KR101938581B1 - 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술 - Google Patents

보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술에 관한 것이다.
본 발명의 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술은 보툴리눔 독소의 농도를미세하게 조절 가능하고, 인체 내 투여시 통증을 경감시키며, 정확한 투여 위치에 독소가 주입되도록 하므로, 보툴리눔 독소의 안전하고 편리한 의학적 이용에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술{Microneedle formulation techniques for botulinum toxin}
본 발명은 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술에 관한 것이다.
신경독성 효과를 지닌 독소를 분비하는 다양한 클로스트리디움 속 균주들이 1890년대부터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성 규명이 이루어져 왔다(Schant, E. J. et al., Microbiol. Rev., 56:80, 1992). 그 중에서도 보툴리눔 독소(botulinum toxin)는 그 혈청학적 특징에 따라 A 내지 G형의 7가지 아형으로 구분되며, 신경 기능을 가지는 동물에 있어서 신경근육종말(neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스(cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스(exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 보툴리눔 독소의 B, D, F 및 G 아형은 시냅토브레빈을, A와 E 아형은 SNAP25를, C 아형은 신택신을 특정 부위에서 절단하는 것으로 알려져 있다(Binz, T. et al., J. Biol. Chem., 265:9153, 1994). 따라서 최근에는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)의 신경독성을 미용 또는 치료 용도로 이용하고자 하는 노력이 있어왔다. 안과질환(미국 특허 6,265,379호), 통증(미국 특허 6,113,915호), 다한증을 포함하는 다양한 자율신경계 신경 기능장애(미국 특허 5,766,605호), 편두통 통증(미국 특허 5,714,468호), 수술-후 통증 및 내장 통증(미국 특허 6,464,986호), 건선 및 피부염(미국 특허 5,670,484호), 다양한 암(미국 특허 6,139,845호 및 6,063,768), 및 신경성 염증(미국 특허 6,063,768호) 등의 치료에 보툴리눔 독소를 이용하기 위한 기술이 제안되었거나 시도되었다.
그러나 보툴리눔 독소는 알려진 생물독소 중 가장 치명적인 물질로, 인간의 반수 치사량은 정맥 주사나 근육 주사의 경우 1.3-2.1 ng/kg, 흡입할 경우 10-13 ng/kg이다. 이와 같이, 보툴리눔 독소는 다양한 질병에서의 치료 효과가 크지만 독성이 강하여 극소량으로도 치명적이므로, 생체를 대상으로 한 이용 시 미세한 농도 조절 기술 및 정확한 위치에 투여하는 기술이 필수적이다.
한편, 마이크로 구조체란, 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(microbarb), 마이크로어레이 또는 마이크로전극 등을 포함하는 것으로, 그 중 마이크로니들은 미세한 침으로 피부에 구멍을 내 약물 침투를 증가시키는 기술을 의미한다. 특히, 마이크로니들을 이용하여 보툴리눔 독소를 전달할 경우, 수십-수백개의 미세침으로 독소를 주입하게 되므로 주사로 인한 통증을 경감시키고 정확한 위치에 투여 실패로부터 발생하는 부작용을 극복할 수 있다.
따라서 본 발명은 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술에 대한 것으로, 본 발명의 마이크로 구조체를 이용하여 보툴리눔 독소 투여시 통증을 경감시키고, 미량의 독소를 정확한 위치에 투여 가능하도록 하므로, 보툴리눔 독소의 안전하고 편리한 의학적 이용에 크게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 “보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)”란, 클로스트리디움 보툴리눔 세균이 만드는 신경독 단백질이다. 클로스트리디움 속은 127 종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독을 생산한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된, 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과할 수 있는 것으로 보이며 콜린성 운동 뉴런에 대해 높은 친화도를 나타낸다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 죽음으로 증상이 진행될 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 상업적으로 입수 가능한 보툴리눔 독소 타입 A(정제된 신경독 복합체)의 LD50은 약 50 피코그램이다(즉, 1 유닛). 흥미롭게도, 몰을 기준으로 할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브라 독(cobra toxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이다. 보툴리눔 독소 1 유닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사를 통한 LD50로서 정의할 수 있다.
일반적으로 면역학적으로 구별되는 7개의 보툴리눔 신경독은, 타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는 각각 신경독 세로타입(serotype) A, B, C1, D, E, F 및 G로 특징 지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 일으키는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 랫드에서 발생하는 마비율로 측정할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 보툴리눔 독소 타입 B에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는, 보툴리눔 독소 타입 A 영장류 LD50의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨진다. 식세포작용 및 음세포작용에 의해서뿐 아니라, 낮은 친화도 수용체를 통하여 추가로 흡수될 수 있다.
세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫 번째 단계에서는, 독소의 중쇄(H 사슬 또는 HC)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스 전 막에 결합하는 것이며, 이 수용체는 보툴리눔 독소 타입 및 파상풍 독소 타입 각각에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 중쇄의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.
두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 보툴리눔 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 중쇄의 아미노 말단 단편, HN에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소(또는 최소한 경쇄)는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다.
보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 중쇄와 경쇄를 연결하는 디설파이드 결합의 환원을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 및 파상풍 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 경쇄에 포함되며; 경쇄는 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아제이다. 파상풍 신경독, 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 시냅토브레빈(또는 소포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 세포질 표면에 존재하는 VAMP은 대부분 이러한 분해작용 중 하나의 결과로 제거된다. 세로타입 A 및 E는 SNAP-25를 절단한다. 세로타입 C1은 원래 신택신을 절단하는 것으로 여겨졌으나, 신택신 및 SNAP-25를 절단하는 것으로 밝혀졌다. 동일한 결합을 절단하는 타입 B(및 파상풍 독소)를 제외하고는, 각각의 독소는 상이한 결합을 특이적으로 절단한다. 각각의 이러한 절단은 소포-막 도킹의 과정을 방해하여 소포 내용물의 엑소시토시스를 막는다.
보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애(즉, 운동 장애)의 치료를 위해 임상에서 사용되고 있다. 1989년에, 보툴리눔 독소 타입 A 컴플렉스는 미국 식품의약청에 의해서, 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 승인되었다. 이어서, 보툴리눔 독소 타입 A는 또한 FDA로부터 경부 디스토니아의 처치 및 미간 주름의 처치에 대해 승인되었고, 보툴리눔 독소 타입 B도 경부 디스토니아의 처치에 대하여 승인되었다. 독소 타입 A 이외의 보툴리눔 세로타입들은 보툴리눔 독소 타입 A와 비교할 때, 활성에 있어서 더 낮은 효력 및/또는 더 짧은 지속시간을 가지는 것으로 보인다. 말초 근육내 주사된 보툴리눔 독소 타입 A의 임상 효과는 보통 주사 후 일주일 이내에 나타난다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육 내 주사에 의한 증상 구제의 전형적인 지속시간은 평균 약 3 개월이나, 상당히 더 긴 기간 동안의 치료 활성이 보고되었다.
모든 보툴리눔 독소 세로타입이 신경근육 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 보인다 하더라도, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용하며, 및/또는 이 단백질을 상이한 부위에서 절단한다. 예를 들어, 보툴리눔 타입 A 및 E는 모두 25kD 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)을 절단하지만, 이 단백질의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위를 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C1은 신택신 및 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 보인다. 이러한 작용 메카니즘의 상이성은 여러 보툴리눔 독소 세로타입들의 작용에 의한 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 미칠 것이다. 특히, 보툴리눔 독소의 기질을 여러 상이한 세포 타입에서 발견할 수 있다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 흥미롭게도, 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 보툴리눔 독소는 관련된 비독성 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900k, 500Dk 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C1은 700kD 또는 500kD 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500kD 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 두가지 비독소 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 포함하는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클수록(분자량이 약 150kD 이상), 보툴리눔 독소 복합체가 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다.
또한 in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP, 물질 P(substance P) 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다. 따라서, 적당한 농도로 사용하는 경우, 보툴리눔 독소에 의해서 대부분의 신경전달물질의 자극-유발 방출이 억제된다.
보툴리눔 독소 타입 A는 발효조에서 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 만들어 배양한 다음, 발효 혼합물을 공지의 방법으로 수확 및 정제하여 얻을 수 있다. 처음에는 모든 보툴리눔 독소 세로타입이, 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는, 비활성 단일 사슬 단백질로서 합성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C1, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 이미 알려진 바와 같이, 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B은 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 동일한 투여량 레벨에서 보툴리눔 독소 타입 B는 보툴리눔 독소 타입 A에 비하여, 근육 주사시, 활성의 지속시간이 더 짧고 또한 효력이 떨어지는 것으로 알려져 있다.
클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A 종(Hall A strain)으로부터 ≥3 X 107U/mg이고, A260/A278이 0.60 이하이고, 겔 전기영동에서 독특한 밴드 패턴을 보이는 특징을 가지는, 질 높은 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻을 수 있다. 공지의 산츠 프로세스(Shantz process)를 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 적절한 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A를 배양한 혐기성 발효물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 공지의 프로세스는 또한, 예를 들어: 분자량이 약 150 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 A를 정제하거나; 분자량이 약 156 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 B를 정제하거나; 분자량이 약 155 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 107 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 F를 정제하는 등의, 비독소 단백질들로부터 순수한 보툴리눔 독소들을 분리하여 얻는데 사용할 수 있다.
보툴리눔 독소 및/또는 보툴리눔 독소 복합체를 당업계에 공지된 화합물 제조업체로부터상업적으로도 입수할 수 있으며, 순수한 보툴리눔 독소를 또한 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다.
일반적으로 효소에서 그렇듯이, 보툴리눔 독소들(이들은 세포내 펩티다아제임)의 생물학적 활성은, 적어도 일부분, 그들의 3차원적 구조에 따라 달라진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A는 열, 다양한 화학물질, 표면 긁힘 및 표면 건조에 의해서 독성이 제거될 수 있다. 또한, 공지의 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어진 독소 복합체를 아주 아주 낮은 독소 농도로 희석하여 약제학적 조성물 제제에 사용하는 경우, 적합한 안정화제가 없으면, 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다. 대량으로 희석하면 특이적 독성이 빠르게 손실되기 때문에, 수 밀리그램 양의 독소를 밀리리터당 수 나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은 상당히 어렵다. 독소를 함유하는 약제학적 조성물을 제조한 후, 수개월 또는 수년동안 사용할 수 있기 때문에, 독소는 적합한 안정화제를 사용하여 안정화하여야만 한다. 따라서 본 발명과 같이, 보툴리눔 독소를 생체 내에서 안정적으로 방출 조절하기 위해서는 최적의 안정화제 기술의 개발이 필수적이라고 할 것이다.
하기와 같이, 임상 세팅에서 보툴리눔 독소 타입 A를 사용하는 것이 보고되었다:
생체 내에서 일회성으로 투여된 보툴리눔 독소에서 근육내 주사의 일반적인 지속시간은 전형적으로 약 3 내지 4개월이다. 그러나 경우에 따라 A 아형은 12 개월 이상 효능을 지속할 수 있으며(European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150 : 1999), 다한증과 같은 선(gland)의 치료에 사용되는 경우, 어떤 상황에서는 27 개월 동안 지속될 수 있다.
보툴리눔 독소는 말초 부위에서 약리학적 작용을 나타낼 뿐 아니라, 중추 신경계에서도 억제 효과를 나타낼 수 있다. Weigand 등의 연구(Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292,161-165, 및 Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281,47-56)는 보툴리눔 독소가 역행 수송에 의해서 척수 영역으로 거슬러 올라갈 수 있다는 것을 보여준다. 이와 같이, 말초 부위에 예를 들어, 근육내로 투여된 보툴리눔 독소는, 척수로 역행 수송될 수 있다.
보툴리눔 독소는 또한 피부, 뼈 및 건의 상처(미국 특허 6,447,787호), 초내 통증(미국 특허 6,113,915 참조), 다한증을 포함하는 다양한 자율신경계 신경 기능장애(미국 특허 5,766,605호 및 Goldman(2000), Aesthetic Plastic Surgery Jul-Aug 24(4):280-282 참조), 긴장성 두통(미국 특허 6,458,365호), 편두통 통증(미국 특허 5,714,468호), 수술-후 통증 및 내장 통증(미국 특허 6,464,986호), 모발 성장 및 모발 유지(미국 특허 6,299.893호), 건선 및 피부염(미국 특허 5,670,484호), 손상된 근육(미국 특허 6,423,319호), 다양한 암(미국 특허 6,139,845호 및 6,063,768), 평활근 장애(미국 특허 5,437,291호), 신경 포착 증후군(미국 특허출원 2003 0224019), 좌창(WO 03/011333), 신경성 염증(미국 특허 6,063,768호), 안과질환(미국 특허 6,265,379 참조), 췌장질환(미국특허 6,143,306 및 6,261,572 참조), 전립선 비대증, 전립선 암 및 요실금을 포함하는 전립선 질환(미국 특허 6,365,164 및 6,667,041 및 Doggweiler R., et al Botulinum toxin type A causes diffuse and highly selective atrophy of rat prostate, Neurourol Urodyn 1998;17(4):363 참조), 섬유조직염(미국 특허 6,623,742호), 이상근 증후군(Childers et al. (2002), American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation, 81 :751-759 참조) 등을 치료하기 위하여 제안되었거나 시도되었다.
미국 특허 제 5,989,545호에는 특정 표적 잔기에 화학적으로 컨쥬게이트되거나, 재조합적으로 융합된 변형 클로스트리디움 신경독 또는 이의 단편, 바람직하게는 보툴리눔 독소를, 척수에 투여하여, 통증을 처치하는 데 사용될 수 있음이 개시되어 있다. 또한, 다양한 질환을 처치하는 데 있어서 표적화된 보툴리눔 독소(즉, 비-천연 결합 잔기를 가짐)가 사용될 수 있다는 것이 개시되어 있다(WO 96/33273; WO 99/17806; WO 98/07864; WO 00/57897; WO 01/21213; WO 00/10598 참조).
또한 보툴리눔 독소를 흉근에 주사하여 흉근경련을 조절하는 기술도 공지되었고(Senior M., Botox and the management of pectoral spasm after subpectoral implant insertion, Plastic and Recon Surg, July 2000, 224-225), 경피 보툴리눔 독소 투여(미국 특허출원 제 10/194,805호)의 경우와 같이, 제어 방출 독소 임플란트(미국특허 6,306,423 및 6,312,708 참조)가 공지되어 있다. 보툴리눔 독소를, 입의 씹거나 무는(biting) 근육을 약화시켜 자신이 입히는 상처 및 얻어지는 궤양을 치료하고(Payne M., et al, Botulinum toxin as a novel treatment for self mutilation in Lesch-Nyhan syndrome, Ann Neurol 2002 Sep; 52(3 Supp 1):S157), 양성 담낭 손상 또는 종양을 치료하고(Blugerman G., et al., Multiple eccrine hidrocystomas: A new therapeutic option with botulinum toxin, Dermatol Surg 2003 May; 29(5):557-9), 치열을 치료하고(Jost W., Ten years' experience with botulinum toxin in anal fissure, Int J Colorectal Dis 2002 Sep; 17(5):298-302), 및 특정 형태의 아토피성 피부염을 치료하기 위하여(Heckmann M., et al. Botulinum toxin type A injection in the treatment of Lichen simplex: An open pilot study, J Am Acad Dermatol 2002 Apr; 46(4):617-9) 사용할 수 있다는 것이 알려져 있다.
추가적으로, 보툴리눔 독소는 랫드 포르말린 모델에서 유도된 염증 통증을 감소시키는 효과를 가질 수 있다(Aoki K., et al, Mechanism of the antinociceptive effect of subcutaneous Botox: Inhibition of peripheral and central nociceptive processing, Cephalalgia 2003 Sep; 23(7):649.). 또한, 보툴리눔 독소 신경 저해가 상피 두께의 감소를 가져올 수 있다고 보고되어 있다(Li Y, et al., Sensory and motor denervation influences epidermal thickness in rat foot glabrous skin, Exp Neurol 1997; 147:452-462). 마지막으로, 과도한 발의 발한(Katsambas A., et al., Cutaneous diseases of the foot: Unapproved treatments, Clin Dermatol 2002 Nov-Dec; 20(6):689-699; Sevim, S., et al, Botulinum toxin-A therapy for palmar and plantar hyperhidrosis, Acta Neurol Belg 2002 Dec; 102(4): 167-70), 경직성 발가락(Suputtitada, A., A., Local Botulinum toxin type A injections in the treatment of spastic toes, Am J Phys Med Rehabil 2002 Oct;81(10):770-5), 특발성 발가락 보행(Tacks, L., et al., Idiopathic toe walking: Treatment with botulinum toxin A injection, Dev Med Child Neurol 2002;44(Suppl 91):6), 및 발 근긴장이상(Rogers J., et al., Injections of botulinum toxin A in foot dystonia, Neurology 1993 Apr;43(4 Suppl 2))을 치료하기 위하여 발에 보툴리눔 독소를 투여하는 것이 알려져 있다.
파상풍 독소(tetanus toxin)와, 이의 유도체(즉, 비-천연 표적 잔기를 가진), 단편, 하이브리드 및 키메라를 또한 치료에 사용할 수 있다. 파상풍 독소는 보툴리눔 독소와 많이 유사하다. 따라서, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 모두 가깝게 연관 된 종의 클로스트리디움(각각, 클로스트리디움 테타니 및 클로스트리디움 보툴리눔)에 의해 생성되는 폴리펩티드이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 단일 디설파이드 결합에 의해서 중쇄(분자량 약 100kD)에 공유 결합된 경쇄(분자량 약 50kD)로 구성된 2중 사슬 단백질이다. 그리고, 파상풍 독소 및 각각 7가지 보툴리눔 독소(비-복합체)의 분자량은 약 150kD이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 모두에서, 경쇄는 세포내 생물학적(프로테아제) 활성을 가지는 도메인을 포함하는 반면에, 중쇄는 수용체 결합(면역원성) 및 세포 막 전위 도메인을 포함한다.
또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 시냅스전 콜린성 뉴런 표면의 갱글리오사이드 수용체에 대하여 크고, 특이적인 친화도를 나타낸다. 말초 콜린성 뉴런에 의한, 파상풍 독소의, 수용체 매개 엔도시토시스로 인하여, 축색돌기 역행수송, 중앙 시냅스로부터의 억제성 신경전달물질 방출 차단 및 경련성 마비가 나타난다. 이에 반하여, 말초 콜린성 뉴런에 의한, 보툴리눔 독소의 수용체 매개 엔도시토시스는 역행 수송, 중독된 말초 운동 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스의 억제 및 이완성 마비를 거의 일으키지 않는다.
끝으로, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 생합성 및 분자 구성 모두에 있어 서로 닮아있다. 따라서, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 타입 A는 단백질 서열이 전체에 걸쳐 34% 동일하며, 몇몇 기능성 도메인에서는 서열이 62%나 동일하다(Binz T. et al., The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparison with Other Clostridial Neurotoxins, J Biological Chemistry 265 (16); 9153-9158: 1990).
본 발명의 일 구체예에서 “아세틸콜린”이란, 콜린과 아세트산의 에스테르로 처음으로 발견된 신경전달물질. 뉴런 전체에 분포하며 화학식은 C7H16NO2, 분자량은 146.21 이다.
몇몇 신경조절물질이 동일한 뉴런에 의해 방출될 수 있는 것을 제시하는 증거가 있지만, 전형적으로 포유류 신경계에서는, 각각의 형태의 뉴런에 의해서 단일 형태의 작은 분자 신경전달물질만이 방출된다. 이 신경전달물질 아세틸콜린은 뇌의 여러 부위의 뉴런, 특히, 운동피질의 큰 피라미드 세포, 대뇌핵의 몇 가지 상이한 뉴런, 골격근에 분포하는 운동 뉴런, 자율신경계(교감신경계 및 부교감신경계 모두)의 신경절이전 뉴런, 근방추 섬유의 bag 1 섬유, 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 뉴런 몇가지에 의해서 분비된다. 본래, 대부분의 교감신경계의 신경절이후 뉴런은 신경전달물질인 노르에피네프린을 분비하는데 비하여, 땀샘, 기모근 및 몇몇 혈관으로의 신경절이후 교감신경 섬유만이 콜린성이다. 대부분의 경우, 아세틸콜린은 흥분효과를 나타낸다. 그러나, 아세틸콜린이 몇몇 말초 부교감신경 말단에서는 억제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 미주신경에 의한 심장박동의 억제).
자율신경계의 원심성 신호는 교감신경계 또는 부교감신경계를 통하여 몸에 전달된다. 교감신경계의 신경절이전 뉴런은 척수의 중간외측각에 위치하는 신경절이전 교감 뉴런 세포체로부터 뻗어 나온다. 세포체로부터 뻗어 나온 신경절이전 교감신경 섬유는, 척추주위 교감 신경절 또는 척추전 신경절에 위치하는 신경절이후 뉴런과 시냅스를 이룬다. 교감신경계 및 부교감신경계의 신경절이전 뉴런은 모두 콜린성이므로, 신경절에 아세틸콜린을 적용하면 교감 및 부교감 신경절이후 뉴런을 흥분시킬 것이다.
아세틸콜린은 두가지 형태의 수용체, 무스카린성 수용체 및 니코틴성 수용체를 활성화시킨다. 무스카린성 수용체는 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 콜린성 뉴런에 의해서 자극된 모든 효과기(effector) 세포에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 부신 수질뿐 아니라, 교감신경계 및 부교감신경계 모두의 신경절이전과 신경절이후 뉴런 사이의 시냅스에서 신경절이후 뉴런의 세포 표면에 있는 자율신경절 내에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 또한 많은 비자율 신경말단, 예를 들어, 신경근육 접합부의 골격근 섬유의 막에서 발견된다.
아세틸콜린은, 작고 투명한, 세포내 소포가 시냅스전 뉴런성 세포막과 융합될 때, 콜린성 뉴런으로부터 방출된다. 부신수질(또한, PC12 세포라인) 및 췌장의 섬세포과 같은, 광범위한 비-뉴런성 분비 세포는 큰 고밀도 중심 소포(large densecore vesicle)로부터 각각 카테콜아민 및 부갑상선 호르몬을 방출한다. PC12 세포라인은 교감신경부신 발달(sympathoadrenal develpoment) 연구를 위한 조직 배양 모델로서 광범위하게 사용되는 랫드 크롬친화성세포종 세포의 클론이다. 탈신경된 세포에 독소를 투과 가능하게 하거나(전기충격법 등에 의해서), 직접 주사하면, 보툴리눔 독소는 in vitro에서 두 가지 세포종류 모두에서 두 가지 화합물 종류의 방출을 모두 억제한다. 보툴리눔 독소는 또한 피질의 시냅토솜 세포 배양물로부터 신경전달물질인 글루타메이트가 방출되는 것을 억제하는 것으로 알려져 있다.
신경근육 접합부는 근육세포의 주변 축색돌기에 의해서 골격근에서 형성된다. 신경계를 통하여 전달된 신호는 말단 축색돌기에서 작용 전위가 되고, 이온 채널을 활성화하며, 그 결과로 예를 들어, 신경근육 접합부의 운동 종판에서, 뉴런내 시냅스성 소포로부터 신경전달물질인 아세틸콜린이 방출된다. 아세틸콜린은 세포외 공간을 가로질러 근육 종판 표면의 아세틸콜린 수용체 단백질과 결합한다. 일단 충분하게 결합되면, 근육 세포의 작용 전위가 특이적인 막 이온 채널 변화를 일으키고, 그 결과로 근육세포가 수축한다. 그리고 나서, 아세틸콜린은 근육세포로부터 방출되어, 세포외 공간에서 콜린에스테라아제에 의해서 대사된다. 대사생성물은 다시 아세틸콜린으로 재생하기 위해서 말단 축색돌기로 다시 회수된다.
본 발명의 일 구체예에서 “마이크로 구조체”란, 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(microbarb), 마이크로어레이 또는 마이크로전극 등을 포함하는 것으로, 상기에 제한되는 것은 아니나, 특히 본 발명에 있어서는 마이크로니들인 것이 바람직하다. 또한 본 발명과 같이 의학적 용도로 사용되는 마이크로니들을 제조하는 경우, 구성물질은 "생체적합성 또는 생분해성 물질"인 것이 바람직하다. 여기서, "생체적합성 물질"이란 인체에 독성이 없고 화학적으로 불활성인 물질을 의미한다. 그리고, "생분해성 물질"은 생체 내에서 체액, 효소 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 마이크로 구조체는 본 발명의 보툴리눔 독소, 점증제, 및 안정화제를 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소 조성물을 내부에 포함하여 제조되거나, 본 발명의 보툴리눔 독소 조성물로 표면 코팅된 것을 의미한다. 상기에서 마이크로 구조체는 업계에서 사용되는 마이크로 구조체 제조방법에 의해서 제조되는 것이라면 모두 포함되는 것이며, 제조방법에 제한되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에서 “마이크로니들(microneedle)”이란, “미세침”으로도 명명되며, 미세한 침으로 피부에 구멍을 내 약물 침투를 증가시키는 기술을 의미한다. 주로 생체 내 약물 전달, 채혈, 체내 분석물질 검출 등에 사용된다.
1998년 미국 Georgia Institute of Tech. 에서 반도체 공정기술을 이용 실리콘소자로 마이크로 구조체 어레이를 만들어 피하주사 대체기술로써 가능성을 제시한 것이 시초인 것으로 알려져 있다.
마이크로니들은 기존의 니들과 달리 무통증의 피부 관통과 무외상을 특징으로 하며, 무통증 피부 관통은 최소 침예성을 위한 상단부(top) 직경이 중요하다. 또한, 마이크로니들은 피부 중 가장 강력한 장애물인 10-20 ㎛의 각질층(stratum corneum)을 관통하여야 하므로, 충분한 물리적 경도를 가질 것이 요구된다. 또한, 모세혈관까지 도달함으로써 약물 전달의 효율성을 높이기 위한 적정 길이도 고려되어야 한다.
종래에 In-plane 타입의 마이크로니들(Silicon-processed Microneedles, Journal of microelectrochemical systems 8, 1999)이 제안된 후, 다양한 유형의 마이크로니들이 개발되었다. 에칭 방법을 이용한 out-of-plane 타입의 솔리드 마이크로니들(미국특허출원 공개 제2002138049호) 제작 방법은 50-100 ㎛ 직경, 500 ㎛의 길이로 솔리드 실리콘 마이크로니들을 제작하지만, 무통증 피부 관통을 실현하는 것이 불가능하였으며, 목적 부위로 약물 및 미용성분을 전달하는 데 어려움이 있었다.
한편, 미국 조지아 대학의 프라우스니츠(Prausnitz)는 유리를 에칭하거나 포토리소그래피(photolithography)로 주형을 만들어 생분해성 폴리머 마이크로니들의 제작방법을 제안한바 있다(Biodegradable polymer microneedles: Fabrication, mechanics and transdermal drug delivery, Journal of Controlled Release 104, 2005, 5166). 또한, 2006년에는 포토리소그래피 방법을 통해 제작한 주형의 끝에 캡슐 형태로 제작된 물질을 탑재하여 생분해성 솔리드 마이크로니들을 제작하는 방법이 제안되었다(Polymer Microneedles for Controlled-Release Drug Delivery, Pharmaceutical Research 23, 2006, 1008). 이 방법을 사용하면 캡슐형태로 제작 가능한 약물의 탑재가 자유롭다는 장점이 있지만 약물 탑재량이 많아지면 마이크로니들의 경도가 약해지므로 다량의 투약이 필요한 약물에는 적용의 한계가 나타났다.
2005년에는 흡수형 마이크로니들이 나노 디바이스 앤드 시스템즈사에 의해 제안되었다(일본특허출원공개 제2005-154321호). 이와 같은, 흡수형 마이크로니들은 피부내로 삽입된 마이크로니들을 제거하지 않고 약물전달 또는 미용에 사용하고자 하는 것이다. 이 방법에서는, 주형에 말토오스(maltose)와 약물을 혼합한 조성물을 가하고 이를 응고시켜 마이크로니들을 제작하였다. 상기 일본특허는 마이크로니들을 흡수형으로 제작하여 약물의 경피흡수를 제안하고 있으나, 피부 관통 시 통증을 수반하였다. 또한 주형제작의 기술적 한계로 인해, 무통증을 수반하는 적절한 상단부 직경을 지니면서, 효과적인 약물전달에 요구되는 수준의 길이 즉, 1 ㎜ 이상의 길이를 지닌 마이크로니들을 제작하는 것이 불가능하였다.
2008년 미국 조지아 대학의 프라우스니츠(Prausnitz)에서 제작한 생분해성 마이크로니들은 폴리다이메틸사일록세인(Polydimethylsiloxane: PDMS) 주형에서 폴리바이닐파이롤리돈(Polyvinylpyrrolidone: PVP)과 메타크릴릭 에시드(Methacrylic acid: MAA)를 혼합한 물질을 사용하여 제작되었다(Minimally Invasive Protein Delivery with Rapidly Dissolving Polymer Microneedles, Advanced Materials 2008, 1). 또한 카르복시메틸셀룰로오스를 피라미드 구조의 주형에 넣어 마이크로니들을 제작하기도 하였다(Dissolving microneedles for transdermal drug delivery, Biomaterials 2007, 1). 그러나, 주형을 사용하여 제작하는 방법은 마이크로니들의 직경과 길이를 조절하기 위하여 복잡한 과정을 거쳐 새로운 주형과 틀을 제작해야 한다는 한계를 지니고 있으며, 주형 내에 물질을 넣어 마이크로니들을 제작하는 공정이 복잡하고, 장시간 소요된다는 단점이 존재한다.
2008년에는 일본의 Mukai et al. 이 등록한 US 특허를 통해 핀 구조를 사용하여 skin needle을 제작하는 장비 및 방법에 대해 발표하였다(미국특허등록 US 20080157421A1). 이 방법은 기판 위의 베이스에서 가열, 점성물의 인장력을 이용하여 pin으로 잡아당기는 방법을 사용하고 있다. 이 방법은 열에 의해 녹거나 점성을 갖는 물질을 pin 구조물을 사용하여 당기는 방법을 사용하였기 때문에 원하는 패턴에 따라 pin 구조를 새롭게 제작해야 하는 과정이 필요하여 생산비용의 증가하고, 가열 공정으로 인해 열에 민감한 다양한 바이오 의약품(호르몬, 백신, 기타 단백질 의약품 등)의 탑재가 어렵다는 한계를 극복하지 못하고 있다.
한편, 피부는 표피로부터 각질층 (< 20 ㎛), 외피(epidermis, < 100 ㎛), 및 진피 (dermis, 300 ~ 2,500 ㎛)로 구성되어 있다. 따라서, 특정 피부층에 통증 없이 약물 및 생리활성물질을 전달하기 위해서는 마이크로니들 상단 부 직경을 30 ㎛ 이내, 유효길이는 200 ~ 2,000 ㎛, 피부관통을 위한 충분한 경도를 갖도록 제작하는 것이 약물과 피부미용성분의 전달에 효과적이다. 또한, 생분해성 솔리드 마이크로니들을 통해 약물 및 생리활성물질 등을 전달하기 위해서는 마이크로니들 제조공정 가운데 고열처리, 유기용매 처리 등 약물 및 생리활성물질의 활성을 파괴할 수 있는 공정을 배제할 수 있어야 한다.
종래 솔리드 마이크로니들은 제조방법상의 한계로 인해 실리콘, 폴리머, 금속, 유리 등의 소재로 한정되었고, 몰딩 기술을 통한 제작방법을 이용함으로써 복잡하고 오랜 제작 시간에 따른 약물의 변성, 불충분한 경도, 약물의 손실이 발생하는 등의 단점을 지녔다. 따라서, 피부 관통 시 무통증을 실현할 수 있을 정도의 가는 직경과 피부 깊숙이 침투할 수 있는 충분한 길이를 가지면서 소재에 특별한 제한 없이 충분한 경도를 구현하고, 약물의 손실을 최소화 할 수 있는 마이크로니들의 제형화 기술에 대한 요구는 지속되고 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 미세하게 농도 조절된 보툴리눔 독소를 정확한 투여 위치에 주입되도록 하는 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.
비경구적인 투여에 적절한 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 마이크로구조체는 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 본 형태는 멸균될 수 있고, 그리고 액체일 수 있다. 이것은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고 그리고 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 마이크로구조체는 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학적 조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.
몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 마이크로구조체는 액체로 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 마이크로구조체 액체 조성물은 보툴리눔 독소, 또는 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함한다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 마이크로구조체 조성물에 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함한다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학적 조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 화합물, 또는 폴리머일 수 있다. 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다.
비경구용 제형은 멸균될 수 있다. 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 보툴리눔 독소 조성물을 유효성분으로 포함하는 마이크로구조체의 경우, 마이크로니들 형태로서 피내 투여가 바람직하다.
본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 보툴리눔 독소, 점증제 및 안정화제를 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소 조성물을 제공하고, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 보툴리눔 독소 조성물을 제공하며, 상기 점증제는 카복시메틸셀루로스 나트륨염(CarboxyMethylCellulose sodium salt), 알긴산 나트륨(Sodium Alginate), 히알루론산(Hyaluronic acid), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 하이드록시에칠셀룰로오스(HydroxyEthyl-Cellulose) 및 폴리비닐피롤리돈(PolyVinylPyrrolidone)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 보툴리눔 독소 조성물을 제공하며, 상기 점증제는 0.05 내지 10 중량%로 포함되는 보툴리눔 독소 조성물을 제공하며, 상기 안정화제는 트레할로오스(Trehalose), 메티오닌(Methionine), 인산나트륨(Sodium phosphate), 및 사람혈청알부민과 염화나트륨의 혼합물(Mixture of human serum albumin and sodium chloride)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 보툴리눔 독소 조성물을 제공하며, 상기 안정화제는 0.03 내지 50 중량%로 포함되는 보툴리눔 독소 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 보툴리눔 독소 조성물을 포함하는 마이크로 구조체를 제공하고, 상기 마이크로 구조체는 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(Microbarb), 마이크로어레이, 및 마이크로전극으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 마이크로 구조체를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 보툴리눔 독소, 점증제 및 안정화제를 혼합하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 점증제는 카복시메틸셀루로스 나트륨염(CarboxyMethylCellulose sodium salt), 알긴산 나트륨(Sodium Alginate), 히알루론산(Hyaluronic acid), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 하이드록시에칠셀룰로오스(HydroxyEthyl-Cellulose) 및 폴리비닐피롤리돈(PolyVinylPyrrolidone)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 점증제는 0.05 내지 10 중량%로 혼합하는 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 안정화제는 트레할로오스(Trehalose), 메티오닌(Methionine), 인산나트륨(Sodium phosphate), 및 사람혈청알부민과 염화나트륨의 혼합물(Mixture of human serum albumin and sodium chloride)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 안정화제는 0.03 내지 50 중량%로 혼합하는 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 목적하는 대상체를 고분자화합물로 전처리 코팅하는 단계; (b) 보툴리눔 독소, 점증제, 및 안정화제를 혼합하는 단계; 및 (c) (a)의 전처리 코팅된 대상체에 (b)의 혼합물을 점적하고 건조시키는 단계를 포함하는 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공하고, 상기 고분자화합물은 폴리비닐알코올(Polyvinyl Alcohol)인 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공하며, 상기 폴리비닐알코올은 0.5 내지 10 중량%로 사용하는 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공하며, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공하며, 상기 점증제는 카복시메틸셀루로스 나트륨염(CarboxyMethylCellulose sodium salt), 알긴산 나트륨(Sodium Alginate), 히알루론산(Hyaluronic acid), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 하이드록시에칠셀룰로오스(HydroxyEthyl-Cellulose) 및 폴리비닐피롤리돈(PolyVinylPyrrolidone)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공하며, 상기 안정화제는 트레할로오스(Trehalose), 메티오닌(Methionine), 인산나트륨(Sodium phosphate), 및 사람혈청알부민과 염화나트륨의 혼합물(Mixture of human serum albumin and sodium chloride)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공하며, 상기 목적하는 대상체는 마이크로 구조체인 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공하며, 상기 마이크로 구조체는 마이크로 니들인 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
보툴리눔 독소는 신경 기능을 가지는 동물에 있어서 신경근육종말의 콜린성 전시냅스에서 아세틸콜린의 엑소시토시스를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 보툴리눔 독소의 신경 독성 기능은 다양한 질병에서의 치료 효과가 크지만 독성이 강하여 극소량으로도 치명적이므로, 생체를 대상으로 한 이용 시 미세한 농도 조절 기술 및 정확한 위치에 투여하는 기술이 필수적이다. 본 발명은 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술에 관한 것으로, 본 발명의 마이크로 구조체를 이용하여 보툴리눔 독소 투여시 통증을 경감시키고, 미량의 독소를 정확한 위치에 투여 가능하도록 하므로, 보툴리눔 독소의 안전하고 편리한 의학적 이용에 크게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 전처리 코팅 물질에 따른 보툴리눔 독소의 절대역가 대비 회수율 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 보툴리눔 독소와 혼합되는 점증제 종류 및 농도에 따른 보툴리눔 독소의 절대역가 대비 회수율 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 보툴리눔 독소와 혼합되는 안정화제 종류 및 농도에 따른 보툴리눔 독소의 절대역가 대비 회수율 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, SA 및 HA 점증제와 안정화제의 조합의 장기 안정성 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, PVP 및 HEC 점증제와 안정화제의 조합의 장기 안정성 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 보툴리눔 독소 역가 시험을 위한 희석배수의 확인
2X 코팅 조성물과 2X 보툴리눔 독소 조성물을 혼합하였을 때 발생하는 보툴리눔 독소 역가의 손실률을 알 수 없으므로, 예비시험을 통해 보툴리눔 독소 조성물 조제 직후의 역가의 추이를 확인하고자 하였다.
이를 위해, 2X 코팅 조성물과 2X 보툴리눔 독소 조성물을 개별적으로 제조하고, 1:1로 혼합하여 표 1과 같이 혼합 조성물을 제조하였다.
제조예 2X 코팅 조성물과 2X 보툴리눔 독소 조성물의 최종 혼합 후 농도
HSA+NaCl 0.5 % HSA, 0.9 % NaCl, 5,000 U Toxin/6.5 uL
Tween20 0.2% Tween20, 5,000 U Toxin/6.5 uL
CMC 1% CMC, 5,000 U Toxin/6.5 uL
인산나트륨 (pH6.0) 0.025 M Sodium phosphate, 5,000 U Toxin/6.5 uL
HSA(Human serum albumin)
NaCl(Sodium chloride)
CMC(CarboxyMethylCellulose sodium salt)
인산나트륨(Sodium phosphate)
상기의 혼합 조성물에 대하여, in vitro 역가측정 키트(BoTest® Matrix Botulinum Neurotoxin Detection Kits, Biosentinel, Inc)를 사용하여 보툴리눔 독소의 역가를 측정하였다. 구체적인 방법은 Dunning FM 등의 선행문헌(J Vis Exp. 2014 Mar 3;(85). doi: 10.3791/51170.)에 기재된 바와 동일하게 수행하였다. 또한 조제 직후 역가가 감소할 경우를 대비하여 두 가지 희석배수(75, 112.5)를 적용하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
제조예 예측 역가 (U/6.25 uL) 희석배수 Potency (U) Average SD RSD 회수율 [%]
HSA+NaCl 5000 75 6169.0 6240 100.7 1.6 124.8
112.5 6311.4
Tween20 5000 75 6465.4 6561 135.2 2.1 131.2
112.5 6656.7
CMC 5000 75 3235.5 3427 270.9 7.9 68.5
112.5 3618.6
인산 나트륨(pH6.0) 5000 75 4275.5 4423 208.7 4.7 88.5
112.5 4570.7
혼합 조성물에 대한 보툴리눔 독소의 역가 측정 결과, 절대 역가 대비 50% 이상 회수되는 것을 확인하였다. 그러나 CMC의 경우 희석배수 112.5를 적용했을 때 표준곡선의 범위를 벗어났고, CMC와 인산 나트륨은 조제 직후의 값이 HSA나 Tween20에 비해 낮은 것으로 나타났다.
실시예 2. 전처리 코팅 물질의 선별
PLA(Poly Lactic Acid) 기판의 전처리 코팅 유무와 종류에 따른 보툴리눔 독소의 역가 추이를 확인하고자 하였다.
보툴리눔 독소와 혼합된 HSA+NaCl, Tween20, CMC, 및 인산 나트륨(Sodium phosphate, pH6.0) 코팅 조성물을 PLA 기판(비코팅(Non-coating; N), 2% PVA 전처리 코팅(PVA), 또는 해당 점증제(예; 점증제로 1% HSA+1.8% NaCl을 사용할 경우, PLA 기판 코팅 또한 1% HSA + 1.8% NaCl로 코팅)에 각각 6.5 ㎕ 점적한 후 상온에서 O/N(overnight) 건조시켰다. 건조가 완료된 후 각 기판은 1.5 mL 튜브에 담긴 0.9% NaCl 0.3 mL에 넣어 상온에서 30분간 독소를 용출시켰다. 용출이 완료된 후, 점적 후 회수하는 과정에서 보툴리눔 독소의 역가가 100% 남았을 경우를 가정하여 83.3의 희석배수로 희석하여 in vitro 역가측정을 진행하였다. 그 결과를 표 3 및 도 1에 기재하였다.
제조예 기판 전처리 코팅 예측역가 (U) 희석배수 Potency (U) 회수율 [%]
HSA+NaCl N 5000 83.3 6195.2 123.9
PVA 5000 83.3 6811.5 136.2
해당 점증제 5000 83.3 6020.7 120.4
Tween20 N 5000 83.3 N/D 낮음
PVA 5000 83.3 N/D 낮음
해당 점증제 5000 83.3 N/D 낮음
CMC N 5000 83.3 N/D 낮음
PVA 5000 83.3 5950.5 119.0
해당 점증제 5000 83.3 N/D 낮음
인산나트륨(pH6.0) N 5000 83.3 N/D 낮음
PVA 5000 83.3 3883.3 77.7
상기 결과와 같이, 점적 후 회수하는 과정에서 역가가 표준곡선의 범위를 넘는 값의 경우 N/D로 표기하였다. 인산나트륨(sodium phosphate) 결과를 고려하였을 때, 기판의 전처리 코팅은 2% PVA로 시행한 경우가 안정적으로 역가가 유지되는 것으로 나타났다.
Tween20의 경우 모든 기판에서 역가가 낮아 코팅 조성물로 적합하지 않다고 판단되며, CMC의 경우에도 인산나트륨과 마찬가지로 PVA로 전처리 코팅된 기판을 제외한 모든 기판에서 역가를 확인할 수 없었다.
실시예 3. 보툴리눔 독소를 포함하는 코팅조성물에 최적화된 점증제의 선별
후보물질 중 코팅 조성물에 포함될 점증제를 선별하기 위하여, 8종류의 코팅 후보물질을 각각 2X 농도(2% CMC, 1% SA, 1% HA, 1% MC, 1% HEC, 2% PVP, 1 % HSA+1.8% NaCl, 및 0.05M 인산염)로 제조하고, 보툴리눔 독소 2X 농도액(5,000 U/3.25 ㎕)을 1:1 로 혼합하여 조제된 용액을 2% PVA가 전처리 코팅된 기판에 6.5 ㎕ 점적한 후 상온에서 O/N 건조시켰다. 건조가 완료된 후 각 기판은 1.5 mL 튜브에 담긴 0.9% NaCl 0.3 mL에 넣어 상온에서 30분간 독소를 용출시켰다. 용출이 완료된 후, 점적 후 회수하는 과정에서 역가가 100% 남았을 경우를 가정하여 83.3의 희석배수로 희석하여 in vitro 역가측정을 진행하였다. 그 결과를 표 4 및 도 2에 기재하였다.
Coating solution 종류 n Potency (U) Total Average Total SD Total RSD 전체 평균 회수율 [%]
1. CMC 1-1 4232.3 4004.4 177.7 4.4 80.1
1-2 4057.9
2-1 3877.9
2-2 3849.6
2. SA 1-1 3412.6 3356.6 51.4 1.5 67.1
1-2 3338.3
2-1 3381.0
2-2 3294.6
3. HA 1-1 3216.0 3193.5 72.5 2.3 63.9
1-2 3086.3
2-1 3245.7
2-2 3226.1
4. MC 1-1 4494.5 4507.2 10.1 0.2 90.1
1-2 4518.9
2-1 4509.8
2-2 4505.7
5. HEC 1-1 4627.1 4356.6 183.2 4.2 87.1
1-2 4286.5
2-1 4221.3
2-2 4291.4
6. PVP 1-1 4097.1 4137.5 83.1 2.0 82.8
1-2 4165.6
2-1 4048.2
2-2 4239.2
7. 인산나트륨 1-1 2915.0 2891.0 81.4 2.8 57.8
1-2 2787.1
2-1 2982.6
2-2 2879.5
8. HSA+NaCl 1-1 5044.6 4769.7 216.7 4.5 95.4
1-2 4837.7
2-1 4567.2
2-2 4629.2
CMC(CarboxyMethylCellulose sodium salt)
SA(Sodium Alginate)
HA(Hyaluronic acid 1,000kDa)
MC(Methyl cellulose)
HEC(HydroxyEthyl-Cellulose)
PVP(PolyVinylPyrrolidone)
인산나트륨(Sodium phosphate)
상기 표 4와 같이 1차로 각 실험군에서 시료 2개(샘플 1, 2)를 제조하여 각 시료에서 용출된 독소를 2회 측정하는 방법으로 실시한 결과, 코팅 조성물 중 CMC, MC, HEC, PVP, 및 HSA+NaCl의 목표 역가 대비 회수율은 80% 이상으로 높게 나타났으며, 특히 MC와 HSA+NaCl의 경우 90% 이상의 높은 회수율을 나타내었다. 또한 SA와 HA도 평균 회수율 60% 이상으로 인산나트륨보다 높은 것으로 확인되었다.
실시예 4. 보툴리눔 독소를 포함하는 코팅조성물에 최적화된 안정화제 선별
후보물질 중 코팅 조성물에 포함될 안정화제를 선별하기 위하여, 표 5에 기재된 바와 같이 제조된 코팅 조성물에 보툴리눔 독소 2X 농도액(5,000 U/3.25 ㎕)을 1:1 로 혼합하여 조제된 용액을 2% PVA가 전처리 코팅된 기판에 6.5 ㎕ 점적한 후 상온에서 O/N 건조시켰다. 건조가 완료된 후 각 기판은 1.5 mL 튜브에 담긴 0.9% NaCl 0.3 mL에 넣어 상온에서 30분간 독소를 용출시켰다. 용출이 완료된 후, 점적 후 회수하는 과정에서 역가가 100% 남았을 경우를 가정하여 83.3의 희석배수로 희석하여 in vitro 역가측정을 진행하였다.
제조예 2X 농도
1. PVP+Tre 10% 2% PVP, 20% Tre
2. PVP+Tre 15% 2% PVP, 30% Tre
3. PVP+Tre 20% 2% PVP, 40% Tre
4. PVP+Met 10mM 2% PVP, 20mM Met
5. PVP+Met 20mM 2% PVP, 40mM Met
6. PVP+Met 30mM 2% PVP, 60mM Met
7. HEC+Tre 10% 1% HEC, 20% Tre
8. HEC+Tre 15% 1% HEC, 30% Tre
9. HEC+Tre 20% 1% HEC, 40% Tre
10. HEC+Met 10mM 1% HEC, 20mM Met
11. HEC+Met 20mM 1% HEC, 40mM Met
12. HEC+Met 30mM 1% HEC, 60mM Met
13. CMC+Tre 10% 2% CMC, 20% Tre
14. CMC+Tre 15% 2% CMC, 30% Tre
15.CMC+Tre 20% 2% CMC, 40% Tre
16. CMC+Met 10mM 2% CMC, 20mM Met
17. CMC+Met 20mM 2% CMC, 40mM Met
18. CMC+Met 30mM 2% CMC, 60mM Met
19. HSA+NaCl 1 % HSA, 1.8% NaCl
20. 인산나트륨 0.05M Sodium phosphate
Tre(Trehalose)
Met(Methionine)
실험 결과 CMC를 제외한 PVP와 HEC 그룹은 모든 안정화제 혼합 조건에서 HSA 조제 직후 대비 90% 이상의 회수율을 보인 것을 확인하였다. 상기 결과를 도 3에 기재하였다.
실시예 5. 보툴리눔 독소를 포함하는 코팅조성물의 장기 안정성 확인
상기 실시예 1 내지 4의 결과로부터 선별된 점증제(SA, HA, PVP, 및 HEC)와 안정화제(Tre, 및 Met)의 혼합제의 장기 안정성을 확인하였다.
먼저 SA 및 HA 점증제와 안정화제의 조합의 장기 안정성을 시험하기 위해, PLA 기판을 2% PVA로 전처리 코팅하고, 표 6에 기재된 바와 같이 제조된 코팅조성물에 보툴리눔 독소 2X 농도액(5,000 U/3.25 ㎕)을 1:1 로 혼합하여 6.5 ㎕ 점적한 후 상온에서 O/N 건조시켰다. 건조가 완료된 후 각 기판은 1.5 mL 튜브에 담긴 0.9% NaCl 0.3 mL에 넣어 8일까지 역가 회수율을 측정하였다. 다양한 조합으로 점증제와 안정화제가 혼합된 코팅 조성물 자체가 보툴리눔 독소의 역가 측정에 영향을 줄 수 있기 때문에, 각 시험군에서 1일차에 측정된 역가를 기준값(100)으로 하고, 8일차에 측정된 역가를 1일차 역가 대비로 환산하여 도 4에 기재하였다. 실험 결과, SA 및 HA 점증제를 이용한 대부분의 실험군에서 8일차까지 1일차 역가 대비 50% 이상의 역가를 유지하는 것을 확인하였다.
제조예 비고
1. SA+Tre 10% 0.5% Sodium Alginate, 10% Trehalose
2. SA+Tre 15% 0.5% Sodium Alginate, 15% Trehalose
3. HA+Tre 10% 0.5% Hyaluronic acid, 10% Trehalose
4. HA+Tre 15% 0.5% Hyaluronic acid, 15% Trehalose
5. HA+Tre 20% 0.5% Hyaluronic acid, 20% Trehalose
6. HA+Met 10 mM 0.5% Hyaluronic acid, 10 mM Methionine
7. HA+Met 20 mM 0.5% Hyaluronic acid, 20 mM Methionine
8. HA+Met 30 mM 0.5% Hyaluronic acid, 30 mM Methionine
9. PVP+Tre 10% 1% PolyVinylPyrrolidone, 10% Trehalose
10. PVP+Met 20 mM 1% PolyVinylPyrrolidone, 20 mM Methionine
11. HAS+NaCl 0.5% Human Serum Albumin, 0.9% Sodium Chloride
12. NaP 25mM Sodium Phosphate pH 6.0
또한 PVP 및 HEC 점증제와 안정화제의 조합의 장기 안정성을 시험하기 위해, 상기 SA 및 HA시험과 동일한방법으로 보툴리눔 독소 코팅조성물 제조 및 점적 후 5주간 37℃에서 가속 안정성 시험을 수행하였다. 정확한 실험값의 비교를 위하여 각 시료의 조제 직후 역가를 100%로 환산하여 5주간의 역가 회수율을 비교하였다. 또한 BoTest 시험의 양성대조군인 표준품의 값을 적용하여 시험간 오차를 최소화하였다. 그 결과를 표 7 및 도 5에 기재하였다.
제조예 조제직후 1day 8day 22day 36day
1% PVP 100.0 92.3 71.2 61.1 N/D
1% PVP + 10% Tre 100.0 107.9 85.1 70.2 57.2
1% PVP + Met 20mM 100.0 108.4 105.9 87.7 55.0
0.5% HEC 100.0 80.7 65.2 N/D N/D
0.5% HEC + 10% Tre 100.0 92.5 88.9 66.0 53.4
0.5% HEC + Met 20mM 100.0 104.0 59.9 N/D N/D
HSA+NaCl 100.0 112.7 86.0 61.5 45.6
인산나트륨(pH6.0) 100.0 105.2 89.4 67.9 -
실험 결과 양성대조군인 HSA와 비교했을 때 1% PVP + 10% Tre, 1% PVP + Met 20mM, 및 0.5% HEC + 10% Tre의 세 조건이 보툴리눔 독소 코팅조성물 제조를 위한 최적의 안정화된 조합인 것으로 확인되었다.
상기 실시예 1 내지 5의 결과로부터, 미세하게 농도 조절된 보툴리눔 독소를 통증 등의 불편함 없이 정확한 위치에 투여할 수 있도록 안정화된 마이크로구조체를 제조하는데 있어서 점증제로 카복시메틸셀루로스 나트륨염(CarboxyMethylCellulose sodium salt), 알긴산 나트륨(Sodium Alginate), 히알루론산(Hyaluronic acid), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 하이드록시에칠셀룰로오스(HydroxyEthyl-Cellulose) 및 폴리비닐피롤리돈(PolyVinylPyrrolidone)이 유효하며, 안정화제로 트레할로오스(Trehalose), 메티오닌(Methionine), 인산나트륨(Sodium phosphate), 및 사람혈청알부민과 염화나트륨의 혼합물(Mixture of human serum albumin and sodium chloride)이 모두 효과가 현저한 것을 알 수 있었다.

Claims (19)

  1. 보툴리눔 독소, 제 1 부형제, 및 제 2 부형제를 포함하는 보툴리눔 독소 조성물로서,
    상기 제 1 부형제는 카복시메틸셀룰로오스 나트륨염, 알긴산 나트륨, 히알루론산, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시에칠셀룰로오스, 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,
    상기 제 2 부형제는 트레할로오스, 및 메티오닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이되,
    제 1 부형제로 폴리비닐피롤리돈을 선택하는 경우의 제 2 부형제는 메티오닌인, 보툴리눔 독소 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 보툴리눔 독소 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 부형제는 0.05 내지 10 중량%로 포함되는, 보툴리눔 독소 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 부형제는 0.03 내지 50 중량%로 포함되는, 보툴리눔 독소 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 독소 조성물을 포함하는 마이크로 구조체.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 마이크로 구조체는 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(Microbarb), 마이크로어레이, 및 마이크로전극으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 마이크로 구조체.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 독소 조성물로 코팅된 마이크로 구조체.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 마이크로 구조체는 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(Microbarb), 마이크로어레이, 및 마이크로전극으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 마이크로 구조체.
  9. 보툴리눔 독소, 제 1 부형제, 및 제 2 부형제를 혼합하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 제 1 부형제는 카복시메틸셀룰로오스 나트륨염, 알긴산 나트륨, 히알루론산, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시에칠셀룰로오스, 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,
    상기 제 2 부형제는 트레할로오스, 및 메티오닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이되,
    제 1 부형제로 폴리비닐피롤리돈을 선택하는 경우의 제 2 부형제는 메티오닌인, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 제 1 부형제는 0.05 내지 10 중량%로 혼합하는, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 제 2 부형제는 0.03 내지 50 중량%로 혼합하는, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.
  13. (a) 보툴리눔 독소, 제 1 부형제, 및 제 2 부형제를 혼합하는 단계; 및
    (b) 목적하는 대상체에 (a)의 혼합물을 점적하고 건조시키는 단계를 포함하는 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법으로서,
    상기 제 1 부형제는 카복시메틸셀룰로오스 나트륨염, 알긴산 나트륨, 히알루론산, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시에칠셀룰로오스, 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,
    상기 제 2 부형제는 트레할로오스, 및 메티오닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이되,
    제 1 부형제로 폴리비닐피롤리돈을 선택하는 경우의 제 2 부형제는 메티오닌인, 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 (b)단계 이전에 목적하는 대상체를 고분자화합물로 전처리 코팅하는 단계를 추가로 포함하는, 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 고분자화합물은 폴리비닐알코올(Polyvinyl Alcohol)인, 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 폴리비닐알코올은 0.5 내지 10 중량%로 사용하는, 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법.
  17. 제 13항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법.
  18. 제 13항에 있어서,
    상기 목적하는 대상체는 마이크로 구조체인, 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 마이크로 구조체는 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(Microbarb), 마이크로어레이, 및 마이크로전극으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 목적하는 대상체를 보툴리눔 독소 조성물로 코팅하는 방법.
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