CN111491659A

CN111491659A - 用肉毒杆菌毒素治疗自主神经疾病

Info

Publication number: CN111491659A
Application number: CN201880082409.9A
Authority: CN
Inventors: J·克虏伯; J·梅盖尔-吕多尔; B·彼格诺尔
Original assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Current assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-08-04
Also published as: BR112020005186A2; TW202017590A; AU2018392818A1; JP2022191409A; SG11202002876WA; WO2019122166A1; US20200377872A1; KR20200100625A; EP3727429A1; JP2021504301A; JP7445725B2; CA3083069A1; AR113983A1; EA202091527A1; MX2020006043A; MA51279A; JP7162059B2; TWI810228B; JP2024059821A

Abstract

本发明涉及用包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D‑C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域治疗自主神经疾病，其中待施用于患者的梭菌神经毒素的剂量等同于或低于通常用于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量。

Description

用肉毒杆菌毒素治疗自主神经疾病

本发明涉及用神经毒素治疗自主神经疾病(autonomic disorders)。

梭菌属(Clostridia)中的细菌产生高度强效且特异的蛋白质毒素，所述毒素毒害它们被递送至的神经元和其他细胞。此类梭菌毒素的例子包括破伤风梭菌(C.tetani)产生的神经毒素(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)产生的神经毒素(BoNT)血清型A-G，以及巴拉迪梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。

梭菌神经毒素通过抑制外周神经系统、特别地通过抑制神经肌肉接头处的胆碱能传递而引起肌肉麻痹，并因此可以是致死的。实际上，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其通过蛋白水解切割事件在翻译后被修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，通常称为活化位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链(dichain)形式是毒素的活性形式。两条链称为重链(H链)(其具有大约100kDa的分子量)和轻链(L链)(其具有大约50kDa的分子量)。H链包含N-末端易位组分(H_N结构域)和C-末端靶向组分(Hc结构域)。切割位点位于L链和H_N结构域之间。

梭菌神经毒素的作用方式取决于五个不同的步骤：(1)Hc结构域与其靶神经元的细胞膜结合，然后(2)结合的毒素通过内体内化到细胞中(3)H_N结构域将L链跨内体膜易位并进入胞质溶胶；(4)L链对称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白进行蛋白水解切割，其提供非细胞毒性的蛋白酶功能；以及(5)抑制靶细胞的细胞分泌。

在事件的这种级联中，SNARE蛋白(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)附着蛋白受体)是细胞内囊泡融合的必要组成部分，并因此是分子通过囊泡运输从细胞分泌所不可或缺的。存在于神经元中的SNARE蛋白质的例子尤其包括SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白。另一方面，L链的非细胞毒性蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，其对SNARE蛋白表现出高的底物特异性。因此，梭菌神经毒素的非细胞毒性蛋白酶一旦被递送至神经元靶细胞，就会通过裂解其底物SNARE蛋白而抑制神经递质的释放，从而导致神经麻痹。

由于梭菌神经毒素独特的特性，梭菌神经毒素诸如肉毒杆菌毒素(botulinumtoxin)已成功用于大范围的治疗应用中，尤其是运动和自主神经疾病，以恢复例如多动神经末梢的活动达到正常水平。到目前为止，已经描述了至少七个抗原性独特的BoNT血清型，即BoNT/A,BoNT/B,BoNT/C,BoNT/D,BoNT/E,BoNT/F,BoNT/G(Rossetto,O.等人，"Botulinumneurotoxins:genetic,structural and mechanistic insights."Nature ReviewsMicrobiology 12.8(2014):535-549)。尽管有这种多样性，BoNT/A仍然是治疗中的血清型选择，有三种市售的商业制剂(

和

)，而市场上只有一种BoNT/B产品

到目前为止，这些BoNT/A和BoNT/B产品是从梭菌属菌株中纯化的毒素，是目前监管机构批准的两种仅用于人类的BoNT血清型，其应用范围尤其包括：痉挛、膀胱功能障碍或多汗症(对于BoNT/A)(参见例如https://www.medicines.orq.Uk/emc/medicine/112,https://www.medicines.orq.uk/emc/medicine/870,https://www.medicines.orq.uk/emc/medicine/2162，在此通过全部引用并入本文作为参考)至宫颈肌张力障碍(对于BoNT/B)(参见例如，https://www.medicines.orq.uk/emc/medicine/20568，在此通过全部引用并入本文作为参考)。

然而，在它们的治疗应用中观察到的当前限制是在患者中产生中和抗体，这使得将来的治疗无效。尽管很少报道

的抗原性问题，但到目前为止，主要针对BoNT/A产品报道了这类抗体应答，而BoNT/A产品仍然是肉毒杆菌毒素的首选。这些免疫应答已被鉴定为与毒素剂量直接相关(Lange,O.,等人，Neutralizing antibodies andsecondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A:muchado about nothing？Clin Neuropharmacol,2009,32,213-218)。毒素扩散到身体其他部位也可能产生不良反应，并且毒素扩散的可能性与注射剂量直接相关。

因为中和抗体的产生和毒素扩散都与注射剂量直接相关，所以本领域需要用能够以较低剂量实现相同水平的治疗效果的产品，例如备选的BoNT血清型，来治疗患者。

在这方面的挑战是各种BoNT血清型的操作方式(modus operandi)差异，这似乎转化为针对同一疾病的治疗功效差异。

实际上，为了发挥临床活性，肉毒杆菌毒素必须获得进入其靶细胞的神经元末端。为此，BoNT通过它们的受体结合结构域(BoNT-Hc)与它们的特定受体结合，从而靶向并进入神经元，这在文献中有明确定义(Schiavo,G.,Matteoli,M.&Montecucco,C.Neurotoxinsaffecting neuroexocytosis,Physiol Rev,2000,80,717-766)。受体结合通常决定了BoNTs识别神经元的功效和特异性。BoNT/B、D-C和G共享两个同源的突触囊泡蛋白：突触蛋白(synaptotagmin)I和II(Syt I/II)作为它们的受体，而BoNT/A、E、D和F使用另一个突触囊泡蛋白SV2。在这方面，应该注意，BoNT血清型与它们的蛋白受体的结合亲和力也可因物种而异：例如，BoNT/B，/D-C和/G在啮齿动物的运动神经末梢对SytII的亲和力比对SytI的亲和力高得多，而在人类中，对SytI的亲和力比SytII大－这种差异是由于啮齿动物和人类SytII序列之间存在独特的氨基酸变化所致。由于这种氨基酸变化，与小鼠SytII相比，人SytII介导BoNT/B，/D-C和/G进入的效率显著较小。这也意味着，在人类中，BoNT/B，/D-C和/G的高亲和力受体似乎仅限于次要受体SytI，至少在运动神经元中如此。所有这些发现可能为临床观察提供了一种解释，即在宫颈肌张力障碍患者中，要达到相同水平的治疗效果，似乎需要远比BoNT/A(其结合不同的受体)更高剂量的BoNT/B(Brashear A.等人，Safety andefficacy of NeuroBloc(botulinum toxin type B)in type A-resistant cervicaldystonia,1999,Neurology 53,1431-1438；Pappert,E.J.&Germanson,T.Botulinum toxintype B vs.type A in toxin-naive patients with cervical dystonia:Randomized,double-blind,noninferiority trial,2008Mov Disord 23,510-517)。特别地，为了用于神经肌肉接头，已经建议

和MyoBloc^TM之间的转化率为1:40(Dressier等人，Botulinum toxin type B for treatment of axillar hyperhidrosis.,2002,J.Neurol.249,1729-1732；Cornelia等人，2005)。

除了蛋白质受体外，所有BoNTs血清型还需要脂质共受体神经节苷脂，所述脂质共受体神经节苷脂在神经元表面丰富并且在血清型之间可以不同，并切割不同的SNARE蛋白质底物，这可能进一步影响它们的治疗效果，取决于所靶向的细胞类型。实际上，BoNT/B,BoNT/D,BoNT/F和BoNT/G的L链蛋白酶切割VAMP，而BoNT/A和BoNT/E的L链蛋白酶切割SNAP25，且BoNT/C的L链蛋白酶切割SNAP25和突触融合蛋白这两者。

尽管肉毒杆菌神经毒素的最初治疗用途依赖于抑制骨骼肌神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放来治疗神经肌肉疾病，例如肌张力障碍(dystonias)和痉挛(spasticity)，但后来发现这些神经毒素通过在自主神经末梢抑制乙酰胆碱的释放而对腺体和平滑肌也有效，因此可用于治疗多种自主神经疾病，例如多汗症、涎泻或膀胱过度活动症。

用于治疗多汗症的

(也称为Onabotulinumtoxin A)的推荐剂量为每个腋窝50单位(https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112)，即约0.365ng剂量的150kD BoNT/A毒素。

(也称为Rimabotulinumtoxin B)未被批准用于治疗多汗症；然而，文献中已经公开了2000单位至4000单位的剂量，即，约4-40ng剂量的150kD BoNT/A毒素。然而，如此高剂量在局部和全身水平上不是没有副作用的，例如口干、吞咽困难、烧心(heartburn)等(Dressier D.和Eleopra R.,Clinical use of non-Abotulinum toxins:botulinum toxin type B.,Neurotoxicity research 9.2-3(2006):121-125；Tintner R.等人，Autonomic function after botulinum toxin type A or B:adouble-blind,randomized trial.,Neurology 65.5(2005):765-767；Birklein F.等人，Botulinum toxin type B blocks sudomotor function effectively:a 6month followup.,Journal of investigative dermatology 121.6(2003):1312-1316)。然而，尚未研究是否用较低剂量的毒素来治疗自主神经疾病可以获得治疗效果。

本发明旨在提供改善的自主神经疾病的治疗，其避免了目前在患者中观察到的临床问题，例如产生抗毒素的中和抗体以及局部和/或全身性副作用。

一方面，本发明提供了用于在人类患者中治疗自主神经疾病的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域，并且其中待施予患者的梭菌神经毒素的剂量等同于或低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。换句话说，本发明涉及一种在需要其的人类患者中治疗自主神经疾病的方法，该方法包括以下步骤：向所述患者施用包含来自BoNT/B,BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素，施用剂量等同于或低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。更确切地，本发明涉及包含来自BoNT/B,BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素的用途，用于制备在人类患者中治疗自主神经疾病的药物，其中待施与该患者的梭菌神经毒素的剂量等同于或低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。

在一个具体的方面，本发明提供了用于在人类患者中治疗自主神经疾病的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域，并且其中待施予患者的所述梭菌神经毒素的剂量比治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量低约1.1倍至约100倍，优选地低约1.3倍至约90倍。换句话说，本发明涉及一种在需要其的人类患者中治疗自主神经疾病的方法，该方法包括以下步骤：向所述患者施用包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素，其剂量比治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量低约1.1倍至约100倍，优选地低约1.3倍至约90倍。更确切地，本发明涉及包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素的用途，用于制备在人类患者中治疗自主神经疾病的药物，其中待施与该患者的梭菌神经毒素的剂量比治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量低约1.1倍至约100倍，优选地低约1.3倍至约90倍。所述剂量优选地以纳克定量。

又，在一个具体的方面，本发明提供了用于在人类患者中治疗自主神经疾病的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域，并且其中将约0.00025ng至约3ng所述梭菌神经毒素的剂量施用于所述患者。换句话说，本发明提供了在需要其的人类患者中治疗自主神经疾病的方法，该方法包括向该患者施用包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素，剂量为约0.00025ng至约3ng。更确切地，本发明涉及包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素的用途，用于制备在人类患者中治疗自主神经疾病的药物，其中待施用于患者的梭菌神经毒素的剂量为约0.00025ng至约3ng。

本发明首先基于发明人的出乎意料的发现，即，在人的平滑肌组织上BoNT/B至少与BoNT/A一样强效。

该发现是出乎意料的，因为如上所述，与BoNT/A(例如

)相比，治疗骨骼肌疾病需要高得多的剂量的BoNT/B

可能的是，根据该临床观察结果，到目前为止，仅测试了BoNT/B

的剂量高于BoNT/A(例如

)的剂量，并且在文献中报道了用于治疗例如涉及平滑肌的多汗症。

据推测，平滑肌和骨骼肌这两种组织在BoNT/B效力上的差异是由于平滑肌疾病和骨骼肌疾病实际上不依赖于相同的神经途径这一事实造成的。平滑肌收缩的确是由自主神经系统驱动的，而骨骼肌收缩是由体干神经系统(somatic nervous system)驱动的。宫颈肌张力障碍和许多其他以肉毒杆菌神经毒素治疗的疾病，例如痉挛，是由骨骼肌过度收缩引起的，而其他疾病，例如，膀胱过度活动症(OAB)或神经源性逼尿肌过度活动(NDO)是由平滑肌过度收缩引起的。

体干神经系统(SoNS或随意神经系统(voluntary nervous system))是与骨骼肌随意控制身体运动相关的周围神经系统的一部分。SoNS由传入神经和传出神经组成。SoNS传入神经负责将感觉从身体传递到中枢神经系统(CNS)，而SoNS传出神经负责将命令从CNS发送到身体，刺激肌肉收缩；它们包括与骨骼肌和皮肤连接的所有非感觉神经元。

自主神经系统(ANS)是周围神经系统的另一个组成部分，也由传入神经和传出神经组成。ANS由两个分支组成：交感神经系统(SNS)和副交感神经系统(PNS)。SNS控制更积极的反应，例如增加心率和血压。除了平滑肌外，ANS还控制如汗液、唾液和眼泪分泌。

在泌尿系统(例如膀胱，输尿管)，消化系统(例如胃壁，胃肠道，肠，奥狄(Oddi)括约肌，肛门括约肌，气管，胆管)，生殖系统(例如前列腺，子宫)，呼吸道，血管系统(例如血管壁，主动脉，动脉，小动脉，静脉)和眼的虹膜发现有平滑肌。平滑肌收缩负责多种身体功能，例如从膀胱释放尿液、在消化道中移动食物、调节肺中的气流、调节动脉和静脉中的血压以及缩小瞳孔的大小。

肉毒杆菌神经毒素可以靶向供应分泌汗腺、唾液腺和泪腺的胆碱能神经元的突触神经末梢。与促汗的或分泌运动亢进有关的神经源性疾病包括多汗症，特别是手掌、腋窝或脚的局灶性多汗症，味觉出汗(Frey综合征)，进食时流泪增加(鳄鱼泪综合征)，唾液分泌过多(唾液泻，流口水)等。

不希望受理论的束缚，假设在体干神经系统与自主神经系统上观察到的BoNT/A和BoNT/B之间效能差异与以下事实有关：BoNT/A和BoNT/B的蛋白受体不同(分别为SV2和SytI/ll)和/或它们的靶SNARE不同(分别为SNAP25和VAMP)。

基于此假设，进一步假设也使用Syt I/ll作为蛋白质受体和/或切割VAMP的其他BoNT血清型，如BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G，至少在人类中，对平滑肌/自主神经系统显示出与BoNT/B相似的效力，即使不是比BoNT/B更好的效力。

因此，本发明的一个方面是提供用于在人类患者中治疗自主神经疾病的梭菌神经毒素，其中所述梭菌神经毒素包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域，且其中待施用于患者的梭菌神经毒素的剂量等同于或低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。换句话说，本发明涉及在需要其的人类患者中治疗自主神经疾病的方法，所述方法包括以下步骤：向所述患者施用包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素，其剂量等同于或低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。更确切地，本发明涉及包含来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素的用途，用于制备在人类患者中治疗自主神经疾病的药物，其中待施用于该患者的梭菌神经毒素的剂量等同于或低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。

在一个实施方案中，待用本发明的梭菌神经毒素治疗的自主神经疾病选自平滑肌疾病，高分泌疾病，呼吸系统疾病，具有自主神经成分的炎性疾病，神经内分泌疾病和与中枢神经系统疾病直接相关的其他自主神经疾病。

此类自主神经疾病的例子包括但不限于：

·平滑肌疾病，主要由过度、异常和/或延长的肌肉收缩引起(痉挛性疾病)，包括例如：

ο泌尿系统疾病，例如神经源性逼尿肌过度活动(NDO)，膀胱过度活动(OAB)，尤其是特发性OAB(iOAB)，膀胱痉挛，逼尿肌括约肌协同失调(DSD)，尿失禁，尿潴留，夜尿，急迫性尿失禁，尿频；胃肠道疾病，例如奥狄括约肌功能障碍，食道痉挛，肠痉挛，弛缓不能，胃轻瘫，痉挛性结肠炎，肛门裂，便秘，偶尔腹泻，吞咽困难，口咽吞咽困难，吞咽疾病；

ο血管和心血管疾病，例如雷诺氏病，吻合血栓形成(anastomotic thrombosis)，心脏手术后的房颤，体位性低血压，血压疾病；

ο前列腺疾病，例如良性前列腺增生(BPH)，前列腺炎，前列腺痛，前列腺肿大；和

ο性疾病：勃起功能障碍，阴茎持续勃起症，射精失败，阴道痉挛；

·分泌过多疾病，例如多汗症(腋窝，手掌，足底多汗，弥漫性出汗，弗雷氏综合征等)，唾液分泌过多(流口水，唾液泻)，味觉出汗，流泪过多，鳄鱼泪综合征，黏液分泌过多，臭汗症，胃酸分泌，痤疮；

·具有高分泌和/或肌肉成分的呼吸系统疾病，例如鼻漏，慢性鼻炎，哮喘，慢性阻塞性肺病(COPD)，支气管高反应性，喘鸣，不自主吸气喘息，呼吸暂停发作；

·具有自主神经成分的炎性疾病，例如中耳炎，瘙痒(itch)，瘙痒症(pruritis)，炎性肠综合征；

·神经内分泌疾病：糖尿病，高胰岛素血症，胰高血糖症，胰腺病，甲状腺疾病，低钙血症，甲状腺机能亢进，代谢紊乱，脂肪分解过多；和

·其他与中枢神经系统疾病直接相关的自主神经疾病，例如帕金森氏症和小脑/锥体束特征。

在一个优选的实施方案中，根据本发明待治疗的自主神经疾病是选自以下的平滑肌疾病：泌尿疾病，胃肠道疾病，血管和心血管疾病，前列腺疾病和性疾病。

如本文所用，术语“梭菌神经毒素”是指进入神经元和抑制神经递质释放的任何多肽。该过程包括神经毒素与低或高亲和力受体的结合，神经毒素的内化，神经毒素的内肽酶部分向细胞质中的易位，以及神经毒素底物的酶促修饰。更具体地，术语“神经毒素”涵盖由梭菌属细菌产生的进入神经元和抑制神经递质释放的任何多肽(梭菌神经毒素)，以及通过重组技术或化学技术产生的此类多肽。正是这种双链形式是该毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)，其分子量约为100kDa，和轻链(L链)，其分子量约为50kDa。优选地，梭菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)。

BoNT血清型A至G可以基于被特异性中和抗血清的失活而区分，其中通过血清型的这种分类与在氨基酸水平上的序列同一性百分数相关。基于氨基酸百分序列同一性，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分为不同的亚型。BoNT/A神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:1(UniProt登录号A5HZZ9)。BoNT/B神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ IDNO:2(UniProt登录号B1INP5)。BoNT/C神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:3(UniProt登录号P18640)。BoNT/D神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:4(UniProt登录号P19321)。BoNT/E神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:5(登录号WP_003372387)。BoNT/F神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:6(UniProt登录号Q57236)或SEQ ID NO:11(UniProt/UniParc登录号UPI0001DE3DAC)。BoNT/G神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:7(登录号WP_039635782)。BoNT/D-C神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:8(登录号BAM65681)。

如本文所用，术语“Hc结构域”是指神经毒素重链的功能独特的区域，其分子量约为50kDa，其使得神经毒素与位于靶细胞表面上的受体结合。Hc结构域由两个结构上不同的亚结构域组成：“H_CN亚结构域”(Hc结构域的N端部分)和“Hcc亚结构域”(Hc结构域的C端部分，也称为Hcc结构域)，每个亚结构域具有约25kDa的分子量。Hcc结构域能够结合梭菌神经毒素蛋白受体。

如本文所用，术语“LH_N结构域”是指一个不同于Hc结构域的神经毒素区域，其由内肽酶结构域(“L”或“轻链”)和负责内肽酶易位至胞质的结构域(重链的H_N结构域)组成。内肽酶结构域(“L”或“轻链”)能够切割SNARE蛋白。

表1中显示了示例性的L、H_N、H_CN和H_CC结构域。

表1－示例性的L、H_N、H_CN和H_CC结构域

以上确定的参考序列应被视为指导，因为根据亚血清型可能存在轻微变化。举例来说，US 2007/0166332(通过引用全部并入本文作为参考)引用了略有不同的梭菌序列。

术语“活化环(activation loop)”是指包含蛋白水解切割位点的多肽结构域。在本领域中已描述了神经毒素的活化环，例如在WO2016156113中(通过引用全部并入本文作为参考)。

在本发明的一个实施方案中，梭菌神经毒素的Hcc结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:2的氨基酸残基1082至1291，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:4的氨基酸残基1083至1276，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:6的氨基酸残基1088至1278，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:11的氨基酸残基1077至1268，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:7的氨基酸残基1090至1297，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，和

SEQ ID NO:8的氨基酸残基1092至1285，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。

如整个说明书中所用，两个或更多个氨基酸序列之间的“序列同一性百分数”是指在相同位置由比对的氨基酸序列共享的相同氨基酸的数量的函数。因此，可以按照比对中每个位置相同的氨基酸数量除以比对序列中氨基酸的总数，乘以100，来计算同一性％。序列同一性％的计算还可以考虑需要引入来优化两个或更多个序列比对的缺口的数量和每个缺口的长度。可以使用特定的数学算法来进行两个或更多个序列之间的序列比较和同一性百分数的确定，特别是使用全局比对数学算法(如Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48(3)，443-453，1972描述的)，所述算法是本领域技术人员熟知的。

在一个优选的实施方案中，Hcc结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:6的氨基酸残基1088至1278，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，和

SEQ ID NO:11的氨基酸残基1077至1268，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。

在一个优选的实施方案中，Hcc结构域由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1082至1291，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，Hcc结构域由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基1088至1278，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，Hcc结构域由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:11的氨基酸残基1077至1268，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与任一SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:11具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与任一SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

在一个更优选的实施方案中，梭菌神经毒素是BoNT/B神经毒素。优选地，BoNT/B梭菌神经毒素由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

在一个更优选的实施方案中，梭菌神经毒素是BoNT/F神经毒素。优选地，BoNT/F梭菌神经毒素由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:11具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素是嵌合神经毒素。

如本文所用的术语“嵌合神经毒素”是指这样的神经毒素，其包含源自第一神经毒素的一个或多个结构域和源自第二神经毒素的一个或多个结构域。例如，嵌合神经毒素可包含源自第一神经毒素血清型或亚型的LH_N结构域和源自第二神经毒素血清型或亚型的Hc结构域。嵌合神经毒素的另一个实例是这样的神经毒素，其包含源自第一神经毒素血清型或亚型的LH_NH_CN结构域和源自第二神经毒素血清型或亚型的Hcc结构域。嵌合神经毒素的又一个实例是这样的神经毒素，其包含来自第一神经毒素血清型或亚型的LH_N结构域和来自第二神经毒素血清型或亚型的活化环。嵌合神经毒素的实例在WO2017191315和WO2016156113中提供，二者均通过在此引用完整地并入本文作为参考。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素是嵌合神经毒素，其包含来自BoNT/B的Hc结构域和来自BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/D-C的LH_N结构域。

在本发明的嵌合神经毒素的一个实施方案中，Hc结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:2的氨基酸残基860至1291,或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:4的氨基酸残基864至1276，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:6的氨基酸残基866至1278，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:11的氨基酸残基863至1268，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:7的氨基酸残基865至1297，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，和

SEQ ID NO:8的氨基酸残基864至1285，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，以及

LH_N结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至872,或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至859，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至867，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:4的氨基酸残基1至863，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:5的氨基酸残基1至846，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:6的氨基酸残基1至865，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:11的氨基酸残基1至862，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:7的氨基酸残基1至864，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，和

SEQ ID NO:8的氨基酸残基1至863，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列。

在一个优选的实施方案中，Hc结构域由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，且LH_N结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至872，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:8的氨基酸残基1至863，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。

在一个更优选的实施方案中，梭菌神经毒素是嵌合神经毒素，其包含来自BoNT/B的Hc结构域和来自BoNT/A的LH_N结构域。

在一个更优选的实施方案中，Hc结构域由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，且LH_N结构域包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至872的氨基酸序列，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素是嵌合神经毒素，其包含来自BoNT/B的Hcc结构域和来自BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/D-C的LH_NH_CN结构域。

在本发明的嵌合神经毒素的一个实施方案中，Hcc结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:4的氨基酸残基1083至1276，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列

SEQ ID NO:6的氨基酸残基1088至1278，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列

SEQ ID NO:8的氨基酸残基1092至1285，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，且

LH_NH_CN结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至1094，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至1081,或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至1095，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:4的氨基酸残基1至1082，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:5的氨基酸残基1至1069，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:6的氨基酸残基1至1087，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:11的氨基酸残基1至1076，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

SEQ ID NO:7的氨基酸残基1至1089，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，和

SEQ ID NO:8的氨基酸残基1至1091，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。

在一个优选的实施方案中，Hcc结构域由这样的氨基酸序列组成或包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1082至1291，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，且LH_NH_CN结构域由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列：

在一个实施方案中，梭菌神经毒素是嵌合神经毒素，其包含来自第一BoNT/F亚型的LH_N结构域和来自第二BoNT/F亚型的活化环，其中所述第二BoNT/F亚型不同于所述第一BoNT/F亚型。本领域中已描述了此类BoNT/F亚型和BoNT/F嵌合神经毒素，如在WO2016156113中(在此通过全部引用并入本文作为参考)。

在一个优选的实施方案中，所述LH_N结构域是BoNT/F7亚型LH_N结构域和/或所述活化环是BoNT/F1亚型活化环。

在一个优选的实施方案中，所述活化环包含氨基酸序列SEQ ID NO:14(或由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成)。

在一个优选的实施方案中，嵌合神经毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:13或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列(或由氨基酸序列SEQ ID NO:13，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列组成)。

梭菌神经毒素可以是修饰的神经毒素或其衍生物，包括但不限于以下所述的那些。修饰的神经毒素或衍生物与天然形式的神经毒素相比可以含有一个或多个已经修饰的氨基酸。这种修饰(也称为突变)的实例包括但不限于氨基酸残基的取代、添加或缺失。在本发明的上下文中，相对于天然梭菌神经毒素氨基酸序列，修饰的梭菌神经毒素可以例如在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。术语天然的、未修饰的、自然的、天然存在的或野生型可以在本文中互换使用。

此类修饰可能会影响神经毒素的功能方面，例如生物学活性或持久性。然而，在本发明的上下文中，修饰的神经毒素是有功能的。换句话说，本发明的修饰的神经毒素保留了神经毒素的功能，所述功能选自与靶细胞上的低或高亲和力神经毒素受体结合的能力，使神经毒素的内肽酶部分(轻链)易位进入细胞质的能力，和切割SNARE蛋白的能力。根据本发明的修饰的神经毒素可以在重链的氨基酸序列中(例如在Hc结构域中)具有一个或多个修饰，其中所述修饰的重链以比天然神经毒素更高或更低的亲和力结合至靶神经细胞。Hc结构域中的此类修饰可包括Hcc结构域的神经节苷脂结合位点中的氨基酸残基的修饰，所述修饰可改变与靶神经细胞的神经节苷脂的结合，和/或Hcc结构域的蛋白受体结合位点中的氨基酸残基的修饰，所述修饰可以改变与靶神经细胞的蛋白受体结合。此类修饰的神经毒素的实例描述于WO2006027207和WO2006114308中，在此通过引用将它们全部并入本文作为参考。

在根据本发明的修饰的梭菌神经毒素的一个实施方案中，与所述BoNT血清型的天然Hcc结构域相比，来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G的Hcc结构域被修饰。

在一个优选的实施方案中，来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G神经毒素的Hcc结构域包含至少一个氨基酸残基突变，与天然BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/D-C Hcc结构域相比，所述突变增加了所述Hcc结构域对人Syt II的结合亲和力。本发明人确实已经发现，这种氨基酸残基突变可以增加神经毒素对人平滑肌的效力。

在一个更优选的实施方案中，来自BoNT/B神经毒素的Hcc结构域包含至少一个氨基酸残基突变，与天然BoNT/B Hcc结构域相比，所述突变增加了所述Hcc结构域对人Syt II的结合亲和力。仍然优选地，与天然BoNT/B Hcc结构域相比，所述至少一个氨基酸残基突变增加所述Hcc结构域对人Syt II的结合亲和力至少50％。

BoNT/B Hcc结构域中的此类合适的氨基酸残基突变已在本领域中描述于WO2013180799和WO2016154534中，二者均通过引用全部并入本文作为参考。

特别地，与天然BoNT/B Hcc结构域相比，所述至少一个适合于使BoNT/B Hcc结构域对人Syt II的结合亲和力提高至少50％的氨基酸残基突变是氨基酸残基取代、添加或缺失，选自：1118M，1183M，1191M，1191I，1191Q，1191T，1199Y，1199F，1199L，1201V，1191C，1191V，1191L，1191Y，1199W，1199E，1199H，1178Y，1178Q，1178A，1178S，1183C，1183P及其任何组合。优选地，BoNT/B Hcc结构域中的所述至少一个氨基酸残基突变由选自以下的两个氨基酸残基取代、添加或缺失组成：1191M和1199L，1191M和1199Y，1191M和1199F，1191Q和1199L，1191Q和1199Y，1191Q和1199F，1191M和1199W，1191M和1178Q，1191C和1199W，1191C和1199Y，1191C和1178Q，1191Q和1199W，1191V和1199W，1191V和1199Y，或1191V和1178Q。还优选地，BoNT/B Hcc结构域中的所述至少一个氨基酸残基突变由以下的三个氨基酸残基取代、添加或缺失组成：1191M、1199W和1178Q。更优选地，BoNT/B Hcc结构域中的所述至少一个氨基酸残基突变由以下的两个氨基酸残基取代、添加或缺失组成：1191M和1199Y。

在一个更优选的实施方案中，与天然BoNT/B Hcc结构域相比，所述至少一个适合使BoN/B Hcc结构域对人Syt II的结合亲和力增加至少50％的氨基酸残基突变是氨基酸残基取代，选自：V1118M，Y1183M，E1191 M，E1191 I，E1191 Q，E1191T，S1199Y，S1199F，S1199L，S1201V，E1191 C，E1191V，E1191 L，E1191Y，S1199W，S1199E，S1199H，W1178Y，W1178Q，W1178A，W1178S，Y1183C，Y1183P及其任何组合。优选地，BoNT/B Hcc结构域中的所述至少一个氨基酸残基突变由选自以下的两个氨基酸残基取代组成：E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、E1191Q和S1199F、E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y、或E1191V和W1178Q。还优选地，BoNT/BHcc结构域中的所述至少一个氨基酸残基突变由三个氨基酸残基取代组成：E1191M，S1199W和W1178Q。更优选地，BoNT/B Hcc结构域中的所述至少一个氨基酸残基突变由两个氨基酸残基取代组成：E1191M和S1199Y。

在一个优选的实施方案中，待修饰的BoNT/B Hcc结构域对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1082至1291(天然BoNT/B Hcc结构域)，或对应于与其具有至少70％的氨基酸序列，优选地具有至少80％，85％，90％，95％或99％的序列同一性。

在一个更优选的实施方案中，本发明的经修饰的梭菌神经毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列(或由氨基酸序列SEQ ID NO:9，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列组成)。

在一个优选的实施方案中，来自BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G神经毒素的Hcc结构域包含至少一个氨基酸残基突变，与天然BoNT/B、BoNT/D、BoNT/D-C、BoNT/F或BoNT/G Hcc结构域相比，所述突变增加了所述Hcc结构域对一个或多个神经节苷脂的结合亲和力。

在一个更优选的实施方案中，与天然BoNT/F Hcc结构域相比，来自BoNT/F的所述Hcc结构域包含至少一个氨基酸残基突变，其增加了所述Hcc结构域对一种或多种神经节苷脂的结合亲和力。

在一个优选的实施方案中，所述神经节苷脂选自GD1a和/或GM1a。

与天然BoNT/F Hcc结构域相比，用于增加BoNT/F Hcc结构域对神经节苷脂例如GD1a和/或GM1a的结合亲和力的合适氨基酸残基突变包括但不限于氨基氨基酸突变1241K，例如氨基酸取代、添加或缺失。更优选地，与天然BoNT/F Hcc结构域相比，增加所述BoNT/FHcc结构域的结合亲和力的所述至少一个氨基酸残基突变是氨基酸取代H1241K。

在一个优选的实施方案中，待修饰的BoNT/F Hcc结构域对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基1088至1278或对应于SEQ ID NO:11的氨基酸残基1077至1268(天然BoNT/F Hcc结构域)，或者对应于与它们具有至少70％，优选地至少80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合梭菌神经毒素包含氨基酸序列SEQ IDNO:12，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列(或由氨基酸序列SEQ ID NO:12，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列组成)。

在一个实施方案中，如上所述，本发明的梭菌神经毒素可以是嵌合的和修饰的这两者。例如,在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列(或由氨基酸序列SEQ ID NO:10，或与其具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列组成)。

可以使用重组技术产生本发明的梭菌神经毒素。因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素是重组梭菌神经毒素。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素与BoNT复合蛋白复合，所述BoNT复合蛋白也称为无毒神经毒素相关蛋白(NAP)。换句话说，梭菌神经毒素与BoNT复合蛋白结合或联合地施用给人类患者。因此，在一个实施方案中，梭菌神经毒素与一种或多种BoNT复合蛋白复合。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素不含(或不与BoNT复合蛋白复合或组合)。换句话说，梭菌神经毒素是在不与BoNT复合蛋白复合或组合的情况下施用于人类患者的。

优选地，梭菌神经毒素(例如，用于如本文所述使用)是药物组合物的一部分，其与至少一种可药用载体一起。“可药用载体”在本文中是指与药物组合物的其他成分相容的，特别是与梭菌神经毒素相容的并且对人类患者无害的任何组分。可药用载体可以基于期望的给药途径，根据标准药学实践进行选择，并且包括但不限于赋形剂，稀释剂，佐剂，推进剂和盐。

因此，本发明进一步涉及用于在人类患者中治疗自主神经疾病的药物组合物，其中所述组合物包含本发明的梭菌神经毒素和至少一种可药用载体，且待施用给患者的梭菌神经毒素的剂量如上所述。本发明还涵盖了治疗自主神经疾病的相应用途和方法，包括向人类患者施用本发明的药物组合物。

本发明的梭菌神经毒素可以制剂为用于口服，肠胃外(即注射)，连续输注，吸入或局部施用。适用于注射的药物组合物可以是溶液、混悬剂或乳剂或干粉形式，所述干粉形式在使用前溶解或悬浮在合适的溶媒中。

对于欲局部递送的神经毒素，可以将神经毒素配制成乳膏(例如用于局部应用)或用于皮下注射。

局部递送方式可包括气雾剂或其他喷雾(例如，喷雾剂)。在这方面，神经毒素的气雾剂制剂能够递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气道通道。

本发明的梭菌神经毒素也可以在与受影响器官的神经支配有关的脊髓节段的水平通过鞘内或硬膜外注射在脊柱中施用给患者。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素或药物组合物用于肌内、皮内或皮下施用。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素或药物组合物用于局部施用，例如通过滴注。

优选的施用途径是通过肌内注射。

但是，也可以不使用任何注射将梭菌神经毒素施用于肌肉。例如，为了治疗泌尿系统疾病，可通过将液体或半固体梭菌神经毒素制剂灌注入患者的膀胱中，从而将梭菌神经毒素施用于膀胱；将含有梭菌神经毒素的凝胶制剂沉积在患者膀胱的适当位置；在患者膀胱的适当位置喷含有梭菌神经毒素的喷雾剂；或将固体(例如，冷冻干燥固体)、半固体或液体肉毒杆菌毒素制剂放置或散布在球囊的外壁上，然后将球囊在膀胱中膨大，以使其与所述膀胱壁接触而局部应用，如在WO2005053733中所述，其全部内容通过引用并入本文作为参考。

如上所述，适合于在患有自主神经疾病的人类患者中获得目的治疗效果的梭菌神经毒素的剂量，或换言之，所述梭菌神经毒素的治疗剂量等同于或低于治疗相同的自主神经疾病的BoNT/A的剂量。

优选地，治疗相同自主神经疾病的所述BoNT/A是纯化的BoNT/A。如本文所用，术语“纯化的BoNT/A”是指从天然产生其的梭菌菌株(天然存在的梭菌菌株)纯化的A型肉毒杆菌神经毒素。纯化的BoNT/A可以与复合蛋白缔合或不含复合蛋白。市售的纯化的BoNT/A的例子包括

和

在一个实施方案中，用于在人类患者中治疗自主神经疾病的待施用梭菌神经毒素的剂量(治疗剂量)低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量约1.1倍至约100倍，优选地低约1.3倍至约90倍。

在一个优选的实施方案中，当梭菌神经毒素包含来自BoNT/B的Hcc结构域时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约1.1倍至约20倍，优选地低约1.3倍至约19.8倍。例如，当本发明的梭菌神经毒素是天然的BoNT/B神经毒素，例如氨基酸序列SEQ ID NO:2的神经毒素时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约1.1倍至约1.5倍，优选地低约1.3倍。作为进一步的例子，当本发明的梭菌神经毒素是对人SytII受体具有(与天然BoNT/B相比)增加的结合亲和力的修饰的BoNT/B神经毒素时，例如氨基酸序列SEQ ID NO:9的梭菌神经毒素时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约15倍至约20倍，优选地低约19.8倍。又作为另一个例子，当本发明的梭菌神经毒素是对人SytII受体具有增加的结合亲和力的修饰的嵌合BoNT/B神经毒素，例如氨基酸序列SEQ ID NO:10的神经毒素时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约2倍至约5倍，优选地低约3.5倍。

在一个优选的实施方案中，当梭菌神经毒素包含来自BoNT/F的Hcc结构域时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约60倍至约100倍，优选地低约61.2倍至约90倍。例如，当本发明的梭菌神经毒素是天然的BoNT/F神经毒素，例如氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11的神经毒素时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约60倍至约65倍，优选地低约61.2倍。作为进一步的例子，当本发明的梭菌神经毒素是对一种或多种神经节苷脂(与天然BoNT/F相比)具有增加的结合亲和力的修饰的BoNT/F神经毒素，例如氨基酸序列SEQ ID NO:12时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约60倍至约65倍，优选地低约61.2倍。又，作为另一个例子，当本发明的梭菌神经毒素是嵌合的BoNT/F神经毒素，例如氨基酸序列SEQ ID NO:13的神经毒素时，所述梭菌神经毒素的治疗剂量低于治疗相同自主神经疾病的BoNT/A的剂量约85倍至约100倍，优选地低约90倍。

如上所述，治疗自主神经疾病的BoNT/A的剂量在本领域是熟知的(https://www.medicines.org.Uk/emc/medicine/112)。

梭菌神经毒素的剂量在本文中优选以纳克为单位测量。

根据本发明的梭菌神经毒素的剂量应理解为是活性双链梭菌神经毒素的剂量，即，不包括与该神经毒素可能组合的复合蛋白的量。换句话说，它是指活性双链梭菌神经毒素的剂量，无论施用于患者的所述神经毒素与或不与复合蛋白组合。如熟练从业者所熟知，活性双链梭菌神经毒素能够结合神经元受体，将轻链易位到细胞质中并切割SNARE蛋白，而复合蛋白则不显示这种生物学活性(即，非“活性的”)。在肉毒杆菌神经毒素的情形，活性双链的总大小通常约为150kD。

确实，如本领域技术人员所熟知的，梭菌神经毒素的效力与达到LD50(致死剂量50)单位所需的神经毒素的量(例如纳克)有关，其中一个LD50单位定义为(如在小鼠中测得的)腹膜中位数致死剂量。但是，目前市场上的BoNT药物制品含有不同量的150kD神经毒素，也含有不同量的LD50单位。此外，在这些制品中，神经毒素可能与或可能不与无毒神经毒素相关蛋白(NAP)(也称为复合蛋白)结合(即，组合)。为了便于转换：

100单位的

(也称为OnabotulinumtoxinA)含有约0.73ng的150kD BoNT/A，以及复合蛋白。

100单位的

(也称为AbobotulinumtoxinA)含有约0.65ng的150kD BoNT/A，以及复合蛋白。

100单位的

(也称为IncobotulinumtoxinA)含有约0.44ng的150kDBoNT/A，没有复合蛋白；

100单位的

(也称为RimabotulinumtoxinB)含有约0.2ng至约1ng的150kD BoNT/B，以及复合蛋白。

梭菌神经毒素的量可以由熟练的从业者根据本领域常规用于定量蛋白质的方法来测量，优选地以纳克水平定量蛋白质，尤其包括质谱法，例如同位素稀释质谱法(Munoz等人，Quantification of protein calibrants by amino acid analysis using isotopedilution mass spectrometry,Anal.Biochem.2011,408,124-131)或荧光测定法(Poras等人，Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin Type A by a NovelRapid In Vitro Fluorimetric Assay，Appl Environ Microbiol.2009Jul；75(13):4382-4390)。

在本文提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该数值范围的上限和下限之间的每个中间值至上限和下限单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述或中间值之间的每个较小范围包含在本公开中。应当进一步理解，本文中用表述“从a到b”表示的任何数值范围是指从a延伸到b的数值范围(即，包括严格的端点a和b)。

此外，术语“约”在本文中应理解为使用其的数的正或负(±)5％，优选地±4％,±3％、±2％、±1％、±0.5％,、±0.1％的数值。

在一个优选的实施方案中，本发明的用于在人类患者中治疗自主神经疾病的待施用梭菌神经毒素的剂量(即，治疗剂量)为约0.00025ng至约3ng。

在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素的治疗剂量为约0.0003ng至约2ng，优选地约0.0004ng至约1.5ng，约0.0005ng至约1ng，还优选地约0.0006ng至约0.5ng所述梭菌神经毒素。

在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素包含BoNT/B Hcc结构域或BoNT/F Hcc结构域，并以本文所述的该梭菌神经毒素的任一剂量施用于人类患者，用于治疗如上所述的自主神经疾病。

在一个更优选的实施方案中，梭菌神经毒素包含BoNT/B Hcc结构域或BoNT/F Hcc结构域，并以本文所述的该梭菌神经毒素的任一剂量施用于人类患者，用于治疗如上所述的平滑肌疾病。更优选地，所述平滑肌疾病选自：泌尿疾病，胃肠疾病，血管和心血管疾病，前列腺疾病和性疾病。

例如，包含BoNT/B Hcc结构域的梭菌神经毒素的治疗剂量优选为约0.001ng至约2ng。

又，例如，包含BoNT/B Hcc结构域的梭菌神经毒素的治疗剂量优选地为约0.0003ng至约0.05ng。

然而，应当理解，所需的剂量范围取决于梭菌神经毒素的确切性质，自主神经疾病，施用途径，制剂的性质，患者的年龄，患者的疾病性质、程度或严重性，(如果有的话)禁忌症，和主治医师的判断。这些剂量水平的变化可以使用用来优化的标准经验程序进行调整。

作为参考，下面提供了用于治疗一些具体自主神经疾病的天然BoNT/A(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的神经毒素)的合适剂量的例子：

NDO(神经原性逼尿肌过度活动)：1.46ng天然BoNT/A至逼尿肌中；

OAB(膀胱过度活动症)：0.73ng天然BoNT/A至逼尿肌中；

腋窝多汗症：0.365ng天然BoNT/A至每个腋窝中；

成年患者，特别是帕金森氏病患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.146ng天然BoNT/A；

小儿脑瘫患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.073ng天然BoNT/A。

根据本发明的用于治疗上述疾病的天然BoNT/B(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的神经毒素)的合适剂量范围的实例是：

NDO(神经原性逼尿肌过度活动)：0.5ng至2ng天然BoNT/B至逼尿肌中；

OAB(膀胱过度活动症)：0.25ng至1ng天然BoNT/B至逼尿肌中；

腋窝多汗症：0.125ng至0.5ng天然BoNT/B至每个腋窝中；

成年患者，特别是帕金森氏病患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.05ng至0.2ng天然BoNT/B；

小儿脑瘫患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.025ng至0.1ng天然BoNT/B。

根据本发明的用于治疗上述疾病的对人SytII受体具有增加的结合亲和力的修饰的BoNT/B(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的神经毒素)的合适剂量范围的实例是：

NDO(神经原性逼尿肌过度活动)：0.025ng至0.2ng修饰的BoNT/B至逼尿肌中；

OAB(膀胱过度活动症)：0.0125ng至0.1ng修饰的BoNT/B至逼尿肌中；

腋窝多汗症：0.0075ng至0.05ng修饰的BoNT/B至每个腋窝中；

成年患者，特别是帕金森氏病患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.0025ng至0.02ng修饰的BoNT/B；

小儿脑瘫患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.001ng至0.01ng修饰的BoNT/B。

根据本发明的用于治疗上述疾病的对人SytII受体具有增加的结合亲和力的嵌合修饰的BoNT/B(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的神经毒素)的合适剂量范围的例子是：

NDO(神经原性逼尿肌过度活动)：0.2ng至1ng嵌合修饰的BoNT/B至逼尿肌中；

OAB(膀胱过度活动症)：0.1ng至0.5ng嵌合修饰的BoNT/B至逼尿肌中；

腋窝多汗症：0.05ng至0.2ng嵌合修饰的BoNT/B至每个腋窝中；

成年患者，特别是帕金森氏病患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.02ng至0.1ng嵌合修饰的BoNT/B；

小儿脑瘫患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.01ng至0.05ng嵌合修饰的BoNT/B。

根据本发明的用于治疗上述疾病的天然BoNT/F(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11的神经毒素)的合适剂量范围的实例是：

NDO(神经原性逼尿肌过度活动)：0.01ng至0.05ng天然BoNT/F至逼尿肌中；

OAB(膀胱过度活动症)：0.005ng至0.025ng天然BoNT/F至逼尿肌中；

腋窝多汗症：0.0025ng至0.01ng天然BoNT/F至每个腋窝中；

成年患者，特别是帕金森氏病患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.001ng至0.005ng天然BoNT/F；

小儿脑瘫患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.0005ng至0.0025ng天然BoNT/F。

根据本发明的用于治疗上述疾病的对一种或多种神经节苷脂具有增加的结合亲和力的修饰的BoNT/F(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的神经毒素)的合适剂量范围的实例是：

NDO(神经原性逼尿肌过度活动)：0.01ng至0.05ng修饰的BoNT/F至逼尿肌中；

OAB(膀胱过度活动症)：0.005ng至0.025ng修饰的BoNT/F至逼尿肌中；

腋窝多汗症：0.0025ng至0.01ng修饰的BoNT/F至每个腋窝中；

成年患者，特别是帕金森氏病患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.001ng至0.005ng修饰的BoNT/F；

小儿脑瘫患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.0005ng至0.0025ng修饰的BoNT/F。

根据本发明的用于治疗上述疾病的嵌合BoNT/F(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的神经毒素)的合适剂量范围的实例是：

NDO(神经原性逼尿肌过度活动)：0.007ng至0.03ng嵌合BoNT/F至逼尿肌中；

OAB(膀胱过度活动症)：0.003ng至0.0015ng嵌合BoNT/F至逼尿肌中；

腋窝多汗症：0.001ng至0.007ng嵌合BoNT/F至每个腋窝中；

成年患者，特别是帕金森氏病患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.0007ng至0.003ng嵌合BoNT/F；

小儿脑瘫患者的流涎：对每个下颌下腺和/或腮腺，0.0003ng至0.0015ng嵌合BoNT/F。

本公开不受限于本文公开的示例性方法和材料，并且与本文所述那些相似或等价的任何方法和材料可以用于本公开实施方案的实施或测试中。除非另外指明，任何氨基酸序列分别从左到右以氨基到羧基方向书写。

另外必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种梭菌神经毒素”包括多种这样的候选剂，以及提及“该梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及其本领域技术人员已知的等价物，诸如此类。

现在将参考以下附图和实施例仅通过举例的方式描述本发明。

附图说明

图1-对EFS诱导的收缩，膀胱条带(Bladder strip)的收缩应答，以1分钟间隔地施加3次刺激，然后休息3分钟。

图2A-在nBoNT/A、nBoNT/B、rBoNT/B_MY和rBoNT/AB_MY以1、3、5或10nM的幅度下，最大EFS收缩抑制50％的时间(T50)。

图2B-在nBoNT/F、mrBoNT/F和mrBoNT/F7-1以0.1、1或10nM的幅度下，最大EFS收缩抑制50％的时间(T50)。

图3-nBoNT/A、nBoNT/B、rBoNT/B_MY、rBoNT/AB_MY、nBoNT/F和mrBoNT/F7-1的浓度响应曲线。针对肉毒杆菌毒素蛋白浓度绘制了50％抑制的时间(T50)，并拟合了对数函数，产生了极好的R²值。

氨基酸序列

·SEQ ID NO:1-BoNT/A1，登录号A5HZZ9，氨基酸序列

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

·SEQ ID NO:2-BoNT/B1，登录号B1INP5，氨基酸序列

MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

·SEQ ID NO:3-BoNT/C1，登录号P18640，氨基酸序列

MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE

·SEQ ID NO:4-BoNT/D，登录号P19321，氨基酸序列

MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE

·SEQ ID NO:5-BoNT/E1，登录号WP_003372387，氨基酸序列

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTIEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

·SEQ ID NO:6-BoNT/F1，登录号Q57236，氨基酸序列

MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

·SEQ ID NO:7-BoNT/G，登录号WP_039635782，氨基酸序列

MPVNIKNFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE

·SEQ ID NO:8-BoNT/DC，登录号BAM65681，氨基酸序列

MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGSDVEIIPQIERLQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWSSNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSKHYLPVFANILDDNIYTIINGFNLTTKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTRNSRDDSTCIQVKNNTLPYVADKDSISQEIFESQIITDETNVENYSDNFSLDESILDAKVPTNPEAVDPLLPNVNMEPLNVPGEEEVFYDDITKDVDYLNSYYYLEAQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNIGNSALRGNFKQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHISYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLKTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTIPFNIFSYTNNSLLKDMINEYFNSINDSKILSLQNKKNTLMDTSGYNAEVRVEGNVQLNPIFPFDFKLGSSGDDRGKVIVTQNENIVYNAMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNENSEQDINFSYDISKNAAGYNKWFFVTITTNMMGNMMIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFQMNKIPNTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDDKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYDKEYYMINVNYMNRYMSKKGNGIVFNTRKNNNDFNEGYKIIIKRIIGNTNDTRVRGENVLYFNTTIDNKQYSLGMYKPSRNLGTDLVPLGALDQPMDEIRKYGSFIIQPCNTFDYYASQLFLSSNATTNRIGILSIGSYSFKLGDDYWFNHEYLIPVIKIEHYASLLESTSTHWVFVPASE

·SEQ ID NO:9-BoNT/B_MY，氨基酸序列

MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPER 49

YTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRI 99

KSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVE 149

RKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEY 199

VSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPI 249

VPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGI 299

VDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLY 349

KSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFN 399

ISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDV 449

DNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLIS 499

KIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLD 549

IRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVN 599

DFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGAS 649

ILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGL 699

IVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNI 749

NIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFD 799

NTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTIL 849

IEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQF 899

KLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNE 949

YTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYI 999

NRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDID 1049

RTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYY 1099

MFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRR 1149

KSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIY 1199

DSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIV 1249

FEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE 1291

·SEQ ID NO:10-BoNT/AB_MY，氨基酸序列

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERD 49

TFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIY 99

STDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEEL 149

NLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEES 199

LEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNA 249

YYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNK 299

AKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIY 349

TEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAA 399

NFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKA 449

LNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLI 499

QQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYT 549

MFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATE 599

AAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYK 649

DDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNAL 699

SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINY 749

QYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNS 799

MIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDI 849

PFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVE 899

VYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPK 949

YKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVF 999

FEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIA 1049

NGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKD 1099

FWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINY 1149

RDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYF 1199

KKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIG 1249

LIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKD 1299

EGWTE 1304

·SEQ ID NO:11-BoNT/F7，氨基酸序列

MPVNINNFNYNDPINNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSIVSKKGTKNSLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSEYTNDKILISYFNRFYKRIIDSSILNMKYENNRFIDSSGYGSNISINGDIYIYSTNRNQFGIYSSRLSEVNITQNNTIIYNSRYQNFSVSFWVRIPKYNNLKNLNNEYTIINCMRNNNSGWKISLNYNNIIWTLQDTTGNNQKLVFNYTQMIDISDYINKWTFVTITNNRLGHSKLYINGNLTDQKSILNLGNIHVDDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKIFNMELDKTEIETLYHSEPDSTILKDFWGNYLLYNKKYYLLNLLKPNMSVTKNSDILNINRQRGIYSKTNIFSNARLYTGVEVIIRKVGSTDTSNTDNFVRKNDTVYINVVDGNSEYQLYADVSTSAVEKTIKLRRISNSNYNSNQMIIMDSIGDNCTMNFKTNNGNDIGLLGFHLNNLVASSWYYKNIRNNTRNNGCFWSFISKEHGWQE

·SEQ ID NO:12-BoNT/F1(H1241K)，氨基酸序列.

MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFKSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

·SEQ ID NO:13-BoNT/F7-1，氨基酸序列

MPVNINNFNYNDPINNTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWIIPERNIIGKKPSDFYPPISLDSGSSAYYDPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIKNGKPYLGNDHTAVNEFCANNRSTSVEIKESKGTTDSMLLNLVILGPGPNILECSTFPVRIFPNNIAYDPSEKGFGSIQLMSFSTEYEYAFNDNTDLFIADPAISLAHELIHVLHGLYGAKGVTNKKVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFITFGGQDLNIITNSTNQKIYDNLLSNYTAIASRLSQVNINNSALNTTYYKNFFQWKYGLDQDSNGNYTVNISKFNAIYKKLFSFTECDLAQKFQVKNRSNYLFHFKPFRLLDLLDDNIYSISEGFNIGSLRVNNNGQNINLNSRIVGPIPDNGLVERFVGLCKSVIPRKGTKAPPRLCIKVNNRDLFFVASESSYNENGINSPKEIDDTTITNNNYKKNLDEVILDYNSDAIPNLSSRLLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSEIKEYTVDKLNVFFYLYAQKAPEGESAISLTSSVNTALLDASKVYTFFSSDFINTVNKPVQAALFISWIQQVINDFTTEATQKSTIDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKGNFKEAIELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFINSDDSKNKIIKAINNALRERELKWKEVYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDGIKKIIEYKYNNYTLDEKNRLKAEYNIYSIKEELNKKVSLAMQNIDRFLTESSISYLMKLINEAKINKLSEYDKRVNQYLLNYILENSSTLGTSSVQELNNLVSNTLNNSIPFELSEYTNDKILISYFNRFYKRIIDSSILNMKYENNRFIDSSGYGSNISINGDIYIYSTNRNQFGIYSSRLSEVNITQNNTIIYNSRYQNFSVSFWVRIPKYNNLKNLNNEYTIINCMRNNNSGWKISLNYNNIIWTLQDTTGNNQKLVFNYTQMIDISDYINKWTFVTITNNRLGHSKLYINGNLTDQKSILNLGNIHVDDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKIFNMELDKTEIETLYHSEPDSTILKDFWGNYLLYNKKYYLLNLLKPNMSVTKNSDILNINRQRGIYSKTNIFSNARLYTGVEVIIRKVGSTDTSNTDNFVRKNDTVYINVVDGNSEYQLYADVSTSAVEKTIKLRRISNSNYNSNQMIIMDSIGDNCTMNFKTNNGNDIGLLGFHLNNLVASSWYYKNIRNNTRNNGCFWSFISKEHGWQE

·SEQ ID NO:14-活化环，氨基酸序列

KSVIPRKGTKAPPRL

实施例

以下实施例用于举例说明本发明的具体实施方案，并且不以任何方式限制权利要求书中限定的本发明的范围。

实施例1-人膀胱组织样品的研究

简而言之，根据患者的医学记录，对没有已知的膀胱功能障碍的膀胱癌，从接受膀胱切除术的患者获取人膀胱组织样品，确保按照所有相关法律、法规和行为准则进行任何组织或其他样品的收集和使用，包括获得患者的书面同意(提及数据隐私义务)以及患者的病史。

外科手术后，将样品立即从手术室运送到病理学分析场所，在那里选择膀胱穹(bladder dome)的正常片，即，无肉眼可见的肿瘤组织，来进行实验。组织样品在取出后立即在4℃储存在含有青霉素(100IU/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的Krebs-HEPES缓冲液中(具有以下mM组成：NaCl 118.0；KCl 4.7；MgSO₄ 1.2；KH2PO₄ 1.2；CaCl₂ 2.5；NaHCO₃ 4.2；葡萄糖11.1；HEPES 20.8；pH 7.4)最佳保存直至使用(最多24小时内)并运输到研究机构。

为了准备膀胱条带(strips)，将膀胱上皮小心取出，并在每个实验中从每个供体的膀胱上切下八段逼尿肌(4x2x2mm)。称量剩余的膀胱组织，分入2个冷冻管中，并立即在液氮中冷冻，然后保存在-80℃用于将来的分析。

使用放置在实验罩(Captair Chem Filtair XL1346A)下的装置进行离体(Exvivo)实验，该装置包含填充有Krebs-HEPES缓冲液的器官室，保持在37℃，并连续通入95％O₂和5％CO₂以保持pH于7.4。将膀胱条带悬挂在5ml的器官室中，并连接到力传感器以记录等距张力(Pioden controls Ltd，UK)。施加1g的初始张力。放大后，使用Chart TM 5软件(ADInstruments Ltd)通过Mac Lab TM/8将张力变化数字化。充分洗涤后，通过位于条带两侧任一侧的两个铂电极，通过电场刺激(EFS)收缩条带，并将其连接到刺激器上(法国BionicSystem Nozay)。

在60分钟的平衡期间调节张力以达到1g的静态张力，在此期间每15分钟更新一次缓冲液。

在平衡期间之后，通过依次加入至器官浴KCl(100mM，10分钟)，然后氨甲酰胆碱(3.10^-6M，10分钟)灌注逼尿肌平滑肌条，在每次添加化合物之间进行洗涤步骤。然后在应用EFS串(EFS trains)之前，先将0.5％的明胶注射入器官浴。

EFS串(20Hz，1ms脉冲持续时间，5s串长，300mA)连续进行，每组3个刺激，间隔1分钟进行刺激，然后休息3分钟(根据我们对人类膀胱组织的经验，选择在人的膀胱条带中产生牢固且稳定的收缩的刺激条件)。持续刺激直至获得稳定的应答(当稳定期间，后三组EFS收缩计算出的EFS收缩幅度的变化百分数≥90％或≤110％时，该应答被认为是稳定的)。

将单个膀胱条带与溶媒(含0.5％明胶的Krebs)、0.1、1、3、5或10nM的肉毒杆菌神经毒素一起孵育，并连续进行EFS刺激3小时。实验结束时，通过向器官浴中加入氨甲酰胆碱(3.10^-6M，10分钟)直接激活毒蕈碱受体，从而使膀胱条带收缩。在肉毒杆菌神经毒素温育之前和之后，由氨甲酰胆碱引起的条带收缩的比较可作为条带在实验期间的生存能力测试。

表2-人膀胱组织样本研究方案

**明胶

高度纯化的A型。

测试了八种非复合的肉毒杆菌神经毒素：

-nBoNT/A，天然的肉毒杆菌神经毒素A型，获自List Biological Laboratories，Inc.(SEQ ID NO:1)；

-nBoNT/B，天然的肉毒杆菌神经毒素B型，获自List Biological Laboratories，Inc.(SEQ ID NO:2)；

-rBoNT/B_MY，重组的肉毒杆菌神经毒素B型，在Hc结构域中包含两个突变，E1191M和S1199Y(SEQ ID NO:9)；

-rBoNT/AB_MY，重组的嵌合肉毒杆菌神经毒素(来自BoNT/A的LH_N结构域和来自BoNT/B的Hc结构域)，其在Hc结构域中包含两个突变，E1191M和S1199Y(SEQ ID NO:10)；

-nBoNT/F，天然的肉毒杆菌神经毒素亚型F1，获自Metabiologics Inc.(SEQ IDNO:6)；

-mrBoNT/F，重组的肉毒杆菌神经毒素亚型F1，其在Hcc结构域中包含单点突变H1241K(SEQ ID NO:12)；

-mrBoNT/F7-1，重组的嵌合肉毒杆菌神经毒素亚型F7，其中天然BoNT/F7活化环已被BoNT/F1活化环替代(SEQ ID NO:13)。

通过将0.75μl，7.5μl，22.5μl，37.5μl或75μl肉毒杆菌毒素储液(666nM)添加到5ml含0.5％明胶的Krebs-HEPES缓冲液中，在器官浴中分别获得0.1、1、3、5或10nM的终浓度，在器官浴中进行肉毒杆菌神经毒素的孵育。

以平均产生的张力(mean developed tension)定量应答药学物质的收缩。在添加氯化钾或氨甲酰胆碱后每个条带的稳定应答之前和结束时的1分钟内，测量平均产生的张力(mg，对应于选定跟踪中数据点的平均值)。

对EFS诱导的收缩的收缩应答定量如下。总之，如图1所示，以1分钟的间隔施加3次刺激，然后休息3分钟。

在两次连续刺激(即60秒)之间的时间范围内分析了每个EFS诱导的响应。对3小时刺激中的每组刺激的最后两个应答进行分析。

对于每组刺激，将在后两个应答(峰2和3)上获得的值进行平均。

为了定量EFS诱导的应答，将EFS诱导的收缩幅度(mg)计算为刺激前产生的张力与应答EFS期间最大产生的张力之间的差，即在选择中的最大(Max)和最小(Min)数据点之间的差。

这些幅度值表示为与添加肉毒杆菌神经毒素之前的稳定化期间在最后刺激串期间测得的最大EFS收缩相对应的值的百分比。

通过确定麻痹时间50(T50)(分钟)值，即抑制50％最大应答所必需的时间，来评估肉毒杆菌神经毒素的抑制作用。这些值是使用GraphPad Prism 6.05可变斜率模型(Y＝底+(顶-底)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))计算得出的，也称为四参数剂量应答逻辑曲线。

结果示于表3和图2中。

表3–肉毒杆菌神经毒素对人膀胱组织收缩的抑制作用，通过幅度收缩抑制(Amplitude Contraction Inhibition)的T50(分钟)评估。

Kruskal-Wallis检验：*,**,***＝p<0.05,p<0.01,p<0.001，相对于nBoNT/A而言。

Kruskal-Wallis检验：$,$$,$$$＝p<0.05,p<0.01,p<0.001，相对于nBoNT/B而言。

nBoNT/A,nBoNT/B,rBoNT/B_MY,rBoNT/AB_MY,nBoNT/F,mrBoNT/F和mrBoNT/F7-1在幅度方面表现出浓度依赖性抑制EFS诱导的收缩应答。在相同浓度下，nBoNT/A和nBoNT/B对EFS诱导的人膀胱条带收缩产生可比的抑制作用。此外，在所有剂量下，与nBoNT/A和/或nBoNT/B相比，rBoNT/B_MY,rBoNT/AB_MY,nBoNT/F,mrBoNT/F和mrBoNT/F7-1诱导了EFS引起的人膀胱条带收缩的更高减少。与nBoNT/A或nBoNT/B相比，所有测试的BoNT/F以及rBoNT/B_MY和rBoNT/AB_MY似乎需要较低的浓度以实现相同的收缩减少。在所有测试的BoNT中，mrBoNT/F7-1是导致收缩最大降低的一种BoNT。

基于上述观察，根据Weisemann等人(Generation and Characterization of SixRecombinant Botulinum Neurotoxins as Reference Material to Serve in anInternational Proficiency Test,Toxins,2015,7(12):5035–5054；doi:10.3390/toxins7124861)所述的方法定量了测试的肉毒杆菌毒素在人膀胱组织上的效力，特别是针对肉毒杆菌毒素蛋白质浓度绘制了T50，并且对数函数拟合得到极好的R²值，如下表4和图3所示。

表4–肉毒杆菌神经毒素的归一化功效

结果表明，BoNT/F在人膀胱组织上的效力最高，其次是BoNT/B，然后是BoNT/A。特别是，nBoNT/B的效力比nBoNT/A多约1.5倍；mrBoNT/B的效力比nBoNT/A多约20倍，比nBoNT/B多约15倍；mrBoNT/AB的效力比nBoNT/A多约4倍的效力，比nBoNT/B多约3倍的效力；nBoNT/F的效力比nBoNT/A多约60倍的效力，比nBoNT/B多约50倍的效力；且mrBoNT/F7-1的效力比nBoNT/A多约90倍的效力，比nBoNT/B多约70倍的效力。此外，mrBoNT/F在1nM和10nM处显示与nBoNT/F相同的T50值：可以合理地推断出mrBoNT/F与nBoNT/F一样有效。

因此，基于本文公开的令人惊讶的数据，BoNT/B和BoNT/F神经毒素、以及表现出相似结合、摄取、易位和/或SNARE切割性质的梭菌神经毒素，例如BoNT/D，BoNT/D-C或BoNT/G可用于治疗人类自主神经系统疾病，例如平滑肌疾病，尤其是泌尿系统疾病(NOD，OAB等)，其剂量低于或等于一种用来治疗同样疾病的BoNT/A剂量。基于能够使用BoNT/A治疗相同的植物神经疾病的已知剂量，可以显著地依赖表4中鉴定的相对功效值来确定BoNT/B，BoNT/F，BoNT/D，BoNT/D-C或BoNT/G梭菌神经毒素的治疗量。

以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施例描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的发明不应不适当地限制于这些特定的实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言显而易见的是，所描述的用于实施本发明的方式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.用于在人类患者中治疗自主神经疾病的梭菌神经毒素，其中梭菌神经毒素包含来自BoNT/B、BoNT/F、BoNT/D、BoNT/D-C或BoNT/G的Hcc结构域，且其中待施用于患者的所述梭菌神经毒素的剂量低于或等同于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。

2.梭菌神经毒素的用途，用于制备在人类患者中治疗自主神经疾病的药物，其中梭梭菌神经毒素包含来自BoNT/B、BoNT/F、BoNT/D、BoNT/D-C或BoNT/G的Hcc结构域，且其中待施用于患者的所述梭菌神经毒素的剂量低于或等同于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。

3.在需要其的人类患者中治疗自主神经疾病的方法，所述方法包括：向患者施用包含来自BoNT/B、BoNT/F、BoNT/D、BoNT/D-C或BoNT/G的Hcc结构域的梭菌神经毒素，其剂量低于或等同于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量。

4.根据权利要求1的用途的梭菌神经毒素，根据权利要求2的用途或根据权利要求3的方法，其中所述梭菌神经毒素的剂量低于治疗所述自主神经疾病的BoNT/A的剂量约1.1倍至约100倍，所述剂量优选地以纳克计量。

5.根据任一前述权利要求所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述梭菌神经毒素的剂量是从约0.00025ng至约3ng的范围。

6.根据任一前述权利要求所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述自主神经疾病选自平滑肌疾病，高分泌疾病，呼吸系统疾病，具有自主神经成分的炎性疾病，神经内分泌疾病和与中枢神经系统疾病直接相关的其他自主神经疾病。

7.根据任一前述权利要求所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述Hcc结构域是BoNT/B Hcc结构域或BoNT/F Hcc结构域。

8.根据任一前述权利要求所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述BoNT/BHcc结构域包含至少一个氨基酸残基突变，与天然BoNT/B Hcc结构域相比，所述至少一个氨基酸残基突变增加所述Hcc结构域对人Syt II受体的结合亲和力至少50％。

9.根据权利要求8所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述至少一个氨基酸残基突变选自1118M、1183M、1191M、1191I、1191Q、1191T、1199Y、1199F、1199L、1201V、1191C、1191V、1191L、1191Y、1199W、1199E、1199H、1178Y、1178Q、1178A、1178S、1183C、1183P和它们的任一组合。

10.根据权利要求8或9所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述至少一个氨基酸残基突变由两个氨基酸突变1191M和1199Y组成。

11.根据权利要求1－7中任一项所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中与天然BoNT/F Hcc结构域相比，所述BoNT/F Hcc结构域包含至少一个氨基酸残基突变，其中所述至少一个氨基酸残基突变增加了所述Hcc结构域对一种或多种神经节苷脂的结合亲和力。

12.根据权利要求11所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述神经节苷脂选自GD1a和/或GM1a，和/或所述氨基酸残基突变是1241K。

13.根据权利要求1－10中任一项所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述梭菌神经毒素是BoNT/B神经毒素。

14.根据权利要求1－7、11或12中任一项所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述梭菌神经毒素是BoNT/F神经毒素。

15.根据任一前述权利要求所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述梭菌神经毒素是嵌合神经毒素。

16.根据权利要求15所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述嵌合神经毒素包含BoNT/B Hc结构域和BoNT/A LH_N结构域。

17.根据权利要求15所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述嵌合神经毒素包含来自第一BoNT/F亚型的LH_N结构域和来自第二BoNT/F亚型的活化环，其中所述第二BoNT/F亚型不同于所述第一BoNT/F亚型。

18.根据权利要求17所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中所述LH_N结构域是BoNT/F7 LH_N结构域和/或所述活化环是BoNT/F1活化环。

19.根据任一前述权利要求所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中梭菌神经毒素包含选自任一SEQ ID NO:2－13的氨基酸序列或与它们具有至少70％序列同一性，优选地至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

20.根据任一前述权利要求所述的用途的梭菌神经毒素、用途或方法，其中梭菌神经毒素包含：

a.SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性，优选地至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；或

b.SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性，优选地至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；或

c.SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性，优选地至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；或

d.SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性，优选地至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列；或

e.SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性，优选地至少90％或95％序列同一性的氨基酸序列。