WO2006010360A2 - Carrier für arzneimittel zur gewinnung der oralen bioverfügbarkeit - Google Patents

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WO2006010360A2
WO2006010360A2 PCT/DE2005/001290 DE2005001290W WO2006010360A2 WO 2006010360 A2 WO2006010360 A2 WO 2006010360A2 DE 2005001290 W DE2005001290 W DE 2005001290W WO 2006010360 A2 WO2006010360 A2 WO 2006010360A2
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protein
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Jürgen Frevert
Thomas Stibora
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Biotecon Therapeutics Gmbh
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the present invention relates to a protein complex comprising at least one hemagglutinin of at least one of the Clostridium botulinum types A, B, C, D, E, F or G and a polypeptide Hc conjugate, wherein the polypeptide Hc conjugate is selected from a selected polypeptide connected to the heavy chain or its N-terminal fragment of botulinum toxin.
  • This concept also includes the simultaneous administration of concentrated low molecular weight carrier molecules (eg 4- (4-2-hydroxybenzoyl) aminophenyl) butyric acid).
  • concentrated low molecular weight carrier molecules eg 4- (4-2-hydroxybenzoyl) aminophenyl
  • Another approach attempts to exploit specific transport mechanisms in the intestinal wall.
  • vitamin B 12 there is a transport mechanism which is to be used for protein active ingredients by the active ingredients being coupled to vitamin B 12. All of these different approaches have not yet led to an approved protein drug that is orally bioavailable.
  • WO 03/101484 Another approach to providing orally bioavailable proteins is described in WO 03/101484.
  • the C-terminal residue of the botulinum toxin heavy chain is linked to a polypeptide.
  • the C-terminal residue could accomplish transport through the epithelial membranes.
  • the hybrid protein it may be mixed with the auxiliary protein naturally surrounding the botulinum toxin.
  • WO 02/05844 describes the provision of orally available bioactive proteins and low molecular weight drugs incorporated into a complex of at least one hemagglutinin and possibly non-toxic, non-hemagglutinating protein (NTNH) of the botulinum toxin complexes of Clostridium botulinum are.
  • NTNH non-toxic, non-hemagglutinating protein
  • Figure 1 is a graph showing the result of a glucose tolerance test on rats. 4 animals were incorporated with 2 U insulin-Hc conjugate and 4 animals with 2 U insulin-Hc conjugate treated in the complex (insulin complex) by oral (gavage), after 60 min, the animals were charged with 2 g / kg glucose. 3 additional groups were treated with 0.1 U, 0.6 U, 2 U insulin ip and were also given 2 g / kg glucose at the same time. The glucose level was determined at intervals of about 30 minutes.
  • Figure 2 is a graph showing the result of comparing the effect of insulin-Hc conjugate, insulin-Hc conjugate integrated into the complex (insulin complex) and i.p. applied insulin.
  • the experimental conditions are identical to those in Figure 1.
  • the area under the curve of glucose concentrations (AUC) is shown.
  • protein complex refers to a vehicle with which other selected polypeptides can be transported into the blood system of humans and animals.
  • the protein complex consists of at least one hemagglutinin and possibly non-toxic, non-hemagglutinating protein (NTNH) of the botulinum toxin complexes of at least one of the Clostridium botulinum types A, B, C, D, E, F or G.
  • NTNH non-toxic, non-hemagglutinating protein
  • US Pat Hemagglutinins and NTNH are the Clostridium-derived proteins that naturally form the botulinum toxin complex with botulinum toxin.
  • the protein complex contains no botulinum toxin.
  • botulinum toxin complex means a naturally occurring type A, B, C, D, E, F or G protein aggregate from Clostridium botulinum comprising the botulinum toxin, hemagglutinins and non-toxic non-hemagglutinating protein (NTNH).
  • polypeptide or "selected polypeptide” as used herein means a peptide of at least 2 amino acids.
  • the polypeptide may be linear, circular or branched.
  • the polypeptide may consist of more than one amino acid chain, the chains e.g. can be linked together via a disulfide bond.
  • the polypeptides may further contain modified amino acids and the usual post-translational modifications such as glycosylation.
  • the polypeptides may be pharmacologically or immunologically active polypeptides or polypeptides used for diagnostic purposes, e.g. Be antibody.
  • carrier or “carrier” as used herein denotes the entire heavy chain (Hc) or an N-terminal fragment of the botulinum toxin heavy chain selected from botulinum toxin complexes of types A, B, C, D, E, F or G.
  • polypeptide-Hc conjugate refers to a carrier that is covalently linked to a selected polypeptide
  • insulin-Hc conjugate refers to a molecule consisting of insulin linked to the heavy Chain or its N-terminal fragment of botulinum toxin.
  • nucleic acid complex refers to a complex of protein complex in which an Hc conjugate is integrated.
  • Clostridium botulinum has developed an efficient mechanism to transport a protein via the oral route into an organism, where this protein is then taken up by its target cells.
  • This protein is the most toxic substance known so far: Clostridium botulinum toxin, also called botulinum toxin in the following.
  • botulinum toxin is present in a botulinum toxin complex with a number of other proteins expressed by Clostridium botulinum.
  • the botulinum toxin complex is administered orally, the high molecular weight neurotoxin botulinum toxin is absorbed in the gut and then reaches the target cell, the motor neuron on the motor endplate. At its site of action, the neurotoxin prevents the release of acetylcholine and thus leads to the paralysis of the respective muscle.
  • Clostridium botulinum is divided into 7 serogroups that are distinguished by their toxins: type A, B, C, D, E, F, G.
  • the toxins are proteins with a molecular weight of about 150,000 daltons (Da).
  • the botulinum toxin complex is usually taken up with contaminated food, enterally absorbed and reaches its site of action, the motor end plate.
  • the botulinum toxin consists of two subunits.
  • the two subunits have a different function: the heavy chain (molecular weight 100 kDa) binds highly specifically to the nerve cell and later allows the translocation of the light chain into the cytoplasm of the cell.
  • the heavy chain (Hc) is linked in the native botulinum toxin via a disulfide bridge to the light chain (Lc).
  • the light chain serves as a protease that cuts proteins (SNARE proteins) responsible for the fusion of secretory vesicles with the nerve cell membrane. The secretory vesicles thus can not release acetylcholine: the activation of the muscle is blocked.
  • the two chains are formed from the originally synthesized polypeptide by proteolytic cleavage.
  • proteolytic cleavage In some types of clostridium cleavage is already carried out by Clostridia's own proteases (type A, C, part B), while in other types, the cleavage takes place only in the digestive tract (trypsin) or tissue of the recipient.
  • the heavy chain in isolated form and without contamination of light chain or total toxin is completely non-toxic, it alone can not block the release of acetylcholine in nerve cells.
  • the clostridia synthesize a number of other proteins that form a complex (botulinum toxin complex) with the botulinum toxin, which is stable in an acidic environment and protects the neurotoxin from denaturation and proteolytic degradation and also allows uptake by the intestinal mucosa.
  • the other proteins are a series of hemagglutinins and a non-toxic, non-hemagglutinating protein (NTNH) having a molecular weight of about 120,000 Da.
  • the other proteins form the protein complex.
  • the botulinum toxin complex of type A described the following hemagglutinins: Ha2 at about 16,900 Da, Ha3a at about 21,000 Da, Ha3b at about 52,000 Da, and HaI at about 35,000 Da.
  • the botulinum toxin complexes of types B to G are based on a similar scheme.
  • the type B botulinum toxin complex Besides NTNH, HA-70 having a molecular weight of about 70,000 Da, Ha-17 having a molecular weight of about 17,000 Da and Ha-33 having a molecular weight of about 33,000 Da are described (Bhandari, M. et al., (1997) Current Microbiology 35, pp. 207-214).
  • the polypeptide can be chemically coupled to the botulinum toxin heavy chain and thus integrated into a protein complex consisting of at least one complex protein.
  • a variety of chemical methods are available.
  • binding with the carrier, the heavy chain can take place.
  • Suitable coupling agents include, for example, reagents such as SPDP (N-succinimidyl 3- [2- pyridyldithiojpropionate) or DTDP (4,4'-dithiodipyridine) in which only one disulfide bridge is attached without a spacer between the proteins.
  • SPDP N-succinimidyl 3- [2- pyridyldithiojpropionate
  • DTDP 4,4'-dithiodipyridine
  • This linkage has the advantage that it can be administered in vivo under reducing conditions, e.g. in the cytoplasm can be cleaved via the thioredoxin system.
  • the coupling is chosen so that the incorporation of the heavy chain is not impaired in the protein complex and the biological activity of the polypeptide is maintained.
  • the heavy chain linkage with the polypeptide can be achieved by synthesizing both peptides as a recombinant fusion protein in a
  • the polypeptides associated with the carrier are preferably pharmacologically or immunologically active polypeptides orally administered with the aid of the protein complex of the invention, which may be therapeutically or preventively effective.
  • the selected polypeptides may be, for example, hormones, cytokines, enzymes, growth factors, antigens, antibodies, inhibitors, receptor agonists or antagonists, or coagulation factors. It does not matter whether the polypeptides were recombinantly produced or isolated from their natural sources.
  • Preferred polypeptides are insulin, erythropoietin, interferons, interleukins, HW protease inhibitors, GM-CSFC granulocyte / macrophage-stimulating factor), nerve growth factor (NGF), platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), plasminogen Activators, eg TPA (tissue plasminogen activator), renin inhibitors, human growth factor, IGF (insulin-like growth factor), vaccines such as tetanus vaccine, hepatitis B vaccine, diphtheria vaccine, antibodies eg Herceptin (antibodies against Her2) , Antibodies against TNF (tumor necrosis factor), antibodies against EGF receptor, antibodies against VEGF, antibodies against IgE, Antibodies to CD IIa, calcitonin, urokinase, streptokinase, angiogenesis inhibitors, factor VIII, factor Xa antagonists, metalloproteinas
  • the polypeptides used for diagnostic purposes may be, for example, antibodies or ligands 5, which polypeptides may be labeled.
  • a marker is any mark in question, which can be detected in the body of the human or animal.
  • Preferred labels are isotopes, for example C 13 , or radioactive labels.
  • the labeled antibodies can be used for the detection of tumors, the labeled ligands for the detection of eg pathological receptors.
  • the carrier linked to the polypeptide is incorporated into the protein complex.
  • the protein complex is composed of at least one hemagglutinin and, if desired, at least one NTNH.
  • the hemagglutinins and the NTNH are selected from the naturally occurring botulinum toxin complexes of types A, B, C, D, E, F or G.
  • the protein complex may also contain other than its natural composition, e.g. it can only be made up of hemagglutinin without the NTNH proteins.
  • the protein complex may be composed of less hemagglutinin species than the naturally occurring botulinum toxin complex, preferably of three different types of hemagglutinin, preferably of two, more preferably of
  • the protein complex may or may not each contain the NTNH protein.
  • the protein complex may also be composed of a mixture of one or more types of hemagglutinin and / or NTNH proteins of the various serotypes.
  • Clostridium botulinum of types A, B, C, D, E, F or G for example a protein complex with HaI, Ha2, Ha3a, Ha3b and NTNH of Clostridium botulinum of types A, B, C, D, E, F or G, for example a protein complex with HaI, Ha2, Ha3a, Ha3b and NTNH of Clostridium botulinum of types A, B, C, D, E, F or G, for example a protein complex with HaI, Ha2, Ha3a, Ha3b and NTNH of
  • Clostridium botulinum type B Clostridium botulinum type B.
  • the protein complex may also be composed of
  • HaI, Ha2, Ha3a and NTNH from HaI, Ha2, Na3b and NTNH, and from HaI and Ha3a, Ha3b and NTNH, further from Ha2, Ha3a, Ha3b and NTNH, from HaI, Ha2 and NTNH, from HaI,
  • the protein complex can be composed of one of the hemagglutinins and NTNH, moreover, the protein complex can be composed of the listed combinations of hemagglutinins without NTNH.
  • Protein complexes of type B are further preferred Protein complexes of hemagglutinins and / or NTNH types A, C, D, E, F or G.
  • a further aspect of the present invention is to provide a process for the production of the protein complex according to the invention, comprising the following steps: a) separate isolation of at least one botulinum toxin complex of the type A, B, C, D, E, F or G from Clostridium botulinum at a pH in the range of about 2.0 to about 6.5, b) increasing the pH to a value in the range of about 7.0 to about 10.0, c) separating the respective botulinum toxin from the Complex proteins by chromatographic methods, d) mixing the complex proteins obtained in step c) with a selected polypeptide Hc conjugate, or e) separating the complex proteins obtained in step c) and mixing at least one complex protein with a polypeptide Hc conjugate, f) Dialyzing the mixture of step d) or e) against a buffer at a pH in the range of about 6.5 to about 2.0, preferably in the range of about 4.0 to about 6.0, in particular bev preformed at 6.0.
  • the complex proteins can be isolated from the natural botulinum toxin complexes.
  • An exemplary method of isolation is as follows: First, the botulinum toxin complex is prepared from clostridia at acidic pH, preferably at a value in the range of about 2.0 to about 6.5, more preferably in the range of about 4.0 to about 6.5, more preferably at pH 6.0, isolated. After raising the pH to a value in the range of about 7.0 to about 10.0, preferably to a pH in the range of about 7.0 to about 8.0, the botulinum toxin becomes chromatographic methods common in protein chemistry separated. This procedure is feasible because the complex is stable at pH ⁇ 6.5, decomposes at neutral or alkaline pH, and releases the toxin.
  • the toxin-free complex proteins can then be treated with a polypeptide-Hc conjugate and the pH by dialysis against a customary in protein chemistry buffer, more preferably a phosphate, acetate or citrate buffer to a pH in the range of about 2.0 to about 6.5, preferably in the range of about 4.0 to about 6.0, particularly preferably reduced to pH 6.0.
  • a protein complex is thus formed which contains the polypeptide-Hc conjugate and thus ensures the oral bioavailability of the selected polypeptide.
  • the complex proteins can also be recombinant due to their known DNA sequences be prepared by recombinant DNA techniques in specific host organisms.
  • the complex proteins thus produced may also have modifications, ie they may be derivatives of complex proteins. Modifications here mean not only deletions, additions, insertions or substitutions but also also chemical modifications of amino acids, eg methylations, or acetylations, as well as post-translational modifications, eg glycosylations or phosphorylations.
  • the expression of desired proteins in different hosts is well known to those of ordinary skill in the art and need not be described separately here. In this case, the complex proteins required for the protein complex can be expressed separately or simultaneously in a host organism.
  • the complex proteins can be isolated and spiked with the selected polypeptide conjugate according to the procedure described above.
  • the selected polypeptide HC conjugate may be expressed as a fusion protein together with the complex proteins in the host organism simultaneously. Particularly preferred is the simultaneous or separate production of the respective complex proteins together with the selected polypeptide-Hc conjugate via a YAC in yeast.
  • the protein complexes of the invention may also be composed of a mixture of recombinantly produced and isolated from natural botulinum toxin complexes complex proteins.
  • Example 1 Isolation of the Clostridium botulinum Heavy Chain Toxin Type A
  • Clostridium botulinum Toxin Type A (strain ATCC 3502) was cultured according to published procedures with the modifications listed below (see Gupta & Sathyamoorthy, 1984, Toxicon 22, pp. 415). 424). After 72 hours of growth, the toxin was precipitated by adding 3N sulfuric acid. After extraction of the precipitate and separation of nucleic acids, the toxin was precipitated by means of ammonium sulfate. Solubilization and dialysis were followed by DEAE-Sepharose chromatography (2.6x15 cm) at pH 6.0.
  • the bound toxin was eluted with 150 mM NaCl, dialyzed against 50 mM Tris / HCl and subjected to further ion exchange chromatography on a Sepharose Q column (2.6 ⁇ 10.0 cm).
  • the neurotoxin was eluted with a NaCl gradient (0-300 mM NaCl).
  • the neurotoxin-containing Fractions were pooled and dialyzed against 10 mM NaPhosphate pH 7.0.
  • the dialysate was applied to a Sepharose S column (1.6x11 cm) and eluted with your NaCl gradient (0-300 mM NaCl). Chromatography yielded the high purity neurotoxin.
  • the isolation of the heavy chain from the neurotoxin was carried out analogously to the published literature with the modifications listed below (compare Kozaki et al., 1981, J. Med. Bio BioV 34, pp. 61-68).
  • the highly pure neurotoxin type A was dialyzed against borate / phosphate buffer pH 8.5 and bound to a column (1 ⁇ 5 cm) filled with QAE-Sephadex. After washing with the borate / phosphate buffer, which additionally contained 10 mM DTE, the column was incubated overnight with 3 mL borate / phosphate buffer, which additionally contained 150 mM DTE and 2 M urea.
  • the heavy chain was eluted with the same buffer, mixed with 200 mM NaCl.
  • the pooled fractions were pumped four times over an affinity column.
  • the affinity column was filled with Sepharose to which an antibody to the light chain of Clostridium botulinum toxin type A was coupled. After this chromatography, a heavy chain was available that contained no light chain or native toxin contaminants. Even in high concentrations, no activity was shown in the activity test (mouse diaphragmatic assay).
  • Clostridium botulinum type B complex proteins are isolated after fermentation of Clostridium botulinum type B (strain okra) by a published method (see Evans et al., 1986, European Journal of Bioch. 154, 409-416), with some steps modified:
  • Example 1 after extraction of the acid-precipitated biomass, the nucleic acids were precipitated from the extract and the toxic Botulinumtoxin complex precipitated from the supernatant with ammonium sulfate.
  • the precipitate was taken up in 0.05 M sodium citrate + 1 mM EDTA pH 5.5 and, after dialysis, purified via DEAE-S ephad ex-chromatography, whereby the high molecular complex on the column (5 ⁇ 12 cm) was not bound and passed quantitatively through the column.
  • the complex-containing eluate was chromatographed on a Sepharose Q column after dialysis against 50 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA pH 7.9, whereby the complex proteins on the column were not bound while the neurotoxin remained bound on the column and eluted first with a salt gradient has been. Further purification of the complex proteins took place on a Q Hyper D column (2.6 ⁇ 13 cm) containing the same buffer (50 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA) was equilibrated. The toxin-free protein complex was eluted with a sodium chloride gradient (0-300 mM NaCl).
  • SPDP N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate, Pierce
  • 500 ⁇ L DMF 500 ⁇ L DMF
  • 274 ⁇ L of this solution was added to 6.3 mL of insulin derivative (adjusted to pH 8.3) added and the mixture incubated for 1 1 A h at room temperature on a blender.
  • Example 5 Incorporation of the insulin-Hc conjugate into the protein complex from Clostridium botulinum type B
  • Example 6 Testing of an Insulin Neocomplex in Rats in the Glucose Tolerance Test The efficacy of an insulin-Hc conjugate incorporated into a protein complex (hereinafter referred to as insulin neo-complex) after oral administration was tested in animals in rats.
  • insulin neo-complex a protein complex
  • Groups of 4 rats were treated with either insulin neo-complex or with free insulin-Hc conjugate (without complex proteins). As control served untreated animals. The dose of insulin was the same in both groups and was 2 U / animal. The solutions were per c lundsonde vera re c t. Further, ontro w ened 0.1 U, 0.6 U un ⁇ to U ui u ⁇ n administered ip. One hour after administration of insulin neocomplex and free insulin-Hc conjugate, the animals were challenged with glucose (2 g / kg per oral). At this time also the injection of the positive control (0.1 U, 0.6 U and 2.0 units insulin) took place. After 30, 60, 120 and 180 minutes, blood was taken and the glucose level was determined.
  • the positive control 0.1 U, 0.6 U and 2.0 units insulin
  • the glucose concentration in the animals treated with insulin-Hc conjugate was the same as in the control: the concentration increased strongly up to 60 minutes. It can be concluded that an insulin-Hc conjugate alone has no effect on the insulin level, the administration of insulin-Hc conjugate without incorporation into the protein complex is therefore not suitable to make insulin orally bioavailable.
  • the c-terminal fragment of the heavy chain (M r "50 kD, also referred to below as HI fragment) of botulinum toxin type A was expressed recombinantly in E. coli.
  • the DNA sequence for the c-terminal fragment of botulinum toxin type A As 871-
  • 100 ⁇ g of the toxin-free complex proteins of C. botulinum type B were mixed with 200 ⁇ g (340 ⁇ L) of the recombinant c-terminal fragment and dialysed for 3 days at 2-8 ° C. against 50 mM NaPhosphate pH 6.0 with 150 mM NaCl. It was then made up to 450 ⁇ L with H 2 O and precipitated by the addition of 150 ⁇ l of 4 M ammonium sulphate. Under these precipitation conditions, the c-terminal fragment which is not incorporated into the protein complex remains in solution, while the protein complex (with or without incorporated c-terminal fragment) precipitates quantitatively.
  • the pellet was spun down and resuspended in 150 ⁇ L 50 mM NaPhosphate, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 6.0. 100 ⁇ l was separated on a Biosep S-3000 gel filtration column into the complex and possibly as an impurity, unbound c-terminal fragment. Two peaks were eluted: the , first peak (12.2 min) represents the protein complex. A very short peak represents the free c-terminal fragment fragment. The first peak was analyzed in SDS-PAGE, only the complex proteins were present, so the c-terminal fragment was not integrated into the complex but remained in the ammonium sulfate precipitate unbound in solution. The c-terminal fragment of botulinutoxin can therefore not be integrated into the complex.
  • Example 8 Comparison of the biological activity of insulin HI-congenate and insulin-Hc conjugate
  • the c-terminal fragment (HI fragment) of the botulinum toxin type A heavy chain was prepared as described in Example 7. After derivatization, 13 mg HI fragment were spiked with 8 mg insulin SPDP. The production of insulin SPDP proceeded analogously to Example 4. After incubation for 24 hours at 4 ° C, uncoupled insulin SPDP was separated by dialysis against 50 mM Tris / HCl, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA.
  • Groups of 4 rats were treated either with insulin-Hc conjugate (Example 5) or with insulin-HI conjugate + complex proteins or with saline.
  • the dose of the first two groups corresponded to 2 U of insulin per animal. 1 h after administration was loaded with glucose (0.5 g / kg i.p.). Measurement of blood sugar levels in the animals receiving saline at 30 min yielded 170 ⁇ 12 mg / dL, while the increase in the group receiving the HC conjugate neocomplex only increased to 115 ⁇ 14 mg / dL.
  • the initial value at the time of glucose injection was 85 ⁇ 14 mg / dL.
  • the Hl-insulin conjugate with the complex proteins thus showed no effect in animal experiments.
  • Example 9 Use of Insulin Conjugate with C-Terminally Shortened Heavy Chain To obtain a c-terminal truncated chain of 30 amino acids, chromosomal DNA was prepared from a culture of C. botulinum type A (ATCC 3502). By PCR
  • Amplification was a gene coding for the light chain gene, which additionally contained a thrombin interface in the loop region, in the plasmid pQE60 (pQE-BoNT (A) -L) cloned.
  • pQE-BoNT (A) -L plasmid pQE60
  • a gene fragment from the chromosomal DNA was generated, which encoded for the 30 amino acids c-terminal truncated chain.
  • the gene fragment was cloned at the 3 'end of the gene fragment coding for BoNT (A) -L into the expression plasmid PQE-BoNT (A) -L (pQE-BoNT (A) -L H30min).
  • Example 1 coli expression strain M15 [pREP4] (Qiagen) was transformed with the plasmid. After induction with 500 ⁇ M IPTG (25 ° C. overnight), the cells were lysed and chromatographed on a Ni-NTA agarose column.
  • the heavy chain H30min as described in Example 1, was isolated from the toxin thus shortened by 30 amino acids.
  • the heavy chain H30min was conjugated with insulin analogously to Example 4 and integrated into the toxin-free complex of C. botulinum type B, analogously to Example 5.
  • the neo-complex thus synthesized was tested in the glucose tolerance test on 4 animals compared to a control without complex (according to Example 8).
  • the blood sugar level had increased to 110 ⁇ 18 mg / dL after 30 min, while it was increased to 168 + 14 mg / dL in the control animals (initial value 90 ⁇ 5 mg / dL).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Proteinkomplex bestehend aus mindestens einem Hämagglutinin aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder G und einem Polypeptid-Hc-Konjugat, wobei das Polypeptid-Hc-Konjugat aus einem ausgewählten Polypeptid verbunden mit der schweren Kette oder dessen N-terminalem Fragment von Botulinumtoxin besteht.

Description

Carrier für Arzneimittel zur Gewinnung der oralen Bioverfügbarkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Proteinkomplex bestehend aus mindestens einem Hämagglutinin aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder G und einem Polypeptid-Hc-Konjugat, wobei das Polypeptid-Hc-Konjugat aus einem ausgewählten Polypeptid verbunden mit der schweren Kette oder dessen N-terminalem Fragment von Botulinumtoxin besteht.
Eine Vielzahl von pharmazeutischen Wirkstoffen ist zwar hochaktiv, ihr therapeutischer Einsatz wird aber erheblich dadurch beeinträchtigt, dass diese Substanzen nicht oral sondern nur parenteral - also per Injektion - verabreicht werden können. Insbesondere die orale Verabreichung von Proteinwirkstoffen scheitert daran, dass diese Substanzen über den oralen Weg nicht an ihren Wirkort gelangen können. Die Proteine stoßen nach oraler Gabe auf zwei schwer überwindbare Hürden: die denaturierenden Bedingungen im Magen-Darm-Trakt führen zu einer Inaktivierung des Proteins, eine Vielzahl von Proteasen sorgt für den Abbau von Polypeptiden und selbst wenn ein Protein resistent gegen diese Bedingungen ist, vermag eine hochmolekulare Substanz nicht, die Barriere der Darmmucosa zu überwinden, um ins Blut überzutreten und an den Wirkort zu gelangen. Proteine werden im Magen bzw. im Dünndarm von Proteasen gespalten und die Spaltprodukte, Aminosäuren und Peptide, resorbiert oder ausgeschieden. Proteinarzneimittel sind somit oral verabreicht wirkungslos.
Zahlreiche Anstrengungen wurden unternommen, um diesen Nachteil zu beseitigen und um Proteinwirkstoffe oral bioverfügbar zu machen. Einige Ansätze seien hier kurz erwähnt: Es wurde versucht, durch Mischungen von Proteaseinhibitoren den Wirkstoff vor dem proteolytischen Abbau zu schützen. So wurden gleichzeitig mit Proteinwirkstoff Proteaseinhibitoren wie Aprotinin, Bestatin, Puromycin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor verabreicht, damit sollten der Abbau verhindert und der Proteinwirkstoff unbeschadet resorbierbar sein.
Es wurde ebenfalls versucht, durch Formulierungen den lokalen pH- Wert im Magen/Darm zu modulieren. Auch am Proteinwirkstoff selbst hat man angesetzt, um durch chemische Modifikation von Aminosäuren deren Stabilität gegen Abbau sowie die Resorbierbarkeit zu erhöhen. Letzteres wollte man durch Erhöhung der Lipophilie erreichen (z. B. durch Palmitoylierung). Als Beispiel sei hier die Kopplung von Insulin mit einem amphiphilen Oligomer genannt (Hexyl-Insulin monoconjugate der Fa. NOBEX Corporation). Ein weiterer Ansatz besteht darin, die Durchlässigkeit der Mukosa zu erhöhen, z. B. durch die Gabe von Chelatoren bzw. oberflächenaktiven Substanzen wie Natriumlaurylsulfat, Natriumdeoxycholat. Zu diesem Konzept gehört auch die gleichzeitige Verabreichung von konzentrierten niedermolekularen Trägermolekülen (z. B. 4-(4-2-hydroxybenzoyl) aminophenyl)Buttersäure). Ein weiterer Ansatz versucht, spezifische Transportmechanismen in der Darmwand auszunutzen. So gibt es für die Resorption von Vitamin B 12 einen Transportmechanismus, der für Proteinwirkstoffe genutzt werden soll, indem die Wirkstoffe an Vitamin B 12 gekoppelt werden. All diese unterschiedlichen Ansätze haben bisher noch nicht zu einem zugelassenen Proteinarzneimittel geführt, das oral bioverfügbar ist.
Ein weiterer Ansatz zur Bereitstellung von oral bioverfügbaren Proteinen ist in WO 03/101484 beschrieben. Entsprechend der Beschreibung wird der C-terminale Rest der schweren Kette von Botulinumtoxin mit einem Polypeptid verbunden. Der C-terminale Rest könne den Transport durch die epithelialen Membranen bewerkstelligen. Für die orale Verabreichung des Hybridproteins kann dieses mit den natürlicherweise das Botulinumtoxin umgebenden Hilfsproteinen gemischt werden.
Ferner beschreibt die WO 02/05844 die Bereitstellung von oral bio verfugbaren Proteinen und niedermolekularen Pharmaka, die in einen Komplex aus mindestens einem Hämagglutinin und evtl. nicht-toxischem, nicht-hämagglutinierendem Protein (NTNH) der Botulinum-Toxin- Komplexe von Clostridium botulinum eingebaut sind. Der Einbau von Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von <50 kDa erwies sich jedoch für eine gewinnbringende Vermarktung als nicht effektiv genug.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem Polypeptide oral bioverfügbar gemacht werden können.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die nachfolgenden Abbildungen erläutern die Erfindung.
Abbildung 1 zeigt in einem Diagramm das Ergebnis eines Glucose-Toleranztests an Ratten. 4 Tiere wurden mit 2 U Insulin-Hc-Konjugat und 4 Tiere mit 2 U Insulin-Hc-Konjugat eingebaut in den Komplex (Insulin-Komplex) per oral (Schlundsonde) behandelt, nach 60 min wurden die Tiere mit 2 g/kg Glucose belastet. 3 weitere Gruppen wurden mit 0.1 U, 0.6 U, 2 U Insulin i.p. behandelt und bekamen gleichzeitig ebenfalls 2 g/kg Glucose verabreicht. Im Abstand von ca. 30 min wurde der Glucosespiegel bestimmt.
Abbildung 2 zeigt in einem Diagramm das Ergebnis des Vergleichs der Wirkung von Insulin-Hc- Konjugat, Insulin-Hc-Konjugat integriert in den Komplex (Insulin-Komplex) und i.p. appliziertem Insulin. Die Versuchsbedingungen sind identisch mit denen in Abbildung 1. Dargestellt ist die Fläche unter der Kurve der Glucosekonzentrationen (AUC).
Der hier verwendete Begriff "Proteinkomplex" bezeichnet ein Vehikel, mit dem andere ausgewählte Polypeptide in das Blutsystem von Mensch und Tier transportiert werden können. Der Proteinkomplex besteht dabei aus wenigstens einem Hämagglutinin und evtl. nicht¬ toxischem, nicht-hämagglutinierendem Protein (NTNH) der Botulinum-Toxin-Komplexe aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder G. Die Hämagglutinine und das NTNH stellen die in Clostridien vorkommenden Proteine dar, die natürlicherweise mit Botulinumtoxin den Botulinumtoxin-Komplex bilden. Der Deutlichkeit halber sei hier vermerkt, dass der Proteinkomplex jedoch kein Botulinumtoxin enthält.
Der hier verwendete Begriff "Botulinumtoxin-Komplex" bedeutet ein natürlicherweise vorkommendes Proteinaggregat des Typs A, B, C, D, E, F oder G aus Clostridium botulinum, umfassend das Botulinumtoxin, Hämagglutinine und nicht-toxisches, nicht-hämagglutinierendes Protein (NTNH).
Der hier verwendete Begriff "Polypeptid" oder "ausgewähltes Polypeptid" bedeutet ein Peptid aus mindestens 2 Aminosäuren. Das Polypeptid kann linear, zirkulär oder verzweigt sein. Ferner kann das Polypeptid aus mehr als einer Aminosäurekette bestehen, wobei die Ketten z.B. über eine Disulfidbindung miteinander verbunden sein können. Die Polypeptide können ferner modifizierte Aminosäuren und die üblichen posttranslationalen Modifikationen wie Glykosylierung enthalten. Die Polypeptide können pharmakologisch oder immunologisch aktive Polypeptide oder für diagnostische Zwecke verwendete Polypeptide z.B. Antikörper sein.
Der hier verwendete Begriff „Carrier" oder „Träger" bezeichnet die gesamte schwere Kette (Hc) oder ein N-terminales Fragment der schweren Kette von Botulinumtoxin ausgewählt aus den Botulinumtoxin-Komplexen der Typen A, B, C, D, E, F oder G. Der hier verwendete Begriff „Polypeptid-Hc-Konjugat", „Hc-Koηjugat" oder „Konjugat" bezeichnet einen Carrier, der kovalent mit einem ausgewählten Polypeptid verbunden ist. Z.B. bezeichnet Insulin-Hc-Konjugat ein Molekül bestehend aus Insulin verbunden mit der schweren Kette oder dessen N-terminalem Fragment von Botulinumtoxin.
Der hier verwendete Begriff "Neokomplex" bezeichnet einen Komplex aus Proteinkomplex in dem ein Hc -Konjugat integriert ist.
Das Bakterium Clostridium botulinum hat einen effizienten Mechanismus entwickelt, um ein Protein über den oralen Weg in einen Organismus zu schleusen, wo dieses Protein dann von seinen Zielzellen aufgenommen wird. Bei diesem Protein handelt es sich um die giftigste Substanz, die man bisher kennt: Clostridium botulinum Toxin, im nachfolgenden auch Botulinumtoxin genannt. Natürlicherweise liegt Botulinumtoxin in einem Botulinumtoxin- Komplex mit einer Reihe von weiteren von Clostridium botulinum exprimierten Proteinen vor. Wird der Botulinumtoxin-Komplex oral verabreicht, wird das hochmolekulare Nervengift Botulinumtoxin im Darm resorbiert und gelangt dann zur Zielzelle, dem Motorneuron an der motorischen Endplatte. An seinem Wirkort verhindert das Neurotoxin die Ausschüttung von Acetylcholin und führt damit zur Paralyse des jeweiligen Muskels.
Clostridium botulinum wird in 7 Serogruppen eingeteilt, die aufgrund ihrer Toxine unterschieden werden: Typ A, B, C, D, E, F, G. Bei den Toxinen handelt es sich um Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 150.000 Dalton (Da). Der Botulinumtoxin-Komplex wird üblicherweise mit kontaminierten Lebensmitteln aufgenommen, enteral resorbiert und gelangt zu seinem Wirkort, der motorischen Endplatte.
Das Botulinumtoxin besteht aus zwei Untereinheiten. Die beiden Untereinheiten haben eine unterschiedliche Funktion: die schwere Kette (Molekulargewicht 100 kDa) bindet hochspezifisch an die Nervenzelle und ermöglicht später die Translokation der leichten Kette in das Cytoplasma der Zelle. Die schwere Kette (Hc) ist im nativen Botulinumtoxin über eine Disulfidbrücke mit der leichten Kette (Lc) verknüpft ist. Die leichte Kette dient als Protease, die Proteine (SNARE- Proteine) schneidet, die für die Fusion von sekretorischen Vesikeln mit der Nervenzellmembran verantwortlich sind. Die sekretorischen Vesikel können somit kein Acetylcholin ausschütten: die Aktivierung des Muskels ist blockiert. Die beiden Ketten entstehen aus dem ursprünglich synthetisierten Polypeptid durch proteolytische Spaltung. Bei einigen Clostridientypen erfolgt die Spaltung bereits durch Clostridien-eigene Proteasen (Typ A, C, teilweise B), während bei anderen Typen die Spaltung erst im Verdauungstrakt (Trypsin) oder Gewebe des Rezipienten abläuft. Die schwere Kette in isolierter Form und ohne Verunreinigung von leichter Kette oder Gesamttoxin ist völlig untoxisch, sie allein vermag in Nervenzellen die Ausschüttung von Acetylcholin nicht- zu blockieren.
Die Clostridien synthetisieren eine Reihe von weiteren Proteinen, die mit dem Botulinumtoxin einen Komplex (Botulinumtoxin-Komplex) bilden, der im sauren Milieu stabil ist und das Neurotoxin vor Denaturierung und proteolytischem Abbau schützt und außerdem die Aufnahme durch die Darmmukosa ermöglicht.
Bei den weiteren Proteinen, die im nachfolgenden Komplexproteine genannt werden, handelt es sich um eine Reihe von Hämagglutininen und einem nicht-toxischen, nicht-hämagglutinierenden Protein (NTNH), das ein Molekulargewicht von etwa 120.000 Da aufweist. Die weiteren Proteine bilden den Proteinkomplex. Bei dem Botulinumtoxin-Komplex des Typ A wurden folgende Hämagglutinine beschrieben: Ha2 mit etwa 16.900 Da, Ha3a mit etwa 21.000 Da, Ha3b mit etwa 52.000 Da und HaI mit etwa 35.000 Da.
Die Botulinumtoxin-Komplexe der Typen B bis G sind nach einem ähnlichem Schema aufgebaut. Als Beispiel seien genannt der Botulinumtoxin-Komlex von Typ B. Neben dem NTNH sind hier HA-70 mit einem Molekulargewicht von etwa 70.000 Da, Ha- 17 mit einem Molekulargewicht von etwa 17.000 Da und Ha-33 mit einem Molekulargwicht von etwa 33.000 Da beschrieben (vgl. Bhandari, M. et al. (1997) Current Microbiology 35, pp. 207 - 214).
Ferner beschrieben East, A.K.et al. ((1994) System Appl. Microbiol. 17 306-312) die Sequenz von Ha-33 von Typ B im Vergleich mit der Sequenz von Typ A und C. Für die Typ C und Typ D sind neben den Ha 33 (= HaI) ebenfalls - analog Typ A - ein Ha3b mit einem Molekulargewicht von etwa 33.000 Da auch das Ha3b mit etwa 53.000 Da und Ha3a mit etwa 22-24.000 Da und Ha2 mit etwa 17.000 Da (vgl. Inoue, K. et al. (1999) Microbiology 145, pp. 2533 - 2542). errascnenderweise an en ie r in er in e ons i u ionsexper menten neraus, uass nur ie schwere Kette des Botulinumtoxins, also ohne die leichte Kette, alleine oder an ein Polypeptid gekoppelt, quantitativ in den Proteinkomplex eingebaut wird.
Das Polypeptid kann an die schwere Kette eines Botulinumtoxins chemisch gekoppelt und so in einen Proteinkomplex bestehend aus mindestens einem Komplexprotein integriert werden. -Zur Kopplung des Proteins an die schwere Kette ist eine Vielzahl von chemischen Methoden verfügbar. Es gibt ein breites Spektrum von bifunktionellen Reagentien, die eine Verknüpfung von zwei verschiedenen Proteinen ermöglichen. Bevorzugt werden Reagentien eingesetzt, die eine Disulfidbrücke mit einem Cystein des Kopplungspartners knüpfen. Im nächsten Schritt kann dann die Bindung mit dem Carrier, der schweren Kette, erfolgen. Geeignet für derartige Kopplung sind zum Beispiel Reagentien wie SPDP (N-Succinimidy 3-[2- Pyridyldithiojpropionat) oder DTDP (4,4' Dithiodipyridine), bei dem lediglich eine Disulfidbrücke ohne einen Spacer zwischen den Proteinen geknüpft wird. Diese Verknüpfung hat den Vorteil, dass sie in vivo unter reduzierenden Bedingungen z.B. im Cytoplasma über das Thioredoxinsystem gespalten werden kann. Die Kopplung wird dabei so gewählt, dass der Einbau der schweren Kette in den Proteinkomplex nicht beeinträchtigt wird und die biologische Aktivität des Polypeptids erhalten bleibt. Alternativ kann die Verbindung der schweren Kette mit dem Polypeptid dadurch erreicht werden, dass beide Peptide als rekombinantes Fusionsprotein in einem geeigneten Expressionssystem synthetisiert werden.
Die mit dem Carrier verbundenen Polypeptide sind vorzugsweise pharmakologisch oder immunologisch aktiven Polypeptide, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oral verabreicht werden, die therapeutisch oder präventiv wirksamen sein können. Die ausgewählten Polypeptide können z.B. Hormone, Cytokine, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Antigene, Antikörper, Inhibitoren, Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten oder Gerinnungsfaktoren sein. Dabei spielt es keine Rolle, ob die Polypeptide rekombinant hergestellt oder aus ihren natürlichen Quellen isoliert wurden. Bevorzugte Polypeptide sind Insulin, Erythropoetin, Interferone, Interleukine, HW-Protease-Inhibitoren, GM- CSFCGranulocyte/Makrophage-stimulating factor), NGF (Nerve growth factor), PDGF (Platelet derived growth factor), FGF (fibroblast growth factor), Plasminogen-Aktivatoren, z.B. TPA (Tissue Plasminogen Activator), Renin-Inhibitoren, humaner Wachstumsfaktor, IGF (Insulin- like Growth Factor), Impfstoffe wie z.B. Tetanus- Vaccin, Hepatitis B Vaccin, Diphterie-Vaccin, Antikörper z.B. Herceptin (Antikörper gegen Her2), Antikörper gegen TNF (Tumor Necrose Factor), Antikörper gegen EGF-Receptor, Antikörper gegen VEGF, Antikörper gegen IgE, Antikörper gegen CD IIa, Calcitonin, Urokinase, Streptokinase, Angiogenese-Inhibitoren, Faktor VIII, Factor Xa- Antagonisten, Metalloproteinase-Inhibitoren.
Die für diagnostische Zwecke verwendeten Polypeptide können z.B. Antikörper oder Liganden 5 sein, wobei die Polypeptide mit einer Markierung versehen sein können. Als Markierung kommt jede Markierung in Frage, die im Körper des Menschen oder Tieres nachgewiesen werden kann. Bevorzugte Markierungen sind Isotope, z.B. C13, oder radioaktive Markierungen. Die markierten Antikörper können zum Nachweis von Tumoren, die markierten Liganden zum Nachweis von z.B. pathologischen Rezeptoren verwendet werden.
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Der mit dem Polypeptid verbundene Carrier wird in den Proteinkomplex eingebaut. Der Proteinkomplex ist aufgebaut aus mindestens einem Hämagglutinin und falls erwünscht mindestens einem NTNH. Die Hämagglutinine und die NTNH sind dabei ausgewählt aus den natürlicherweise vorkommenden Botulinumtoxin-Komplexen der Typen A, B, C, D, E, F oder G
15 von Clostridium botulinum. Der Proteinkomplex kann jedoch auch eine andere als seine natürliche Zusammensetzung enthalten, z.B. kann er nur aus Hämagglutinin ohne die NTNH- Proteine aufgebaut sein. Ferner kann der Proteinkomplex aus weniger Hämagglutininarten als der natürlicherweise vorkommende Botulinumtoxin-Komplex aufgebaut sein, vorzugsweise aus drei verschiedenen Hämagglutininarten, vorzugsweise aus zwei, insbesondere bevorzugt aus
10 einer Hämagglutininart, wobei der Proteinkomplex jeweils das NTNH-Protein enthalten kann oder nicht. Der Proteinkomplex kann ferner aus einem Gemisch eines oder mehrerer Hämagglutininarten und/oder NTNH-Proteinen der verschiedenen Serotypen aufgebaut sein.
Bevorzugt sind Proteinkomplexe, die den natürlicherweise vorkommenden Proteinkomplexen
?5 (ohne Botulinumtoxin) aus Clostridium botulinum der Typen A, B, C, D, E, F oder G entsprechen, beispielsweise ein Proteinkomplex mit HaI, Ha2, Ha3a, Ha3b und NTNH von
Clostridium botulinum Typ B. Der Proteinkomplex kann außerdem zusammengesetzt sein aus
HaI, Ha2, Ha3a und NTNH, aus HaI, Ha2, Na3b und NTNH, sowie aus HaI und Ha3a, Ha3b und NTNH, des weiteren aus Ha2, Ha3a, Ha3b und NTNH, aus HaI, Ha2 und NTNH, aus HaI,
K) Ha3a und NTNH, aus HaI, Ha3b und NTNH, aus Ha2, Ha3a und NTNH, aus Ha2, Ha3b und
NTNH aus Ha3a, Ha3b und NTNH oder aus weiteren beliebigen Kombinationen der aufgeführten Komplexproteine. Der Proteinkomplex kann sich ferner zusammensetzen aus einem der Hämagglutinine und NTNH, außerdem kann sich der Proteinkomplex zusammensetzen aus den aufgeführten Kombinationen der Hämagglutinine ohne NTNH.
»5 Entsprechend der beispielhaften Proteinkomplexe des Typs B sind ferner bevorzugt Proteinkomplexe aus den Hämagglutininen und/oder NTNH der Typen A, C, D, E, F oder G.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes, umfassend die folgenden Schritte: a) getrennte Isolierung von wenigstens einem Botulinumtoxin-Komplex des Typ A, B, C, D, E, F oder G aus Clostridium botulinum bei einem pH- Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 6,5, b) Erhöhen des pH-Wertes auf einen Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 10,0, c) Abtrennen des jeweiligen Botulinumtoxins von den Komplexproteinen mittels chromatographischer Verfahren, d) Mischen der in Schritt c) erhaltenen Komplexproteine mit einem ausgewählten Polypeptid- Hc-Konjugat, oder e) Auftrennen der in Schritt c) erhaltenen Komplexproteine und Mischen wenigstens eines Komplexproteins mit einem Polypeptid-Hc-Konjugat, f) Dialysieren des Gemisches aus Schritt d) oder e) gegen einen Puffer bei einem pH- Wert im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 2,0, vorzugsweise im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,0, insbesondere bevorzugt bei 6,0.
Die Komplexproteine können aus den natürlichen Botulinumtoxin-Komplexen isoliert werden. Ein beispielhaftes Verfahren zur Isolierung ist das Folgende: Zunächst wird der Botulinumtoxin- Komplex aus Clostridien bei saurem pH- Wert, vorzugsweise bei einem Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 6,5, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,5, insbesondere bevorzugt bei pH 6,0, isoliert. Nach Erhöhung des pH- Werts auf einen Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 10,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,0 wird das Botulinumtoxin über in der Proteinchemie übliche chromatographische Verfahren abgetrennt. Dieses Verfahren ist durchführbar, da der Komplex bei einem pH- Wert < 6,5 stabil ist, bei neutralen bzw. bei alkalischem pH-Wert zerfällt und das Toxin freigesetzt wird. Die Toxin-freien Komplexproteine können dann mit einem Polypeptid-Hc-Konjugat versetzt werden und der pH- Wert durch Dialyse gegen einen in der Proteinchemie üblichen Puffer, insbesondere bevorzugt einen Phosphat-, Acetat- oder Citratpuffer auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 6,5, vorzugsweise im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,0, insbesondere bevorzugt auf pH 6,0 reduziert werden. Dabei wird ein Proteinkomplex gebildet, der das Polypeptid-Hc-Konjugat enthält und so die orale Bioverfiigbarkeit des ausgewählten Polypeptids gewährleistet.
Andere in der Proteinchemie übliche chromatographische Verfahren, Konzentrierungsverfahren und Fällungen können für die Isolierung der Komplexproteine ebenfalls verwendet werden.
Die Komplexproteine können aufgrund ihrer bekannten DNA-Sequenzen auch rekombinant mittels DNA-Rekombinationstechniken in speziellen Wirtsorganismen hergestellt werden. Die so hergestellten Komplexproteine können ferner Modifikationen aufweisen, d.h. sie können Derivate der Komplexproteine sein. Modifikationen bedeuten dabei nicht nur Deletionen, Additionen, Insertionen oder Substitutionen sondern ferner auch chemische Modifikationen von Aminosäuren, z.B. Methylierungen, oder Acethylierungen, sowie posttranslationale Modifikationen, z.B. Glykosylierungen oder Phosphorylierungen. Die Expression -von gewünschten Proteinen in verschiedenen Wirten ist Wissen des Durchschnittsfachmanns und muß hier nicht gesondert beschrieben werden. Dabei können die für den Proteinkomplex benötigten Komplexproteine gesondert oder auch gleichzeitig in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Bevorzugt ist die Herstellung der rekombinanten Komplexproteine in Bakterien, z.B. in E. coli, Bacillus subtilis oder Clostridium difficile, oder in eukaryotischen Zellen, z.B. in CHO-Zellen, in Insektenzellen, z.B. unter Verwendung des Baculovirus-Systems, oder in Hefezellen. Die Komplexproteine können isoliert werden und nach dem wie vorstehend beschriebenen Verfahren mit dem ausgewählten Polypeptid-Konjugat versetzt werden. Ferner kann das ausgewählten Polypeptid-HC-Konjugat als Fusionsprotein zusammen mit den Komplexproteinen gleichzeitig in dem Wirtsorganismus exprimiert werden. Besonders bevorzugt ist die gleichzeitige oder getrennte Herstellung der jeweiligen Komplexproteine zusammen mit dem ausgewählten Polypeptid-Hc-Konjugat über ein YAC in Hefe.
Die erfindungsgemäßen Proteinkomplexe können ferner aus einer Mischung von rekombinant hergestellten und aus natürlichen Botulinumtoxin-Komplexen isolierten Komplexproteinen zusammengesetzt sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.
Beispiel 1 : Isolierung der schweren Kette von Clostridium botulinum Toxin Typ A Clostridium botulinum Toxin Typ A (strain ATCC 3502) wurde nach publizierten Verfahren mit den nachfolgend aufgeführten Abänderungen kultiviert (vgl. Das Gupta & Sathyamoorthy, 1984, Toxicon 22, pp. 415 - 424). Nach 72 h Wachstum wurde das Toxin durch Zugabe von 3 N Schwefelsäure gefällt. Nach Extraktion des Präzipitats und Abtrennung von Nukleinsäuren wurde das Toxin mittels Ammoniumsulfat gefällt. Nach Solubilisation und Dialyse erfolgte eine DEAE-Sepharose-Chromatographie (2,6x15 cm) bei pH 6.0. Das gebundene Toxin wurde mit 150 mM NaCl eluiert, gegen 50 mM Tris/HCl dialysiert und einer weiteren Ionaustauscher- Chromatographie über eine Sepharose Q-Säule (2.6x10.0 cm) unterzogen. Das Neurotoxin wurde mit einem NaCl-Gradienten (0-300 mM NaCl) eluiert. Die Neurotoxin-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und gegen 10 mM NaPhosphat pH 7.0 dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Sepharose S-Säule (1,6x11 cm) aufgetragen und mit deinem NaCl-Gradienten (0- 300 mM NaCl) eluiert. Die Chromatographie lieferte das hochreine Neurotoxin.
Die Isolierung der schweren Kette aus dem Neurotoxin erfolgte analog der publizierten Literatur mit den nachfolgend aufgeführten Abänderungen (vgl. Kozaki et al., 1981, J. Med Sei BioV 34, pp. 61 - 68). Dazu wurde das hochreine Neurotoxin Typ A gegen Borat/Phosphatpuffer pH 8.5 dialysiert und auf einer Säule (1 x 5 cm) gefüllt mit QAE-Sephadex gebunden. Nach dem Waschen mit dem Borat/Phosphatpuffer, der zusätzlich 10 mM DTE enthielt, wurde die Säule über Nacht mit 3 mL Borat/Phosphatpuffer inkubiert, der zusätzlich 150 mM DTE und 2 M Harnstoff enthielt. Nach der darauffolgenden Elution der leichten Kette mit dem Borat/Phosphatpuffer + 10 mM DTE + 2 N Harnstoff wurde die schwere Kette mit demselben Puffer versetzt mit 200 mM NaCl eluiert. Zur Abtrennung von Resten vom unvollständig abgetrennten aktiven Neurotoxin wurden die gepoolten Fraktionen viermal über eine Affϊnitätssäule gepumpt. Die Affinitätssäule war gefüllt mit Sepharose, an die ein Antikörper gegen die leichte Kette von Clostridium botulinum Toxin Typ A gekoppelt war. Nach dieser Chromatographie war eine schwere Kette verfügbar, die keine Verunreinigungen von leichter Kette oder nativem Toxin enthielt. Selbst in hohen Konzentrationen zeigte sich im Aktivitätstest (Maus-Zwerchfell-Assay) keine Aktivität.
Beispiel 2: Präparation der Komplexproteine von Clostridium botulinum Typ B Die Komplexproteine von Clostridium botulinum Typ B werden nach Fermentation von Clostridium botulinum Typ B (Stamm-Okra) nach publiziertem Verfahren isoliert (vgl. Evans et al., 1986; European Journal of Bioch. 154, 409-416), wobei einige Schritte modifiziert wurden:
Wie in Beispiel 1 wurden nach Extraktion der säuregefällten Biomasse die Nukleinsäuren aus dem Extrakt gefällt und der toxische Botulinumtoxin-Komplex aus dem Überstand mit Ammoniumsulfat präzipitiert. Der Niederschlag wurde in 0.05 M Natriumeitrat + 1 mM EDTA pH 5.5 aufgenommen und nach Dialyse über eine DEAE-S ephad ex-Chromatographie gereinigt, wobei der hochmolekulare Komplex auf der Säule (5x12 cm) nicht gebunden wurde und quantitativ durch die Säule lief. Das komplexhaltige Eluat wurde nach einer Dialyse gegen 50 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA pH 7.9 über eine Sepharose Q-Säule chromatographiert, wobei die Komplexproteine auf der Säule nicht gebunden wurden während das Neurotoxin auf der Säule gebunden blieb und erst mit einem Salzgradienten eluiert wurde. Eine weitere Reinigung der Komplexproteine erfolgte auf einer Q Hyper D-Säule (2,6x13 cm), die mit dem gleichen Puffer (50 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) equilibriert war. Der toxinfreie Proteinkomplex wurde mit einem Natriumchlorid-Gradienten (0 - 300 mM NaCl) eluiert.
Letzte Spuren von Neurotoxin wurden mittels Affinitätschromatographie entfernt. Dazu wurde die komplexhaltige Lösung viermal über eine Säule gepumpt, die als Affinitätsmatrix eine mit einem Antikörper (IgG-Fraktion) gegen Botulinum Neurotoxin Typ B gekoppelte Sepharose enthielt. Ln Aktivitätstest (Maus-Hämidiaphragma-Assay) war anschließend keine biologische Aktivität (Toxizität) mehr nachweisbar.
Beispiel 3: Integration der schweren Kette von Botulinumtoxin Typ A in einen Proteinkomplex von C. botulinum Typ B
100 μg (34μl) der hochgereinigten Komplexproteine von Typ B aus Beispiel 2 wurden vermischt mit 200 μg (690μl) der isolierten schweren Kette von Typ A aus Beispiel 1. Das Gemisch wurde 3 Tage bei 2-80C gegen 1 L .50 mM NaPhosphat-Puffer pH 6.0 mit 150 mM NaCl dialysiert. Anschließend wurden 450 μL durch Zugabe von 150 μl 4 M Ammoniumsulphat gefällt. Unter diesen Fällungsbedingungen bleibt die nicht in den Proteinkomplex eingebaute schwere Kette in Lösung wärend der Proteinkomplex (nαit oder ohne eingebaute schwere Kette) quantitativ ausfällt. Nach erneuter Inkubation über Nacht wurde das Pellet abzentrifugiert und in 120 μL NaPhosphat, mm NaCl, 2mM EDTA pH 6,0 resuspendiert. Die Bildung des Proteinkomplexes wurde durch "Gelfiltration" über eine BioSep-S-3000 geprüft. Das Chromatogramm zeigte nur einen einzigen Peak (bei einem Molekulargewicht von ca. 500 000 Dalton). Die SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese ergab, dass die Peakfraktionen sowohl die Komplexproteine von Typ B als auch die schwere Kette von Botulinumtoxin Typ A enthielten.
Beispiel 4: Kopplung von Insulin an die schwere Kette von Botulinumtoxin Typ A Synthese von SPDP-Insulin
12.5 mg Insulin (Roche, rekombinant) wurden in 6.3 mL Puffer (10 mM Natriumcarbonat pH = 6.9) gelöst. Dazu wurden zum Blocken von α-Aminogruppen 3 μL Citaconanhydrid (Fluka) pipettiert und die Mischung bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der pH- Wert verfolgt wurde. Durch Zugabe von 1 M NaOH wurde der pH- Wert bei 6.8 - 7.0 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend über Nacht bei 4°C gegen 50 mM Natrium-phosphat, 100 mM Natriumchlorid pH = 7.3 dialysiert.
6.2 mg SPDP (N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionat, Pierce) wurden in 500 μL DMF gelöst. 274 μL dieser Lösung wurden zu 6.3 mL Insulinderivat (auf pH 8.3 eingestellt) hinzugefügt und das Gemisch 1 1A h bei Raumtemperatur auf einem Mixer inkubiert. Noch vorhandenes SPDP wurde mittels Dialyse gegen 50 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl pH = 7.3 entfernt. Zur Entfernung der Schutzgruppen wurde gegen Wasser dialysiert (2 h bei Raumtemperatur) und dann gegen 10 mM HCl für 5 1A h bei Raumtemperatur. Schließlich wurde über Nacht gegen 50 mM Natriumphosphat, 100 mM Natriumchlorid, 4 mM EDTA pH ^ 7.3 dialysiert (Endvolumen der SPDP-Lösung: 7 mL).
Herstellung des Insulin-Hc-Konjugats
25 mg der schweren Kette von Botulinumtoxin Typ A, die ensprechend Beispiel 1 isoliert wurde, wurden mit 8 mg Insulin-SPDP versetzt (Endvolumen: 41.5 mg) und 4 Tage bei 40C inkubiert
(end-over-end Mixer). Zur Abtrennung von nicht gekoppeltem Insulin-SPDP wurde gegen 50 mM Tris/HCl, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA dialysiert, wobei der Dialyseschlauch eine
Ausschlussgrenze von 50 kD besaß.
Das Produkt wurde im Western Blot analysiert. Mit Antikörpern gegen Insulin wurde ein Protein mit dem Molekulargewicht von ~ 100 kD identifiziert. Es handelte sich also um das Konjugat aus schwerer Kette und Insulin (= Insulin-Hc-Konjugaf). An 3T3-Zellen wurde in vitro die
Aktivität des Insulins nachgewiesen.
Beispiel 5: Einbau des Insulin-Hc-Konjugats in den Proteinkomplex aus Clostridium botulinum Typ B
In 52 mL wurden 7.4 mg Insulin-Hc-Konjugat (aus Beispiel 4) mit 21 mg Proteinkomplex (gereinigt entsprechend Beispiel 2) und gegen 50 mM Natriumphosphat, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 6.0 4 Tage bei 40C dialysiert. Eine Probe von 500 μL wurde in einer Gelfiltration über eine BioSep-S-3000-Säule (Phenomenex) analysiert. Es zeigte sich nur ein hochmolekularer Peak bei einem Molekulargewicht von ~ 600 kD. Eine Probe der Peakfraktion wurde im Western Blot analysiert. Mit Antikörpern gegen Insulin ergab sich, dass Insulin (als Insulin-Hc-Konjugat) in den Proteinkomplex (aus Komplexproteinen von C. botulinum) integriert war.
Beispiel 6: Prüfung eines Insulin-Neokomplexes an Ratten im Glucose-Toleranztest Die Wirksamkeit eines in einen Proteinkomplex eingebauten Insulin-Hc-Konjugats (im nachfolgenden als Insulin-Neokomplex bezeichnet) nach oraler Verabreichung wurde im Tierversuch an Ratten überprüft.
Gruppen aus 4 Ratten wurden entweder mit Insulin-Neokomplex oder mit freiem Insulin-Hc- Konjugat (ohne Komplexproteine) behandelt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Tiere. Die Dosis an Insulin war in beiden Gruppen gleich und betrug 2 U/Tier. Die Lösungen wurden per c lundsonde vera re c t. s we tere ontro en wur en 0.1 U, 0.6 U unα z u U ui uπn i.p. verabreicht. 1 h nach Applikation von Insulin-Neokomplex und freiem Insulin-Hc-Konjugat wurden die Tiere mit Glucose (2 g/kg per oral) belastet. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte auch die Injektion der Positivkontrolle (0.1 U, 0.6 U und 2.0 Units Insulin). Nach 30, 60, 120 und 180 min wurde Blut entnommen und der Glucosespiegel bestimmt. Nach 60 min wurde bei den Kontrolltieren eine Höchstkonzentration an Glucose mit ca. 140 mg/mL erreicht, während bei den mit Insulin-Neokomplex behandelten Tieren die Konzentration nur wenig anstieg (s. Abb. 1). Betrachtet man den Verlauf der Glucosekonzentration (Fläche unter der Kurve, AUC), so ist die Wirkung des Insulin-Neokomplexes vergleichbar mit i.p. verabreichtem Insulin (Abb. 2).
Die Glucosekonzentration bei den Tieren, die nur mit Insulin-Hc-Konjugat behandelt wurden, verhielt sich genauso wie bei der Kontrolle: die Konzentration stieg bis zum Zeitpunkt 60 min stark an. Es läßt sich daraus schließen, dass ein Insulin-Hc-Konjugat allein keine Wirkung auf den Insulinspiegel hat, die Verabreichung von Insulin-Hc-Konjugat ohne den Einbau in den Proteinkomplex ist also nicht geeignet, Insulin oral bioverfügbar zu machen.
Beispiel 7: Vergleich der Integration von Insulin-Hc-Konjugat mit Insulin gebunden an den C-
Terminus der schweren Kette von Botulinumtoxin
Das c-terminale Fragment der schweren Kette (Mr«50 kD; im Nachfolgenden auch als Hl- Fragment bezeichnet) von Botulinumtoxin Typ A wurde recombinant in E. coli exprimiert. Dazu wurde die DNA-Sequenz für das c-terminale Fragment von Botulinumtoxin Typ A As 871-
1296 (NIINT ERPL) verknüpft mit einem His-Tag in den Vektor pBN29 4772 kloniert, damit E. coli Nl 5 [pREP4] (Quiagen) transformiert und das exprimierte Fragment über eine Ni- NTA-Sepharose-Säule mittels Affinitätschromatographie gereinigt.
100 μg der toxinfreien Komplexproteine von C. botulinum Typ B wurden mit 200μg ( 340 μL) des recombinanten c-terminalen -Fragments gemischt und drei Tage bei 2-8°C gegen 50 mM NaPhosphat pH 6,0 mit 150 mM NaCl dialsysiert. Anschließend wurde mit H2O auf 450 μL aufgefüllt und durch Zugabe von 150 μl 4 M Ammoniumsulphat gefällt. Unter diesen Fällungsbedingungen bleibt das nicht in den Proteinkomplex eingebaute c-terminale Fragment in Lösung, während der Proteinkomplex (mit oder ohne eingebautes c-terminales Fragment) quantitativ ausfällt. Nach erneuter Inkubation über Nacht wurde das Pellet abzentrifugiert und in 150 μL 50 mM NaPhosphat, 150 mM NaCl, 2mM EDTA pH 6,0 resuspendiert. lOOμL wurden auf einer Biosep S-3000 Gelfiltrationssäule in den Komplex und eventuell als Verunreinigung vorhandenes, nicht gebundenes c-terminal Fragment aufgetrennt. Es wurden 2 Peaks eluiert: der . erste Peak (12,2 min) repräsentiert den Proteinkomplex. Em sehr kiemer Peak repräsentiert das freie c-terminale Fragment-Fragment. Der erste Peak wurde in der SDS-PAGE untersucht, es waren nur die Komplexproteine vorhanden, das c-terminale Fragment war also nicht in den Komplex integriert sondern blieb in der Ammoniumsulfatfällung ungebunden in Lösung. Das c- terminale Fragment von Botulinutoxin läßt sich also nicht in den Komplex integrieren.
Beispiel 8: Vergleich der biologischen Aktivität von Insulin-HI -Koni ugat und Insulin-Hc- Konjugat
Das c-terminale Fragment (Hl -Fragment) der schweren Kette von Botulinumtoxin Typ A wurde wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt. Nach Derivatisierung wurden 13 mg HI-Fragment mit 8 mg Insulin-SPDP versetzt. Die Herstellung von Insulin-SPDP verlief analog zu Beispiel 4. Nach Inkubation über 24 Stunden bei 4°C wurde nicht gekoppeltes Insulin-SPDP durch Dialyse gegen 50 mM Tris/HCl, 250 mM NaCl, 1 raM EDTA abgetrennt.
3.8 mg (Hl-Insulin-Konjugat) wurden mit 21 mg toxinfreien Proteinkomplex (gereinigt entsprechend Beispiel 2) gegen 50 mM NaPhosphat, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.0 5 Tage bei 4°C wie bei der Integration der schweren Kette in den Komplex (Beispiel 5) dialysiert. Diese Mischung wurde im Tierversuch geprüft.
Gruppen aus 4 Ratten wurden entweder mit Insulin-Hc-Konjugat (Beispiel 5) oder mit Insulin- HI -Konjugat + Komplexproteine oder mit Kochsalzlösung behandelt. Die Dosis der beiden ersten Gruppen entsprach 2 U Insulin pro Tier. 1 h nach Verabreichung wurde mit Glukose belastet (0.5 g/kg i.p.). Die Messung des Blutzuckerspiegels ergab bei den Tieren, die Kochsalz erhielten nach 30 min 170 ± 12 mg/dL, während der Anstieg in der Gruppe, die den HC- Konjugat Neokomplex erhielten nur auf 115 ± 14 mg/dL anstieg. Der Anfangswert zum Zeitpunkt der Glukoseinjektion betrug 85 ± 14 mg/dL. Das Hl-Insulin-Konjugat mit den Komplexproteinen zeigte somit im Tierversuch keine Wirkung.
Beispiel 9: Einsatz eines Insulin-Konjugats mit c-terminal verkürzter schwerer Kette Zur Gewinnung einer c-terminal um 30 Aminosäuren verkürzten Kette wurde aus einer Kultur von C. botulinum Typ A (ATCC 3502) chromosomale DNS präpariert. Durch PCR-
Amplifikation wurde ein für die leichte Kette kodierendes Genfragment, das im Loop-Bereich zusätzlich eine Thrombin-Schnittstelle enthielt, in das Plasmid pQE60 (pQE-BoNT(A)-L) kloniert. Durch PCR-Amplifikation wurde ein Genfragment aus der chromosomalen DNS erzeugt, das für die um 30 Aminosäuren c-terminal verkürzte Kette kodierte. Das Genfragment wurde an das 3 '-Ende des für BoNT(A)-L kodierenden Genfragments in das Expressionsplasmid PQE-BoNT(A)-L kloniert (pQE-BoNT(A)-L H30min). Der E. coli Expressionsstamm M15[pREP4] (Qiagen) wurde mit dem Plasmid transformiert. Nach Induktion mit 500 μM IPTG (250C über Nacht) wurden die Zellen lysiert und über eine Ni-NTA-Agarose-Säule chromatographiert. Aus dem so gewonnenen, um 30 Aminosäuren verkürzten Toxin wurde die schwere Kette H30min, wie im Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Die schwere Kette H30min wurde analog zu Beispiel 4 mit Insulin konjugiert und in den toxinfreien Komplex aus C. botulinum Typ B integriert, analog zu Beispiel 5.
Der so synthetisierte Neokomplex wurde im Glukose-Toleranztest an 4 Tieren im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Komplex geprüft (entsprechend Beispiel 8). Bei einer Dosis, die 2 U Insulin entsprachen, war der Blutzuckerspiegel nach 30 min auf 110 ± 18 mg/dL gestiegen, während er bei den Kontrolltieren auf 168 + 14 mg/dL erhöht war (Anfangswert 90 ± 5 mg/dL).

Claims

Patentansprüche
1. Ein Proteinkomplex bestehend aus mindestens einem Hämagglutinin aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder G und einem Polypeptid-Hc-
Konjugat, wobei das Polypeptid-Hc-Konjugat aus einem ausgewählten Polypeptid verbunden mit der schweren Kette oder dessen N-terminalem Fragment von Botulinumtoxin besteht.
2. Proteinkomplex nach Anspruch 1, wobei die Hämagglutinine ein Gemisch aus Hämagglutininen aus wenigstens einem der Clostridium botulinum Typen A, B, C, D, E, F oder
G sind.
3. Proteinkomplex nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Proteinkomplex zusätzlich nicht-toxisches, nicht-hämagglutinierendes Protein enthält.
4. Proteinkomplex nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die schwere Kette aus einem der Botulinumtoxin-Komplexe der Typen A, B, C, D, E, F oder G isoliert ist.
5. Proteinkomplex nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die schwere Kette in einem geeigneten Expressionssystem rekombinant hergestellt ist.
6. Proteinkomplex nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid ein Hormon, Cytokin, Wachstumsfaktor, Antigen, Antikörper, Inhibitor, Rezeptor- Agonist oder -Antagonist oder Gerinnungsfaktor ist.
7. Proteinkomplex nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das ausgewählte Polypeptid und die schwere Kette oder dessen N-terminales Fragment als Fusionsprotein rekombinant hergestellt sind.
8. Proteinkomplex nach Anspruch einem der Ansprüche 1-6, wobei das ausgewählte Polypeptid und die schwere Kette oder dessen N-terminales Fragment über eine chemische Bindung verbunden sind.
9. Proteinkomplex nach Anspruch 8, wobei die chemische Bindung eine Disulfidbindung ist.
10. Proteinkomplex nach Anspruch 8, wobei die chemische Bindung eine Peptidbindung ist.
11. Verfahren zur Herstellung des Proteinkomplexes nach Anspruch einem • der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Schritte: a) Isolieren eines Botulinumtoxin-Komplex aus Clostridium botulinum bei einem pH-Wert im Bereich von von 2,0 bis 6,5; b) Einstellen des isolierten Botulinumtoxin-Komplex aus Schritt a) auf einen pH- Wert im
Bereich von 7,0 bis 10,0; c) Abtrennen des Botulinumtoxins von den Komplexproteinen mittels chromatographischer Verfahren; d) Mischen der in Schritt c) erhaltenen Komplexproteine mit einem Polypeptid-Hc- Konjugat; oder e) Auftrennen der in Schritt c) erhaltenen Komplexproteine und Mischen wenigstens eines Komplexproteins mit einem Polypeptid-Hc-Konjugat; f) Dialysieren des Gemisches aus Schritt d) oder e) gegen einen Puffer bei einem pH- Wert im Bereich von 6,5 bis 2,0.
12. Verwendung des Proteinkomplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Transportvehikel für pharmakologisch aktive, immunologisch aktive oder für diagnostische Zwecke verwendete Polypeptide.
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