KR100822006B1 - 경구적으로 투여가능한 약제의 전파체로서 작용하는단백질 복합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 또는 그 이상의 복합체 단백질들 또는 클로스트리듐 보툴리늄의 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형의 유도체들을 포함하는 단백질 복합체와 선별된 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품에 관계된다.
Description
본 발명은 복합적인 단백질 또는 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) A, B, C1, C2, D, E, F 또는 G형으로부터의 유도체들을 구성하는 단백질 복합체와 선별된 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품에 관계된다.
생명공학적 과정에 의해 야기된 성공으로 인해 많은 매우 효과적인 의약약품들이 개발되었고, 그 약품들은 예를들면 효과적인 성분으로서 단백질을 포함할 수 있다. 재조합 인슐린과는 별문제로, 성장인자, 인터류킨, 모노클로널 항체와 같은 고분자량의 단백질들이 그에 속한다. 예를들면 에리쓰로포에틴(EPO) 같은 이들 의약약품들의 일부는 가장 큰 전환을 가지는 약품이다. 단백질성 의약약품의 수는 결코 가벼이 볼 것이 아니라 역시 인간게놈의 완전한 서열분석으로부터 유도될 수 있는 지식에 의해 미래에는 실로 증가할 것이다. 이들 새로운 의약약품들 모두는 저분자량의 편리한 의약약품에 비하여 경구적으로 재흡수되지 않는다는 중대한 결점을 보인다. 언급된 결점들은 예를들어 파상풍 독소 같은 활성 면역에 대한 백신에 응용될 수 있다.
많은 저분자량의 약품들은 경구적으로 투여될 수 있다. 그 물질들은 장의 점막을 가로지르고, 혈액순환으로 들어가서 조직적으로 이용가능하고 혈액순환계를 경유하여 그들의 효과를 미치는 부위에 도달한다. 이 경로는 단백질성 의약약품, 산, 불안정한 약품, 바람직하지 않은 전하를 보이는 약품에 대해서는 이용할 수 없다. 많은 메커니즘들이 단백질들의 재흡수를 막는다. 처음 위에서, 많은 단백질들이 낮은 pH로 인해 변성되고, 그들의 생물학적 활성을 잃는다. 게다가 단백질들은 많은 췌장의 프로티에이즈(inter alia, 트립신, 키모트립신, 펩신)에 의해 그들의 아미노산 잔기들로 분해되어 재흡수될 수 있다. 단백질이 프로테올리틱 공격에서 살아남고 소장에 안전하게 도달하더라도, 장의 벽은 항원체의 과다범람을 피하기 위해 고분자량의 물질에 대해 비투과성이므로 쉽게 재흡수될 수 없다. 또한 많은 의약약품들이 각각 바람직하지 못한 전하와 소수성 때문에 재흡수되지 못하고 존재한다.
경구적으로 투여된 단백질성 의약약품 또는 백신 및 저분자의 특별한 의약약품이 어떤 영향도 미치지 못하는 것은 이러한 이유 때문이다. 그들은 주사되어, 코에 투입시에 효과가 나나타는 부위에 도달한다.
상기 언급한 장애를 극복하기 위해 많은 발전들이 상기 목적을 다룬다. 단백질과 저분자량의 특이적인 의약약품을 위장 계통에서의 비활성화와 분해로부터 보호하기 위해 그들을 소장에서 용해되는 위-저항성 캡슐내로 캡슐화시킬수 있고 활성인 단백질 또는 저분자량의 의약약품을 해리할 수 있다. 이 방법은 단백질 과 저분자량의 의약약품이 분해되지 않을것이라는 결점을 가진다. 그러나 이들 구성물질은 여전히 장의 벽을 침투할 수 없을 것이다. 비타민 B의 캐리어시스템과 같이 장의 점막을 가로지르는 물질들의 능동수송을 돕는 캐리어시스템으로부터의 이익을 얻기 위해 추가의 개발들이 시도된다. 하나만으로 이러한 방법들은 성공적이지 못하고 부가적으로 단백질들과 저분자량의 불안정한 의약약품들이 초기에 보호될 것을 필요로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 대상에 원하는 폴리펩티드와 저분자량의 의약약품을 경구적으로 투여하는데 적합한 방법을 제공하는 것이다.
이 목적은 첨부된 청구항들에서 규정된 내용에 의해 해결된다.
여기에서 사용된 "단백질 복합체"라는 용어는 전파체(vehicle)를 규정하고, 그에 의해 더욱 선별된 폴리펩티드들은 인간 혈액계로 수송되고 동물의 혈액계로 수송될 수 있는 저분자량의 의약약품이다.
단백질 복합체는 적어도 하나의 헤마글루티닌(hemagglutinin)과 적어도 클로스트리듐 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형의 하나의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)의 보톨리늄 독소 복합체들로 임의로 구성된다.
여기서 사용된 "보톨리늄 독소 복합체" 라는 용어는 보톨리늄 독소, 헤마글루티닌과 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)을 포함하는 클로스트리듐 보툴리늄의 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G 형의 자연적으로 발생하는 단백질 복합체를 의미한다.
여기서 사용된 "폴리펩티드" 또는 "선별된 폴리펩티드" 라는 용어는 적어도 2개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 의미한다. 상기 폴리펩티드는 선형, 환형, 또는 가지형일 수 있다. 또 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 체인으로 이루어질 수 있고, 그 체인은 예를들면 디설파이드 결합을 통해 서로 연결될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 수식된 아미노산 잔기들과 글리코실레이션 같은 일반적인 번역후 수식을 포함한다. 폴리펩티드는 제약적으로나 면역적으로 활성인 폴리펩티드이거나 항체나 리간드 같은 진단의 목적을 위해 이용되는 폴리펩티드일 수 있다.
클로스트리듐 보툴리늄 균주의 박테리아는 진화동안에 본래의 단백질인 클로스트리듐 보툴리늄 독소를 위장 계통을 통한 포유동물의 혈액순환내에 도입하는 경로를 발견하였다.
클로스트리듐 보툴리늄은 그들의 독소에 따라 다른 8가지 혈청형들(serotypes) A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G로 분류된다. 여기서 빈번히 보툴리늄 독소로 칭하는 단백질들은 약 150kDa의 분자량을 가지는 단백질이다. 보툴리늄 독소는 대개 오염된 음식과 함께 얻어지고 내부적으로 흡수되어 그 영향을 미치는 부위, 즉 모터 엔드플레이트(motor endplate)에 도달하고 그곳에서 신경충격이 근육으로 전달된다. 독소는 신경세포에 의해 흡수되고 신경말단에서의 아세틸콜린 분비기작을 마비시켜서 근육관련은 더이상 활성화되지 않고 이완한다.
그러나 보툴리늄 독소는 클로스트리듐 보툴리늄으로부터 노출된 형태로 분비되지 않고 복합체의 형태로 생산된다. 즉, 클로스트리듐의 세포는 보톨리늄 독 소만이 아니라 독소와 함께 약 700 에서 900kDa 분자량을 가지는 보툴리늄 독소 복합체를 형성하는 다양한 다른 단백질을 생산한다. 다양한 연구에서 보툴리늄 독소 복합체의 형성이 보툴리늄 독소의 경구적 독성에 필요하다는 것이 증명될 수 있었다. 보툴리늄 독소 복합체에 존재하는 보툴리늄 독소는 순수한 보툴리늄 독소보다 100,000배 더 높은 독성을 보인다는 것이 증명될 수 있었다. 헤마글루티닌들은 장의 벽에 대해 복합체에 접착하도록 결정되어 있고, 따라서 장의 점막을 통과하여 혈액순환으로의 수송을 가능하게 한다고 생각된다. 또한 상기 복합체는 위 계통에서 프로티에이즈에 대하여 상기 독소를 보호하도록 작용하는 것으로 보고되었다.
다른 단백질들은(복합적인 단백질)은 많은 헤마글루티닌 및 약 120kDa 분자량을 보이는 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)이다. A형의 보툴리늄 독소 복합체에 대해 다음의 약 16.9kDa의 Ha2, 약 21kDa의 Ha3a, 약 52kDa의 Ha3b, 및 약 35kDa의 Ha1 헤마글루티닌들이 기술되었다.
B에서 G형까지 다른 독소의 복합체들이 다음의 유사한 구조로 구성되었다. 예로써 B형 복합체는, NTHT에다 약 70kDa의 분자량을 가진 Ha-70, 약 17kDa의 분자량을 가진 Ha-17 및 약 33kDa의 분자량을 가진 Ha-33을 포함한다.(cf.Bhandari,M. et al., Current Microbiology 35, 207-214(1997))
또한 East,A.K et al., System Appl.Microbiol.17,306-313(1994)는 A형과 C형의 서열과 비교로서 B형의 Ha-33의 서열을 서술한다. C형과 D형에 대해, 약 53kDa의 분자량을 가진 Ha-3b와 약 22에서 24kDa의 분자량을 가진 Ha3a 및 약 17kDa의 분자량을 가진 Ha2가(ch.Inoue,K.et al.,Microbiology 145,2533-2542(1999)) 약 33kDa의 분자량을 가진, 즉 A형과 유사체인 Ha-33(=Ha1)에 더하여 서술되어 있다.
형성된 복합체들은 그들의 혈청형에 따라서 다른 조성을 나타낸다. 즉, 다른 수의 헤마글루티닌과 NTHT 각각이 복합체내로 통합된다. A형 복합체에 대하여 다음의 조성이 예를들면, Inoue et al.,Infection and Immunity 64(5), 1589-1594(1996)에 의해 계산되었다:
| 단백질 | 몰비 |
| 독소 | 1 |
| Ha-35(=Ha1) | 7.76 |
| Ha-15(=Ha2) | 2.71 |
| Ha-19(=Ha3a) | 3.4 |
| Ha-52(=Ha3b) | 2.24 |
| NTHT | 1.41 |
본 발명의 한 관점은 복합적인 단백질들 또는 적어도 하나의 클로스트리듐 A, B, C1, C2, D, E, F형의 유도체를 포함하는 단백질 복합체(헤마글루티닌과 선택적으로 클로스트리듐 A, B, C1, C2, D, E, F형들의 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT))의 준비이다. 상기 단백질 복합체는 경구적으로 투여된 때에 상기 발명에 따른 단백질 복합체에 의해 위를 통과하는데 있어서 프로티에이즈나 산에 의한 분해로부터 보호되고 복합적인 단백질에 의해 각각 조직적으로 이용가능하게 되는 선별된 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 추가로 포함한다. 선별된 폴리펩티드는 제약적으로 활성이고, 면역학적으로 활성인 의약약품 또는 진단 목적으로 이용된 폴리펩티드일 것이다. 저분자량의 선별된 의약약품은 마찬가지로 제약적으로 활성이고 면역학적으로 활성인 의약약품 또는 진단목적 또는 다른 치료에 이용된 의약약품일 것이다. 본 발명의 단백질 복합체는 따라서 폴리펩티드와 저분자량의 의약약품을 동물, 바람직하게는 포유동물이나 조류, 또는 바람직하게는 인간의 혈액계내로 도입하여 그들의 효과를 미치는 부위로 수송하는 수송전파체로서 유용하다. 본 발명의 또다른 관점은 인간 및/또는 수의학을 위한 치료약제, 백신 또는 진단약제로서 단백질 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 관점은 제약적으로 활성인 폴리펩티드나 저분자량의 물질들(의약약품), 면역학적으로 활성인 폴리펩티드나 저분자량의 물질들(의약약품) 또는 진단목적의 폴리펩티드나 저분자량인 물질들(의약약품 또는 진단약품)을 위한 수송 전파체로서 클로스트리듐 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 복합적인 단백질(헤마글루티닌과 선택적으로 NTHT)을 포함하는 단백질 복합체의 이용이다.
상기 단백질 복합체는 헤마글루티닌과 NTHT로 구성되고 자연적으로 발생하는 클로스트리듐 보툴리늄의 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형 복합체들과 등가일 것이다. 상기 단백질 복합체는 그러나 그 자연적인 조성과 다른 조성을 나타낼 것이다. 예를들면 NTHT 단백질 없이 헤마글루티닌으로만 이루어질 수 있다. 나아가 상기 단백질 복합체는 자연적으로 발생하는 복합체보다 적은 헤마토글루티닌형으로, 바람직하게는 3가지의 다른형의 헤마토글루티닌, 바람직하게는 2가지 및 더욱 바람직하게는 오직 한가지형의 헤마토글루티닌으로 이루어질 수 있고, 상기 단백질 복합체는 NTHT 단백질을 포함하거나 또는 이 단백질을 포함하지 않을 수 있다. 상기 단백질 복합체는 추가로 하나 또는 그 이상 형의 헤마토글루티닌 및/ 또는 다른 혈청형의 NTHT단백질들로 이루어질 수 있다.
바람직한 것은 클로스트리듐 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형으로부터 자연적으로 발생하는 단백질 복합체들에 상당하는 단백질 복합체들, 예를들면 클로스트리듐 보툴리늄 B형의 Ha1, Ha2, Ha3a, Ha3b 및 NTNH의 복합체이다. 단백질 복합체는 부가적으로 Ha1, Ha2, Ha3a, Ha3b 및 NTNH, Ha1, Ha2, Ha3b 및 NTNH, Ha1, Ha3a, NTNH, Ha1, Ha3b 및 NTNH, Ha2, Ha3a 및 NTNH, Ha2, Ha3b 및 NTNH, Ha3a, Ha3b 및 NTNH, 또는 열거된 복합적인 단백질의 추가의 임의적 조합들로 구성될 수 있다. 단백질 복합체는 추가로 헤마토글루티닌들의 하나와 NTNH로 구성될 수 있다. 또한 단백질 복합체는 NTNH없이 상기에 주어진 헤마토글루티닌들의 조합으로 구성될 수 있다. B형의 예시적인 단백질 복합체들에 따르면 추가로 언급된 단백질 복합체들은 A, C1, C2, D, E, F, 또는 G형의 헤마토글루티닌 및/또는 NTNH로 이루어지는 것들이다.
더욱 바람직한 것은 본 발명에 따른 단백질 복합체이고, 복합적인 단백질들이 화학결합을 통해 선별된 폴리펩티드나 저분자량의 의약약품들에 결합된다. 이 결합은 혈액내에서 흡수후 끊어질 수 있고, 폴리펩티드나 저분자량의 약제는 그 효과를 발휘할 부위에 도달할 수 있다. 선별된 폴리펩티드나 저분자량의 의약약품은 교차결합 시약을 통해 복합적인 단백질들에 결합할 수 있다. 바람직한 교차결합 시약들은 예를들면, N-(4-아지도페닐티오 프탈리미드((azidophenylthio)phthalimide), 4,4'-디티오비스-페닐아지도(dithiobis-phenylazido), 디티오비스프로피오니미데이트(dithiobispropionimidate), 3,3'-디티오비스(dithiobis)(설포숙시니미드-프로피오네이트(sulphosuccinimide-propionate)), 에틸-4-아지도페닐-1,4-디티오프로피네이트(ethyl-4-azidophenyl-1,4-dithiopropinate),N-설포숙시니딜-(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(N-sulphosuccinidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionate), 설포숙시니딜-2-(p-아지도살리실라민)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sulphosuccinidyl-2-(p-azidosalicylamine)-ethyl-1,3'-dithiopropionate), N-숙시니미드-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinimide-3-(2-pyridyldithio)propionate) 또는 비스-(2-(숙시니미딜옥시카보닐옥시)-에틸)설폰(bis-(2-(succinimidyloxycarbonyloxy)-ethyl)sulphone)이다. 바람직한 것은 화학결합을 통해 선별된 폴리펩티드나 저분자량의 의약약품에 연결된 단일의 복합적인 단백질이다.
본 발명의 또다른 관점은 상기 발명의 단백질 복합체를 준비하는 방법을 제공하는 것이다. 그 방법은 다음의 단계들을 포함한다.
a) pH 2.0내지 6.5에서 클로스트리듐 보툴리늄으로부터 적어도 하나의 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형의 보툴리늄 독소 복합체의 분리
b) pH 7.0 에서 10.0까지 증가
c) 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들을 얻기 위한 크로마토그래피법에 의해 헤마글루티닌들과 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)로부터 보툴리늄 독소의 분리단계,
d) c)단계에서 얻어진 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 혼합하는 단계 또는,
d') c)단계에서 얻어진 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들의 분리단계 및, 상기 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들 중 하나 이상과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 혼합하는 단계,
d') c)단계에서 얻어진 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들의 분리단계 및, 상기 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들 중 하나 이상과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 혼합하는 단계,
e) 단계 d) 또는 d') 로부터 혼합물을 2.0에서 6.5의 pH에서 버퍼에 대하여 투석하고 임의적으로
f) 단계 d) 또는 d')의 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 화학결합을 통하여 결합(coupling)하는 단계를 포함한다.
바람직한 것은 단계 d) 또는 d') 에서 혼합된 적어도 2개의 복합적인 단백질이(보툴리늄-독소-유리(free)단백질) 단일의 또는 다른 보툴리늄 독소 복합체형들로부터 유도된 방법이다.
복합적인 단백질은 자연의 보툴리늄 독소 복합체들로부터 분리될 수 있다. 그들의 분리를 위한 예시적인 방법은 다음과 같다. 클로스트리듐 세포의 보툴리늄 독소 복합체는 산성의 pH, 바람직하게는 2.0에서 6.5의 pH, 더욱 바람직하게는 4.0에서 6.5의 pH, 더더욱 바람직하게는 pH 6.0에서 분리된다. 7.0에서 10.0까지, 바람직하게는 7.0에서 8.0까지 pH의 증가후 보툴리늄 독소는 크로마토그래피 절차에 의해 분리될 것이다. 이 절차는 상기 복합체는 pH 6.5 미만에서 안정하고 중성 및 알칼리 pH에서 분해하고 독소를 해리한다. 경구적으로 투여될 다른 폴리펩티드는 그 후에 독소가 없는 복합적인 단백질에 더해질 수 있다. pH는 단백질 화학에서 통상적인 버퍼에 대한 투석, 특히 2.0에서 6.5 pH에서, 바람직하게는 4.0에서 6.0, 더욱 바람직하게는 pH 5.5에서 포스페이트, 아세테이트 또는 시트레이트 버퍼에 대한 투석에 의해 감소될 수 있다. 이들 단계동안, 상기 폴리펩티드 결합(bound)의 경구의 생물학적 이용효능을 보장하는 새로운 복합체가 형성된다.
추가의 크로마토그래피 절차들, 단백질 화학에서 일반적인 농축하는 절차 및 침전들이 또한 복합적인 단백질들을 분리하는 데 이용될 수 있다.
복합적인 단백질들(헤마글루티닌과 클로스트리디움 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT))은 DNA서열이 알려진 특정한 호스트 생물에서 DNA재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 이렇게 생산된 복합적인 단백질들은 추가적인 수식을 나타낼 수 있고, 즉, 수식들은 복합적인 단백질의 유도체가 될 수 있다. 수식은 결실, 부가, 삽입, 또는 치환만을 의미하는 것이 아니라 예를들면 메틸화, 아세틸등 아미노산의 화학적 수식뿐 아니라 글리코실레이션 또는 인산화등 번역후q변형(posttranslational modifications)도 포함한다. 다른 호스트들에서 원하는 단백질의 발현은 통상의 지식을 가진자의 기술수준에 속하고 더이상의 설명을 요하지 않는다. 단백질 복합체의 형성에 필요한 복합적인 단백질은 호스트 생물에서 따로 또는 동시에 발현될 수 있다. 바람직한 것은 예를들면 E.coli, 바실러스 서브틸리스 및/또는 Clostridium difficile등 박테리아내, 또는 예를들면 바큘로바이러스 시스템에 의해 CHO세포, 곤충세포등 진핵세포내, 또는 이스트세포내에서의 재조합 복합적인 단백질의 생산이다. 복합적인 단백질은 상기의 절차에 따라서 분리되어 선별된 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품에 가해질 수 있다. 또한 선별된 폴리펩티드는 호스트 생물에서 복합적인 단백질과 동시에 발현될 수 있다. 특히 바람직한 것은 이스트에서 YAC를 통하여 선별된 폴리펩티드와 함께 각 복합적인 단백질의 동시의 또는 분리된 생산이다.
본 발명에 따른 단백질 복합체는 추가로 재조합적으로 생산된 복합적인 단백질들과 자연의 보툴리늄 독소 복합체로부터 분리된 복합적인 단백질의 혼합물로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 복합체에 의해 경구적으로 투여될 수 있는 제약적으로나 면역학적으로 활성인 폴리펩티드들은 전에는 비경구적으로 투여되어야했던 치료적으로나 예방적으로 효과적인 폴리펩티드들일 수 있다. 상기 폴리펩티드들은 예를들면 호르몬, 사이토카인, 효소, 성장인자, 항원, 항체, 저해제, 리셉터 길항물질(receptor agonist), 또는 길항물질(antagonist), 또는 혈액응고인자일 수 있다. 상기 폴리펩티드들이 재조합적으로 준비되었는지 또는 그들의 자연의 원료로부터 분리되었는지는 문제되지 않는다. 바람직한 폴리펩티드들은 인슐린, 에리쓰로포에틴(erythropoetin), 인터페론, 인터류킨, HIV프로티에이즈 저해제, GM-CSF(그래뉼로사이트/매크로파지 자극인자), NGF(신경 성장인자), PDGF(혈소판유래 성장인자), FGF(섬유아세포 성장인자), 플라스미노겐-활성화인자, 예를들면 t-PA(조직 플라스미노겐 활성화인자), 레닌 저해제, 인간성장인자, IGF(인슐린유사 성장인자), 파상풍 백신과 같은 백신, 헤파티티스 B 백신, 디프테리아 백신, 헤르셉틴(Her2에 대한 항체) 같은 항체, TNF(종양궤사요소)에 대한 항체, 칼시토닌, 우로키네이즈, 스트렙토키네이즈, 혈관형성의 저해제, 인자 Ⅷ, 인자 Xa길항물질, 메탈로프로티에이즈 저해제이다.
진단적 목적에 이용된 폴리펩티드들은 예를들면, 항체 또는 리간드가 될 수 있고, 그중에 폴리펩티드들은 표지를 나타낼 수 있다. 그 표지는 인간이나 동물의 신체에서 탐지할 수 있는 어느 표지이면 된다. 바람직한 표지들은 동위원소, 예를들면 13C 또는 방사성 표지들이다. 표지된 항체들은 종양을 탐지하는데 이용될 수 있고, 표지된 리간드들은 예를들면 병리상의 레셉터을 탐지하는데 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 파상풍 독소와 단백질 복합체의 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(12%)의 결과를 도식적으로 서술한다.
아래의 실시예들은 상기 발명을 보다 상세하게 설명하는 것이나 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
예 1 : C.botulinium B형으로부터 복합적인 단백질들의 준비
C.botulinium B형이 공개된 방법(cf.Evans et al., Eur.J.Biochem. 154, 409-416(1986))에 따라 20-L-발효조에서 발효되었다. 발효배지는 2% 프로테오즈 펩톤 no.2(DIFCO), 1% 이스트추출물, 1% 글루코오스 및 0.05% 티오글리콜레이트 나트륨을 포함한다. 33℃에서 72시간동안 성장후 상기 독소 복합체는 3N H2SO4 첨가에 의해 침전되었다. 상기 침전은 250ml 0.2M 나트륨 포스페이트 pH 6.0으로 2번 추출되었다. 핵산들은 125ml 2% 프로타민 설페이트의 첨가에 의해 상기 혼합된 추출액들로부터 침전되었다.
계속해서, 독소 복합체는 233g 암모늄 설페이트에 의해 침전되었다(2 - 8℃에서 14시간). 침전은 125 ml 50 mM Tris/HCl, 1mM EDTA에서 용해되었고, 이 버퍼에 대해 2 - 8℃로 밤새 도록(2×2l) 투석되었다. 용해되지 않은 입자들은 원심분리(15분, 15,000 rpm)를 통해 분리되었다. 이렇게 얻어진 429 mg 단백질은 세파로오즈 Q 컬럼(2.6×25 cm)을 통해 크로마토그래피 되었다. 결합된 단백질은 NaCl 구배(0 - 500 mM)로 용출되었다. B형의 프리 신경독소가 약 100 mM NaCl에서 용출되었고, 복합체는 약 250 mM NaCl에서 해리되었다. 크로마토그래피는 151 mg 단백질의 수득을 가져왔다.
예 2 : 복합적인 단백질들로부터 보툴리늄 독소 B형 오염물질의 분리
보툴리늄 독소로 오염된 33 mg의 상기 복합적인 단백질들은(세파로오즈 Q 크로마토그래피 후의 모여진 조각들) 50 mM Tris/HCl pH 7.9, 2mM EDTA(2×1 l) 밤새 도록 투석되었다. 단백질 용액은 Q Hyper-D 컬럼(2.6×8cm)을 통과하여 크로마토그래피되었고, 결합된 단백질은 NaCl 구배(0 - 400 mM)로 용출되었다. 뉴로톡신은 약 100 mM의 NaCl농도에서 해리되었고, 복합적인 단백질들이 약 190 mM NaCl에서 나타났다. SDS-PAGE에서 신경독소 부위는 분석된 단백질들의 1% 미만이었다.
예 3 : 단백질 복합체(apo complex)의 분리를 위한 친화성 크로마토그래피에 의한 신경독소(neurotoxin) 흔적들의 분리.
신경독소의 흔적으로부터 복합적인 단백질들을 정제하기 위해 친화성 크로마토그래피가 실행되었다. 토끼는 독성이 제거된 동질의 신경독소로 면역되었다. 얻어진 항혈청은 암모늄 설페이트 침전에 의해 정제되었다. 신경독소 특이적 항체들은 친화성 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있었다. 이 목적을 위해 3 mg 의 순수한 신경독소가 6.0 g 재수화된 CnBr-세파로오즈(제조자의 처방에 따른) 상에 고정되었다. 신경독소 B형에 특이적인 항혈청(암모늄 설페이트 침전에 따른)이 20 mM 소디움 포스페이트 pH 7.0, 0.5M NaCl에 대한 투석 후 합성된 기질로 채워진 컬럼(0.5×3 cm)을 통하여 크로마토그래피 되었다.
독소 특이적 항체들이 0.1M 글리신 pH 2.7과의 희석에 의해 얻어졌다(수득:1.57 mg). 1.25 mg의 정제된 신경독소 항체들이 1g CNBr-세파로오즈 상에 고정되었다. 계속하여, 11.6 mg의 복합체(Q Hyper-D 크로마토그래피에 따른)는 50 mM Tris/HCl pH 7.9, 2 mM EDTA pH 7.9에서 이 항체 친화성 컬럼을 거쳐 크로마토그래피 되었다. 용액은 컬럼을 통해 밤새도록 16시간 동안, 40 ml/h 의 유속으로 반복하여 순환되었다. 결합된 신경독소 포함 복합체는 0.1M 글리신 pH 2.7로 해리될 수 있었다. 친화성 정제된 복합체(9.8 mg)에서 신경독소는 생물학적 검출 에세이(프레닉 테스트/에세이 : Goeschel et al., Experimental Neurology 147, 96-102(1987))로 더이상 검출될 수 없었다.
예 4 : 본 발명에 따른 파상풍 독소와의 단백질 복합체 형성.
(A) 200㎍ 순수 파상풍 독소가 1㎖ 50mM Tris/HCl-버퍼, pH 8.0 에 있는 1㎎의 정제된 복힙적인 단백질에 첨가되었다. 계속해서 50mM 시트레이트/포스페이트 버퍼 pH 6.0에 대해 밤새 도록 투석되었다. aliquot(25㎕)가 50mM 나트륨 시트레이트 버퍼에서 겔 여과 컬럼(Bioselect SEC 250-5) 상에 분석되었다. 분자량 약 500 kDa에 해당하는 단일 피크가 나타났다. 피크 분획이 SDS-PAGE 되었다. 복합적인 단백질들과 파상풍 독소의 밴드들 모두가 검출되었다. 따라서, 이종의 독소와의 새로운 단백질 복합체가 형성되었다.
(B) 3㎖ Tris/HCl, pH7.9, 2mM EDTA에 있는 6㎎ 파상풍 독소와 6㎎ 아포 복합체(예 3 참조)가 50mM 소디움 포스페이트, 250mM NaCl, 2mM EDTA, pH7.0 에 대해 2-8℃에서 2일동안 투석되었고, 계속해서 pH6.0 인 동일한 버퍼에 대해 5일동안 투석되었다. 그후, 346㎕ 4M 암모늄 설페이트(→ 0.75M)가 이 용액 1.5㎖에 첨가되어 상기 복합체를 침전시킨다. 덩어리(pellet)가 50mM 소디움 포스페이트, 150mM NaCl, 2mM EDTA, pH5.9에서 용해되었고 그 앨리컷(aliquot)이 겔 여과를 통해 분석되었다. 이러한 목적으로 Biosep SEC 3000 7.8×300mM(페노메넥스)가 사용되었다(유속 0.5㎖/min). 단백질의 90% 초과가 고분자량 피크(Mr＞500000)에서 용출되었다. 12% SDS-PAGE 에서 상기 피크 프랙션(peak fraction)의 분석은 단백질 복합체가 파상풍 독소를 포함한다는 것을 증명하였다. 파상풍 독소의 존재가 프레닉 에세이에서 확인되었다.
예 5 : 쥐에서 생체내 파상풍 독소-단백질 복합체와의 에세이
1㎎ 파상풍 독소가 2.5㎖의 50mM Tris/HCl, pH 8.0내의 5㎎의 정제된 복합적인 단백질에 첨가되었다. 계속하여 50mM 시트레이트 포스페이트 버퍼에 대해 pH 6.0 밤새도록 투석되었다. 용액 25㎕가 단백질 복합체 내의 파상풍 독소의 존재에 대해 분석되었다(예 4(A)참조). 0.5 ml 각각이 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 5 CD1 생쥐들에 투여되었다. 3마리 추가의 생쥐들(기준)이 동량의 파상풍 독소로 처리되었다. 파상풍 독소-단백질 복합체로 처리된 생쥐들은 24시간 후에 파상풍으로 죽은 반면, 기준들은 어떠한 파상풍 증상도 보이지 않았다.
예 6 : 쥐에서 생체내 파상풍 독소-단백질 복합체와의 에세이
5마리 위스터 쥐들(180-200g)이 각각 인두관(pharyngeal tube)을 통해 0.5㎖ 소디움 포스페이트, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 100㎍ BSA/㎖ 내의 2㎍의 본 발명의 단백질 복합체(예 4(B)참조)로 처리되었다. 3마리의 추가의 쥐들이(기준) 동일 버퍼에서 동량의 파상풍 독소로 처리되었다. 파상풍 독소-단백질 복합체로 처리된 쥐들은 24시간 내에 파상풍으로 죽은 반면, 기준 쥐들은 어떠한 파상풍 증상도 보이지 않았다.
예 7 : 본 발명에 따른 인슐린과의 단백질 복합체 형성
(A) 10㎎의 정제된 복합적인 단백질들이 50mM 시트레이트/포스페이트 버퍼에서 0.5mg 인슐린과 함께 밤새도록 투석되었다. 그들의 샘플이 겔여과에서 복합체 형성에 대해 분석되었다. 500 kDa초과 분자량에 해당하는 피크가 나타났다. 피크 분획의 앨리컷(aliquot)이 SDS-PAGE에서 분석되었다. 피크 분획은 복합적인 단백질의 밴드뿐 아니라 인슐린의 밴드도 포함하였다.
(B) 3㎎의 정제된 복합적인 단백질들이 50mM 포스페이트 버퍼 pH 7.0에서 0.5mg 인슐린과 함께 2일동안 투석되었고, 50mM 포스페이트, pH6.0에 대해 5일동안 투석되었다. 계속해서 암모늄 설페이트 침전이 다시 실행되었다. 겔여과에 의해서 샘플이 복합체 형성에 대해 분석되었다. 500 kDa초과 분자량에 해당하는 피크가 나타났다. 피크 분획의 앨리컷(aliquot)이 SDS-PAGE에서 분석되었다. 피크 분획은 복합적인 단백질의 밴드뿐 아니라 인슐린의 밴드 모두 포함하였다.
예 8 : 생쥐와의 글루코오스 스트레스 테스트
혈당치가 결정된 후에 10% 사카로오스(saccharose) 용액 1㎖가 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 10 CD1 생쥐들에 투여되었다. 1㎎의 인슐린-단백질 복합체 각각이 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 5마리 생쥐들에 투여되었다. 30분 간격으로 생쥐들의 혈당치가 결정되었다. 그 결과 처리된 생쥐들의 혈당치는 처리되지 않은 생쥐들의 평균 혈당치의 25에서 40% 이하였다.
예 9 : 쥐들과의 글루코오스 스트레스 테스트
혈당치가 결정된 후에 10% 사카로오스(saccharose) 용액 1㎖가 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 6마리 위스터 쥐들에 투여되었다. 0.5㎎의 인슐린-단백질 복합체 각각이 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 3마리 쥐들에 투여되었다. 30분 간격으로 생쥐들의 혈당치가 결정되었다. 그 결과 처리된 쥐들의 혈당치는 처리되지 않은 쥐들의 평균 혈당치의 25에서 40% 이하였다.
예 10 : 파상풍에 대한 경구적 면역
(A) 30㎎의 복합적인 단백질의 침전이 3㎎ 파상풍 독소(돌연변이된 파상풍 독소)에 첨가되었다. 그 혼합물은 50mM 시트레이트/포스페이트 버퍼 pH 5.5에 대해 밤새도록 투석되었다. 1㎎ 파상풍 독소-단백질 복합체 각각이 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 5마리 CD1-생쥐들에 투여되었다. 2주와 6주후에 동일 용량이 투여되었다. 2주후 맨마지막 처리 혈액이 얻어졌고 항체 적정량이 ELISA에 의해 결정되었다. 생쥐들은 독소(1:1000 초과)에 대해 항체 적정량을 발달시켰고, 상기 복합체에 결합되지 않은 동일 용량의 독소를 얻은 5마리 기준 생쥐들과는 대조적이다. 나아가 중화 에세이에서도 상기 항체가 독소의 활성을 비활성화시켰다는 것을 나타낸다.
(B) 10㎎의 복합적인 단백질의 침전이 3㎎ 파상풍 독소(돌연변이된 재조합 파상풍 독소)에 첨가되었다. 그 혼합물은 50mM 포스페이트 버퍼 pH 7.0에 대해 밤새도록 2일동안, 계속하여 pH 6.0에서 3일동안 투석되었다. 0.5㎎ 파상풍독소-단백질 복합체 각각이 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 5마리 CD1-생쥐들에 투여되었다. 2주후 맨 마지막 처리 혈액이 얻어졌고 항체 적정량이 ELISA에 의해 결정되었다. 생쥐들은 독소(1:1000 초과)에 대해 항체를 발달시켰고 상기 복합체에 결합되지 않은 동일 용량의 독소를 얻은 5마리 기준 생쥐들과는 대조적이다. 나아가 중화 에세이에서도 상기 항체가 독소의 활성을 비활성화시켰다는 것을 나타낸다.
예 11 : 클로스트리듐 보툴리늄 A형의 재조합 복합적인 단백질과의 복합체의 준비
재조합 복합체를 준비하기 위해 다른 단백질 인자들이 E.coli에서 준비되었다(cf.Fujinaga, Y. et al., FEBS Letters 467,179-183(2000)). 그 방법은 E.coli내 pGEX-SX-3 발현벡터에서 GST 융합 단백질들로서의 헤마글루티닌(HA 1:Mr약 33kDa, HA 2:Mr 약 17kDa, HA 3a:Mr 약 21kDa, HA 3b:Mr 약 48kDa)의 준비와 동일하다. 글루타티온-세파로오즈 4B 컬럼을 통한 정제후 글루타티온-S 트랜스퍼라아제가 요소 Xa에 의해 잘려나갔다. 요소 Xa와 GST의 분리후 순수한 재조합 단백질들이 분리되었다. 동일한 방법으로 비독성, 비-혈구응집성 복합적인 단백질이 준비되었다. 재조합 복합적인 단백질들이 50mM Tris/HCl 버퍼 pH8.0에 대하여 밤새도록 투석되었다(단백질 농도 1-1.5㎎/㎖).
파상풍 독소와의 복합체를 준비하기 위해 구성성분들이 다음의 몰비로 혼합되었다.
| 몰비(molar ratio) | ㎍ | |
| Ha 1 | 8 | 264 |
| Ha 2 | 3 | 51 |
| Ha 3a | 3 | 63 |
| Ha 3b | 3 | 144 |
| 파상풍 독소 | 1 | 150 |
단백질 복합체는 50mM 소디움 시트레이트 버퍼 pH 5.5에 대해 16시간동안 투석되었다. 25㎕의 샘플이 겔여과에 의한 복합체 형성에 대해 분석되었다. 단백질은 약 500kDa의 분자량에 해당하는 피크로 나타났다. SDS-PAGE에서의 피크 분획의 분석은 복합적인 단백질에서뿐만 아니라 파상풍 독소의 밴드(150kDa)에서도 행해졌다.
예 12 : 생쥐와의 재조합 복합체 에세이
예 10(A)에서 설명된 상기 복합체는 3마리의 CD1 생쥐들로 테스트되었다. 50㎍의 재조합 복합체가 인두관(pharyngeal tube)/프로브를 통해 생쥐들에 투여되었다. 3마리 모두가 48시간 내에 파상풍으로 죽은 반면, 동량의 순수 파상풍 독소(11㎍)가 투여된 3마리의 생쥐들은 파상풍 증상을 보이지 않았다.
Claims (14)
- 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 보툴리늄 독소 복합체의 헤마클루티닌과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품으로 구성되고, 상기 폴리펩티드는 보툴리늄 독소가 아닌 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 1항에 있어서,상기 단백질 복합체는 클로스트리듐 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 1항에 있어서,상기 단백질 복합체는 클로스트리듐 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 보툴리늄 독소 복합체의 헤마글루티닌들의 혼합물로 구성되는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 3항에 있어서,상기 혼합물은 클로스트리듐 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 1항 내지 제 4항에 있어서,상기 폴리펩티드는 제약적으로나 면역학적으로 활성인 폴리펩티드이거나 또는 진단 목적으로 이용되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 5항에 있어서,상기 제약적으로나 면역학적으로 활성인 폴리펩티드는 호르몬, 사이토카인, 효소, 성장인자, 항원, 항체, 저해제, 리셉터 길항물질(receptor agonist), 길항물질(antagonist) 또는 혈액응고인자인 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 5항에 있어서,상기 진단목적으로 이용되는 폴리펩티드는 표지된 항체 또는 표지된 리간드인 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 1항 내지 제4항에 있어서,상기 저분자량의 의약약품은 네오마이신, 살부타몰, 피리메타민, 메티실린, 페티딘, 케타민 또는 메페네신인 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 제 1항 내지 제4항에 있어서,상기 헤마글루티닌 또는 클로스트리듐 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)은 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품과 결합하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
- 치료시약, 백신, 또는 인간 및/또는 수의학에서의 진단시약으로서 이용되는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 4항의 단백질 복합체.
- 청구항 제1항 내지 제4항의 단백질 복합체의 제조방법에 있어서,상기 방법은,a) pH 2.0 내지 6.5에서 클로스트리듐 보툴리늄으로부터 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형 중 적어도 하나의 보툴리늄 독소 복합체의 분리단계,b) pH 7.0 내지 10.0까지의 증가단계,c) 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들을 얻기 위한 크로마토그래피법에 의해 헤마글루티닌들과 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)로부터 보툴리늄 독소의 분리단계,d) c)단계에서 얻어진 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 혼합하는 단계 또는,d') c)단계에서 얻어진 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들의 분리단계 및, 상기 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들 중 하나 이상과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 혼합하는 단계,e) 단계 d) 또는 d')로부터의 혼합물을 pH 2.0 내지 6.5의 버퍼에서 투석하는 단계, 및 임의로f) 단계 d) 또는 d')의 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들과 폴리펩티드 또는 저분자량의 의약약품을 화학결합을 통하여 결합(coupling)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체의 제조방법.
- 제 11항에 있어서,상기의 단계 d) 또는 d')에서 혼합된 보툴리늄-독소-유리(free) 단백질들은 단일의 또는 몇 가지 다른 형들의 보툴리늄 독소 복합체들로부터 유도된 것을 특징으로 하는 단백질 복합체의 제조방법.
- 제 1항 내지 제4항에 있어서,상기 헤마글루티닌들과 클로스트리디움 보툴리늄 A, B, C1, C2, D, E, F, 또는 G형들의 보툴리늄 독소 복합체의 비독성 비혈구응집성 단백질(NTHT)은 재조합 DNA기술에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체의 제조방법.
- 제약적으로 활성인 폴리펩티드들 또는 저분자량의 물질들, 면역학적으로 활성인 폴리펩티드들 또는 저분자량의 물질들, 또는 진단목적의 폴리펩티드들 또는 저분자량의 물질들을 위한 수송 전파체로서 이용되는 것을 특징으로 하는 청구항 제1항 내지 제4항의 단백질 복합체.
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Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6346510B1 (en) * | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
| JP2003009897A (ja) * | 2001-07-03 | 2003-01-14 | Keiji Oguma | ボツリヌス毒素の分離・精製法 |
| US7691394B2 (en) * | 2002-05-28 | 2010-04-06 | Botulinum Toxin Research Associates, Inc. | High-potency botulinum toxin formulations |
| US20040086532A1 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-06 | Allergan, Inc., | Botulinum toxin formulations for oral administration |
| JP2007070225A (ja) * | 2003-07-25 | 2007-03-22 | Yukako Fujinaga | クロストリジウム属菌由来成分を含む医薬製剤 |
| DE102004035606A1 (de) * | 2004-07-22 | 2006-03-30 | Biotecon Therapeutics Gmbh | Carrier für Arzneimittel zur Gewinnung der oralen Bioverfügbarkeit |
| CA2576971A1 (en) * | 2004-08-20 | 2006-03-02 | Entremed, Inc. | Compositions and methods comprising proteinase activated receptor antagonists |
| JP2009081997A (ja) * | 2007-09-27 | 2009-04-23 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ボツリヌス毒素成分ｈａを核酸の細胞内導入キャリアーとして利用する方法 |
| WO2009131435A1 (en) * | 2008-04-23 | 2009-10-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Linker containing bungarotoxin and a binding peptide |
| WO2010096134A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-08-26 | Botulinum Toxin Research Associates, Inc. | Extended length botulinum toxin formulation for human or mammalian use |
| US20130085267A1 (en) | 2009-12-18 | 2013-04-04 | Allergan, Inc. | Stabilization of Therapeutic Agents to Facilitate Administration |
| KR101134146B1 (ko) | 2010-05-31 | 2012-04-19 | 메덱스젠 주식회사 | 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 |
| US9393291B2 (en) | 2012-04-12 | 2016-07-19 | Botulinum Toxin Research Associates, Inc. | Use of botulinum toxin for the treatment of cerebrovascular disease, renovascular and retinovascular circulatory beds |
| US9901627B2 (en) | 2014-07-18 | 2018-02-27 | Revance Therapeutics, Inc. | Topical ocular preparation of botulinum toxin for use in ocular surface disease |
| US11484580B2 (en) | 2014-07-18 | 2022-11-01 | Revance Therapeutics, Inc. | Topical ocular preparation of botulinum toxin for use in ocular surface disease |
| US11096993B2 (en) | 2016-12-08 | 2021-08-24 | Gary E. Borodic | Method of treating macular degeneration using botulinum toxin-based pharmaceuticals |
| US11123411B2 (en) | 2016-12-08 | 2021-09-21 | Gary E. Borodic | Method of treating macular degeneration using botulinum toxin-based pharmaceuticals |
| US20210121542A1 (en) * | 2019-10-28 | 2021-04-29 | Prime Bio, Inc. | Composition for delivery of protein therapeutics through oral, sublingual and buccal route |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995032738A1 (en) * | 1994-05-31 | 1995-12-07 | Allergan, Inc. | Modification of clostridial toxins for use as transport proteins |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ286242A (en) * | 1991-03-26 | 1997-11-24 | Csl Ltd | Use of veterinary implant as a single dose vaccination system: rupturable polymer film coating around core of active agent and water soluble excipient |
| GB9120306D0 (en) * | 1991-09-24 | 1991-11-06 | Graham Herbert K | Method and compositions for the treatment of cerebral palsy |
| JP3510886B2 (ja) * | 1992-06-23 | 2004-03-29 | ボツリヌム トキシン リサーチ アソシエイト インコーポレイテッド | ボツリヌスｂ複合体を含有する医薬組成物 |
| AU689772B2 (en) * | 1993-03-29 | 1998-04-09 | Zoetis Llc | Multicomponent clostridial vaccines using saponin adjuvants |
| US5562907A (en) * | 1993-05-14 | 1996-10-08 | Arnon; Stephen S. | Method to prevent side-effects and insensitivity to the therapeutic uses of toxins |
| DE69432299T2 (de) * | 1993-06-10 | 2003-12-11 | Allergan, Inc. | Multiple Botulinum Toxine zur Behandlung von neuromuskulären Störungen und Zuständen |
| US6004583A (en) * | 1995-03-22 | 1999-12-21 | Orex Pharmaceutical Development Corp. | Protein-containing polymer composition for oral administration |
| GB9508204D0 (en) * | 1995-04-21 | 1995-06-07 | Speywood Lab Ltd | A novel agent able to modify peripheral afferent function |
| US6699966B1 (en) * | 1996-07-08 | 2004-03-02 | University Of Massachusetts | Proteins within the type E botulinum neurotoxin complex |
| DE19735105A1 (de) * | 1997-08-13 | 1999-03-04 | Univ Albert Ludwigs Freiburg | Transportsystem zur Einbringung von Proteinen in Zielzellen mit Hilfe eines Fusionsproteins, Nucleinsäurekonstrukte kodierend für die Komponenten des Transportsystems und Arzneimittel, die Komponenten des Transportsystems umfassen |
| US20030082107A1 (en) * | 1997-10-01 | 2003-05-01 | Dugger Harry A. | Buccal, polar and non-polar spray or capsule containing drugs for treating an infectious disease or cancer |
| GB9721189D0 (en) * | 1997-10-08 | 1997-12-03 | Speywood Lab The Limited | Analgesic conjugates |
| AU2340299A (en) * | 1998-01-26 | 1999-08-09 | University Of Massachusetts | Biologically active hemagglutinin from type a (clostridium botulinum) and methods of use |
| US5955368A (en) * | 1998-04-06 | 1999-09-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Expression system for clostridium species |
| DE19856897A1 (de) * | 1998-12-10 | 2000-06-15 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Therapeutikum zur Unterdrückung von Schnarchgeräuschen |
| US20030118598A1 (en) * | 2000-02-08 | 2003-06-26 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin pharmaceutical compositions |
| ES2275992T5 (es) * | 2000-02-08 | 2011-05-18 | Allergan, Inc. | Composiciones farmacéuticas de toxina botulínica. |
| JP2003009897A (ja) * | 2001-07-03 | 2003-01-14 | Keiji Oguma | ボツリヌス毒素の分離・精製法 |
| NZ537120A (en) * | 2002-05-31 | 2008-07-31 | Univ Jefferson | Compositions and methods for transepithelial molecular transport |
| US20050169942A1 (en) * | 2003-10-07 | 2005-08-04 | Allergan, Inc. | Novel DNA sequences of the botulinum neurotoxin complex of Clostridium botulinum type A-Hall (Allergan) strain for production of therapeutics |
| US7172764B2 (en) * | 2003-11-17 | 2007-02-06 | Allergan, Inc. | Rescue agents for treating botulinum toxin intoxications |
| US7514088B2 (en) * | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
| US20060073208A1 (en) * | 2004-10-01 | 2006-04-06 | Allergan, Inc. | Cosmetic neurotoxin compositions and methods |
| JP2008535486A (ja) * | 2005-03-15 | 2008-09-04 | アラーガン、インコーポレイテッド | クロストリジウム毒素標的細胞に対する改変された標的能力を有する修飾クロストリジウム毒素 |
| FR2896693B1 (fr) * | 2006-01-27 | 2008-03-14 | Sod Conseils Rech Applic | Composition comprenant plusieurs toxines botuliques |
-
2000
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-
2001
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2003
- 2003-01-10 CU CU20030009A patent/CU23381A3/es not_active IP Right Cessation
- 2003-01-17 NO NO20030231A patent/NO20030231L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995032738A1 (en) * | 1994-05-31 | 1995-12-07 | Allergan, Inc. | Modification of clostridial toxins for use as transport proteins |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J Protein Chem. Vol.18(7):753-60. (1999) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| PL364993A1 (en) | 2004-12-27 |
| NO20030231D0 (no) | 2003-01-17 |
| IL153539A0 (en) | 2003-07-06 |
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