TWI810228B

TWI810228B - 自主神經系統障礙之治療

Info

Publication number: TWI810228B
Application number: TW107143840A
Authority: TW
Inventors: 約翰尼斯克魯卜; 賈基梅涅路多; 伯納代特皮諾
Original assignee: 英商艾普森生物製藥有限公司
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2023-08-01
Also published as: AU2018392818A1; MA51279A; JP2022191409A; EA202091527A1; JP7162059B2; CA3083069A1; BR112020005186A2; TW202017590A; JP2021504301A; WO2019122166A1; JP7445725B2; US20200377872A1; CN111491659A; EP3727429A1; AR113983A1; JP2024059821A; KR20200100625A; MX2020006043A; SG11202002876WA

Abstract

本發明係關於以包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域的梭菌神經毒素治療自主神經系統障礙，其中該欲投予至病患之梭菌神經毒素的劑量係等於或低於將用於治療相同自主神經系統障礙的BoNT/A劑量。

Description

自主神經系統障礙之治療

本發明係關於以神經毒素治療自主神經系統障礙。

梭菌屬(genus Clostridia)中的細菌產生極強且特異性的蛋白質毒素，其可毒害該毒素被遞送到的神經元及其他細胞。此種梭菌神經毒素之例包括由破傷風桿菌(C.tetani)(TeNT)及由肉毒桿菌(C.botulinum BoNT)血清型A-G所產生的神經毒素，以及彼等由巴氏梭菌(C.baratii)及酪酸梭菌(C.butyricum)所產生者。

梭菌神經毒素藉由抑制周圍神經系統中的膽鹼性傳遞而引起肌肉麻痺，特別是在神經肌肉交接處，因而可以致死。在自然界中，梭菌神經毒素被合成為單鏈多肽，其藉由蛋白水解切割現象在轉譯後修飾以形成經二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈。切割發生於特定切割位，其通常稱為活化位，其位於半胱胺酸殘基間提供鏈間雙硫鍵，正是此種雙鏈形式是毒素的活性形式。此兩條鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有大約100kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有大約50kDa之分子量。該H- 鏈包含N-端轉位組件(translocation component)(H_N域)及C-端目標組件(targeting component)(H_C域)。切割位係位於L-鏈及H_N域之間。

梭菌神經毒素的作用模式依據五個不同的步驟：(1)H_C域結合至其目標神經元的細胞膜，之後(2)經由胞內體(endosome)將結合的毒素內化到細胞中，(3)藉由H_N域跨越胞內體膜轉移L-鏈並進入細胞溶質，(4)藉由L-鏈將已知為SNARE蛋白質的細胞內轉運蛋白質蛋白水解切割，該L-鏈提供非細胞毒性蛋白酶功能，及(5)抑制由靶細胞的細胞分泌。

在此一連串的事件中，SNARE蛋白質(可溶性N-乙基馬來醯亞胺敏感因子結合蛋白受體蛋白質(Soluble N-ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein REceptor))是細胞內囊泡融合的組成部分，因此通過囊泡從細胞轉運分泌分子。神經元中存在的SNARE蛋白質之例包括，尤其是SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白(syntaxin)。另一方面，L-鏈的非細胞毒性蛋白酶功能是鋅依賴性內肽酶活性，其對SNARE蛋白質表現出高受質特異性。因此，一旦被遞送至神經元目標細胞，此梭菌神經毒素之無細胞毒性蛋白酶藉由切割其受質SNARE蛋白質而抑制神經傳導物釋放，因此導致神經麻痺。

由於其獨特的性質，梭菌神經毒素，例如肉毒桿菌毒素，已成功應用於廣泛的治療應用，特別是用於運動和自主神經系統障礙，以恢復例如過度活躍神經末梢活動至正常水平。到目前為止已經描繪出至少七種抗原性不同的BoNT血清型，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G(Rossetto,O.et al.,"Botulinum neurotoxins：genetic,structural and mechanistic insights." Nature Reviews Microbiology 12.8(2014)：535-549)。儘管存在這種多樣性，BoNT/A仍然是治療所選擇的血清型，有三種常用的商業製劑(Botox®、Dysport®及Xeomin®)，而市場上只有一種BoNT/B產品(Neurobloc®/Myobloc®)。迄今為止，這些BoNT/A和BoNT/B產品是從梭菌菌株中純化出來的毒素，是目前唯一獲得監管機構批准用於人類應用的兩種BoNT血清型，其中包括痙攣、膀胱功能障礙或多汗症(針對BoNT/A)(詳見例如https：//www.medicines.org.uk/emc/medicine/112,https：//www.medicines.org.uk/emc/medicine/870,https：//www.medicines.org.uk/emc/medicine/2162，藉由引用將其全文併入本文)，對於頸肌張力障礙(針對BoNT/B)(詳見例如https：//www.medicines.org.uk/emc/medicine/20568，藉由引用將其全文併入本文)。

然而，在其治療用途中觀察到的當前限制是在患者中產生中和抗體，這使得將來的治療沒有效用。雖然很少有人報導過Neurobloc®/MyoBloc®的抗原性問題，但到目前為止，這種抗體反應主要是以BoNT/A產品被報導的，這些產品仍然是首選的肉毒桿菌毒素，已經證實這些免疫反應與毒素劑量直接相關(Lange,O.,et al.,Neutralizing antibodies and secondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A：much ado about nothing？Clin Neuropharmacol,2009,32,213-218)。毒素擴散到身體其他部位也可能導致不良反應，毒物擴散的可能性與注射劑量直接相關。

因為中和抗體的產生和毒素擴散都與注射劑量直接相關，故在技術領域中需要用能夠以較低劑量達到相同治療效果水平的產品(例如替代的BoNT血清型)來治療患者。

在這方面的挑戰是各種BoNT血清型的操作方式的差異，其似乎轉化為對相同病症的治療功效的差異。

實際上，為了發揮臨床活性，肉毒桿菌毒素必須進入其目標細胞的神經末端，為此，BoNT藉由其受體結合域(BoNT-HC)與其特異性受體結合而靶向並進入神經元，這在文獻中有明確定義(Schiavo,G.,Matteoli,M.& Montecucco,C.Neurotoxins affecting neuroexocytosis,Physiol Rev,2000,80,717-766)。受體結合通常決定了BoNT識別神經元的功效和特異性。BoNT/B、D-C和G共有兩個同源突觸小泡蛋白質突觸結合蛋白I和II(Syt I/II)作為它們的受體，而BoNT/A、E、D和F使用另一個突觸小泡蛋白質SV2。在這方面，應該注意的是，BoNT血清型對其蛋白質受體的結合親和力也因物種而異：例如，BoNT/B、/DC及/G在囓齒動物的運動神經末梢顯示出遠高於SytI的SytII親和力，而在人類中，它們對SytI的親和力則是大於SytII，這種差異是由於在囓齒動物和人類SytII序列之間獨特的胺基酸變化，依該胺基酸變化的結果，與小鼠SytII相比，人類SytII在調控BoNT/B、/D-C和/G的進入上的效率顯著降低。這也意味著，在人類中，BoNT/B、/D-C和/G的高親和力受體似乎限於次要受體SytI，至少是在運動神經元中。所有這些發現可能為臨床觀察提供一種解釋，即在頸部肌張力障礙患者中達到相同水平的治療效果似乎需要遠高於BoNT/A(其結合不同受體)的BoNT/B劑量(Brashear A.et al.,Safety and efficacy of NeuroBloc(botulinum toxin type B)in type A-resistant cervical dystonia,1999,Neurology 53,1431-1438；Pappert,E.J.& Germanson,T.Botulinum toxin type B vs.type A in toxin-naive patients with cervical dystonia：Randomized,double-blind,noninferiority trial,2008 Mov Disord 23,510-517)。特別是，使用於神經肌肉連接處時，BOTOX®和MyoBloc^TM之間建議的轉換率為1：40(Dressler et al.,Botulinum toxin type B for treatment of axillar hyperhidrosis.,2002,J.Neurol.249,1729-1732；Comella et al.,2005)。

除了蛋白質受體外，所有BoNT血清型都需要脂質共受體神經節苷脂(lipid co-receptor ganglioside)，其在神經元表面上是豐富的並在血清型之間可不相同，並切割不同的SNARE蛋白質基質，其可根據靶向的細胞類型進一步影響它們的治療功效。實際上，BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G的L-鏈蛋白酶切割VAMP，而BoNT/A和BoNT/E的L-鏈蛋白酶切割SNAP25，而BoNT/C的L-鏈蛋白酶切割SNAP25和突觸融合蛋白。

儘管肉毒桿菌神經毒素的最初治療用途是憑藉著抑制骨骼肌神經肌肉連接處的乙醯膽鹼釋放來治療神經肌肉疾病，如肌張力障礙和痙攣，但後來發現這些神經毒素藉由抑制自主神經神經末梢的乙醯膽鹼釋放，對腺體及平滑肌也有效，因此可用於治療各種自主神經系統障礙，例如多汗症、流涎或膀胱過動症。

用於治療多汗症的Botox®(亦已知為A型肉毒桿菌毒素(Onabotulinumtoxin A))的推薦劑量是每個腋窩50個單位(https：//www.medicines.org.uk/emc/medicine/112)，即0.365ng的150kD BoNT/A毒素的劑量。Neurobloc®/Myobloc®(亦已知為B型肉毒桿菌毒素(Rimabotulinumtoxin B))未被批准用於治療多汗症；然而，文獻中已揭露2000單位至4000單位的劑量，即劑量範圍為約4-40ng的150kD BoNT/A毒素。然而，如此高的劑量在局部和全身水平上都沒有副作用，例如口乾、吞嚥困難、胃灼熱等(Dressler D.and Eleopra R.,Clinical use of non-A botulinum toxins：botulinum toxin type B.,Neurotoxicity research 9.2-3(2006)：121-125；Tintner R.et al.,autonomic function after botulinum toxin type A or B：a double-blind,randomized trial.,Neurology 65.5(2005)：765-767；Birklein F.et al. Botulinum toxin type B blocks sudomotor function effectively：a 6 month follow up.,Journal of investigative dermatology 121.6(2003)：1312-1316)。然而，尚未研究用較低劑量的毒素是否可以達到自主神經系統障礙的治療效果。

本發明旨在提供對自主神經系統障礙的改良治療，其避開目前在患者中所觀察到的臨床問題，例如產生抗毒素的中和抗體，以及局部及/或全身副作用。

於第一態樣，本發明提供一種在人類病患中用於治療自主神經系統障礙的梭菌神經毒素，其中該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域，且其中欲投予至病患的梭菌神經毒素劑量等於或少於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量。換言之，本發明係關於一種在所需之人類病患中用於治療自主神經系統障礙的方法，其包含以等於或少於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量的梭菌神經毒素劑量投予該病患之步驟，該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域。更明確而言，本發明係關於包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域的梭菌神經毒素用於製造在人類病患中治療自主神經系統障礙之醫藥品的用途，其中該投予至病患的梭菌神經毒素劑量等於或少於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量。

在一個特定方面，本發明提供一種在人類病患中用於治療自主神經系統障礙的梭菌神經毒素，其中該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域，且其中該投予至病患的梭菌神經毒素劑量為低於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量約1.1倍至約100倍，較佳為約1.3倍至約90倍。換言之，本發明係關於一種在所需之人類病患中用於治療自主神經系統障礙的方法，其包含以低於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量約1.1倍至約100倍，較佳為約1.3倍至約90倍的梭菌神經毒素劑量投予該病患之步驟，該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域。更明確而言，本發明係關於包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域的梭菌神經毒素用於製造在人類病患中治療自主神經系統障礙之醫藥品的用途，其中該投予至病患的梭菌神經毒素劑量低於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量約1.1倍至約100倍，較佳為約1.3倍至約90倍。該劑量較佳以奈克(nanogram)量化。

然而，在一個特定的態樣中，本發明提供一種在人類病患中用於治療自主神經系統障礙的梭菌神經毒素，其中該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域，且其中投予約0.00025ng至約3ng之該梭菌神經毒素劑量至該病患。換言之，本發明提供一種在所需之人類病患中用於治療自主神經系統障礙的方法，其包含以約0.00025ng至約3ng之劑量範圍的梭菌神經毒素投予該病患，該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域。更明確而言，本發明係關於包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域的梭菌神經毒素用於製造在人類病患中治療自主神經系統障礙之醫藥品的用途，其中該投予至病患的梭菌神經毒素之劑量範圍為約0.00025ng至約3ng。

發明之詳細說明

本發明係首次基於發明人不可預期之發現，即BoNT/B至少與人類平滑肌組織上的BoNT/A一樣有效。

此一發現是不可預期的，因為如上所述，與BoNT/A(例如Botox®)相比，治療骨骼肌疾病需要更高劑量的BoNT/B(Neurobloc®/Myobloc®)。可能基於該臨床觀察結果，迄今為止在文獻中僅測試和報導比BoNT/A(例如Botox®)更高劑量的BoNT/B(Neurobloc/Myobloc)用於治療例如涉及平滑肌的多汗症。

據推測，這兩種組織中這種BoNT/B效力的差異是由於平滑肌和骨骼肌疾病實際上並非依賴於相同的神經路徑，平滑肌收縮確實由自主神經神經系統驅動，而骨骼肌收縮由軀體神經系統驅動。頸部肌張力障礙和許多用以肉毒桿菌神經毒素治療的其他疾病(如痙攣)是由骨骼肌過度收縮所引起，而其他疾病，如膀胱過動症(OAB)或神經源性逼尿肌過動症(NDO)是由平滑肌的過度收縮所引起。

軀幹神經系統(SoNS或自主控制神經系統)是與骨骼肌自主控制身體運動相關的周圍神經系統之一部分。SoNS由傳入神經和傳出神經組成，SoNS傳入神經負責傳遞從身體到中樞神經系統(CNS)的感覺，而SoNS傳出神經負責從CNS向身體發出命令，刺激肌肉收縮；它們包括與骨骼肌和皮膚相連的所有非感覺神經元。

自主神經神經系統(ANS)是周圍神經系統的另一個組成部分，也由傳入神經和傳出神經組成。ANS由兩個分支組成：交感神經系統(SNS)和副交感神經系統(PNS)，SNS控制更積極的反應，例如增加心率和血壓。除了平滑肌外，ANS還控制分泌，如汗水、唾液和眼淚。

平滑肌可發現於泌尿系統(膀胱、輸尿管...)、消化系統(胃壁、胃腸道、腸道、歐迪氏(Oddi)括約肌、肛門括約肌、氣管、膽管...)、生殖系統(前列腺、子宮...)、呼吸道、血管系統(血管壁、主動脈、動脈、小動脈、靜脈...)和眼睛虹膜中。平滑肌收縮負責許多身體功能，例如從膀胱釋放尿液、通過消化道移動食物、調節肺部的空氣流動、調節動脈和靜脈中的血壓及縮小瞳孔的大小。

提供外分泌汗腺、唾液腺和淚腺的膽鹼神經元的突觸神經末梢可以用肉毒桿菌神經毒素靶向。與催汗或刺激分泌神經過度活躍相關的神經性疾病包括多汗症，特別是手掌、腋窩或足部的局部多汗症、味覺性出汗(弗雷氏症候群(Frey syndrome))、進食時流淚增加(鱷魚眼淚症候群(crocodile tears syndrome))、過度唾液分泌(流涎，流口水)等。

不希望受到理論束縛，推測在軀幹系統上BoNT/A和BoNT/B之間觀察到的效力與自主神經系統的差異與BoNT/A和BoNT/B對其蛋白質受體(各為SV2及Syt I/II)方面的差異有關，及/或與其目標SNARE(各為SNAP25及VAMP)方面的差異有關。

基於這個假設，進一步推測其他BoNT血清型也使用Syt I/II作為蛋白質受體及/或切割VAMP(例如BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G)對於平滑肌/自主神經系統若不是更好的效力，則將顯示與BoNT/B類似的效力，至少是在人類。

因此，本發明的一種態樣係提供一種在人類病患中用於治療自主神經系統障礙的梭菌神經毒素，其中該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域，且其中欲投予至病患的梭菌神經毒素劑量等於或少於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量。換言之，本發明係關於一種在所需之人類病患中用於治療自主神經系統障礙的方法，其包含以等於或少於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量的梭菌神經毒素劑量投予該病患之步驟，該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域。更明確而言，本發明係關於包含來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域的梭菌神經毒素用於製造在人類病患中治療自主神經系統障礙之醫藥品的用途，其中該投予至病患的梭菌神經毒素劑量等於或少於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量。

在一具體實施例中，該欲以本發明梭菌神經毒素治療之自主神經系統障礙係選自下列所組成之群組：平滑肌疾病、過度分泌疾病、呼吸系統疾病、具有自主神經成分的炎症疾病、神經內分泌疾病和與中樞神經疾病直接相關的其他自主神經系統障礙。

此類自主神經系統障礙之例包括，但不限於： ●平滑肌疾病，特別是由過度的、異常的及/或延長的肌肉收縮(痙攣性疾病)所引起的，包括例如：○泌尿系統疾病，例如神經性性逼尿肌過動(NDO)、膀胱過動症(OAB)，特別是特發性OAB(iOAB)、膀胱痙攣、逼尿肌-括約肌協同失調(DSD)、尿失禁、尿閉留、夜尿、急迫性尿失禁、頻尿；胃腸道疾病，例如歐迪氏括約肌功能障礙、食道痙攣、腸痙攣、賁門弛緩不能、胃輕癱、痙攣性結腸炎、肛裂、便秘、偶爾腹瀉、吞嚥困難、口咽性語言障礙、吞嚥障礙； ○血管和心血管疾病，例如雷諾氏症(Raynaud’s disease)、吻合術後血栓、心臟術後心房顫動、體位性低血壓、血壓障礙；○前列腺疾病，例如良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎、前列腺增生，前列腺肥大；及○性功能障礙：勃起功能障礙、陰莖異常勃起、射精失敗、陰道痙攣；●過度分泌病症，例如多汗症(腋下、手掌、足底多汗，瀰漫性出汗，弗雷氏症候群等)、流涎過多(流口水、流涎)、味覺性出汗、過度流淚、鱷魚眼淚症候群、黏液分泌過多，臭汗症、胃酸分泌、粉刺；●具有過度分泌及/或肌肉構成之呼吸道病症，例如流鼻水、慢性鼻炎、氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管過度反應、喘鳴、非自願吸氣性喘息、呼吸中止；●具有自主神經構成之炎症疾病，例如中耳炎、發癢、瘙癢症、炎症性腸症候群；●神經內分泌失調：糖尿病、高胰島素血症、高血糖胰臟病、甲狀腺疾病、低鈣血症、甲狀腺功能亢進、代謝紊亂、過度脂肪分解；及●與中樞神經系統疾病直接相關之其他自主神經系統障礙，如帕金森病和小腦/錐體束特徵(pyramidal feature)。

在一較佳具體實施例中，該欲根據本發明治療之自主神經系統障礙為選自泌尿系統疾病、胃腸道疾病、血管和心血管疾病、前列腺疾病及性功能障礙所組成群組之平滑肌疾病。

於本文中使用時，術語「梭菌神經毒素」意指進入神經元並抑制神經傳導物釋放之任一多肽。此過程涵括神經毒素結合至低或高親和性受體、神經毒素的內化、神經毒素的內肽酶部分轉位到細胞質中及神經毒素基質的酶修飾。更具體而言，術語「神經毒素」涵括進入神經元並抑制神經傳導物釋放之任一梭狀芽孢桿菌產生的多肽(梭菌神經毒素)，且此種多肽係藉由重組技術或化學技術產生。此種雙鏈形式為毒素之活性形式。此兩鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有約100kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有約50kDa之分子量。較佳地，該梭菌神經毒素為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)。

可基於特定中和抗血清的去活化來區分BoNT血清型A至G，此種利用血清型之分類係與胺基酸程度的序列同一性(sequence identity)百分比相關。基於胺基酸序列同一性百分比，給定的血清型之BoNT蛋白質被進一步分成不同亞型。

提供BoNT/A神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：1(UniProt登錄號A5HZZ9)。提供BoNT/B神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：2(UniProt登錄號B1INP5)。提供BoNT/C神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：3(UniProt登錄號P18640)。提供 BoNT/D神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：4(UniProt登錄號P19321)。提供BoNT/E神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：5(登錄號WP_003372387)。提供BoNT/F神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：6(UniProt登錄號Q57236)或為SEQ ID NO：11(UniProt/UniParc登錄號UPI0001DE3DAC)。提供BoNT/G神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：7(登錄號WP_039635782)。提供BoNT/D-C神經毒素胺基酸序列之一實例為SEQ ID NO：8(登錄號BAM65681)。

如本文使用之術語「H_C域」意指神經毒素重鏈之功能上獨特區，具分子量約50kDa，其能夠使神經毒素與位於目標細胞表面的受體結合。H_C域由兩個結構上獨特的次域(subdomain)所組成，「H_CN次域」(H_C域之N-端部分)及「H_CC次域」(H_C域之C-端部分，亦稱為H_CC域)，其每一者具有約25kDa的分子量。H_CC域能結合至梭菌神經毒素蛋白質受體。

如本文使用之術語「LH_N域」意指不同於H_C域且由內肽酶域(「L」或「輕鏈」)及負責將內肽酶轉位至細胞質的域(重鏈之H_N域)所組成之神經毒素。內肽酶域能切割SNARE蛋白質。

例示的L、H_N、H_CN及H_CC域示於表1。

表1-例示的L、H_N、H_CN及H_CC域

上述參考序列應被視為指引，因依據亞血清型可能會發生輕微的變化。舉例來說，US 2007/0166332(藉由引用將其全文併入本文)引用些微不同的梭菌序列。

術語「活化環(activation loop)」意指包含蛋白水解切割位的多肽。神經毒素的活化環已在本領域中描述，例如於WO2016156113(藉由引用將其全文併入本文)。

在本發明一具體實施例中，梭菌神經毒素之H_CC域選自由以下胺基酸序列所組成之群組組成或包含其等：-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1083至1276，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1077至1268，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1090至1297，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1092至1285，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列。

如整個說明書中所使用，二或多個核酸或胺基酸序列之間的術語「序列同一性百分比」意指在對齊的胺基酸序列共有的相同位置上相同胺基酸之數量的函數。因此，本文所使用之%同一性可計算為在比對中每個位置的相同胺基酸的數量除以比對序列中的胺基酸總數，再乘以100。序列同一性%之計算亦可考量間隙的數目，以及需要導入的每個間隙的長度以最佳化對齊兩個或更多個序列。兩個或更多個序列之間的序列比較及百分比同一性的確定可使用特定的數學運算法來進行，特別是整體比對數學運算法(global alignment mathematical algorithm)(例如Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48(3),443-453,1972中所述)，其對於本項技術領域中具通常知識者為熟悉的。

在一較佳之具體實施例中，H_CC域由以下胺基酸序列所組成之群組組成或包含其等：-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及-SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1077至1268，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列。

在一較佳之具體實施例中，H_CC域由對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291的胺基酸序列或具有與其之同一性為至少70%之序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性所組成或包含其等。

在一較佳之具體實施例中，H_CC域由對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278的胺基酸序列或具有與其之同一性為至少70%之序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性所組成或包含其等。

在一較佳之具體實施例中，H_CC域由對應於SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1077至1268的胺基酸序列或具有與其之同一性為至少70%之序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性所組成或包含其等。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素由任何與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11具有至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列所組成或包含其等。

在一較佳具體實施例中，該梭菌神經毒素由任何與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11具有至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列所組成或包含其等。

在一較佳具體實施例中，該梭菌神經毒素由與SEQ ID NO：2具有至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列所組成或包含其等。

在一較佳具體實施例中，該梭菌神經毒素由與SEQ ID NO：6具有至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列所組成或包含其等。

在一較佳具體實施例中，該梭菌神經毒素由與SEQ ID NO：11具有至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列所組成或包含其等。

在一更佳具體實施例中，該梭菌神經毒素為BoNT/B神經毒素。較佳地，該BoNT/B梭菌神經毒素由與SEQ ID NO：2具有至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列所組成或包含其等。

在一更佳具體實施例中，該梭菌神經毒素為BoNT/F神經毒素。較佳地，該BoNT/F梭菌神經毒素由與SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11具有至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列所組成或包含其等。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素為嵌合神經毒素。

如本文所使用，術語「嵌合神經毒素」意指一神經毒素其包含源自第一神經毒素之一或多個域及源自第二神經毒素之一或多個域。例如，一嵌合神經毒素可包含源自第一神經毒素血清型或亞型之LH_N域及源自第二神經毒素血清型或亞型之H_C域。嵌合神經毒素另一實例為一神經毒素其包含源自第一神經毒素血清型或亞型之LH_N H_CN域及源自第二神經毒素血清型或亞型之H_CC域。嵌合神經毒素之進一步實例為一神經毒素其包含源自第一神經毒素血清型或亞型之LH_N域及源自第二神經毒素血清型或亞型之活化環。嵌合神經毒素之實例被提供於WO2017191315及WO2016156113，其二者藉由引用將其全文併入本文。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素為嵌合神經毒素，其包含來自BoNT/B之H_C域及來自BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/D-C之LH_N域。

在根據本發明嵌合神經毒素之一具體實施例中，該H_C域由選自下列所組成之群組之胺基酸序列所組成或包含其等：- SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1291，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，- SEQ ID NO：4之胺基酸殘基864至1276，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，- SEQ ID NO：6之胺基酸殘基866至1278，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，- SEQ ID NO：11之胺基酸殘基863至1268，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，- SEQ ID NO：7之胺基酸殘基865至1297，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及- SEQ ID NO：8之胺基酸殘基864至1285，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，且LH_N域由選自下列所組成之群組之胺基酸序列所組成或包含其等：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至872，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至859，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至867，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至863，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至846，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至865，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1至862，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列， -SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至864，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至863，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列。

在一較佳具體實施例中，該H_C域由對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1291的胺基酸序列，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列所組成或包含其等，且該LH_N域由選自下列所組成群組之胺基酸序列所組成或包含其等：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至872，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至867，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至863，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至846，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至865，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1至862，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至864，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至863，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列。

在一更佳具體實施例中，該梭菌神經毒素為嵌合神經毒素，其包含來自BoNT/B之H_C域及來自BoNT/A之LH_N域。

在一更佳具體實施例中，該H_C域由對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1291的胺基酸序列，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列所組成或包含其等，且該LH_N域包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至872的胺基酸序列，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素為一嵌合神經毒素，其包含來自BoNT/B之H_CC域及來自BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G 或BoNT/D-C之LH_NH_CN域。

在一根據本發明嵌合神經毒素之具體實施例中，該H_CC域由選自下列所組成群組之胺基酸序列所組成或包含其等：-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1083至1276，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1077至1268，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1090至1297，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1092至1285，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，且該LH_NH_CN域由選自下列所組成群組之胺基酸序列所組成或包含其等：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至1094，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至1081，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至1095，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至1082，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至1069，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至1087，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1至1076，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至1089，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至1091，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、 95%或99%序列同一性之序列。

在一較佳具體實施例中，該H_CC域由對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291的胺基酸序列，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列所組成或包含其等，且該LH_NH_CN域由選自下列所組成群組之胺基酸序列所組成或包含其等：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至1094，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至1095，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至1082，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至1069，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至1087，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，-SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1至1076，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列， -SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至1089，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至1091，或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之序列。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素為嵌合神經毒素，其包含來自第一BoNT/F亞型之LH_N域及來自第二BoNT/F亞型之活化環，其中該第二BoNT/F亞型不同於該第一BoNT/F亞型。此類BoNT/F亞型及BoNT/F嵌合神經毒素已被敘述於技術中，例如於WO2016156113(其藉由引用將其全文併入本文)。

在較佳具體實施例中，該LH_N域為BoNT/F7亞型LH_N域及/或該活化環為BoNT/F1亞型活化環。

在較佳具體實施例中，該活化環包含或由胺基酸序列SEQ ID NO：14組成。

在較佳具體實施例中，該嵌合神經毒素包含胺基酸序列SEQ ID NO：13或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列或由其等組成。

該梭菌神經毒素可為經修飾神經毒素或其衍生物，包括但不限於以下所述者。經修飾之神經毒素或衍生物可含有一或多個胺基酸，與神經毒素的天然形式相比，其等已被修飾。這種修飾之例，亦稱為突變，包括但不限於胺基酸殘基取代、添加或刪除。在本發明上下文中，經修飾的梭菌神經毒素相對於天然梭菌神經毒素胺基酸序列可例如在一或多個域中具有經修飾的胺基酸序列。術語自然的、未經修飾的、天然的、天然存在的或野生型可在本文中互換使用。

這些修飾可能影響神經毒素的功能態樣，例如生物活性或持久性。然而，在本發明上下文中，經修飾的神經毒素可以說是具有功能性。換言之，本發明經修飾之神經毒素保留神經毒素的功能，選自能與目標細胞上的低或高親和力神經毒素受體結合的能力、能轉運神經毒素的內肽酶部分(輕鏈)進入細胞質的能力和切割SNARE蛋白質的能力。

根據本發明的經修飾神經毒素可在重鏈的胺基酸序列中具有一或多個修飾(例如在H_C域中)，其中該經修飾的重鏈以比天然神經毒素更高或更低的親和力結合至目標神經細胞。H_C域中此類修飾可包括在H_CC域的神經節苷脂結合位中修飾胺基酸殘基，其可改變與目標神經細胞之神經節苷脂的結合，及/或在H_CC域的蛋白質受體結合位中的胺基酸殘基修飾可改變與目標神經細胞之蛋白質受體的結合。此類經修飾之神經毒素實例敘述於WO2006027207及WO2006114308，其二者藉由引用將其全文併入本文。

在根據本發明的經修飾梭菌神經毒素之一具體實施例中，相較於該BoNT血清型之天然H_CC域，來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G之H_CC域被修飾。

在較佳具體實施例中，該來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G神經毒素之H_CC域包含至少一個胺基酸殘基突變，當相較於天然BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/D-C H_CC域，其增加該H_CC域對於人類Syt II之結合親和力。發明人確實發現這種胺基酸殘基突變可以增加神經毒素對人類平滑肌的效力。

在更佳之具體實施例中，該來自BoNT/B神經毒素之H_CC域包含至少一個胺基酸殘基突變，當相較於天然BoNT/B H_CC域，其增加該H_CC域對於人類Syt II之結合親和力。仍較佳地，該至少一個胺基酸殘基突變相較於天然BoNT/B H_CC域，對於人類Syt II之結合親和力係增加至少50%。

此類在BoNT/B H_CC域中適當之胺基酸殘基突變已被描述於WO2013180799及WO2016154534之技術中，其二者藉由引用將其全文併入本文。

特別是，與天然BoNT/B H_CC域相比，該適於將BoNT/B H_CC域對於人類Syt II之結合親和力增加至少50%的至少一個胺基酸殘基突變為選自下列所組成群組之胺基酸殘基的取代、增加或刪除：1118M、1183M、1191M、1191I、1191Q、1191T、1199Y、1199F、1199L、1201V、1191C、1191V、1191L、1191Y、1199W、1199E、1199H、1178Y、1178Q、1178A、1178S、1183C、1183P及其之任何組合。較佳地，在BoNT/B H_CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係由選自下列所組成群組二個胺基酸殘基的取代、增加或刪除：1191M與1199L、1191M與1199Y、1191M與1199F、1191Q與1199L、1191Q與1199Y、1191Q與1199F、1191M與1199W、1191M與1178Q、1191C與1199W、1191C與1199Y、1191C與1178Q、1191Q與1199W、1191V與1199W、1191V與1199Y或1191V與1178Q。仍較佳地，在BoNT/B H_CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係三個胺基酸殘基之取代、增加或刪除：1191M、1199W與1178Q。更佳地，在BoNT/B H_CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係二個胺基酸殘基取代、增加或刪除：1191M與1199Y。

在一更佳的具體實施例中，與天然BoNT/B H_CC域相比，該適於將BoNT/B H_CC域對於人類Syt II之結合親和力增加至少50%的至少一個胺基酸殘基突變為選自下列所組成群組之胺基酸殘基的取代、增加或刪除：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其任何之組合。較佳地，在BoNT/B H_CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係由選自下列所組成群組之二個胺基酸殘基的取代：E1191M與S1199L、E1191M與S1199Y、E1191M與S1199F、E1191Q與S1199L、E1191Q與S1199Y、E1191Q與S1199F、E1191M與S1199W、E1191M與W1178Q、E1191C與S1199W、E1191C與S1199Y、E1191C與W1178Q、E1191Q與S1199W、E1191V與 S1199W、E1191V與S1199Y、或E1191V與W1178Q。仍較佳地，在BoNT/B H_CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係三個胺基酸殘基之取代：E1191M、S1199W與W1178Q。更佳地，在BoNT/B H_CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係二個胺基酸殘基之取代：E1191M與S1199Y。

在較佳具體實施例中，該欲修飾之BoNT/B H_CC域對應於SEQ ID NO：2(天然BoNT/B H_CC域)之胺基酸殘基1082至1291，或對應於具有與其至少70%，較佳為至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列。

在一更佳的具體實施例中，該本發明經修飾之梭菌神經毒素包含胺基酸序列SEQ ID NO：9或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列或由其等組成。

在較佳具體實施例中，該來自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C BoNT/F或BoNT/G神經毒素之H_CC域包含至少一個胺基酸殘基突變，當相較於天然BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/D-C H_CC域，其增加該H_CC域對於一或多種神經節苷脂之結合親和力。

在一更佳的具體實施例中，該來自BoNT/F之H_CC域包含至少一個胺基酸殘基突變，當相較於天然BoNT/F H_CC域，其增加該H_CC域對於一或多種神經節苷脂之結合親和力。

在較佳具體實施例中，該神經節苷脂選自GD1a及/或GM1a。

當相較於天然BoNT/F H_CC域，用於增加BoNT/F H_CC域對於神經節苷脂(例如GD1a及/或GM1a)之結合親和力的適當胺基酸殘基突變包括，但不限於胺基酸突變1241K，例如胺基酸取代、增加或刪除。更佳地，當相較於天然BoNT/F H_CC域，增加該BoNT/F H_CC域之結合親和力的該至少一個胺基酸殘基突變為胺基酸取代H1241K。

在較佳具體實施例中，該欲修飾之BoNT/F H_CC域對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278或對應於SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1077至1268(天然BoNT/B H_CC域)，或對應於具有與其至少70%，較佳為至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列。

在較佳具體實施例中，本發明嵌合梭菌神經毒素包含胺基酸序列SEQ ID NO：12或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列或由其等組成。

在一具體實施例中，本發明梭菌神經毒素可為嵌合及經修飾的，如上所述。例如，在較佳具體實施例中，該梭菌神經毒素包含胺基酸序列SEQ ID NO：10或具有與其至少70%，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性之胺基酸序列或由其等組成。

本發明梭菌神經毒素可使用重組技術製造。因此，在一具體實施例中，本發明梭菌神經毒素為重組梭菌神經毒素。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素與BoNT複合蛋白有關，亦稱為無毒神經毒素相關蛋白(NAP)。換言之，將梭菌神經毒素與BoNT複合蛋白聯合或與其組合投予人類病患。

在另一個具體實施例中，梭菌神經毒素不含BoNT複合蛋白(或不與其聯合或組合)。換言之，梭菌神經毒素不與BoNT複合蛋白聯合或組合投予人類病患。

較佳地，梭菌神經毒素與至少一種醫藥上可接受載劑一起為醫藥組成物的一部分。關於「醫藥上可接受載劑」，本文中其意指與醫藥組成物的其他成分相容，特別是與梭菌神經毒素相容，並且對人類病患無害的任何組分。醫藥上可接受載劑可依標準藥學實務根據所需的給藥途徑選擇，並包括但不限於賦形劑、稀釋劑、佐劑、推進劑和鹽類。

因此，本發明進一步關於一種用於治療人類病患自主神經系統障礙之醫藥組成物，其中該組成物包含本發明梭菌神經毒素和至少一種醫藥上可接受載劑，且投予病患的梭菌神經毒素之劑量如上所述。

本發明梭菌神經毒素可調配用於口服、腸胃外外(即注射)、連續輸注、吸入或局部給藥。適於注射的醫藥組成物可為溶液、懸浮液或乳液型式，或在使用前溶解或懸浮於適當媒劑中的乾粉。

在欲局部遞送神經毒素的情況中，神經毒素可調配成乳膏(例如用於局部投予)，或用於皮下注射。

局部遞送裝置可包括氣溶膠或其他噴霧(例如噴霧器)。於此方面，神經毒素的氣溶膠製劑能夠遞送至肺及/或其他鼻及/或支氣管或氣管通道。

本發明的梭菌神經毒素亦可藉由鞘內或硬膜外注射投予至病患之脊柱中在涉及受影響器官神經支配的脊柱節水平位置。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素或醫藥組成物用於肌肉內、皮內或皮下給藥。

在一具體實施例中，該梭菌神經毒素或醫藥組成物係用於局部給藥，例如經由滴注。

較佳的投予路徑是經由肌肉內注射。

然而，也可以在不使用任何注射的情況下將梭菌神經毒素施用於肌肉，例如，治療泌尿系統疾病，可藉由以梭菌神經毒素的液體或半固體調配物輸注患者的膀胱來投予梭菌神經毒素至膀胱；在病患膀胱的適當位置沉積含有梭菌神經毒素的凝膠調配物；在患者膀胱的適當位置噴灑含有梭菌神經毒素的噴霧調配物；或局部施用固體(例如凍乾的)、半固體或液體的肉毒桿菌毒素調配物，其被放置或鋪展在球囊的外壁上，然後將球囊充氣使其與該膀胱壁接觸，如WO2005053733中所述，其藉由引用將其全文併入本文。

如上所述，梭菌神經毒素的劑量適於在患有自主神經系統障礙的人類病患中實現所需的治療效果，或，換言之，該梭菌神經毒素的治療劑量等於或低於治療相同自主神經系統障礙的BoNT/A劑量。

較佳地，該治療相同自主神經系統障礙的BoNT/A為經純化之BoNT/A。如本文所使用，術語「經純化之BoNT/A」意指由自然產生其之梭菌菌株(天然存在的菌菌株)所純化的肉毒桿菌神經毒素A型。該經純化之BoNT/A可與複合蛋白有關或不含複合蛋白，商業上可獲得之經純化的BoNT/A的實例包括Botox®、Dysport®及Xeomin®。

在一具體實施例中，用於治療人類病患中自主神經系統障礙的梭菌神經毒素的劑量(治療劑量)為低於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A劑量約1.1倍至約100倍，較佳約1.3倍至約90倍。

在較佳具體實施例中，當該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B之H_CC域時，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量約1.1倍至約20倍，較佳約1.3倍至約19.8倍。例如，當本發明梭菌神經毒素為天然BoNT/B神經毒素時，例如胺基酸序列SEQ ID NO：2之神經毒素，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量約1.1倍至約1.5倍，較佳約1.3倍。如進一步之實例，當本發明梭菌神經毒素為對於人類SytII受體具有增強之結合親和力(相較於天然BoNT/B)的經修飾之BoNT/B神經毒素時，例如胺基酸序列SEQ ID NO：9之神經毒素，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量的約15倍至約20倍，較佳約19.8倍。再者，如另一實例，當本發明梭菌神經毒素為對於人類SytII受體具有增強之結合親和力(相較於天然BoNT/B)的經修飾之嵌合BoNT/B神經毒素時，例如胺基酸序列SEQ ID NO：10之神經毒素，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量的約2倍至約5倍，較佳約3.5倍。

在較佳具體實施例中，當該梭菌神經毒素包含來自BoNT/F之H_CC域時，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量的約60倍至約100倍，較佳約61.2倍至約90倍。例如，當本發明梭菌神經毒素為天然BoNT/F神經毒素時，例如胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11之神經毒素，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量約60倍至約65倍，較佳約61.2倍。如進一步之實例，當本發明梭菌神經毒素為對於一或多種神經節苷脂具有增強之結合親和力(相較於天然BoNT/F)的經修飾之BoNT/F神經毒素時，例如胺基酸序列SEQ ID NO：12之神經毒素，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量的約60倍至約65倍，較佳約61.2倍。再者，如另一實例，當本發明梭菌神經毒素為嵌合BoNT/F神經毒素時，例如胺基酸序列SEQ ID NO：13之神經毒素，該梭菌神經毒素之治療劑量為低於治療相同自主神經系統障礙之BoNT/A劑量的約85倍至約100倍，較佳約90倍。

如上所述，治療自主神經系統障礙的BoNT/A劑量在技術領域中是熟知的(https：//www.medicines.org.uk/emc/medicine/112)。

本文中梭菌神經毒素的劑量以奈克為單位測量。

根據本發明的梭菌神經毒素的劑量應理解為活性雙鏈梭菌神經毒素的劑量，即不包括神經毒素可能與之聯合的複合蛋白的量。換言之，其意指活性雙鏈梭菌神經毒素的劑量，無論該神經毒素是否與複合蛋白聯合或沒有復合蛋白而投予病患。如本領域技術人員所熟知的，活性雙鏈梭菌神經毒素能結合神經元受體、將輕鏈轉移到細胞質中並切割SNARE蛋白質，而復合蛋白質不顯示這種生物活性(即並非「活性的」)。在肉毒桿菌神經毒素的情況下，活性雙鏈的總大小通常為約150kD。

實際上，如本領域技術人員所熟知的，梭菌神經毒素的效力與需要達到LD50(致死劑量50)單位所需的神經毒素的量(例如納克)有關；一個LD50單位被定義為半數死亡之腹膜內投予劑量(在小鼠中測量)。然而，目前市場上的BoNT藥物製劑含有不同量的150kD神經毒素，而且還含有LD50單位。此外，在這些製劑中，神經毒素可能或可能不與無毒的神經毒素聯合蛋白(NAP)聯合(即組合)，也稱為複合蛋白。為了便於轉換：-100單位之Botox®(亦已知為OnabotulinumtoxinA)含有約0.73ng之150kD BoNT/A，及複合蛋白； -100單位之Dysport®(亦已知為AbobotulinumtoxinA)含有約0.65ng之150kD BoNT/A，及複合蛋白；-100單位之Xeomin®(亦已知為IncobotulinumtoxinA)含有約0.44ng之150kD BoNT/A，及複合蛋白；-100單位之Neurobloc/Myobloc®(亦已知為RimabotulinumtoxinB)含有約0.2ng至約1ng之150kD BoNT/B，及複合蛋白。

梭菌神經毒素的量可藉由熟悉技術者以本領域習知所使用的方法測量，較佳以奈克程度定量蛋白質，包括質譜法，例如同位素稀釋質譜法(Muñoz et al.,Quantification of protein calibrants by amino acid analysis using isotope dilution mass spectrometry,Anal.Biochem.2011,408,124-131)，或螢光測定法(Poras et al.,Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin Type A by a Novel Rapid In Vitro Fluorimetric Assay,Appl Environ Microbiol.2009 Jul；75(13)：4382-4390)。

在本文所提供之範圍值下，應當理解，除非上下文另有明確規定，否則亦已具體揭示該範圍上限和下限間的單位十分之一的每個中間值。在所述範圍內的任何所述值或所述範圍內的中間值之間的每個較小範圍以及在該所述範圍內的任何其他所述或中間值皆包含在本揭示範圍內。亦應理解，本文中用「從a到b」所表示的任何數值範圍意指從a到b延伸的數值範圍(即包括精確的端點a和b)。

此外，術語「約」在本文中應理解為其使用數字的數值之正或負(±)5%，較佳為±4%、±3%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%。

在較佳具體實施例中，用於治療人類病患的自主神經系統障礙所欲投予之本發明梭菌神經毒素的劑量範圍(即治療劑量)為約0.00025ng至約3ng。

在較佳具體實施例中，該梭菌神經毒素之治療劑量範圍為約0.0003ng至約2ng，較佳為約0.0004ng至約1.5ng，約0.0005ng至約1ng，仍較佳為約0.0006ng至約0.5ng之該梭菌神經毒素。

在較佳具體實施例中，該梭菌神經毒素包含BoNT/B H_CC域或BoNT/F H_CC域，且以本文中所述之任何劑量的該梭菌神經毒素投予人類病患，用於治療自主神經系統障礙，如上所述。

在一更佳的具體實施例中，該梭菌神經毒素包含BoNT/B H_CC域或BoNT/F H_CC域，且以本文中所述之任何劑量的該梭菌神經毒素投予人類病患，用於治療平滑肌疾病，如上所述。更佳地，該平滑肌疾病選自泌尿系統疾病、胃腸道疾病、血管和心血管疾病、前列腺疾病及性功能障礙所組成之群組。

例如，該包含BoNT/B H_CC域之梭菌神經毒素的治療劑量較佳範圍為約0.001ng至約2ng。

然而，例如，該包含BoNT/B H_CC域之梭菌神經毒素的治療劑量較佳範圍為約0.0003ng至約0.05ng。

然而，應該理解所需的劑量範圍取決於梭菌神經毒素的確切性質、自主神經系統障礙、給藥途徑、調配物的性質、患者年齡、病患病情的性質、程度或嚴重性、禁忌症(如有)以及主治醫師的判斷。這些劑量水平的變化可使用標準經驗程序調整以進行優化。

作為參考，以下提供用於治療一些特定自主神經系統障礙的天然BoNT/A(例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：1的神經毒素)的適當劑量之實例：-NDO(神經源性逼尿肌過動症)：1.46ng天然BoNT/A至逼尿肌中；-OAB(膀胱過動症)：0.73ng天然BoNT/A至逼尿肌中；-腋窩多汗症：0.365ng天然BoNT/A至各腋下；-成年病患之流涎，特別是在帕金森氏症病患：0.146ng天然BoNT/A每一頜下及/或腮腺；-小兒腦癱患者之流涎：0.073ng天然BoNT/A每一頜下及/或腮腺。

根據本發明用於治療上述病症的天然BoNT/B(例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：2的神經毒素)的適當劑量範圍之實例為：-NDO(神經源性逼尿肌過動症)：0.5ng至2ng天然BoNT/B至逼尿肌中；-OAB(膀胱過動症)：0.25ng至1ng天然BoNT/B至逼尿肌中；-腋窩多汗症：0.125ng至0.5ng天然BoNT/B至各腋下；-成年病患之流涎，特別是在帕金森氏症病患：0.05ng至0.2ng天然BoNT/B每一頜下及/或腮腺；-小兒腦癱患者之流涎：0.025ng至0.1ng天然BoNT/A每一頜下及/或腮腺。

根據本發明用於治療上述病症之對於人類SytII受體具有增強之結合親和力的經修飾之BoNT/B(例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：9的神經毒素)的適當劑量範圍之實例為：-NDO(神經源性逼尿肌過動症)：0.025ng至0.2ng經修飾之BoNT/B至逼尿肌中；-OAB(膀胱過動症)：0.0125ng至0.1ng經修飾之BoNT/B至逼尿肌中；-腋窩多汗症：0.0075ng至0.05ng經修飾之BoNT/B至各腋下；-成年病患之流涎，特別是在帕金森氏症病患：0.0025ng至0.02ng經修飾之BoNT/B每一頜下及/或腮腺；-小兒腦癱患者之流涎：0.001ng至0.01ng經修飾之BoNT/B每一頜下及/或腮腺。

根據本發明用於治療上述病症之對於人類SytII受體具有增強之結合親和力的嵌合經修飾之BoNT/B(例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：10的神經毒素)的適當劑量範圍之實例為：-NDO(神經源性逼尿肌過動症)：0.2ng至1ng嵌合經修飾之BoNT/B至逼尿肌中；-OAB(膀胱過動症)：0.1ng至0.5ng嵌合經修飾之BoNT/B至逼尿肌中；-腋窩多汗症：0.05ng至0.2ng嵌合經修飾之BoNT/B至各腋下；-成年病患之流涎，特別是在帕金森氏症病患：0.02ng至0.1ng嵌合經修飾之BoNT/B每一頜下及/或腮腺；-小兒腦癱患者之流涎：0.01ng至0.05ng嵌合經修飾之BoNT/B每一頜下及/或腮腺。

根據本發明用於治療上述病症的天然BoNT/F(例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11的神經毒素)的適當劑量範圍之實例為：-NDO(神經源性逼尿肌過動症)：0.01ng至0.05ng天然BoNT/F至逼尿肌中；-OAB(膀胱過動症)：0.005ng至0.025ng天然BoNT/F至逼尿肌中；-腋窩多汗症：0.0025ng至0.01ng天然BoNT/F至各腋下；-成年病患之流涎，特別是在帕金森氏症病患：0.001ng至0.005ng天然BoNT/F每一頜下及/或腮腺；-小兒腦癱患者之流涎：0.0005ng至0.0025ng天然BoNT/F每一頜下及/或腮腺。

根據本發明用於治療上述病症之對於一或多種神經節苷脂具有增強之結合親和力的經修飾之 BoNT/F(例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：12的神經毒素)的適當劑量範圍之實例為：-NDO(神經源性逼尿肌過動症)：0.01ng至0.05ng經修飾之BoNT/F至逼尿肌中；-OAB(膀胱過動症)：0.005ng至0.025ng經修飾之BoNT/F至逼尿肌中；-腋窩多汗症：0.0025ng至0.01ng經修飾之BoNT/F至各腋下；-成年病患之流涎，特別是在帕金森氏症病患：0.001ng至0.005ng經修飾之BoNT/F每一頜下及/或腮腺；-小兒腦癱患者之流涎：0.0005ng至0.0025ng經修飾之BoNT/F每一頜下及/或腮腺。

根據本發明用於治療上述病症之嵌合BoNT/F(例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：13的神經毒素)的適當劑量範圍之實例為：-NDO(神經源性逼尿肌過動症)：0.007ng至0.03ng嵌合BoNT/F至逼尿肌中；-OAB(膀胱過動症)：0.003ng至0.0015ng嵌合BoNT/F至逼尿肌中；-腋窩多汗症：0.001ng至0.007ng嵌合BoNT/F至各腋下；-成年病患之流涎，特別是在帕金森氏症病患：0.0007ng至0.003ng嵌合BoNT/F每一頜下及/或腮腺； -小兒腦癱患者之流涎：0.0003ng至0.0015ng嵌合BoNT/F每一頜下及/或腮腺。

本揭示內容不受本文所揭示之例示性方法和材料的限制，並與本文所描述之該等類似或等同的任何方法和材料皆可用於本揭示具體實施例的實施或測試。除另有說明，否則任何胺基酸序列分別以胺基至羧基方向從左至右書寫。

必須進一步注意的是，於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」、「一種」、及「該」包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一種梭菌神經毒素」包括多種的此種候選藥劑，且意指「該梭菌神經毒素」包括提及本技術領域中具有通常知識者已知的一或多種梭菌神經毒素及其等效物(equivalent)等。

本發明將參考以下列圖示和實施例僅藉由舉例方式描述。

圖1-在1分鐘間隔施加3次刺激後然後休息3分鐘，對於經EFS誘導的收縮的膀胱條收縮反應。

圖2A-在nBoNT/A、nBoNT/B、rBoNT/B_MY和rBoNT/AB_MY的1、3、5或10nM的振幅方面，最大EFS收縮之50%(T50)抑制的時間。

圖2B-在nBoNT/F、mrBoNT/F及mrBoNT/F7-1的0.1、1或10nM的振幅方面，最大EFS收縮之50%(T50) 抑制的時間。

圖3-nBoNT/A、nBoNT/B、rBoNT/B_MY、rBoNT/AB_MY、nBoNT/F及mrBoNT/F7-1的濃度反應曲線。將50%(T50)抑制的時間對肉毒桿菌毒素蛋白質濃度作圖，並配合對數函數，得到優異的R²值。

胺基酸序列：

●SEQ ID NO：1-BoNT/A1，登錄號A5HZZ9，胺基酸序列

●SEQ ID NO：2-BoNT/B1，登錄號B1INP5，胺基酸序列

●SEQ ID NO：3-BoNT/C1，登錄號P18640，胺基酸序列

●SEQ ID NO：4-BoNT/D，登錄號P19321，胺基酸序列

●SEQ ID NO：5-BoNT/E1，登錄號WP_003372387，胺基酸序列

●SEQ ID NO：6-BoNT/F1，登錄號Q57236，胺基酸序列

●SEQ ID NO：7-BoNT/G，登錄號WP_039635782，胺基酸序列

●SEQ ID NO：8-BoNT/DC，登錄號BAM65681，胺基酸序列

●SEQ ID NO：9-BoNT/B_MY，胺基酸序列

●SEQ ID NO：10-BoNT/AB_MY，胺基酸序列

●SEQ ID NO：11-BoNT/F7，胺基酸序列

●SEQ ID NO：12-BoNT/F1(H1241K)，胺基酸序列

●SEQ ID NO：13-BoNT/F7-1，胺基酸序列

●SEQ ID NO：14-活化環，胺基酸序列 KSVIPRKGTKAPPRL

實施例

以下實施例用於說明本發明的特定實施例，且不以任何方式限制申請專利範圍中所定義之發明範圍。

實施例1-人類膀胱組織樣本的研究

簡而言之，人類膀胱組織樣本來自接受膀胱癌膀胱切除術的患者，根據他們的醫學圖表沒有已知的膀胱功能障礙，確保收集和使用任何組織或其他樣本是符合所有相關法律、法規和行為準則進行的，包括以書面形式獲得患者的知情同意(提及數據隱私義務)以及病患醫療病歷。

在外科手術之後，立即將樣品從手術室運送到病理學者的設備，其中選擇正常的膀胱頂(bladder dome)片，即沒有肉眼可見的腫瘤組織進行實驗。移除後，立即將組織樣本在4℃下儲存於含有青黴素(100IU/ml)和鏈黴素(0.1mg/ml)的Krebs-HEPES緩衝液(具有以下mM之組成物：NaCl 118.0；KCl 4.7；MgSO₄ 1.2；KH₂PO₄ 1.2；CaCl₂ 2.5；NaHCO₃ 4.2；葡萄糖11.1；HEPES 20.8；pH7.4)中，以便最佳保存直至使用(在最多24小時內)並運輸到研究設施。

為了製備條帶，小心地移除尿道上皮，並且對於每個實驗從每個捐贈者的膀胱切除八個逼尿肌部分(4×2×2mm)。將剩餘的膀胱組織稱重，分成2個冷凍管並立即在液氮中冷凍，然後儲存在-80℃下用於將來的分析。

使用置於實驗室抽氣罩(Captair Chem Filtair XL1346A)下的裝置進行離體實驗，該裝置由充滿維持於37℃的Krebs-HEPES緩衝液的器官灌流室(organ chamber)構成，並連續鼓泡95%O₂和5%CO₂以維持pH 值為7.4。將膀胱條帶懸掛於5ml器官灌流室中並連接至用於等長張力記錄的力傳感器(Pioden controls Ltd，UK)。施加1g的初始張力。擴增後，使用Chart TM ⁵軟體(AD Instruments Ltd)經由Mac Lab TM/8將張力變化數位化。在大量洗滌之後，經由位於條帶兩側的兩個鉑電極並連接到刺激器(Bionic System Nozay，France)，藉由電場刺激(EFS)使條帶收縮。

在60分鐘的平衡期間調節張力以達到1g的靜息張力(resting tension)，在此期間緩衝溶液每15分鐘更新一次。

在平衡期後，逼尿肌平滑肌條帶藉由依次加入器官浴KCl(100mM，10分鐘)然後加入碳醯膽鹼(carbachol)(3.10^-6M，10分鐘)進行引發，每次加入化合物之間進行洗滌步驟，然後在施加EFS訓練前將0.5%的明膠注入器官浴中。

EFS訓練(20Hz，1ms脈衝持續時間，5秒訓練持續時間，300mA)藉由以1分鐘間隔施加的3次刺激組連續進行，然後進行3分鐘的休息(刺激條件係基於我們對人類膀胱組織的經驗，並選擇在人類膀胱條帶中提供健全和穩定的收縮)，持續刺激直至獲得穩定的反應(當穩定期內最後三組EFS收縮的EFS收縮幅度變化百分比計算為

90%或

110%時，反應被認為是穩定的)。

將各條帶與載體(含有0.5%明膠的Krebs)，0.1、1、3、5或10nM的肉毒桿菌神經毒素一起溫育，並持續EFS刺激3小時。在實驗結束時，藉由向器官浴中加入碳醯膽鹼(3.10^-6M，10分鐘)直接激活蕈毒鹼受體使膀胱條帶收縮。在實驗期間，在肉毒桿菌神經毒素培養之前和之後，比較經碳醯膽鹼誘導的條帶收縮作為條帶的活力測試。

測試八種非複合肉毒桿菌神經毒素：-nBoNT/A，獲自List Biological Laboratories, Inc.(SEQ ID NO：1)之天然肉毒桿菌神經毒素A型；-nBoNT/B，獲自List Biological Laboratories,Inc.(SEQ ID NO：2)之天然肉毒桿菌神經毒素B型；-rBoNT/BMY，重組肉毒桿菌神經毒素B型，包含在H_C域，E1191M及S1199Y的二個突變(SEQ ID NO：9)；-rBoNT/ABMY，重組嵌合肉毒桿菌神經毒素(來自BoNT/A之LH_N域及來自BoNT/B之H_C域)，包含在H_C域，E1191M及S1199Y的二個突變(SEQ ID NO：10)；-nBoNT/F，獲自Metabiologics Inc.之天然肉毒桿菌神經毒素F1亞型(SEQ ID NO：6)；-mrBoNT/F，重組肉毒桿菌神經毒素F1亞型，包含在Hcc域之H1241K單點突變(SEQ ID NO：12)；-mrBoNT/F7-1，重組嵌合肉毒桿菌神經毒素F7亞型，其中活化環原生BoNT/F7活化環已被BoNT/F1活化環取代(SEQ ID NO：13)。

藉由添加0.75μl、7.5μl、22.5μl、37.5μl或75μl肉毒桿菌毒素原液(666nM)至5ml具有0.5%明膠之Krebs-HEPES緩衝液中，將肉毒桿菌神經毒素在器官浴中進行培養，分別獲得0.1、1、3、5或10nM作為器官浴中的最終濃度。

在平均形成張力方面量化對藥理學試劑的收縮反應，在加入KCl或碳醯膽鹼之後，在每個條帶的穩定反應之前和結束時的1分鐘期間測量平均形成張力(mg，對應於所選擇跟踪中數據點的平均值)。

將對於經EFS誘導的收縮之收縮反應量化如下。總而言之，以1分鐘的間隔施加3次刺激，然後休息3分鐘，如圖1所示。

在2次連續刺激(即60秒)間的時間範圍內分析每個經EFS誘導的反應，在每組刺激的最後兩個反應進行此分析3小時。

對於每組刺激，將在最後兩個反應(峰值2和3)上所獲得的值進行平均。

為了量化經EFS誘導的反應，將經EFS誘導的收縮幅度(mg)計算為刺激前形成的張力與在對EFS反應期間最大形成張力之間的差異，即在選擇中最大(Max)與最小(Min)數據點之間的差異。

將這些幅度值表示為對應於最大EFS收縮值的百分比，該最大EFS收縮係在添加肉毒桿菌神經毒素之前的穩定期期間的最後一次刺激訓練期間所測量的。

藉由測定麻痺時間50(T50)(min)值，即抑制50%最大反應所需的時間來評估肉毒桿菌神經毒素的抑製作用。使用GraphPad Prism 6.05可變斜率模型(Y=底部+(頂部-底部)/(1+10^((LogIC50-X)*坡斜率(HillSlope))計算這些值，其亦稱為四參數劑量反應邏輯曲線。

結果列於表3和圖2中。

nBoNT/A、nBoNT/B、rBoNT/B_MY、rBoNT/AB_MY、nBoNT/F、mrBoNT/F和mrBoNT/F7-1在幅度方面顯示出經EFS誘導的收縮反應之的濃度依賴性抑制。nBoNT/A和nBoNT/B在相同濃度下，對人類膀胱條帶的經EFS誘導收縮誘導出相當的抑製作用。此外，在所有劑量下，與nBoNT/A及/或nBoNT/B相比，rBoNT/B_MY、rBoNT/AB_MY、nBoNT/F、mrBoNT/F和mrBoNT/F7-1誘導出更高的人類膀胱條帶之經EFS引起的收縮降低。所有測試的BoNT/F以及rBoNT/B_MY和rBoNT/AB_MY似乎都需要較低的濃度來實現與nBoNT/A或nBoNT/B相同的收縮降低。在所有測試的BoNT中，mrBoNT/F7-1是誘導出最大收縮降低者。

基於上述觀察，根據Weisemann等人(Generation and Characterization of Six Recombinant Botulinum Neurotoxins as Reference Material to Serve in an International Proficiency Test,Toxins,2015,7(12)：5035-5054；doi：10.3390/toxins7124861)所描述的方法定量測試的肉毒桿菌毒素對人類膀胱組織的效力，特別是藉由繪製對比肉毒桿菌毒素蛋白質濃度之T50，並且擬合對數函數產生優異的R²值，如下表4和圖3所示。

結果顯示BoNT/F的效力在人類膀胱組織上最高，其次是BoNT/B，然後是BoNT/A。特別是，nBoNT/B比nBoNT/A強約1.5倍；mrBoNT/B比nBoNT/A強約20倍，比nBoNT/B強約15倍；mrBoNT/AB比nBoNT/A強約4倍，比nBoNT/B強約3倍；nBoNT/F比nBoNT/A強約60倍，比nBoNT/B強約50倍；和mBoNT/F7-1比nBoNT/A強約90倍，比nBoNT/B強約70倍。此外，mrBoNT/F在1nM和10nM下表現出與nBoNT/F相同的T50值：可以合理地推斷出mrBoNT/F與nBoNT/F一樣有效。

因此，基於本文揭示令人驚訝的數據，BoNT/B和BoNT/F神經毒素，以及顯示相似結合、攝取、易位及/或SNARE裂解特性的梭菌神經毒素，例如BoNT/D、BoNT/D-C或BoNT/G，可用於治療人類自主神經系統的疾病，例如平滑肌疾病，特別是泌尿系統疾病 (NOD、OAB等)，其劑量低於或等於用於治療相同疾病之BoNT/A的劑量。表4中所確定的相對效力值可特別依賴確定給予該受試者的BoNT/B、BoNT/F、BoNT/D、BoNT/D-C或BoNT/G梭菌神經毒素的治療量，基於能以BoNT/A治療相同自主神經系統障礙的已知劑量。

<110> 艾普森生物製藥有限公司

<120> 自主神經系統障礙之治療

<130> IBL 006-EP-P2

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1296

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 1276

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 1252

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 1278

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 1297

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 7

<210> 8

<211> 1285

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 8

<210> 9

<211> 1291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變BONT/B

<400> 9

<210> 10

<211> 1304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變BONT/AB

<400> 10

<210> 11

<211> 1268

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 11

<210> 12

<211> 1278

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變BONT/F1(H1241K)

<400> 12

<210> 13

<211> 1270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合BONT/F7-1

<400> 13

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 14

Claims

一種梭菌神經毒素之用途，其係用於製造在人類病患中治療自主神經系統障礙之藥物，其中該梭菌神經毒素包含來自BoNT/B、BoNT/F、BoNT/D、BoNT/D-C或BoNT/G之H_CC域，其中投予至該病患之該梭菌神經毒素之劑量低於或等於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A的劑量，且其中該梭菌神經毒素之H_CC域係由選自以下胺基酸序列所組成之群組所組成或包含以下胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291或具有與其至少90%序列同一性之序列，(ii)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1083至1276或具有與其至少90%序列同一性之序列，(iii)SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278或具有與其至少90%序列同一性之序列，(iv)SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1077至1268或具有與其至少90%序列同一性之序列，(v)SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1090至1297或具有與其至少90%序列同一性之序列，(vi)SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1092至1285或具有與其至少90%序列同一性之序列。
如請求項1之用途，其中該梭菌神經毒素之劑量為低於治療該自主神經系統障礙之BoNT/A的劑量1.1倍至100倍。
如請求項1之用途，其中該梭菌神經毒素之劑量範圍為0.00025ng至3ng。
如請求項1之用途，其中該自主神經系統障礙係選自平滑肌疾病、過度分泌疾病、呼吸系統疾病、具有自主神經成分的炎症疾病、神經內分泌疾病和與中樞神經疾病直接相關的其他自主神經系統障礙。
如請求項1之用途，其中該H_CC域為BoNT/B H_CC域或BoNT/F H_CC域。
如請求項1之用途，其中相較於天然BoNT/B H_CC域，該BoNT/B H_CC域包含對於人類Syt II受體之結合親和力係增加至少50%的至少一個胺基酸殘基突變。
如請求項6之用途，其中該至少一個胺基酸殘基突變係選自1118M、1183M、1191M、1191I、1191Q、1191T、1199Y、1199F、1199L、1201V、1191C、1191V、1191L、1191Y、1199W、1199E、1199H、1178Y、1178Q、1178A、1178S、1183C、1183P及其任何之組合所組成之群組。
如請求項7之用途，其中該至少一個胺基酸殘基突變係由1191M及1199Y二個胺基酸突變所組成。
如請求項1之用途，其中相較於天然BoNT/F H_CC域，該BoNT/F H_CC域包含增加其對於一或多種神經節苷脂之結合親和力的至少一個胺基酸殘基突變。
如請求項9之用途，其中該神經節苷脂係選自GD1a及/或GM1a，及/或該胺基酸殘基突變為1241K。
如請求項1之用途，其中該梭菌神經毒素為BoNT/B神經毒素。
如請求項1之用途，其中該梭菌神經毒素為BoNT/F神經毒素。
如請求項1之用途，其中該梭菌神經毒素為嵌合神經毒素。
如請求項13之用途，其中該嵌合神經毒素包含BoNT/B H_C域及BoNT/A LH_N域。
如請求項13之用途，其中該嵌合神經毒素包含來自第一BoNT/F亞型之LH_N域及來自第二BoNT/F亞型之活化環，且其中該第二BoNT/F亞型不同於該第一BoNT/F亞型。
如請求項15之用途，其中該LH_N域為BoNT/F7 LH_N域及/或該活化環為BoNT/F1活化環。
如請求項13之用途，其中該嵌合神經毒素的H_C域係由選自以下胺基酸序列所組成之群組所組成或包含以下胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1291或具有與其至少90%序列同一性之序列，(ii)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基864至1276或具有與其至少90%序列同一性之序列，(iii)SEQ ID NO：6之胺基酸殘基866至1278或具有與其至少90%序列同一性之序列，(iv)SEQ ID NO：11之胺基酸殘基863至1268或具有與其至少90%序列同一性之序列，(v)SEQ ID NO：7之胺基酸殘基865至1297或具有與其至少90%序列同一性之序列， (vi)SEQ ID NO：8之胺基酸殘基864至1285或具有與其至少90%序列同一性之序列；以及該嵌合神經毒素的LH_N域係由選自以下胺基酸序列所組成之群組所組成或包含以下胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至872或具有與其至少90%序列同一性之序列，(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至859或具有與其至少90%序列同一性之序列，(iii)SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至867或具有與其至少90%序列同一性之序列，(iv)SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至863或具有與其至少90%序列同一性之序列，(v)SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至846或具有與其至少90%序列同一性之序列，(vi)SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至865或具有與其至少90%序列同一性之序列，(vii)SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1至862或具有與其至少90%序列同一性之序列，(viii)SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至864或具有與其至少90%序列同一性之序列，(ix)SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至863或具有與其至少90%序列同一性之序列。
如請求項13之用途，其中該嵌合神經毒素的LH_N域由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至872或具有與其至少90%序列同一性之序列所組成或包含該序列，且該嵌合神經毒素的H_C域由SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1291或具有與其至少90%序列同一性之序列所組成或包含該序列。
如請求項13之用途，其中該嵌合神經毒素的LH_N域由SEQ ID NO：11之胺基酸殘基1至862或具有與其至少90%序列同一性之序列所組成或包含該序列，且該嵌合神經毒素的H_C域由SEQ ID NO：11之胺基酸殘基863至1268或具有與其至少90%序列同一性之序列所組成或包含該序列。
如請求項1之用途，其中該梭菌神經毒素包含：(i)SEQ ID NO：10或具有與其至少90%序列同一性之胺基酸序列，(ii)SEQ ID NO：13或具有與其至少90%序列同一性之胺基酸序列，(iii)SEQ ID NO：9或具有與其至少90%序列同一性之胺基酸序列，(iv)SEQ ID NO：12或具有與其至少90%序列同一性之胺基酸序列，(v)SEQ ID NO：6或具有與其至少90%序列同一性之胺基酸序列，(vi)SEQ ID NO：2或具有與其至少90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項20之用途，其中該梭菌神經毒素為雙鏈梭菌神經毒素。