 Q
柱规格：5ml
流动相：
A：0.02M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.5；
B：0.02M Na2HPO4-NaH2PO4，0.6M NaCl,pH7.5
流速：5ml/min
洗脱梯度：1-10％ 1个柱体积
          10％-30％ 4个柱体积
          30％-50％ 5个柱体积
          50％-100％ 3个柱体积
检测波长：228nm
收集：每管2ml
结果：通过此步离子交换层析可以将未修饰的与已修饰的L-门冬酰胺酶分开，修饰产物先出来。收集聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的峰。
凝胶过滤层析：
预处理：将通过离子交换获得的蛋白溶液用截留量为10000的超滤膜浓缩至2.5ml,而后上柱分离。
色谱条件如下：
层析填料：Sephacryl S-300
柱规格：1.5×200cm
流动相：0.02M Na2HPO4-NaH2PO4，0.15M NaCl,pH7.5；
流速：2ml/min
检测波长：228nm
收集：每管2ml
结果：通过此步凝胶过滤层析，可以获得不同的洗脱峰，分别为不同数目的聚乙二醇分子修饰的L-门冬酰胺酶。
Hitrap-Desalting柱脱盐：
预处理：将通过凝胶过滤层析获得的蛋白溶液,分别用截留量为10000的超滤膜浓缩至1ml,而后依次上柱进行分离洗脱。
色谱条件如下：
层析填料：Sephadex G-25
柱规格：5ml
流动相：ddH2O
流速：1ml/min
检测波长：228nm
收集：每管2ml
结果：对此步脱盐分别收集的洗脱峰，采用高效液相色谱(HPLC)对获得的组分进行分析，合并相同组分。
高效液相色谱条件如下：
色谱柱：TSKgel G 5000
流动相：0.02M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.5
流速：0.5ml/min
检测波长：228nm
柱温：10℃
结果：检测收集获得的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶和L-门冬酰胺酶的纯度均在95％以上。
实施例3
修饰产物的生物活性(比活力)测定(参考中国药典2005版：门冬酰胺酶)
用L-门冬酰胺酶标准品作为对照，测定标准品和样品催化底物的生成量，而后计算获得样品的比活力(U/mg)。结果见表1
表1：L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的生物活性
样品 比活力(U/mg)
L-门冬酰胺酶 249
YPEG-SMP-5000修饰的L-门冬酰胺酶 193
mPEG-SMP-5000修饰的L-门冬酰胺酶 149
结果表明：本发明获得的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的活性保持率更高。
实施例4
聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶热稳定性的研究
热稳定性：取L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶(液体状态，无添加保护剂)，分别置于4℃、25℃、37℃、45℃和60℃的条件下，定时取样测活。
结果：4℃的条件下：L-门冬酰胺酶的酶活力维持了2d，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶则维持了5d内基本没有改变；25℃的条件下：L-门冬酰胺酶的酶活力维持了1d，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶4d还保留了92％；37℃的条件下：L-门冬酰胺酶的酶活力维持了5h左右，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶3d还保留了97％的酶活；60℃的条件下：L-门冬酰胺酶的酶活力仅维持了5min左右便失去全部活性，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶则在保温50min后才失去全部活性.
因而，可以初步认定聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶可以明显增加L-门冬酰胺酶的热稳定性。
酶稳定性测定方法：
取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)5.4ml，分别加入1mlL-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶样品，37℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取样0.5ml，测定样品的生物活性。
结果表明：L-门冬酰胺酶在0.5h内活性迅速降到原来的22％，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶在1h内活性仅降到原来的73％。
结果表明，聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶能明显增加L-门冬酰胺酶抵抗胰蛋白酶水解的能力。
实施例5
用YPEG-SMB-2000、YPEG-SMB-10000和YPEG-SMB-30000代替试验例子1中的YPEG-SMB-5000，得到了试验例子1～4中相似的结果。
实施例6
聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶对实验动物免疫原性的研究
以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，并分别以L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶(试验例子3所得产物)作为抗原，剂量均为5U/kg/次，每周1次，共5次。
分别以L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，
测定结果：L-门冬酰胺酶组抗血清的效价为1∶17；聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶组抗血清的效价测不出。
分别以L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶作为抗原，然后用L-门冬酰胺酶组的抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定它们各自的免疫原性，
测定结果：L-门冬酰胺酶组为阳性，聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶组为阴性。
以上结果表明：同L-门冬酰胺酶比较，聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的免疫原性显著降低。

Claims (10)

1.聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于该L-门冬酰胺酶采用支链化聚乙二醇对其进行修饰；支链化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点，所述的含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇的结构式如下：
所述的n1、n2、n3分别为大于等于1的正整数,表示各分支链的聚合度，各个聚乙二醇分支链链段的数均分子量在5000-100000之间；所述的R为源自醇类化合物的烷基；所述的X为修饰L-门冬酰胺酶的活性功能基团；所述的L-门冬酰胺酶亚基上的1-8个伯氨基被相同数目的PEG修饰。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：所述的L-门冬酰胺酶亚基上的1-3个伯氨基被相同数目的PEG修饰。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：Y型聚乙二醇的分子量为5kDa-40kDa。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：活性功能基团选自氰基、羧基、氨基、醛基、琥珀酸基碳酸酯、琥珀酸基琥珀酸酯、硝基苯酯和琥珀酰亚胺酯中的一种；作为再优选，上述的活性功能基团选用琥珀酸基碳酸酯。
5.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：R基选用甲基、乙基或丙基。
6.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶，其特征在于：所述的L-门冬酰胺酶是天然或重组的。
7.一种制备上述权利要求1～6任意一项权利要求所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶的方法，该方法中含单一活性功能基团的Y型聚乙二醇与L-门冬酰胺酶发生共价结合反应的重量比例为1：0.5～20,缓冲液的pH值为4-10，反应温度为4℃～37℃，反应时间为2～36小时；在修饰反应结束后，分离纯化采用离子交换层析，凝胶过滤层析和Hitrap-Desalting柱脱盐。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：离子交换层析使用的介质为阴离子交换层析或阳离子交换层析；离子交换层析介质骨架的为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型或球状纤维素型；作为优选，离子交换层析使用的介质为QSepharose系列、SPSepharose系列，DEAE Sepharose系列、CM Sepharose系列，DEAE Sephacel系列、CMSephacel系列，QAE Sephadex系列、SP Sephadex系列，DEAE Sephadex系列、CM Sephadex系列，SOURCE Q系列或SOURCE S系列；作为再优选，选择使用SOURCE Q系列，洗脱方式采用梯度洗脱。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：凝胶过滤层析使用的介质为葡聚糖型、琼脂糖型或球状纤维素型；优选采用Sepharose系列、Sephacel系列、Sephadex系列、Superdex系列和Superose系列中的一种混多种混合；作为再优选，使用Sephacryl-300作为层析介质进行分离。
10.权利要求1～6任意一项权利要求所述的聚乙二醇共价修饰的L-门冬酰胺酶用于制备治疗单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病的药物中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101082043A (zh) * 2006-05-29 2007-12-05 上海医药工业研究院 聚乙二醇修饰的l－门冬酰胺酶
CN101584866A (zh) * 2008-05-21 2009-11-25 北京双鹭药业股份有限公司 聚乙二醇修饰的人白介素-2、其制备方法及应用
CN102898641A (zh) * 2012-06-13 2013-01-30 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 一种含单一活性官能团的y型聚乙二醇及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101082043A (zh) * 2006-05-29 2007-12-05 上海医药工业研究院 聚乙二醇修饰的l－门冬酰胺酶
CN101584866A (zh) * 2008-05-21 2009-11-25 北京双鹭药业股份有限公司 聚乙二醇修饰的人白介素-2、其制备方法及应用
CN102898641A (zh) * 2012-06-13 2013-01-30 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 一种含单一活性官能团的y型聚乙二醇及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张加慧 等: "新型Y 型聚乙二醇-尿酸氧化酶修饰物的制备及免疫原性和生物活性评价", 《中国药学杂志》 *

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