CN107693796A - Peg定点修饰的门冬酰胺酶注射剂 - Google Patents

Peg定点修饰的门冬酰胺酶注射剂 Download PDF

Info

Publication number
CN107693796A
CN107693796A CN201610461047.7A CN201610461047A CN107693796A CN 107693796 A CN107693796 A CN 107693796A CN 201610461047 A CN201610461047 A CN 201610461047A CN 107693796 A CN107693796 A CN 107693796A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pegaspargase
asp
injection
terminal
pointed decoration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610461047.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107693796B (zh
Inventor
马永
王俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changzhou Qianhong Biopharma Co., Ltd.
ZonHon Biopharma Institute Inc.
Original Assignee
ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc filed Critical ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority to CN201610461047.7A priority Critical patent/CN107693796B/zh
Publication of CN107693796A publication Critical patent/CN107693796A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107693796B publication Critical patent/CN107693796B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射剂及其制备方法。注射剂主要成份为N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶，还包括缓冲盐、蛋白稳定剂、水，所述蛋白稳定剂为山梨醇。本发明N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射剂能够有效提高门冬酰胺酶的稳定性，降低用药过程中的不良反应，同时延长用药周期、减少给药次数和注射给药带给患者的痛苦。

Description

PEG定点修饰的门冬酰胺酶注射剂
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，尤其涉及聚乙二醇N端定点修饰门冬酰胺酶的注射剂。
背景技术
门冬酰胺酶(Asparaginase，ASP)又名L-天冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，是一种催化天冬酰胺水解成天冬氨酸的酶。门冬酰胺酶可以有效的治疗儿童或成人中的急性淋巴细胞白血病(ALL)。最近几年，含有门冬酰胺酶的药物已经用于联合化疗方案来治疗NK/T细胞淋巴瘤，并取得了较好的治疗效果。NK/T细胞淋巴瘤是种特殊类型的非霍奇金淋巴瘤，多见于亚洲和拉丁美洲，我国发病率相对较高。根据肿瘤发生部位，NK/T细胞淋巴瘤可分为鼻型NK/T细胞淋巴瘤和非鼻型NK/T细胞淋巴瘤。另外门冬酰胺酶还被用于治疗何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓单核细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤，网状细胞肉瘤和黑素肉瘤。
L-门冬酰胺酶最初从若干生物体中纯化，包括大肠杆菌(E.coli)和软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。在哺乳动物中，仅在豚鼠(Cavioidea超科)和某些阔鼻猴(NewWorld monkey)中发现略高于痕量的L-门冬酰胺酶。由于它来源于外源生物，对人而言是一种外源蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，因而限制了其临床应用。对门冬酰胺酶进行聚乙二醇修饰可以解决这个问题。国外利用聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的产品Oncaspar(Enzon inc.)于1994年上市，在2006年起被批准作为儿童和成人的ALL的一线治疗用药。国内SFDA于2009年批准恒瑞培门冬酶(聚乙二醇化门冬酰胺酶)注射液上市。
这两种产品都是随机修饰的产品，产品组成不均一，由偶联了不同数目的PEG分子而组成。并且由于修饰位点较多，对门冬酰胺酶的活性部分具有较大的位阻作用，造成活性有较大损失，只保留了原蛋白60％的活性。本发明专利中的修饰产品，采用的是N端定点修饰技术。修饰产物均一，活性更高。
本发明内容是针对N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶开发出的制剂产品。目前国内外尚无相关产品的报道和研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适合N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的注射给药的药物制剂。
本发明提供的N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射剂由N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶、药用辅料和水组成，所述N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶为聚乙二醇在L-门冬酰胺酶的2个亚基的N端伯氨基上偶联，所述聚乙二醇分子量为30kDa～40kDa，聚乙二醇为分支型、活化基团为醛基。
作为优选，所述N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的结构通式如下所示：
其中R为H或C1-C4的烷基；n为100到500的整数值，p为1-4的整数；AA为N端的L-氨基酸残基，m为0-5的整数,s为1或者2。
优选地，所述烷基为甲基，n为320-455之间的整数值，p为2，m为0。所述聚乙二醇优选分子量40KDa。
所述注射剂中N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶含量为0.5-50mg/ml。
优选的，所述药用辅料包括蛋白稳定剂，优选为山梨醇。
优选地，所述蛋白稳定剂的含量为10-50mg/ml。
优选地，N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射剂pH为5-7，优选pH为6。
所述药用辅料还包括缓冲盐，缓冲盐选自磷酸缓冲盐或醋酸缓冲盐，优选磷酸缓冲盐，缓冲盐浓度为10mM-500mM。
最优选的，所述N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射剂配比如下：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶0.5g、磷酸二氢钠5.26g、磷酸氢二钠0.87g、山梨醇30g、水1000g。
本申请注射用N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶制剂为肌肉注射型，给药剂量为2500IU/m2，每14天给药一次。
本申请中所涉及的N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的注射剂，具有以下优点：
(1)提高门冬酰胺酶的稳定性
门冬酰胺酶的不稳定性主要表现为聚集、变性、降解。而导致这些不稳定性的因素除了外界环境的温度、光照、PH外，还有蛋白相互之间的碰撞。经N端定点修饰的聚乙二醇修饰后，相当于数十个同样大小的具有自身空间结构的分子将其包裹。首先，修饰时选择蛋白分子上活性较高的位点进行修饰。其次N端定点修饰的聚乙二醇将蛋白包裹后，减少蛋白与蛋白之间的碰撞，使蛋白的稳定性有所增加，而本发明对溶液体系的pH、缓冲盐的种类、缓冲盐的浓度、蛋白稳定剂的种类、蛋白稳定剂的浓度进行了筛选，进一步提高了门冬酰胺酶的稳定性。
(2)降低不良反应
首先，门冬酰胺酶是从动物胰腺中提取的一种蛋白水解酶，对人而言是一种外源蛋白。N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的免疫原性明显下降。从而大大降低了临床用药的风险。其次，本发明中所涉及的聚乙二醇化门冬酰胺酶的修饰方法采用定点修饰方法，所修饰的蛋白位点和修饰数量一致，修饰产物均一，降低临床用药的风险。
(3)延长用药周期，提高药效
N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的分子较修饰前有较大的扩增，体内代谢周期延长，减少给药次数和注射给药带给患者的痛苦，减少未修饰的门冬酰胺酶给药所呈现血药浓度的峰谷现象，避免血药浓度的峰谷现象带来的不良反应。给药后，患者体内血药浓度长时间相对稳定的维持在治疗阈内，有利于药品更好的发挥治疗效果。
附图说明
图1：不同N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶高效液相分析。
使用SEC法分别对培门冬酶、Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)、Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)进行分析。从结果中可以看出，经过纯化后，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)，Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)纯度均能达到98％以上，略高于培门冬酶的纯度97％。且与培门冬酶相比，Y-PALD-40K-ASP(Di)、Y-PALD-30K-ASP(Di)具有更高的分子量。
图2：不同N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶SDS-PAGE分析。
使用还原性SDS-PAGE对培门冬酶、Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)、Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)进行分析。图2a泳道1-4分别为高分子量Marker、培门冬酶、Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)。图2b泳道1-3别为高分子量Marker、Y-PALD-30K-ASP(Di)及Y-PALD-30K-ASP(Mono)。由于ASP为四亚基组成的同源四聚体，在还原环境中，四个亚基会发生解聚。由于修饰度不同各亚基在SDS-PAGE中将显示出不同的条带。如图所示，培门冬酶呈现出弥散条带，说明其蛋白均一度较差，与之相比，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)显示出被修饰亚基与未被修饰亚基两条清晰的谱带，均一度较高，图2a中泳道3、4图2b中泳道2、3中显示的分子量较大的条带表示经修饰后的ASP单亚基，分子量较小的条带表示未经修饰的ASP单亚基。
图3：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的修饰位点鉴定。
从N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶和原蛋白的酶解肽图可以看出，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)的PEG是修饰在蛋白的N端的。其中Y-PALD-40K-ASP(Mono)是门冬酰胺酶分子的4个亚基中，只有一个亚基的N端偶联上了一个PEG分子。其中Y-PALD-40K-ASP(Di)是门冬酰胺酶分子的4个亚基中，有两个亚基的N端各偶联上了一个PEG分子。
图4：不同N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶圆二色光谱分析
使用圆二色光谱分别对门冬酰胺酶、Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)进行结构鉴定。从结果看，远紫外扫描结果显示，与门冬酰胺酶相比，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)圆二色特征谱图未发生明显变化，近紫外结果显示出相同结果。由此认为，经过Y-PALD-40K-PEG修饰后，蛋白主体结构未发生变化。
图5：不同N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶荧光光谱分析
使用荧光分光光度计对门冬酰胺酶、Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)进行内源荧光光谱扫描，结果表明PEG修饰后没有改变门冬酰胺酶的三级结构。
图6：门冬酰胺酶及N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶药代动力学性质检测。
图6a表示静脉注射的药代动力学结果，图6b表示肌肉注射的药代动力学结果。
使用125I同位素标记示踪法对PEG修饰后的门冬酰胺酶的体内血药浓度进行了研究。从结果看，与门冬酰胺酶相比，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)均具有更好的药代动力学性质，其中Y-PALD-40K-ASP(Di)药代动力学性质提升更为显著。
图7：不同N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶热处理后的活性测定
图8：不同N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶体外酶活测定。
使用《中国药典》所附方法分别对门冬酰胺酶、Oncaspar、培门冬酶、Y-PALD-40K-ASP(Mono)、Y-PALD-40K-ASP(Di)、Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)的体外酶活进行检测。从结果可以看出，门冬酰胺酶相比，经过修饰后，各修饰产物均有不同程度活性损失。其中Oncaspar和培门冬酶损失较大，本发明的修饰产物的活性损失相对较小。
图9：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液在NOD/SCID小鼠体内对非霍奇金淋巴瘤(RI-1)的抑制作用
具体实施方式
定义：
本发明使用的缩写含义如下：
PEG，聚乙二醇；PEG修饰剂，聚乙二醇修饰剂。
聚乙二醇(PEG，HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH)是一种两端带羟基的线型聚合物，聚乙二醇是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成，有分支型，直链型和多臂型。PEG也被称为poly(ethyleneoxide)(PEO)，poly(oxy-ethylene)(POE)，或者polyoxirane。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)，这种衍生物是蛋白质聚乙二醇化技术中最常用到。
聚乙二醇修饰剂，则是指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是指经过活化的聚乙二醇，目前主要用于蛋白质以及多肽药物修饰，又叫修饰性聚乙二醇，修饰性PEG。
Y-PALD-40K，分子量为40KDa的分支聚乙二醇丙醛，结构通式为其中R为甲基，n为455，p为2；
Y-PALD-30K，分子量为30KDa的分支聚乙二醇丙醛，结构通式为其中R为甲基，n为320，p为2。
ASP，门冬酰胺酶。
几种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的修饰产物可在本申请中称为“Y-PALD-40K-ASP(Mono)(用分子量为40K的PEG丙醛修饰门冬酰胺酶后纯化得到的单修饰产物，只有一个亚基的N端偶联了PEG)及Y-PALD-40K-ASP(Di)(用分子量为40K的PEG丙醛修饰门冬酰胺酶后纯化得到的二修饰产物，有两个亚基的N端偶联了PEG)，Y-PALD-30K-ASP(Mono)(用分子量为30K的PEG丙醛修饰门冬酰胺酶后纯化得到的单修饰产物，只有一个亚基的N端偶联了PEG)及Y-PALD-30K-ASP(Di)(用分子量为30K的PEG丙醛修饰门冬酰胺酶后纯化得到的二修饰产物，有两个亚基的N端偶联了PEG)”统称为PEG-ASP或PEG修饰ASP的偶联物。Oncaspar，是原研药的产品名称。
本发明使用的聚乙二醇修饰剂优选下面几种：醛基活化的的聚乙二醇，更具体地，聚乙二醇修饰剂为丙醛活化的聚乙二醇。
在本发明中，所修饰的门冬酰胺酶蛋白，可以是任何来源的，门冬酰胺酶可从大肠杆菌中提取，包括但不限于大肠杆菌。也可以是重组表达的。在本发明的偶联物的特定实施方式中，门冬酰胺酶与包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白具有至少约60％的序列一致性。更特别地与包含SEQ ID NO:1的蛋白具有至少约65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或100％的序列一致性。
在特定的实施方式中，所述蛋白为大肠杆菌来源的门冬酰胺酶，其具有SEQ IDNO:1的序列。
下面将通过实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的制备及分析
制备例一，本发明N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶通过如下方法制备、纯化、鉴定：
1.N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶制备
用40mM pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解将L-门冬酰胺酶(来源于常州千红生化制药股份有限公司)配制成为20mg/mL的溶液，PEG采用Y-PALD-40K(购自北京键凯科技有限公司)，按门冬酰胺酶:PEG:氰基硼氢化钠为1:4:200的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h后，加入1M甘氨酸终止反应。制备得到单修饰产物Y-PALD-40K-ASP(Mono)及二修饰产物Y-PALD-40K-ASP(Di)。
2.N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶纯化
色谱法条件：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrap Q HP 5mL)，A液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，B液：含1M NaCl的20mM的Tris-HCl(pH9.0)，流速2.5mL/min，检测波长为280nm。
上样：上述修饰反应产物用0.5M的NaOH溶液调节至pH 9.0，结合至Q离子交换柱。
平衡：A液冲洗5个柱体积。
洗脱：0-50％B液，洗脱体积为10个柱体积，时间20分钟，分步进行收样。
2.N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶样品检测
2.1色谱方法检测：
色谱法条件：HPLC(Waters，e2695 HPLC)，Superdex 200 10/300GL(购自GE公司)，流动相为含0.1M Na2SO4的PBS(pH7.4)，流速为0.4mL/min，检测波长为280nm，进样量50μL，检测时间为60min。
分析结果见图1a所示。如图可以看出，制备的两种产物Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)的纯度均高于98％。同时，Y-PALD-40K-ASP(Di)修饰产物的分子量也高于培门冬酶(购自江苏恒瑞医药股份有限公司)的分子量。
2.2电泳方法鉴定：
蛋白浓缩胶为8％，分离胶为7％。浓缩胶缓冲液为0.5M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)；分离胶缓冲液为1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)。取10ug蛋白样品，与样品缓冲液等体积混合，在100℃下煮沸5min后上样运行，电泳结束后用使用考马斯亮蓝染液进行染色。鉴定结果如图2a所示。
制备例二PEG为Y-PALD-30K，具体参数与得率如下表1所示，表1未列出的方法步骤和参数与制备例一相同：
表1
实验条件 对应实验参数
pH值 5.0
修饰剂 Y-PALD-30K
摩尔比(蛋白:PEG:还原剂) 1:5:100
反应温度 4℃
反应时间(小时) 24
蛋白浓度(mg/mL) 15
同时也对制备例二所得修饰产物进行色谱法与电泳法进行鉴定，所得结果分别如图1b、2b所示。
制备例二所制备的单修饰及二修饰产物的活性及纯度与制备例一中的所得的单修饰及二修饰产物无显著性差异，Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)的纯度均高于98％。
由图2a、2b可以看出，修饰产物Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)，Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)的电泳条带非常均一。比较国内市场上的同类产品——培门冬酶(购自江苏恒瑞医药股份有限公司)，均一性得到很大提高。
图2a中第3、4泳道都显示出两条均一的条带，第3、4泳道中的第一个条带所对应的分子量大概是200KDa左右，由于PEG分子在溶液中会结合大量水分子，使得其表观分子量是其理论分子量的4倍左右。因此可以初步判断这个条带是偶联了一个PEG分子的门冬酰胺酶的亚基，而第二个条带所对应的分子量是34KDa左右，和门冬酰胺酶的单个亚基的分子量一致，因此可以初步判断第二个条带是没有偶联上PEG的门冬酰胺酶的单个亚基。通过软件分析结果可以得出，第3泳道的第一个条带和第二个条带的含量的比例为1：1，说明该修饰产物中，有两个亚基偶联上了PEG，而另两个亚基没有偶联上PEG分子，可以确定是二修饰产物。同样，在第4泳道上我们通过软件分析得出，第一个条带和第二个条带的含量的比例为1：3，说明该修饰产物中，只有一个亚基偶联上了PEG，而另三个亚基没有偶联上PEG分子，可以确定是单修饰产物。结果和我们的预期相一致。而第2泳道已上市的产品培门冬酶确显示出弥散的条带，这是由于培门冬酶采用的是随机修饰方式，在最终的修饰产物中，每个门冬酰胺酶上的亚基所偶联的PEG个数并不相同，因此在电泳中显示出来的是弥散的条带。从产品的均一性来看，本发明中制备的定点修饰产物均一性较好，具有较大的优势。和图2a比较，在图2b中也得到了类似的结果，有所区别的是，由于所使用的PEG是分子量为30KDa的，因此图2b中第2，3泳道的第一个条带的大小对应的分子量是150KDa左右，略小于用分子量为40KDa的PEG修饰得到的修饰产物。
实施例2：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶修饰位点的鉴定
为了确定N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的PEG修饰位点，我们对N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶进行了胰蛋白酶的酶解实验，并和原蛋白的酶解图谱做比较。通过比较原蛋白和修饰产物肽段的差异，可以确定PEG的修饰位点。具体实验步骤如下，取浓度为0.5mg/mL样品100μL加入0.9μL浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应5h。反应结束后加入10％wt的TFA对反应进行终止。酶解产物使用C18反相色谱柱(购自Waters公司)进行分析，流动相分别为：A液H2O+0.1％wtTFA，B液乙腈+0.1％wtTFA，上样量为80μL，流速为0.5mL/min，运行时间为120min。梯度洗脱条件：0-100min 5％wt-60％wtB。
肽图的比较结果如图3所示，由图可以看出，N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的N末端肽段和原蛋白比较，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)N末端肽段峰面积已经分别降低了25％和50％，说明PEG确实是偶联到了ASP的N末端氨基酸上，与预期结果一致。其中Y-PALD-40K-ASP(Mono)是单修饰产物，只有一个PEG偶联在门冬酰胺酶的一个亚基上，而另外3个亚基并没有偶联上PEG，因此在对其进行胰蛋白酶酶解后，和原蛋白比较，只有一个亚基的N端肽段的峰会发生位移，而另外三个亚基由于并没有偶联上PEG，因此N端肽段的出峰不会发生变化。因此最终N端肽段的峰面积只降低了25％。而对于二修饰产物Y-PALD-40K-ASP(Di)，每个门冬酰胺酶分子有两个亚基偶联上了PEG，因此和原蛋白比较，最终N端肽段的峰面积降低了50％。
结合实施例1中的实验结果，进一步验证了我们纯化得到的两个修饰产物是修饰在蛋白N端的单修饰和二修饰产物。用分子量为30KDa的PEG修饰产物进行酶解肽图的分析也得到了相同的结果，说明我们用分子量为30KDa的PEG修饰后得到的两个修饰产物是修饰在蛋白N端的单修饰和二修饰产物。
实施例3：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶和原蛋白的圆二色谱图分析
用圆二色光谱仪可以表征修饰蛋白以及未修饰蛋白的二级结构及三级结构。蛋白浓度范围是0.1～0.2mg/mL。样品加入1mm光径的圆二色比色杯，检测其远紫外区(190nm-250nm)和近紫外区(253nm-480nm)的圆二色光谱，扫描带宽为1nm，扫描速度为500nm/min。每次检测以相应缓冲液为背景，测三次取平均值。由图4可以看出，N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的远紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的光谱几乎没有发生峰的位移，峰值没有明显变化，说明用分枝状PEG修饰后的二级结构没有差别，这个结果符合PEG的特性，由于PEG在溶液中是一种柔性的两亲性大分子，因此偶联到蛋白表面后，不会对其结构有显著影响。说明PEG修饰没有影响ASP的二级结构。同样的，N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的近紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的光谱也几乎没有发生峰的位移，虽然峰值有一定变化，这说明PEG修饰没有影响ASP的三级结构。总体看来，通过定点修饰制备的偶联物，ASP的高级结构基本没有发生改变。由于偶联物经过PEG修饰后，其结构未变化，因此其活性和原蛋白比较，损失较少。
实施例4：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶和原蛋白的荧光谱图分析
修饰蛋白以及未修饰蛋白的内源荧光检测的激发波长为280nm，发射波长范围为300～400nm。扫描速度为1200nm/min。激发和发射的缝隙宽度(slit widths)均为5nm，使用0.1cm的样品池，在室温下进行检测。待测蛋白质的浓度范围是0.1～0.2mg/ml。
通过内源荧光(Intrinsic Fluorescence)来检测PEG修饰对门冬酰胺酶三级结构的影响。如图5所示，当激发波长为280nm时，门冬酰胺酶及其修饰产物的发射荧光峰值在315nm处。单修饰、二修饰和门冬酰胺酶，其荧光发射光谱基本一致。这表明PEG对门冬酰胺酶的修饰不影响其三级结构。PEG修饰蛋白的发射光谱强度比未修饰蛋白略有降低，这可能跟PEG链对蛋白光谱发射产生的屏蔽作用有关。
实施例5：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的药代动力学研究
用分子量为30KDa和40KDa的分支PEG修饰门冬酰胺酶得到的修饰产物的活性差别不大。但从药代动力学的角度考虑，一般分子量越大的修饰产物，其药代动力学的表现越好。因此本实施例中选择用分子量为40KDa的分支PEG修饰得到的二修饰和单修饰产物进行药代动力学研究，并和未修饰的原蛋白以及已上市的的产品培门冬酶进行比较。
我们分别考察了静脉注射和肌肉注射给药的药代动力学。对样品采用IODOGEN标记方法进行125I标记。并对标记后的供试品进行纯化，经SHPLC验证纯度。标记后的系列样品采用BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度测定，然后分别与各自一定量的未标记的样品混合，用1×的溶媒(10×的溶媒用注射用水稀释到1×)将样品稀释1.175mg/mL的注射液，并取配制后的药物(5μL左右)，测定放射性。比活性＝放射性/蛋白浓度。大鼠给药后按照一定的时间点进行取样，如果各静脉给药组最后一个取血时间点血药浓度未低于2min时间点血药浓度的1/20，那么接下来继续取血每天一次，直至其血药浓度低于2min时间点的1/20。如果各肌肉给药组最后一个取血时间点血药浓度未低于达峰血药浓度的1/10，那么接下来继续取血每天一次，直至其血药浓度低于达峰血药浓度的1/10。取血后将血样立即置于加有肝素钠(1000IU/mL，10μL)抗凝的EP管中，颠倒5～10次，4000rpm离心5分钟分离出血浆。取50μL血浆，加入等体积的20％三氯乙酸(TCA)，涡旋混匀后，测定总放射性。之后4500rpm，常温离心10min，弃上清，测定沉淀部分放射性。
代谢动力学参数计算：采用WinNonlin6.2进行非房室模型方法(NCA)拟合计算AUC等主要代谢动力学参数；
2)浓度计算：
3)数据处理：采用Excel 2007对均值、标准差等数据进行统计描述。
药代动力学各参数的计算结果见表2、表3，图6a、6b所示。
表2 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶和门冬酰胺酶的药代动力学参数比较(静脉注射)
表3 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶和门冬酰胺酶的药代动力学参数比较(肌肉注射)
Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)的药代参数与门冬酰胺酶的参数相比，无论是静脉注射还是肌肉注射，其半衰期明显延长，并且药时曲线下面积(AUC)有了显著提高。其次，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)在血液中的清除速率也远低于门冬酰胺酶。由此可见，与门冬酰胺酶相比，Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)在体内的稳定性均有一定程度的增强，而Y-PALD-40K-ASP(Di)增强幅度更为明显，因此其半衰期显著提高，血液中代谢速度明显降低，有效的延长了药物的药效时间，如图6所示。另外从软件计算的药代参数可以看出，和已上市的培门冬酶比较，不管是肌肉注射还是静脉注射，Y-PALD-40K-ASP(Di)的半衰期都高于培门冬酶。
实施例6：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的稳定性研究
将培门冬酶、Oncaspar(购自Sigma Tau制药公司)以及Y-PALD-40K-ASP(Di)分别用Tris-HCl(9.0)的缓冲液稀释到1mg/ml。放入55℃水浴锅中，分别于0h、1h、2h、3h、4h、5h之后各取出100ul，用于酶活性检测。活性测定结果如图7所示。
由图可以看出，经过水浴处理1小时，培门冬酶的活性基本完全损失，活性基本为零，Oncaspar样品的酶活略好于培门冬酶，在处理1小时后保留了30％左右的活性，而Y-PALD-40K-ASP(Di)样品在处理1小时后保留了80％左右的活性，在处理5小时后依然保持了60％左右的生物活性，稳定性显著优于培门冬酶和Oncaspar。分析培门冬酶和Oncaspar活性显著降低的原因，应该和其PEG容易脱落有关，由于PEG分子的不断脱落，使得PEG对门冬酰胺酶的保护作用显著降低，造成活性损失较大。而Y-PALD-40K-ASP(Di)样品在处理过程中没有发生PEG脱落，PEG分子可以很好的增加门冬酰胺酶的热稳定性，因此活性损失相对较慢。
实施例7：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的体外活性检测
L-门冬酰胺酶可以水解门冬酰胺的酰胺基，根据这一原理，可以对门冬酰胺酶的活性进行测定。具体测定方法参照2005版药典第二部第31页所述方法进行。测活所需的试剂都购自国药集团化学试剂有限公司。检测的样品分别是Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)，Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)以及未修饰的原蛋白和市场上的同类产品培门冬酶(购自江苏恒瑞医药股份有限公司)，Oncaspar(购自Sigma Tau制药公司)。它们的相对活性比较结果如图8所示。
由图8活性测定的结果可以看出，本发明的PEG修饰门冬酰胺酶后的活性和市场上的同类产品培门冬酶，Oncaspar都有一定程度的降低，但Y-PALD-40K-ASP(Mono)及Y-PALD-40K-ASP(Di)，Y-PALD-30K-ASP(Mono)及Y-PALD-30K-ASP(Di)分别保留了原蛋白90.25％、90.5％、89.5％、85.8％的活性，而培门冬酶和Oncaspar的活性仅保留了原蛋白62.9％、53.5％的活性。
通过酶活测定结果可以看出，本发明实施例1中制备的门冬酰胺酶定点修饰产物，其活性显著高于市场上已有的产品培门冬酶和Oncaspar。市售的培门冬酶和Oncaspar是采用分子量5000Da的PEG通过随机修饰得到的产品，修饰后的门冬酰胺酶的活性只保留了原蛋白62.9％和53.5％的活性；而本发明采用分子量30kDa～40kDa的PEG丙醛对门冬酰胺酶进行N端定点修饰，修饰后的门冬酰胺酶的活性保留了原蛋白90％左右的生物活性。另外，按照PEG修饰的一般规律，使用同类型的PEG对蛋白进行修饰，PEG的分子量越大，修饰后蛋白的活性损失越大。但在本发明中制备的修饰产物却很意外的没有完全遵循这样的规律，不仅修饰物活性高于培门冬酶的活性，而且本发明中使用分子量为30KDa和40KDa的PEG修饰剂修饰后得到的修饰产物的活性基本都保留了原蛋白90％左右的活性，其中用40KDa的PEG修饰后得到的修饰产物的活性略大于用30KDa的PEG修饰后得到的修饰产物。另外，对于使用同一分子量的PEG修饰剂修饰后得到的修饰产物来说，和单修饰产物比较，二修饰产物中每个门冬酰胺酶的分子上多偶联了一个PEG分子，因此二修饰的分子量显著高于单修饰产物。从实施例1中的凝胶过滤分析的图谱上也可以看出这点。因此按照PEG修饰的一般规律，二修饰产物的活性应该显著低于单修饰产物。但本发明中制备的单修饰产物和二修饰产物的活性基本没有差别。我们进一步分析，这可能和门冬酰胺酶的结构特点有密切的关系，门冬酰胺酶是由4个亚基组成的多亚基蛋白，这4个亚基的氨基酸序列完全一致，活性中心处在由4个亚基包裹的空间区域中。我们制备的二修饰产物，PEG分子是分别偶联在2个不相邻亚基的N端，因此这两个PEG分子相对独立，相互之间不会有较大的空间位阻，因此使得单修饰产物和二修饰产物的活性差别不大。
另外，由于已有的文献或专利报道中，也有使用定点修饰技术对门冬酰胺酶进行N端定点修饰的例子。这些例子中使用的都是直链PEG，并且制备出的修饰产物是N端定点的单修饰产物，活性都只有原蛋白40％左右，远低于本发明中制备的修饰产物。由于都属于N端定点修饰，且都是直链、小分子量的PEG，因此修饰后的修饰产物其活性理论上应该更优于本发明，但结果出人意料的是本发明中制备出的修饰产物活性较高。因此可以看出，在用PEG对蛋白进行修饰，开发长效蛋白药物的过程中，虽然有一些普遍的规律可以遵循，但最为重要的是要结合所修饰的蛋白药物的结构特点，进行大量的优化筛选，这样才能筛选制备出最佳的修饰产物。这是一个具体情况具体分析的过程。
实施例8：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶对肿瘤细胞的抑制率评价
为了评价N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶对肿瘤细胞的抑制率，并和培门冬酶以及Oncaspar进行比较，我们选择了THP-1(来源于人的单核细胞白血病细胞系)、Raji(来源于人的淋巴瘤细胞系)、L1210(来源于小鼠的白血病细胞)这3种细胞进行评价。通过MTT法检测细胞的抑制率，考察了不同给药浓度的抑制率，并最终计算出IC50值，计算结果如下表4所示。
表4 不同N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶及培门冬酶对肿瘤细胞的IC50值
根据实验结果，PEG定点修饰后的门冬酰胺酶对上述3种肿瘤细胞的杀伤性普遍高于未修饰的门冬酰胺酶，并且它们的抗肿瘤活性明显高于培门冬酶和Oncaspar，对多种细胞株均表现出良好的抗肿瘤作用。由于本发明中制备的门冬酰胺酶的定点修饰产物，其比活都高于培门冬酶和Oncaspar，因此对肿瘤细胞的抑制作用更好。实施例9-19所用N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶均为Y-PALD-40K-ASP(Di)。
实施例9 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液处方及制备工艺：
制备方法：
配制磷酸盐缓冲液(处方量的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，加水1000ml，搅拌溶解，即得)适量。将聚乙二醇化门冬酰胺酶脱盐至磷酸盐缓冲液中，将处方量的山梨醇溶于磷酸盐缓冲盐中，加入脱盐后的聚乙二醇化门冬酰胺酶溶液，混匀，并用磷酸盐缓冲液稀释，药液经0.2um微孔滤器，无菌过滤，灌装。
实施例10 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液PH的筛选
我们将N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶脱盐至PH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液中，置高温(40℃±2℃)、光照(4500±500LX,25℃±2℃)条件下放置，分别与0、5、10天考察样品的酶活性。
表5 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液不同PH筛选数据(酶活性IU/ml)
从实验数据可以看出，样品在pH 5.0-7.0稳定性较好，优选pH为6.0。
实施例11 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液缓冲盐体系的筛选
根据PH筛选的结果，PH在6.0为最优，在此pH值共有两种缓冲盐体系，即醋酸盐和磷酸盐。将N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶脱盐至50mM醋酸盐、50mM磷酸盐缓冲液中，置高温(40℃±2℃)、光照(4500±500Lx,25℃±2℃)条件下放置，分别与0、5、10天考察样品的酶活性。
表6 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液缓冲体系的筛选(酶活性IU/ml)
从实验数据可以看出，样品磷酸盐缓冲液体系优于醋酸盐缓冲体系。因此，N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液优选磷酸盐缓冲体系。
实施例12 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液离子浓度的筛选
我们将N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶脱盐至50mM磷酸盐(渗透压112mOsm)、50mM磷酸盐+0.5％氯化钠(渗透压280mOsm)、50mM磷酸盐+1％氯化钠(渗透压400mOsm)缓冲液中，pH均调节为6.0，置高温(40℃±2℃)、光照(4500±500LX,25℃±2℃)条件下放置，分别与0、5、10天考察样品的酶活性。
表7 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液离子浓度筛选(酶活性IU/ml)
从实验数据可以看出，不同离子的样品，在高温、光照条件下样品稳定性一致。说明溶液中离子浓度对样品的稳定性无影响。
实施例13 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液冻融实验
我们将N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶脱盐至50mM磷酸盐+0.85％氯化钠、50mM磷酸盐+3％山梨醇、50mM磷酸盐+3％甘露醇缓冲液中，pH均调节为6.0，将样品置-40℃条件下冷冻24小时，取出置37℃条件下复融，取样，循环三次，检测样品的酶活性。
表8 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液冻融试验(酶活性IU/ml)
冻融次数 PB+0.85％氯化钠 PB+3％山梨醇 PB+3％甘露醇
冻融前 209(100％) 214(100％) 213(100％)
一次冻融 160(76.56％) 213(99.5％) 165(77.46％)
二次冻融 155(74.16％) 214(100％) 158(74.18％)
三次冻融 160(76.56％) 212(99.1％) 154(72.30％)
从实验数据可以看出，含有山梨醇的样品冻融后酶活性较稳定，明显优于不含山梨醇的样品。因此在处方中应优选山梨醇及类似作用的辅料。
实施例14 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液不同辅料的筛选
我们将N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶脱盐至50mM磷酸盐、50mM磷酸盐+3％山梨醇、50mM磷酸盐+3％甘露醇、50mM磷酸盐+3％海藻糖、50mM磷酸盐+0.1％精氨酸缓冲液中，pH均调节为6.0，将样品置高温(40℃±2℃)、光照(4500±500LX,25℃±2℃)条件下放置，分别与0、5、10天考察样品的酶活性。
表9 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液不同辅料筛选(酶活性,IU/ml)
根据不同辅料筛选的结果，含有山梨醇的处方酶活性稳定性优于其它辅料，因此，优选山梨醇作为处方组成。
实施例15 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液辅料浓度的筛选
我们将N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶脱盐至50mM磷酸盐+1％山梨醇、50mM磷酸盐+3％山梨醇、50mM磷酸盐+5％甘露醇缓冲液中，pH均调节为6.0，将样品置高温(40℃±2℃)、光照(4500±500LX,25℃±2℃)条件下放置，分别与0、5、10天考察样品的酶活性。
表10 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液辅料浓度筛选(酶活性,IU/ml)
根据上述浓度筛选的数据表明，山梨醇浓度在3％以上时对样品稳定性较优。
实施例16 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液处方验证
根据上述实验结果，我们按50mM磷酸盐+3％山梨醇的处方进行了三批样品的试制，pH均调节为6.0，并将样品置高温(40℃±2℃)、光照(4500±500LX,25℃±2℃)条件下放置，分别与0、5、10天考察样品的酶活性。
表11 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液处方验证(酶活性,IU/ml)
根据三批样品制备及稳定性考察的数据，表明制备的处方工艺质量稳定性一致。
实施例17 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液在体外对非霍奇淋巴瘤的增值抑制作用
我们在体外对N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的可行性进行了评估，采用CTG方法测试N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液和阳性化合物顺铂在10多个非霍奇金淋巴瘤细胞系中的细胞增殖50％抑制浓度(IC50)。收集处于指数生长期的细胞并用Vi-Cell XR细胞计数仪进行活细胞计数。每孔加90μl细胞悬液于96-孔细胞培养板，最终细胞浓度为5000细胞/孔(具体细胞密度根据各细胞生长情况调整)。每株细胞每孔分别加入10μl相应的10倍药物溶液，每个药物浓度各3个复孔，置于37℃，5％CO2孵箱中培养72小时。药物处理72小时后，按照CTG操作说明，每孔加入50μl(1/2培养体积)预先融化并平衡到室温的CTG溶液，用微孔板震荡器混匀2分钟，于室温放置10分钟后用Envision2104读板仪测定萤光信号值，并最终计算出IC50，具体结果如表19所示。
由体外实验IC50可以看出，不同类型的非霍奇金淋巴瘤细胞株对N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液都表现出了不同程度的被抑制效果，尤其以弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)这一类型的非霍奇淋巴瘤最为敏感，在N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液的作用下表现出了明显的增值抑制效应。
表12 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液对非霍奇金淋巴瘤体外的细胞毒实验
实施例18 N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液在体内对非霍奇金淋巴瘤的增值抑制作用
在体外实验结果的基础上，我们进一步在动物整体水平上研究了N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液对非霍奇金淋巴瘤的抑制作用并与阳性药美罗华作了比较。将NOD/SCID小鼠分组后共4组，每组8只。所有实验小鼠均饲养在屏障系统中，并且提前适应环境至少7天。每只鼠于右侧背部皮下接种1×107Ri-1细胞，细胞重悬在PBS中(0.1ml/只)，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均150～200mm3时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长。整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。具体结果如图9所示。
实验结果表明较低剂量的N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射液(0.9mg/kg)在动物整体水平上对非霍奇金淋巴瘤细胞株Ri-1的抑制率达到近60％，并且优于阳性药美罗华的治疗效果(抑制率：42％)。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> PEG定点修饰的门冬酰胺酶注射剂
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 348
<212> PRT
<213> 埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli， EC 3.5.1.1）
<400> 1
Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly
20 25 30
Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr
35 40 45
Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu
50 55 60
Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser
65 70 75 80
Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn
85 90 95
Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp
100 105 110
Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp
115 120 125
Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser
130 135 140
Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp
145 150 155 160
Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val
165 170 175
Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr
180 185 190
Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys
195 200 205
Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro
210 215 220
Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala
245 250 255
Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr
260 265 270
Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala
275 280 285
Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala
290 295 300
Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn
305 310 315 320
Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys
325 330 335
Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
340 345

Claims (9)

1.N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射剂，由N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶、药用辅料和水组成，所述N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶为聚乙二醇在L-门冬酰胺酶的2个亚基的N端伯氨基上偶联，所述聚乙二醇分子量为30kDa～40kDa，聚乙二醇为分支型、活化基团为醛基。
2.权利要求1所述的注射剂，其特征在于所述N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶的结构通式如下所示：
其中R为H或C1-C4的烷基；n为100到500的整数值，p为1-4的整数；AA为N端的L-氨基酸残基，m为0-5的整数,s为1或者2。
3.权利要求2所述的注射剂，其特征在于所述烷基为甲基，n为320-455之间的整数值，p为2，m为0。所述聚乙二醇优选分子量40KDa。
4.权利要求1所述的注射剂，其特征在于所述注射剂中N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶含量为0.5-50mg/ml。
5.权利要求1所述的注射剂，其特征在于所述药用辅料包括蛋白稳定剂，优选为山梨醇。
6.权利要求1所述的注射剂，其特征在于所述蛋白稳定剂的含量为10-50mg/ml。
7.权利要求1所述的注射剂，其特征在于N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶注射剂pH为5-7，优选pH为6。
8.权利要求1所述的注射剂，其特征在于所述药用辅料还包括缓冲盐，缓冲盐选自磷酸缓冲盐或醋酸缓冲盐，优选磷酸缓冲盐，缓冲盐浓度为10mM-500mM。
9.权利要求1所述的注射剂，其特征在于注射剂配比如下：N端定点修饰的聚乙二醇化门冬酰胺酶0.5g、磷酸二氢钠5.26g、磷酸氢二钠0.87g、山梨醇30g、水1000g。
CN201610461047.7A 2016-06-22 2016-06-22 Peg定点修饰的门冬酰胺酶注射剂 Active CN107693796B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610461047.7A CN107693796B (zh) 2016-06-22 2016-06-22 Peg定点修饰的门冬酰胺酶注射剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610461047.7A CN107693796B (zh) 2016-06-22 2016-06-22 Peg定点修饰的门冬酰胺酶注射剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107693796A true CN107693796A (zh) 2018-02-16
CN107693796B CN107693796B (zh) 2020-12-22

Family

ID=61168201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610461047.7A Active CN107693796B (zh) 2016-06-22 2016-06-22 Peg定点修饰的门冬酰胺酶注射剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107693796B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101586099A (zh) * 2008-05-21 2009-11-25 北京双鹭药业股份有限公司 一种聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶及其修饰方法
CN102138909A (zh) * 2010-12-30 2011-08-03 常州千红生化制药股份有限公司 门冬酰胺酶冻干粉针剂及其制备方法以及门冬酰胺酶溶解液
CN104046600A (zh) * 2013-12-30 2014-09-17 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用
CN105802948A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101586099A (zh) * 2008-05-21 2009-11-25 北京双鹭药业股份有限公司 一种聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶及其修饰方法
CN102138909A (zh) * 2010-12-30 2011-08-03 常州千红生化制药股份有限公司 门冬酰胺酶冻干粉针剂及其制备方法以及门冬酰胺酶溶解液
CN104046600A (zh) * 2013-12-30 2014-09-17 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用
CN105802948A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
庞梦婷等: "聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的研究进展", 《药物生物技术》 *
迟少萍等: "聚乙二醇醛(mPEG-ALD20000 )对L-门冬酰胺酶化学修饰的初步研究", 《药物生物技术》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107693796B (zh) 2020-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101588819B (zh) 具有可释放的键合的ix因子部分-聚合物轭合物
EP2459226B1 (en) Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
CN102573917B (zh) 聚乙二醇化的l-天冬酰胺酶
CN104046600B (zh) 多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用
US11103565B2 (en) Site-specific polyethylene glycolylated (pegylated) asparaginase, preparation method therefor and use thereof
JP6961061B2 (ja) 癌治療のためのａｄｉ−ｐｅｇ２０抗体に対する交差反応性が低減したアルギニンデイミナーゼ
CN103140499B (zh) 一种粒细胞集落刺激因子与聚乙二醇的共轭物
CN101193658A (zh) 聚乙二醇化g-csf多肽及其产生方法
CN101627056B (zh) Y型聚乙二醇修饰的g-csf及其制备方法和应用
KR100822006B1 (ko) 경구적으로 투여가능한 약제의 전파체로서 작용하는단백질 복합체
KR20210069126A (ko) 암치료를 위한 ａｄｉ-ｐｅｇ 20 항체에 대해 감소된 교차반응성을 지니는 아르기닌 탈이민효소
CN112933219A (zh) 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途
EP3315508A1 (en) Polypeptide compound and preparation method and use thereof
EP3323825A1 (en) Polypeptide compound and preparation method and use thereof
CN101585864B (zh) 柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物
CN107693796A (zh) Peg定点修饰的门冬酰胺酶注射剂
CN101591649B (zh) 甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用
CN105796507B (zh) 含聚乙二醇化门冬酰胺酶的药物组合物及其制备方法
CN108265044A (zh) 聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法与应用
CN101880326B (zh) 干扰素‑β复合物
CN100355784C (zh) 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法
CN106749608B (zh) 干扰素α缀合物
CN109535247A (zh) 聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白及其制备方法与制药应用
CN107226858A (zh) 干扰素高分子结合体ifn-pmpc的制备及其应用
CN107753953A (zh) 聚乙二醇化激肽原酶的制剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200106

Address after: 213125 No. 518 Yunhe Road, Xinbei District, Changzhou City, Jiangsu Province

Applicant after: ZonHon Biopharma Institute Inc.

Applicant after: Changzhou Qianhong Biopharma Co., Ltd.

Address before: 213125 No. 518 Yunhe Road, Xinbei District, Changzhou City, Jiangsu Province

Applicant before: ZonHon Biopharma Institute Inc.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant