CN101586099A - 一种聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶及其修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了如式(1)所示的一种聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶及其修饰方法。利用聚乙二醇分子修饰反应特性,在适宜的反应体系pH值条件下,对门冬酰胺酶进行修饰。其特征在于:反应产物中有2个聚乙二醇分子共价结合,该物质较单一聚乙二醇分子修饰物有更低的肾小球滤过率,更低的免疫原性,从而有更好的抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的聚乙二醇修饰门冬酰胺酶及其修饰方法。
背景技术
门冬酰胺酶是一种酰胺基水解酶,专一催化门冬酰胺,生成门冬氨酸和氨。某些肿瘤细胞缺乏门冬酰胺合成酶,因此不能自身合成生长必需的门冬酰胺,其生长需要依赖宿主正常细胞合成的门冬酰胺。门冬酰胺酶可以将血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨。使用门冬酰胺酶可使血中门冬酰胺急剧缺失,肿瘤细胞既不能依赖宿主取得足够的门冬酰胺,也不能自身合成,导致其蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏,增殖受抑制,肿瘤细胞大量破坏而不能生长、存活。
门冬酰胺酶在临床上适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)的诱导缓解期疗效最好。
许多药物蛋白由于其在体内不稳定及其较高的免疫原型,导致其应用严重受限。门冬酰胺酶在人体内血浆半衰期为20小时,必须每天注射以维持药效浓度,其在临床使用中过敏反应发生率达73%。为降低酶蛋白分子的免疫原性,自1975年起曾先后尝试用亚硝酸、三硝基苯磺酸等小分子和白蛋白、单甲氧基聚乙二醇等大分子对酶蛋白分子进行修饰,研究发现单甲氧基聚乙二醇是较好的降低酶蛋白分子性的修饰剂。修饰后的药物蛋白可抵御蛋白水解酶的降解作用,其结果是药物蛋白在体内的半衰期明显延长,免疫原性明显降低,其临床疗效较天然药物蛋白明显增强。
聚乙二醇是乙二醇的聚体,分子式为H(OCH..2CH.2)nOH,其特性因聚合物分子大小而异。聚乙二醇被用于塑形剂、柔软剂、保湿剂、上光剂、化妆品、药品助溶、橡胶工业等,也用于食品或动物饲料添加剂。聚乙二醇分子呈线状或分支状,通常溶于水和有机溶剂。
聚乙二醇用于生物医药领域的原因在于其助溶性和表面保护特性,其免疫原性极低。聚乙二醇与蛋白分子共价结合后可以改变蛋白分子的一些特性,从而进一步拓展药物蛋白的应用范围。
用聚乙二醇修饰已获成功的药物包括:PEG-ADA用于酶替代治疗ADA缺乏导致的免疫缺陷;PEG-rhG-CSF在使用中也表现出更好的稳定性,并试图改用口服途径给药;PEG-TNFα随着修饰程度的提高,活性降低,但血浆半衰期显著提高;PEG-IL2在保留体内外生物活性的同时,血浆半衰期明显提高。PEG与寡核苷酸的共价结合物也已被研制出来,其抵御核酸外切酶的能力提高了10余倍。其他聚乙二醇修饰蛋白包括木瓜蛋白酶、胶原蛋白、血清IgG、α1蛋白酶抑制剂、生长激素释放因子、过氧化氢酶、尿酸酶、血红蛋白等。
聚乙二醇修饰技术目前已较为成熟,使用该技术对部分大分子蛋白类药物修饰后,可以达到延长体内半衰期,在保持生物等效的前提下减小给药剂量、减轻毒副作用、降低生产成本的目的。因此对于现有产品的升级换代将发挥重要作用。
目前,聚乙二醇修饰的优点已成为共识。但以往聚乙二醇修饰同样存在一些不足:一.由于第一代聚乙二醇修饰剂(如聚乙二醇琥珀酰亚胺脂)修饰的非选择性,使得修饰产物呈不均一性,且对于修饰混合物的分离有一定技术难度。目的修饰物收率明显降低,从而影响药物的规模化制备,且聚乙二醇的过多结合势必影响到酶活。二.在聚乙二醇单修饰中,可获得均一修饰产物。但有些时候,聚乙二醇单一修饰产物并不能完全的达到增加生物利用度和延长生物活性半衰期的目的。聚乙二醇在体内一旦脱落,药物就完全失去了聚乙二醇修饰的优势了。
发明内容
为了解决上述聚乙二醇修饰的问题,我们在最大限度保存酶活性的同时,通过适宜的反应条件,利用聚乙二醇醛对门冬酰胺酶N端和一个赖氨酸侧链的游离氨基有较强的连接反应的特性,获得了连接两个聚乙二醇分子的聚乙二醇修饰门冬酰胺酶。此聚乙二醇修饰物具有几方面特点:一.两个聚乙二醇修饰,酶活没有明显变化;二.反应产物均一度高,便于后续的分离纯化;三.生物半衰期较单聚乙二醇修饰物有明显的提高。
本发明目的在于提供一种新的聚乙二醇修饰门冬酰胺酶及其修饰方法。
其特征在于:
一.聚乙二醇修饰物
所用门冬酰胺酶为大肠杆菌来源的天然酶,聚乙二醇为优选的分子量20KD的单甲氧基聚乙二醇醛。一条聚乙二醇链连接于门冬酰胺酶的N端,另一条连接于门冬酰胺酶任意一个可反应的赖氨酸上。
二.修饰方法
1.修饰反应中门冬酰胺酶与聚乙二醇的用量比(摩尔比)范围是20∶1-1∶1,优选的用量比是5∶1。
2.修饰反应的pH范围应控制在6.0-8.0,优选为7.0,缓冲体系为磷酸盐缓冲液。
3.修饰反应的温度范围应控制在4-25℃,反应前8个小时在4℃冰箱中进行;后8小时在室温下进行,伴以充分搅拌。
我们选用来自大肠杆菌的天然酶,由321个氨基酸组成4个亚单位而构成。门冬酰胺酶作为药物已经上市多年,且肿瘤治疗效果显著。但其抗原性高,血浆清除率高的缺点可以通过聚乙二醇修饰来克服。
有研究数据显示,聚乙二醇的分子量越大,其修饰产物的体内半衰期就越长,本发明中聚乙二醇分子量选择1KD-60KD,较佳的是5KD-40KD,更佳的是10KD-30KD,最佳的是20KD。
聚乙二醇分子一端封闭,以减少不可控的多连接产物的产生,本发明尝试了带有不同封闭基团的聚乙二醇醛,其反应特性相类似,反应产物没有明显的不同。其中优选甲氧基封闭的聚乙二醇醛。
从反应机理来看,不同结构的聚乙二醇分子的结合反应应该没有不同。但我们发现,直连、支链、星形和树形四者的反应效率有所不同,反应效率由高到低顺序为直连、支链、星形、树形。很有可能聚乙二醇的空间结构的影响所致。本发明优选直连和支链结构的聚乙二醇醛分子。
聚乙二醇脂类修饰剂反应所需量通常为蛋白质或酶量的10倍以上,对于某些药物的修饰甚至要在50倍或更多,投入成本较高;聚乙二醇脂可以与蛋白质或酶分子上的N端氨基酸,赖氨酸甚至组氨酸等多种氨基酸连接,反应专一性较差,修饰产物大多是混合物,不容易得到均一物质,且聚乙二醇连接过多势必影响酶活。聚乙二醇脂性状也不很稳定,很容易水解失活,不利于修饰反应的进行。
第二代修饰剂,如聚乙二醇醛类,可以获得N端单一聚乙二醇修饰的产物,一定程度上解决了定点修饰的问题和修饰产物均一性问题。如美国安进公司上市产品Neulasta获得成功。但并不是所有药物进行单一定点修饰就是最理想的方式,有数据显示,某些药物聚乙二醇单一修饰产物并不能完全的达到增加生物利用度和延长生物活性半衰期的目的。聚乙二醇在体内一旦脱落,药物就完全失去了聚乙二醇修饰的优势了。
本发明利用聚乙二醇醛分子自身的反应特性,在适宜的反应条件下,获得了两个聚乙二醇分子连接的门冬酰胺酶产物。此分子最大程度上保护了门冬酰胺酶的活性,又实现了产物均一化,免疫原性明显下降,半衰期明显降低。
通常情况下,在修饰反应中,聚乙二醇投入量应大于或远大于蛋白质的量,以达到提高修饰效率的目的。但聚乙二醇的过量,增加了反应结合物再次反应的几率,从而增加了多聚乙二醇修饰物的产生,影响了产物的均一性,给后续纯化带来一定难度。本发明则采用门冬酰胺酶过量的方法,门冬酰胺酶与聚乙二醇醛的比例为20∶1-1∶1,考虑成本,优选5∶1的比例,有效的避免了多修饰物过量产生。
对于聚乙二醇醛来说,通常选择酸性条件,并利用蛋白质N末端pK值的优势,修饰N末端氨基。此反应虽然专一性较强,但不能完全避免聚乙二醇与蛋白质侧链赖氨酸游离氨基反应。研究发现,pH值的升高,结合与赖氨酸的聚乙二醇增多。本发明就是利用这一点,优选pH7.0下反应,获得了N末端和赖氨酸分别连接聚乙二醇的双聚乙二醇修饰产物。而且通过活性检定实验表明,此分子与单一聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶的活性相差无几。
本发明修饰反应中,我们发现,聚乙二醇醛分子反应所需时间较长,随着时间的延续,多修饰物的产生不断增多。反应时间在10-16小时反应产物组成基本稳定,只是各个产物比例会随着时间的延续而增加。小于10小时,反应效率不是最佳,而大于16小时,多修饰产物比例将大幅增加,而造成产物过度不均一。优选反应时间为16小时。
反应过程采用两个阶段进行。这是基于聚乙二醇醛分子的反应特点进行的。聚乙二醇修饰反应还有另一个特点就是已连接上聚乙二醇分子的蛋白质,再次连接聚乙二醇的能力下降。本发明首先选择4℃下进行起初反应,减少分子活跃度,从而减少不确定修饰物产生过多;25℃下进行,有利于增加第二个聚乙二醇的结合。
以上反应条件单独进行,都不能获得所需物质,必须结合进行才能获得预期效果
附图说明
附图为本发明中聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶修饰效率及修饰产物分子量分析的SDS-PADE电泳图。
Lane1:PEG-ASP反应物
Lane2:ASP
Lane3:分子量Marker
具体实施方式
为了更好的说明本专利的实施过程,我们列举如下实施例。需要说明的是,以下所列举的实施例是本发明思路和精神的具体体现之一,并不是本发明专利说明书内容的范围限制,更不是对权利要求的具体细化。
实施例1聚乙二醇修饰门冬酰酶的制备
取门冬酰胺酶原液100ml(缓冲体系为pH7.0、20mMPB缓冲液,蛋白浓度为5mg/ml),另取mPEG-ALD(20kd)100mg,加入门冬酰胺酶原液中,室温下搅拌使之迅速溶解,置10℃慢速搅拌8小时。再加入mPEG-ALD(20kd)100mg,10℃慢速搅拌8小时,通过凝胶排阻层析及离子交换层析达到修饰物的提纯。
实施例2SDS-PADE电泳检测
电泳仪:DYY-6C
浓缩胶:5%
分离胶:12%
上样体积:25μl
电压设置:80V,30min;180V,60min
检测结果:经凝胶成像系统分析后得出,聚乙二醇总修饰效率为76.25%,其中主要条带修饰效率为63.41%。主要条带的分子量为81400道尔顿,而理论的分子量应为75500道尔顿。这是因为聚乙二醇在聚丙烯酰胺凝胶中迁移时,聚乙二醇象一个易弯曲的长尾巴,减缓了整体迁移速度所致。
实施例3酶活测定
利用Mashburn Wriston方法。该方法通过测定产物中氨基酸的浓度来确定门冬酰胺酶(Asparaginase)对底物的水解速率,所产生的氨量通过Nessler试剂与蛋白质间的颜色反应而确定。
At:样品值
A0:阴性对照值
df:稀释倍数
As:阳性对照值
Cpr:蛋白样品浓度
两个聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶,酶活保留率为41.14%,酶活没有因为第二个聚乙二醇的连接而下降。
实施例4免疫原性研究
方法:福氏佐剂免疫法
实验动物:家兔
抗原:门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶
注射剂量:5U/kg/次
给药周期:4周
测定结果:
一.以门冬酰胺酶和聚乙二醇化门冬酰胺酶各自作为抗原,用双向免疫扩散法测定各自抗血清的效价。门冬酰胺酶组抗血清效价为1∶14,而聚乙二醇化门冬酰胺酶组则测不出其抗血清的效价。
二.再用门冬酰胺酶组的抗血清作为一抗,以HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗,ELISA测定各自的免疫原性,结果显示,门冬酰胺酶组为阳性,聚乙二醇化门冬酰胺酶组为阴性。
实施例5初步药效学研究
Balb C(SPF级)小鼠,60只,雌雄各半,体重18-22g,购自中国军事医学科学院。
将60只小鼠进行淋巴细胞白血病P388细胞的接种,接种后,筛选出接种理想的小鼠并进行分组,分别是:空白对照组、阳性对照组、门冬酰胺酶组和聚乙二醇门冬酰胺酶组。每组10只,雌雄各半,组间动物平均体重相差不超过1g。分别用生理盐水将门冬酰胺酶和聚乙二醇门冬酰胺酶稀释至3750IU/kg,腹腔注射给药。空白对照组给予生理盐水,阳性对照组注射阿霉素(20mg/kg)连续给药7天。停药后24h处死小鼠,取出瘤块,称瘤块重量。结果下表所示:
与对照组比较P<0.01,与门冬酰胺酶组比较P<0.05
结果显示:聚乙二醇化的门冬酰胺酶对P388实体瘤的抑瘤作用明显优于门冬酰胺酶组和阳性对照组,有更好的抑瘤作用。
Claims (9)
1.如式(1)所示:一种聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶,其特征是该分子由门冬酰胺酶分子和两个聚乙二醇分子组成。一条聚乙二醇链结合于蛋白质N末端,另一条聚乙二醇链与门冬酰胺酶任一赖氨酸侧链上的游离氨基结合所组成的聚乙二醇共价连接产物。Y是末端封闭基团,X是赖氨酸的位置。
2.权利要求1所述的门冬酰胺酶可以是大肠杆菌来源、欧文氏菌来源或重组门冬酰胺酶。
3.权利要求2所述的门冬酰胺酶,优选来源于大肠杆菌(Asp1.357株)的门冬酰胺酶。
4.权利要求1所述的聚乙二醇分子是一端封闭的聚乙二醇,另一端为-CHO或-CO的结构。如聚乙二醇乙、醛聚乙二醇丙醛、聚乙二醇丁醛、聚乙二醇叔丁醛等,其分子量范围是1KD-60KD。
5.权利要求4所述的聚乙二醇分子,其结构可以是直连、支链、星形或树形结构。
6.权利要求4所述的聚乙二醇分子,封闭基团Y为C1-12的烷氧基、环烷氧基或芳烷基。
可以是甲氧基、乙氧基、苄氧基,其中优选单甲氧基封闭的聚乙二醇分子。
7.权利要求4所述的聚乙二醇分子,优选分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇。
8.权利要求4所述的聚乙二醇分子,是聚乙二醇醛或其衍生物。
9.获得权利要求1所述物质的方法是:门冬酰胺酶浓度:0.1-10mg/ml;聚乙二醇分子∶门冬酰胺酶(摩尔比)=20-1∶1;反应温度:4-25℃;反应体系pH值:4-8。
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