WO2005009475A1

WO2005009475A1 - クロストリジウム属菌由来成分を含む医薬製剤

Info

Publication number: WO2005009475A1
Application number: PCT/JP2004/010395
Authority: WO
Inventors: Yukako Fujinaga; Keiji Oguma
Original assignee: Yukako Fujinaga; Keiji Oguma
Priority date: 2003-07-25
Filing date: 2004-07-22
Publication date: 2005-02-03
Also published as: JP2007070225A

Abstract

　クロストリジウム　ボツリヌス菌が産生するボツリヌス神経毒素複合体または赤血球凝集活性物質あるいはこれらの構成成分は、生体の上皮細胞のバリア機能を低下させて、蛋白質やポリペプチドを上皮細胞バリアを横断させて体内へ送達させる機能を有するため、これらの無毒化したものを、生理活性蛋白質やポリペプチドなどの薬物と共に用いることにより、経口投与が困難とされている生理活性蛋白質や生理活性ポリペプチドなどの薬物の経口投与可能な医薬製剤が得られる。

Description

明細書

クロストリジゥム属菌由来成分を含む医薬製剤

技術分野

[0001] 本発明は、薬物と共にクロストリジゥム属菌由来成分を含む医薬製剤に関する。更に詳細には、本発明は、生体の上皮細胞ノリアを横断するのが困難とされている、あるいは上皮細胞へ運搬するのが困難とされている生理活性蛋白質、生理活性ポリべプチド、中 ·低分子量薬物などの薬物を、経口投与、経皮投与、経鼻投与あるいは吸入投与するのに好適な医薬製剤であって、好ましくは、クロストリジゥムボツリヌス菌が産生する、無毒化されたボツリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質、それらの構成成分、あるいはその構成成分の断片を含有する医薬製剤に関する。更に本発明は、クロストリジゥム属菌由来成分を用いた薬物の投与方法に関する。

背景技術

[0002] インシュリン、成長ホルモン、エリスロポイエチンなどのポリペプチドもしくは蛋白質から構成される高分子量の薬物は、胃酸による分解作用、小腸や大腸などの消化管における蛋白分解酵素の作用、消化管の上皮細胞のノリアを横断することができないなどの理由から、経口投与することが出来ないため、現在では多くの場合、注射により投与されている。また、水溶性あるいは親水性の高い中'低分子量の薬物も、上皮細胞のノリアを横断することが難しぐ同様に経口投与が困難とされ注射により投与されている。

し力しながら、これらのポリペプチドや蛋白質などは、一般的に生体内での半減期が短いために、有効血中濃度を維持するために頻回投与が必要であり、注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。従って、ポリペプチドや蛋白質などの薬物を注射せずに経口投与で効果的に体内へ送達させて、有効血中濃度を長時間維持できる投与方法の開発が望まれている。

ポリペプチドや蛋白質を経口投与する方法として、消化管における蛋白分解酵素の作用を防ぐためァプロチニンなどの蛋白分解酵素阻害剤と共に投与する方法、胃酸による分解を防ぐために腸溶性コーティングを施した製剤を利用する方法、リポソームに封入して投与する方法 (非特許文献 1；非特許文献 2)などが提案されて!ヽる。しかしながら、未だ満足の行く方法がな!、のが現状である。

他方、クロストリジゥムボツリヌス (Clostridium botulinum)菌は自然界に広く存在し食品中毒の原因となる菌として知られている。この食品中毒の原因物質であるボッリヌス神経毒素には、抗原性の相違から A型カゝら G型の 7種類があり、ボツリヌス神経毒素は分子量約 150 kDaの易熱性の蛋白質 (7S毒素）であるが、食品中では無毒成分と結合し、分子量 300 kDaの 12S毒素または M毒素、分子量 500 kDaの 16S 毒素または L毒素、分子量 900 kDaの 19S毒素または LL毒素の複合体として存在している（非特許文献 3および非特許文献 4)。また、ボツリヌス神経毒素は、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、ジストニアなどに対して治療効果を有することも知られて Vヽる（非特許文献 3および非特許文献 4)。

非特許文献 l : Pharm. Res. 13, 896, (1996)

非特許文献 2 : Biol. Pharma. Bull. 19, 1055, 1996)

非特許文献 3 :脳 21、 Vol.5, No.4, 2002, 53(389)

非特許文献 4:蛋白質核酸酵素 Vol.42, No.13 23(1997)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明の目的は、ボツリヌス神経毒素などのクロストリジゥム属菌由来成分を利用した、ポリペプチドや蛋白質などの薬物を経口投与、経皮投与、経鼻投与または吸入投与するための医薬製剤を提供することにある。更には、本発明は、クロストリジゥム属菌由来成分を利用した薬物の投与方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0004] 本発明者は、分子量 150 kDaの蛋白質であるボツリヌス神経毒素（7S毒素）力食品中毒を起こす際に、消化管上皮細胞のバリアを通過する機構の解明を目的とする研究の課程で、クロストリジゥムボツリヌス菌が産生するボツリヌス神経毒素複合体および赤血球凝集活性物質（Free hemagglutinin, Free- HAと略すこともある）に上皮細胞のノリア機能を著しく低下させる作用があることを見出した。そして、この作用を利用することにより、上皮細胞のノリアを調節して、ポリペプチドや蛋白質などの薬物を効率よく経口投与、経皮投与あるいは経鼻投与することができ、また脳関門のバリァも低下させるため、脳に移行させたい薬物の投与にも有効であることを見出し、この知見に基き更に研究を進めて本発明を完成させた。

即ち、本発明は、薬物と共に、クロストリジゥム属菌由来成分を含有する医薬製剤でめる。

更に本発明は、クロストリジゥム属菌由来成分を有効成分として含有する医薬製剤であって、薬物を体内へ送達させるための、あるいは薬物を生体の細胞へ運搬するための医薬製剤である。

更に本発明は、薬物の投与方法であって、薬物と共に、クロストリジゥム属菌由来成分をヒトを含む哺乳動物に投与する薬物の投与方法である。

発明の効果

[0005] クロストリジゥム属菌由来成分、例えばクロストリジゥムボツリヌス菌が産生するボッリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質あるいはこれらの構成成分には、生体の上皮細胞のバリア機能を低下させて、薬物を上皮細胞バリアを横断させて体内へ送達させる機能を有する。従って、これらを無毒化したものを、生理活性蛋白質や生理活性ポリペプチドと共に用いることにより、これらの薬物を体内へ送達させ、あるいは生体の細胞へ運搬することができ、そのために薬物を経口投与、経皮投与、経鼻投与あるいは吸入投与することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0006] 以下、本発明をより具体的に説明する。

本発明の医薬製剤においては、薬物と共にクロストリジゥム属菌由来成分を用いる。クロストリジゥム属菌由来成分としては、生体の上皮細胞のノリア機能を低下させて薬物を上皮細胞バリアを横断させて体内へ送達させる機能、あるいは薬物を生体の上皮細胞へ運搬する機能を有するものであれば、いずれの成分を用いてもよい。例えば、クロストリジゥムボツリヌス菌、クロストリジゥムディフイシル菌、クロストリジゥムパーフリンジエンス菌などが産生する成分が挙げられ、なかでもクロストリジゥムボッリヌス菌由来成分が好ましい。より具体的には、クロストリジゥムボツリヌス菌が産生する、無毒化されたボツリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質、これらの構成成分、あるいはその構成成分の断片、あるいはそれらの複合体が挙げられる。クロストリジゥムボツリヌス菌が産生するボツリヌス神経毒素には、抗原性の相違から A型から G型の 7種類があり、ボツリヌス神経毒素は分子量約 150 kDaの易熱性の蛋白質 (7S毒素）であるが、食品中では無毒成分と結合し、分子量 300 kDaの 12S 毒素または M毒素、分子量 900 kDaの 16S毒素または L毒素、分子量 900 kDa の 19S毒素または LL毒素の複合体として存在している (非特許文献 3および非特許文献 4)。本発明では、好ましくは、このボツリヌス神経毒素と無毒成分とが結合したボツリヌス神経毒素複合体を用いる。ボツリヌス神経毒素複合体としては、特に、ボッリヌス A、 Bまたは C型菌が産生する 16S毒素（蛋白質核酸酵素 Vol.42, No.13, 23 (1997))が好ましぐ特にボツリヌス A型または B型 16S毒素、 A型 19S 毒素が好ましい。ボツリヌス A型または B型 16S毒素は、分子量約 500 kDaで、神経毒素活性、赤血球凝集活性およびラタトース結合活性を有する。より具体的には、ボツリヌス A型または B型 16S毒素は、ボツリヌス神経毒素（7S毒素、分子量約 160 kDa) ,毒性がなく赤血球凝集活性のない NTNH (nontoxic non- hemagglutininの略名、分子量約 130 kDa)および赤血球凝集活性をもつ HA (hemagglutininの略名、 HA1、 HA2、 HA3a、 HA3bの 4つのサブコンポーネントからなる。分子量約 150 kDa )が非共有結合により結合した安定な複合体蛋白質である。ボツリヌス A型または B 型 16S毒素は公知の方法により容易に取得可能である（Infection and Immunity, 71,

1599-1603, 2003) o A型 19S毒素は、 A型 16S毒素と構成成分が全く同じで、 A 型 16S毒素のほぼ二量体と考えられており、公知の方法で精製される（Infection and

Immunity, May 1996, 1589—1594)。

また、ボツリヌス B型 16 nontoxic componentや A型 HA positive progenitor toxin も好ましいものとして挙げられる。ボツリヌス B型 16 nontoxic componentは、 pH8.0 で B型 16S毒素力解離する神経成分と無毒成分のうちの無毒成分であり、 NTNH と HAの複合体であり、 Infection and Immunity, Mar. 2003, 1599-1603に記載された方法により精製されるものである。 A型 HA positive progenitor toxinは、 A型菌が産生する 12S毒素、 16S毒素および 19S毒素のうちで、 16S毒素と 19S毒素との混合物であり公知の方法で精製される（Infectio and Immunity, May 1996, 1589-1594) 本発明では、これらのボツリヌス神経毒素複合体は、無毒化されたものを用いる。無毒化は、ボツリヌス神経毒素複合体中に存在する毒素成分である 7S毒素を除去するなり、 7S毒素の毒性を無くすよう処理するなどの方法により容易に実施できる。例えば pH 8のリン酸緩衝液中で、ボツリヌス神経毒素複合体を神経毒部分である 7S 毒素と無毒成分に分離し、無毒部分を例えばラタトースカラムを用いて分離精製することにより実施できる。また、必要に応じて、更に抗神経毒素抗体で、混入している神経毒を除去することもできる。

[0007] 本発明では、好ましくは、クロストリジゥムボツリヌス A、 Bまたは C型菌が産生する赤血球凝集活性物質、即ち、赤血球凝集活性をもつ HA (hemagglutininの略名、 HA1、 HA2、 HA3a、 HA3bの 4つのサブコンポーネントからなる。分子量約 150 kDa )を用いることもできる（蛋白質核酸酵素 Vol.42, No.13, 23 (1997)) ₀特に、ボッリヌス Aまたは B型菌が産生する赤血球凝集活性物質が好ましい。赤血球凝集活性物質は、赤血球凝集活性およびラタトース結合活性を有するが致死活性などの毒性はない。赤血球凝集活性物質は単独で菌の培養液中に存在し、培養上清から、陽ィオン交換クロマトグラフィーおよびラタトースゲルを用いたァフィユティーカラムクロマトグラフィ一により精製することができる。ボツリヌス菌が産生する赤血球凝集活性物質には、毒性が無いため、特に無毒化させる必要はないが、必要に応じて、上記したと同様の無毒化処理を施してもょヽ。

本発明では、上記したボツリヌス神経毒素複合体または赤血球凝集活性物質の構成成分、あるいはその構成成分の断片、あるいはそれらの複合体を用いることもできる。これらの構成成分あるいはその断片が毒性を有する場合には、上記したと同様の方法で無毒化することができる。ボツリヌス神経毒素複合体の構成成分としては、ボッリヌス Aまたは B型 16S毒素の構成成分である NTNHおよび HA(Infection and Immunity, Mar. 2003, p.1599- 1603; Infection and Immunity, May 1996,

p.1589-1594)などが挙げられ、赤血球凝集活性物質の構成成分としては、 HA1、 HA2、 HA3、 HA3a、 HA3bなどが挙げられる。

[0008] 本発明で用いる薬物は、いずれでもよく特に限定されないが、経口投与、経皮投与、経鼻投与などが難しいとされている薬物が好適な対象である。このような薬物としては、例えば、分子量約 100 kDaから 500 kDaの生理活性蛋白質または生理活性ポリペプチドが挙げられる。生理活性蛋白質または生理活性ポリぺプヂドとしては、具体的には、例えば、インスリン、成長ホルモン、プロラタチンなどのホルモン;インターフエロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子などのサイト力イン；エリスロポイエチン、コ口-一刺激因子などの造血因子;セロトニンなどの神経伝達物質;繊維芽細胞増殖因子 (FGF)、神経細胞増殖因子 (NGF)、骨増殖因子 (BMP)などの増殖因子；ゥロキナーゼ、カリクレインなどの酵素；ポリミキシンなどのポリペプチド系抗生物質;エンケフアリンなどの鎮痛性ポリペプチド;ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体などの抗体などが挙げられる。また、中'低分子量の薬物でもよぐこのような薬物としては、水溶性あるいは親水性の高い薬物が好適な対象であり、例えば、ァドリアマイシン、 5Fu、メトトレキセートなどの抗腫瘍剤などが挙げられる。

本発明の医薬製剤は、経口投与、経皮投与、経鼻投与、吸入投与などにより投与することができる。これらの投与経路で投与する場合の剤型としては、例えば、薬物と、クロストリジゥム属菌由来成分、例えば無毒化されたボツリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質、これらの構成成分、あるいはその構成成分の断片などとをリポソームまたはマイクロカプセルに封入して、経口製剤、経皮製剤、経鼻製剤、吸入製剤に成形した製剤が挙げられる。

リボソームは、リン脂質を主体とする脂質と十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体であり、多重膜リボソーム (MLV)と、一枚膜リポソームに分類される力本発明ではいずれのリボソームであってもよい。具体的には、例えば、レシチン、ステロール、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリンなどの脂質を、例えばエタノールなどの有機溶媒で可溶ィ匕し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を形成後に、これにポリペプチドまたは蛋白質などの薬物を含む水溶液を添カロし、高速度で回転攪拌して、リボソーム懸濁液として得ることができる。得られた懸濁液を、液状のまま、あるいは凍結乾燥した後に、通常の方法により、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤などに成形して経口投与用製剤とすることができる。また、通常の方法により、軟膏剤、クリーム剤、パッチ型製剤などに成形して経皮投与用製剤とし、また通常の方法により、噴霧剤、スプレー剤などに成形することにより、経鼻投与用製剤とすることもできる。また、散剤、顆粒剤、液剤などに成形してカプセルに充填して、吸入デバイスにより吸入投与する吸入投与用製剤とすることもできる。

[0010] マイクロカプセルとしては、例えば、ポリ（d,l—ラクチドーコーダリコライド)などの生体内分解性合成ポリマーに、薬物とクロストリジゥム属菌由来成分とを分散させ微小胞体としたものなどが挙げられる。より具体的には、例えば、生体内分解性合成ポリマ一を塩化メチレンなどの有機溶媒に溶解し、これに薬物と、クロストリジゥム属菌由来成分、例えば無毒化されたボツリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質、これらの構成成分、あるいはその構成成分の断片とを含む水溶液を加え、高速攪拌し、共乳化し、次いで生体内分解性合成ポリマーに非溶解の溶媒を加えて、マイクロ力プセルを形成させ、安定化剤などを加えて、溶媒を除去することにより得ることができける。これ以外にも、通常採用されているマイクロカプセルの調製法を採用することも勿論できる。このようにして得られたマイクロカプセルを、通常の方法により、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤などに成形して経口投与用製剤とすることができる。また、通常の方法により、軟膏剤、クリーム剤、パッチ型製剤などに成形して経皮投与用製剤とし、また通常の方法により、噴霧剤、スプレー剤などに成形することにより、経鼻投与用製剤とすることもできる。また、通常の方法により吸入投与用製剤とすることもできる。

[0011] 経鼻投与用製剤の場合には、薬物と、例えば無毒化されたボツリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質、これらの構成成分、あるいはその断片とを、ヒドロキシプロピルメチルセルロースの粉末と良く混合して粉末製剤とすることもできる。腸溶性ポリマーでコーティングした淀剤などの腸溶性製剤として経口投与用製剤とすることもできる。また、クロストリジゥム属菌由来成分と薬物とを、生理食塩水などに添加して溶液剤として、あるいは通常のゲル剤として、経皮投与用製剤、経鼻投与用製剤とすることちでさる。

また、本発明においては、中'低高分子量の薬物の場合には、薬物をクロストリジゥム属菌由来成分と通常の方法により共有結合させて用いることも出来る。生理活性蛋白質または生理活性ポリペプチドの場合には、これらの薬物とクロストリジゥム属菌由来成分とを融合させた融合蛋白質または融合ポリペプチドを遺伝子工学的に作製して、本発明に用いることができる。この場合には、上記したリボソーム、マイクロカプセルに成形して投与するのが好まし、。

また、本発明においては、薬物とクロストリジゥム属菌由来成分とを別々に製剤化して、それぞれを、実質的に同時に投与することもできる。この場合には、クロストリジゥム属菌由来成分を含む製剤は、本発明の、クロストリジゥム属菌由来成分を有効成分として含有する医薬製剤であって、薬物を体内へ送達させるための、あるいは薬物を生体の細胞へ運搬するための医薬製剤に相当する。薬物とクロストリジゥム属菌由来成分とを別々に製剤化する場合にも、上記したと同様の製剤を、同様の方法で製剤ィ匕することがでさる。

本発明の医薬製剤においては、クロストリジゥム菌由来成分の使用量は、用いる薬物、投与経路などに応じて変動するが、通常、薬物に対して、 0.01から 10重量％、好ましくは、 0.1から 5重量％である。

本発明の医薬製剤においては、必要に応じて、通常医薬製剤に使用されている保存剤、安定剤、界面活性剤、防腐剤などを適宜添加することができる。

[0012] 以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によつて何ら限定されるのもではな、。

実施例で使用する吸収促進剤

(1) B型 16S毒素

クロストリジゥムボツリヌス B型菌が産生する蛋白質であり、分子量約 500 kDaで、神経毒素活性、赤血球凝集活性およびラタトース結合活性を有する。ボツリヌス神経毒素（7S毒素、分子量約 160 kDa)、毒性がなく赤血球凝集活性のない NTNH ( nontoxic non- hemagglutininの略名、分子量約 130 kDa)および赤血球凝集活性をもつ HA (hemagglutininの略名、 HA1、 HA2、 HA3a、 HA3bの 4つのサブコンポーネントからなる。分子量約 150 kDa)が非共有結合により結合した安定な複合体蛋白質である。本物質は公知の方法により容易に取得可能である（Infection and Immunity, 71, 1599-1603, 2003)。

[0013] ( 2) B型 Free- HA クロストリジゥムボツリヌス B型菌が産生する蛋白質であり、赤血球凝集活性およびラタトース結合活性を有するが致死活性などの毒性はない。 Free-HAとして単独で菌の培養液に存在する。 Free-HAには、図 2に示すように少なくとも 4つのサブコンポーネント A, B, C, Dが存在し、それらのすべてあるいは一部が複合体を形成していると考えられる。それらのサブコンポーネントを含む画分が本発明の吸収促進剤でめる。クロストリジゥムボツリヌス B型菌 lamanna株を、透析チューブ培養法で外液 14L 、 5 日間培養し、チューブ内の溶液を回収し、培養上清を得た。培養上清の 60 %硫安沈殿物を 50 mMリン酸緩衝液に溶解し、同液で透析した後、 2%プロタミン処理を行い、 50 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 4.2)で透析を行った。本試料を

SP-Toyopearl 650 M (トーソ一社製）による陽イオン交換クロマトグラフィーにて分画した。その時の分画プロファイルを図 1に示す。 Free- HA画分である peak 2を、ラタトースゲルを用いたァフィユティーカラムに結合させ、 0.2 Mラタトースで溶出されたものを 20 mMリン酸緩衝液 (pH6.0)で透析し、 Free-HA画分 (本発明の吸収促進剤）を得た。図 2に Free- HAの SDS- PAGEの結果を示す。

実施例 1

ボツリヌス B型 16S毒素による T 84細胞の細朐間電気抵抗値の低下の測定ヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞を transwell (コースター社製、 4.7cm²)を用いて培養し、 3週間ほど維持して、細胞間の tight junctionを形成させ,腸管上皮細胞のバリアを構築した。 Tight junctionの形成は細胞間電気抵抗値 (TER)を測定して判定した。この実験系の場合、 400 Ω ' cm²以上ある場合、 tight junctionが充分形成されており、細胞のバリアが構築されていることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 1988, 82, 1516- 1524)ことから、 400 Ω ' cm²以上の TERを示した well を実験に用いた。 TER値は MilliceU-ERS (ミリポア社製)を用いて測定した。

細胞の apical側より、ボツリヌス B型 16S毒素、 B型 7S毒素、 B型 Free- HAを終濃度がそれぞれ 50 nMづつになるように添カ卩した。その後、 37での CO インキュべ

2 一ター中で、横軸に示した時間、細胞を培養し、電気抵抗を測定した。そこで得られた数値カゝら細胞がない wellの電気抵抗値を差し引いた値を算出し、その時間における TERとした。結果を図 3に示した。縦軸は、毒素および Free-HAを添加する直前の TER値を 100%として、各時間の TER値を％で示している。

その結果、 B型 16S毒素を添加した場合、 12時間後には明らかな TERの低下が認められた。 B型 Free-HAを添カ卩した場合は B型 16S毒素と同様に TERの低下が認められた。一方で、 B型 7Sや bufferのみを添カ卩した場合は、 TERの低下は全く見られなかった。以上より、 B型 16S毒素のみならず Free- HAに T84細胞の tight junction機能を低下させ、細胞間のノリアを消失させる作用があることが明らかとなつた。さらに B型 16S毒素力もつ本作用は、 B型 16S毒素中の 7S毒素ではなぐ NTNHと HAの両方、あるいは NTNHか HAのいずれかにあると考えられる。

実施例 2

ボツリヌス B型 16S毒素の adcal側から basolateral側への移行の測定

ヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞を transwell (コースター社製、 0.33cm²)を用いて培養し、 3週間ほど維持して、細胞間の tight junctionを形成させ,腸管上皮細胞のノリアを構築した。 Tight junctionの形成は細胞間電気抵抗値 (TER)を測定して判定した。この実験系の場合、 800 Ω ' cm²以上ある場合、 tight junctionが充分形成されており、細胞のバリアが構築されていることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 104, 903-111, 1999)ことから、 800 Ω ' cm²以上の TERを示した well を実験に用いた。

細胞の頭頂部（apical)側より、ボツリヌス B型 16S毒素を終濃度がそれぞれ 50 nM づつになるように添カ卩した。その後、 37 °Cの CO インキュベータ一中で、図 4中に

2

示した時間細胞を培養し、 apicalの培養液と細胞の側底部（basolateral)側の培養液を採取し、トリクロ口酢酸を添加して、蛋白質を沈殿させた。この際、キャリアータンパク質として 2マイクログラムのリゾチームを添カ卩している。トリクロ口酢酸で沈殿した蛋白質画分を 7.5-15 %ポリアクリルアミドゲルを用いて SDS-PACEを行った。その後、ゲル中の蛋白質を-トロセルロース膜にブロッテイングし、 5%スキムミルクでブロッキングした後、抗 7Sゥサギポリクローナル抗体を 1次抗体、 HRP標識ャギ抗ゥサギ IgG 抗体 (Jackson社製）を 2次抗体として用いて western blotを行った。発色は、 SuperSignal West Pico (Pierce社製)を用いて、フィルム（Kodak社製）にて、毒素のバンドを検出した。

その結果、 16Sを apical力添カ卩した場合、 3時間後、 6時間後では、 basolateral の medium中に移行した毒素は、ほとんど検出できなかった力 17時間後では、相当量の毒素が検出された。従って、上皮細胞のバリアを通過する毒素は、 6時間までは非常に少ないが、 17時間の時点では、比較的大量の毒素が通過していることが明らカとなった。この結果は、図 3で示した B型 16Sおよび Free- HAによる TER値の低下作用の経時変化とよく一致している。従って B型 16S毒素あるいは Free- HAにより apical側から添加後 12時間で、上皮細胞のノリア機能が低下して、その結果 16S分子中の少なくとも 7S毒素が、 basolateral側へ大量に移行していると考えられる。

本実施例より、 7S毒素は分子量 150 kDaの巨大なタンパク質なので、同等あるいは、それ以下のタンパク質製剤など力この経路で上皮細胞のノリアを通過できると考えられる。

実施例 3

ボツリヌス B HA添加による T84細胞の細朐間バリア機能の消失および FITC- デキストラン 10k、 40kおよび 500kのバリア诵渦促進

ヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞を transwell (コースター社製、 4.7cm²)を用いて培養し、 3週間ほど維持して、細胞間の tight junctionを形成させ,腸管上皮細胞のノリアを構築した。 Tight junctionの形成は細胞間電気抵抗値 (TER)を測定して判定した。この実験系の場合、 400 Ω ' cm²以上ある場合、 tight junctionが充分形成されており、細胞のバリアが構築されていることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 1988, 82, 1516- 1524)ことから、 400 Ω - cm²以上の TERを示した well を実験に用いた。 TER値は MilliceU-ERS (ミリポア社製)を用いて測定した。

細胞の basolateral側より、ボツリヌス B型 HAを終濃度が 50nMづつになるように添加した。その後、 37°Cの CO インキュベータ一中で、 21時間、細胞を培養した後

2

、各種分子量の FITC-デキストランを apical側から添カ卩した。 4時間後に basolateral 側の培地を回収し、 FITC-デキストランの量をその蛍光強度で定量ィ匕した。 Negative controlは HAを添カ卩しない場合である。

得られる結果を図 5に示した。図 5の結果力も分力るように、 HAを上皮細胞 monolayerに作用させると、処理しない場合にくらべ、 FITC-デキストラン 10Kで約 50倍、 FITC-デキストラン 40Kで約 40倍、 FITC-デキストラン 500Kで約 60倍の量が apicalから basolateralへ移行した。従って、 B型 HAは、少なくとも分子量 500kDaまでの大きさの分子の上皮細胞バリア通過を促進させることが明ら力となった実施例 4

ボツリヌス B 16S添加による T84細胞の細胞バリア機能の消安あびルテユウムレッドのバリア诵渦促進

ヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞を transwell (コースター社製、 4.7cm²)を用いて培養し、 3週間ほど維持して、細胞間の tight junctionを形成させ、腸管上皮細胞のノリアを構築した。 Tight junctionの形成は細胞間電気抵抗値 (TER)を測定して判定した。この実験系の場合、 400 Ω ' cm²以上ある場合、 tight junctionが充分形成されており、細胞のバリアが構築されていることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 1988, 82, 1516- 1524)ことから、 400 Ω - cm²以上の TERを示した well を実験に用いた。 TER値は MilliceU-ERS (ミリポア社製)を用いて測定した。

細胞の basolateral側より、ボツリヌス B型 16Sを終濃度が ΙΟΟηΜづつになるように添加した。その後、 37°Cの CO インキュベータ一中で、 23時間、細胞を培養した

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後、ルテニウムレッド（分子量 858.42)を apical側から添加し、細胞を固定して透過型電子顕微鏡で観察した。ルテニウムレッドは細胞膜上の酸性ムコ多糖に結合し、透過型電子顕微鏡では黒く染色される。 Tight junctionが機能しており細胞間に隙間がない場合は、添加した側の細胞膜のみが染色される力 Tight junctionが機能しておらず細胞間隙がぁ、て、る状態では、添加した側の細胞膜に加えて添加して、ない側の細胞膜も染色される。

本実験の結果を図 6Aおよび図 6Bに示した。図 6Aの aの negative control(B 16S 添カ卩していない)の場合、ルテニウムレッドは apical側の形質膜のみに存在するが、図 6Aの b、図 6Bの cのボツリヌス B型 16S添カ卩した場合、ルテニウムレッドは apical 側から tight junctionを超えて lateral側にも局在するようになる。

従って、ボツリヌス B型 16Sによって細胞間電気抵抗が低下した状態の時は、 tight junction機能が破壊され、ルテニウムレッドのような分子が apicalから basolateralへ移行するようになることが明らかになった。

実施例 5

[0018] apicalから添加したボツリヌス B型 nontoxic componentの Caco2細朐内への取り jAみ

ヒト大腸がん由来細胞株 caco2細胞を transwell (コースター社製、 4.7cm²)を用いて培養し、 3週間ほど維持して、細胞間の tight junctionを形成させ、腸管上皮細胞のバリアを構築した。 Tight junctionの形成は細胞間電気抵抗値 (TER)を測定して判定した。この実験系の場合、 400 Ω - cm²以上ある場合、 tight junctionが充分形成されており、細胞のバリアが構築されていることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 1988, 82, 1516- 1524)ことから、 400 Ω - cm²以上の TERを示した well を実験に用いた。 TER値は MilliceU-ERS (ミリポア社製)を用いて測定した。

細胞の apical側より、 Alexa-568でラベルしたボツリヌス B型 nontoxic component を終濃度が 50nMになるように添カ卩した。このボツリヌス B型 nontoxic componentは、 pH8.0で B型 16S毒素から解離する神経成分と無毒成分のうちの無毒成分であり、 NTNHと HAの複合体であり、 Infection and Immunity, Mar. 2003, 1599-1603に記載された方法により精製されるものである。

その後、 37°Cの CO インキュベータ一中で 5時間細胞を培養し,細胞をパラホルム

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アルデヒドで固定して、 confocal顕微鏡 (1000倍)により、細胞の断面を観察した。その結果を図 7に示した。細胞部分はァクチンをファロイジンー Alexa 488で染色して可視化している。図 7から分かるように、 Alexa 568- B型 16 nontoxic componentが細胞内に取り込まれている様子が観察された。

実施例 6

[0019] ボツリヌス A ¾ί HA positive progenitor toxinの活性

ヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞を transwell (コースター社製、 4.7cm²)を用いて培養し、 3週間ほど維持して、細胞間の tight junctionを形成させ、腸管上皮細胞のノリアを構築した。 Tight junctionの形成は細胞間電気抵抗値 (TER)を測定して判定した。この実験系の場合、 400 Ω 'cm²以上ある場合、 tight junctionが充分形成されており、細胞のバリアが構築されていることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 1988, 82, 1516- 1524)ことから、 400 Ω - cm²以上の TERを示した well を実験に用いた。 TER値は MilliceU-ERS (ミリポア社製)を用いて測定した。

細胞の apical側より、ボツリヌス B型 16S毒素、 A型 HA positive progenitor toxin 、 A型 12Sを終濃度がそれぞれ 100nMづつになるように添カ卩した。 A型 HA positive progenitor toxinは、 A型菌が産生する 12S毒素、 16S毒素および 19S毒素のうちで、 16S毒素と 19S毒素との混合物であり公知の方法で精製される（Infectio and Immunity, May 1996, 1589—1594)。

その後、 37°Cの CO インキュベータ一中で、横軸に示した時間、細胞を培養し、

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電気抵抗を測定した。そこで得られた数値力細胞がない wellの電気抵抗値を差し引いた値を算出し、その時間における TERとした。結果を図 8に示した。縦軸は、毒素を添加する直前の TER値を 100%として、各時間の TER値を％で示している。図 8の結果から分かるように、 A型 HA positive progenitor toxin (16S+19S毒素)は B型 16S毒素を添加した場合と同様、 24時間後には明らかな TERの低下が認められた。以上より、 B型 16S毒素のみならず A型 HA positive progenitor toxinにも T84細胞の tight junction機能を低下させ、細胞間のバリアを消失させる作用があることが明らかとなった。さらに A型 HA positive progenitor toxinがもつ本活性は、 A 型 12S毒素にはないことから、 A型 HAにあると考えられる。

産業上の利用可能性

以上の実施例より、 16S毒素中の NTNH、 HAと Free-HAあるいはそれらのァミノ酸配列の一部をもつ物質は、上皮細胞のバリア機能を低下させ、薬物を上皮細胞バリアを横断させて体内へ送達させる機能を有し、また、薬物を生体内の上皮細胞へ運搬する機能を有することが明ら力となった。従って、 16S毒素中の NTNH、 HAと Free-HAなどのボツリヌス属菌由来成分は、蛋白質などの薬物を体内へ送達させる機能あるいは細胞内へ運搬する機能があることが明らかになった。

以上に詳細に説明した通り、クロストリジゥム属菌由来成分、例えばクロストリジゥムボツリヌス菌が産生するボツリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質あるいはこれらの構成成分には、生体の上皮細胞のバリア機能を低下させて、薬物を上皮細胞バリアを横断させて体内へ送達させる機能を有する。また、薬物を生体内の上皮細胞へ運搬する機能を有することが明らかとなった。従って、これらを無毒化したものを、生理活性蛋白質や生理活性ポリペプチドと共に用いることにより、これらの薬物を、体内へ送達させ、あるいは細胞内へ運搬することができ、経口投与、経皮投与、経鼻投与、吸入投与する事が可能となる。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、クロストリジゥムボツリヌス B型菌 lamanna株の培養上清中の蛋白成分を陽イオン交換クロマトグラフィーにて分画した時の分画プロファイルを示す。

[図 2]図 2は、クロストリジゥムボツリヌス B型菌 lamanna株の培養上清中の蛋白成分を陽オン交換クロマトグラフィーにて分画し、その後ァフィユティークロマトグラフィーにより得られる Free-HA画分の SDS-PAGEの結果を示す。

[図 3]図 3は、 tight junctionを形成したヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞の apical 側より、ボツリヌス B型 16S毒素、 B型 7S毒素、 B型 Free-HAをそれぞれ添カ卩した時の電気抵抗値の割合を示す。

[図 4]図 4は、 tight junctionを形成したヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞の apical 側より、ボツリヌス B型 16S毒素を添カ卩し、その後、細胞の basolateral側に移行した成分を測定した結果を示している。図 4において、 NTNHは nontoxic non-HA、 Hc+Lcは、 7S毒素の重鎖と軽鎖、 Heは、 7S毒素の重鎖、 Lcは 7S毒素の軽鎖、 HA3bは HAサブコンポーネントの 1つを示す。

[図 5]図 5は、 tight junctionを形成したヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞の basolateral側より、ボツリヌス B型 HAを添加し、その後、細胞を培養した後、各種分子量の FITC-デキストランを apical側から添カ卩し、 apical側から basolateral側へ移行した FITC-デキストランの量を測定した結果を示す。

[図 6A]図 6Aは、 tight junctionを形成したヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞の basolateral側より、ボツリヌス B型 16Sを添加し、その後、細胞を培養した後、ルテ -ゥムレッドを apical側から添カ卩し、 apical側から basolateral側へ移行したルテ-ゥムレッドを観察した結果を示す。

[図 6B]図 6Bは、 tight junctionを形成したヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞の basolateral側より、ボツリヌス B型 16Sを添加し、その後、細胞を培養した後、ルテ -ゥムレッドを apical側から添カ卩し、 apical側から basolateral側へ移行したルテ-ゥムレッドを観察した結果を示す。

[図 7]図 7は、 tight junctionを形成したヒト大腸がん由来細胞株 caco2細胞の apical 側から添力卩したボツリヌス B型 nontoxic componentが Caco2細胞内へ取り込まれることを示す。

[図 8]図 8は、 tight junctionを形成したヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞の apical 側より、ボツリヌス A型 HA positive progenitor toxin (16S+19S毒素)を添カ卩した場合を示しており、この場合には、 B型 16S毒素を添加した場合と同様、ヒト大腸がん由来細胞株 T84細胞の tight junction機能を低下させ、細胞間のバリアを消失させる作用があることを示す。

Claims

請求の範囲

[I] 薬物と共に、クロストリジゥム属菌由来成分を含有する医薬製剤。

[2] クロストリジゥム属菌由来成分が、薬物を体内へ送達させる機能、あるいは薬物を生体の細胞へ運搬する機能を有するものである、請求項 1の医薬製剤。

[3] クロストリジゥム属菌由来成分が、生体の上皮細胞のバリア機能を低下させて薬物を上皮細胞バリアを横断させて体内へ送達させる機能、あるいは薬物を生体の上皮細胞へ運搬する機能を有するものである、請求項 1または 2の医薬製剤。

[4] クロストリジゥム属菌由来成分力クロストリジゥムボツリヌス菌が産生する、無毒化されたボツリヌス神経毒素複合体、赤血球凝集活性物質、それらの構成成分、あるいはその構成成分の断片、あるいはそれらの複合体である、請求項 1から 3のいずれかに記載の医薬製剤。

[5] クロストリジゥム属菌由来成分力クロストリジゥムボツリヌス A型または B型菌が産生する、ボツリヌス A型または B型 16S毒素、ボツリヌス A型 19S毒素、ボッリヌス A型または B型赤血球凝集活性物質、それらの構成成分、あるいはその構成成分の断片である、あるいはそれらの複合体である、請求項 1から 4のいずれかの医薬製剤。

[6] 薬物が、生理活性蛋白質、生理活性ポリペプチドまたは中'低分子量の薬物である

、請求項 1から 5のいずれかの医薬製剤。

[7] 経口投与用、経皮投与用、経鼻投与用または吸入投与用である、請求項 1から 6のいずれかの医薬製剤。

[8] マイクロカプセル、リボソームまたは溶液剤の形態にある、請求項 1から 7のいずれかの医薬製剤。

[9] クロストリジゥム属菌由来成分を有効成分として含有する医薬製剤であって、薬物を体内へ送達させるための、あるいは薬物を生体の細胞へ運搬するための医薬製剤。

[10] クロストリジゥム属菌由来成分が、生体の上皮細胞のバリア機能を低下させて薬物を上皮細胞バリアを横断させて体内へ送達させる機能、あるいは薬物を生体の上皮細胞へ運搬する機能を有するものである、請求項 9の医薬製剤。

[II] 薬物の投与方法であって、薬物と共に、クロストリジゥム属菌由来成分をヒトを含む哺乳動物に投与する薬物の投与方法。

[12] クロストリジゥム属菌由来成分が、生体の上皮細胞のバリア機能を低下させて薬物を上皮細胞バリアを横断させて哺乳動物の体内へ送達させる、あるいは薬物を生体の上皮細胞へ運搬する、請求項 11の薬物の投与方法。