JPWO2010013495A1 - 高度精製ボツリヌス毒素治療剤を有効成分として含有する薬学的組成物およびその利用 - Google Patents

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Abstract

中枢及び末梢神経疾患治療剤を提供するために、ＨＡ非産生性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａの高度精製ボツリヌス毒素を有効成分とし、当該高度精製ボツリヌス毒素を中枢神経または末梢神経疾患患者の中枢神経または末梢神経へ直接投与することにより、神経ネットワークの主体である神経伝達物質の種類及び量を調整可能なニューロモデュレーターである中枢神経及び末梢神経疾患治療剤を用いる。

Description

本発明は、乳児ボツリヌス症の原因菌として分離された赤血球凝集素（ＨＡ）非産生性のＡ２型ボツリヌス菌株より得られる１５０ｋＤａのＡ型神経毒素（Ａ２ＮＴＸ）を有効成分として含有する薬学的組成物およびその利用に関するものである。
嫌気性のグラム陽性菌であるクロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）が産生するボツリヌス毒素は地球上で最も致死性の高い毒素であり、これまでに血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧの７種のボツリヌス菌由来の毒素とその特性が明らかにされている。これらは、それぞれ血清型に特異的な中和抗体で識別される。ボツリヌス毒素の血清型の違いにより、それらが影響する動物類、誘発される麻痺の重症度および持続期間等が異なる。ボツリヌス毒素の活性中心蛋白質は、既知のボツリヌス毒素血清型の７種すべてにおいて、分子量約１５０ｋＤａのＮＴＸである。
すべてのボツリヌス毒素はボツリヌス菌から産生される場合、関係する無毒蛋白質と結合した複合体の分子形態をとる。Ａ型ボツリヌス毒素は、９００ｋＤａ（ＬＬ毒素）、５００ｋＤａ（Ｌ毒素）、または３００ｋＤａ（Ｍ毒素）の分子形態として、ボツリヌス菌から産生される（図１）。これら、ＬＬ毒素、Ｌ毒素、Ｍ毒素は、ボツリヌス毒素複合体、プロジェニター毒素などと呼ばれている。ボツリヌス毒素は、アルカリ条件下（ｐＨ７．２以上）で、ＮＴＸ（神経毒素が活性を有する中心の蛋白質、Ｓ毒素とも呼ばれる。）とＮＴＮＨ（無毒非ＨＡである蛋白質）とが解離するため、この性質を利用することで、１５０ｋＤａのＮＴＸのみを単離することができる。
ボツリヌス毒素は、小腸上部で吸収された場合（上皮輸送、粘膜輸送）には、リンパ管内で無毒蛋白質とＮＴＸとに解離する。解離したＮＴＸは、その重鎖Ｃ末端側で神経終末の受容体に結合し、受容体を介して神経細胞内に取り込まれる。その後、軽鎖のもつ亜鉛メタロエンドペプチダーゼ活性により神経シナプス前膜の蛋白質を特異的に切断し、カルシウム依存性の神経伝達物質の放出を阻害して、シナプスでの神経伝達を遮断する（非特許文献１）。神経終末の受容体については、近年Ｂ型ボツリヌス毒素で解明され、神経終末外表面にあるガングリオシドＧＴ１ｂと、アセチルコリンの放出が盛んでシナプス小胞の内面にあるsynaptotagminn IIとであることが判明している（非特許文献２）。
このように、ボツリヌス毒素の最も基本的な作用部位は、アセチルコリン作動性神経筋接合部の神経終末であるが、大量の毒素はノルアドレナリン作動性の神経終末にも作動すると考えられ、次の部位での作用も確認されている。（１）神経筋接合部、（２）自律神経節、（３）神経節後の副交感神経末端、（４）神経節後の交感神経末端（これは（１）〜（３）に比べて多くの毒素が必要である（非特許文献３））。
近年、ボツリヌス毒素が痛みの緩和に有効であることが知られるようになった。動物実験では痛覚受容線維にボツリヌス毒素が作用し、グルタミン酸、Substance P、Calcitonin gene-related peptide（ＣＧＲＰ）の放出を抑制することが確認されており、これにより局所の痛覚感受性を低下させることが報告されている（非特許文献４）。また、近年クローニングされた痛みの感受性を高めるカプサイシン受容体vanillpid receptor VR1（TRPV1）（非特許文献５）の発現にはProtein Kinase Cとボツリヌス毒素の基質であるSNARE複合体が関与していることが明らかになっており、Ａ型ボツリヌス毒素がこの受容体に作用することが示唆されている（非特許文献６）。
また、ボツリヌス毒素は、脊髄神経の初代培養物においてグリシン（Ｇｌｙ）とグルタミン酸（Ｇｌｕ）との両方の誘発性遊離を抑制し、また脳シナプトソーム標本において神経伝達物質であるアセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、ＣＧＲＰおよびグルタメート、ＧＡＢＡの遊離をそれぞれ抑制すると報告されている（特許文献１）。
ボツリヌス毒素は、ボツリヌス中毒においては全身の神経伝達を遮断して人を死に至らしめる毒素ではあるが、逆にその活性を積極的に利用して、異常な筋緊張性亢進を来たす疾患（例えば、ジストニア）の患者の筋肉内に直接投与することによって、局所の筋緊張を緩和する治療薬として用いられている（非特許文献７）。例えば、Ａ型ボツリヌス毒素（ＢＯＴＯＸ（登録商標）：Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．）は、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣、頚部ジストニアの治療用、並びに眉間のしわの治療用としてアメリカ食品薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。また、Ｂ型ボツリヌス毒素（ＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）：Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）も頚部ジストニア治療用としてＦＤＡによって承認されている。非Ａ型ボツリヌス毒素は、Ａ型ボツリヌス毒素と比較して、効力は低く、持続時間は短いといわれている。Ａ型ボツリヌス毒素１回の筋肉内注射から、症状の改善効果が現れ、そして消失するまでの典型的な期間は、平均して約３〜４ヶ月である。
治療用ボツリヌス毒素製剤は、Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．（米国）、Ｉｐｓｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ（英国）、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国）から入手可能である。これら市販されている治療用ボツリヌス製剤は、関係する無毒蛋白質と結合した分子形態をとったＬＬ毒素のみを精製した製剤である。例えば、現在市販されているＡ型ボツリヌス毒素製剤、すなわち、ＢＯＴＯＸ（登録商標）とＩｐｓｅｎ ＬｉｍｉｔｅｄのＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）とは、その毒素複合体の成分として、ＨＡ１７、ＨＡ３４、およびＨＡ７０のＨＡ蛋白を持つＬＬ毒素である。
近年、ボツリヌス毒素を繰り返し投与することにより、その有効性が減弱してくるという問題点が指摘されているが、この現象は毒素に対する抗体産生に依存していると考えられている。この原因の一つとしては、製剤中に含まれるＨＡに、抗体産生に関するアジュバンド作用があることが指摘されており（非特許文献８）、このアジュバント作用により、ＮＴＸに対する中和抗体が生じやすくなっていると考えられる。
そのため、近年では、２００５年に無毒蛋白を含まないＡ型ＮＴＸ製剤（Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）：Ｍｅｒｚ Ｐｈａｒｍａ：ドイツ）が発売され、また米国でも同様な別製剤の臨床試験も実施されており、次世代製剤の開発も積極的に行われている。
一方、１９９０年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたボツリヌス毒素はＡ型ではあるものの、ＨＡ蛋白を含まないＭ毒素のみを産生する。ＨＡ蛋白を含まないボツリヌス毒素を産生するＡ２型ボツリヌス菌は、１９８６年に日本で最初に乳児ボツリヌス症に関する患者から同定されている(非特許文献９)。この臨床分離株は、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ、Ｃｈｉｂａ−Ｈ、Ｙ−８０３６、７Ｉ０３−Ｈ、７Ｉ０５−ＨとＫＺ１８２８である。他のボツリヌス毒素と比較した場合、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌由来ボツリヌス毒素は、ＡからＧの毒素型分子とは異なる特異な毒素である。
遺伝子学的見地から、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌群の毒素遺伝子クラスター構造は、他のすべてのボツリヌス毒素複合体の血清型と異なっている。従来のＡ型ボツリヌス毒素に代表される多くのボツリヌス毒素は、複合体の成分として、ＨＡタンパク質を持つ神経毒素複合体として見出されている。ＨＡ１７、ＨＡ３４、およびＨＡ７０などのＨＡタンパク質をコードする遺伝子は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧ型のＨＡ産生ボツリヌス菌の神経毒素遺伝子群に含まれているが、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌群の毒素遺伝子クラスターには完全に欠損している。一方、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌群の遺伝子は、ｐ４７などの調節遺伝子を含んでいる（非特許文献１０）。さらに、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌の産生するボツリヌス毒素のＮＴＮＨタンパク質の遺伝子は、Ｃ型菌のＮＴＮＨ遺伝子とＡ型菌のＮＴＮＨ遺伝子の寄せ集め、すなわちモザイク型であることが示された（非特許文献１１）。
また、ＮＴＸ分子自体については、従来のＡ型ボツリヌス毒素の重鎖は９３ｋＤａであるが、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌由来のボツリヌス毒素では１０１ｋＤａであり、分子量が異なる。また、ＮＴＸ分子は、異なるプロテアーゼ反応性を示す（非特許文献１２）。これら２つのボツリヌス毒素アイソタイプのアミノ酸配列は、全体では１０．１％異なり、重鎖領域で１３％、軽鎖領域では４．９％が異なるにすぎない（非特許文献１３）。
市販のＡ型ボツリヌス毒素製剤の製造に使用されている菌株については、ＢＯＴＯＸ（登録商標）及びＸｅｏｍｉｎ（登録商標）はＨＡＬＬ株であり（非特許文献３）、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）はＮＣＴＣ２９１６株であることが報告されており（非特許文献１４）、これらはＨＡ蛋白質を含むＡ型ボツリヌス毒素、つまりＡ１型ボツリヌス毒素に分類される。一方で、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌由来のボツリヌス毒素は、Ａ２型ボツリヌス毒素に分類される。
近年、ボツリヌス毒素を繰り返し投与することにより、その有効性が減弱してくるという問題点が指摘されているが、この現象は毒素に対する抗体産生に依存していると考えられている。この原因の一つとしては、製剤中に含まれるＨＡに、抗体産生に関するアジュバンド作用があることが指摘されており（非特許文献８）、このアジュバント作用により、ＮＴＸに対する中和抗体が生じやすくなっていると考えられる。
また、ボツリヌス毒素の投与により、投与部位以外の部位での脱力が認められたり、最悪の場合には死亡に至る場合がある。
WO2001/026736（公開日：2001年4月19日）
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上述したように、各種神経毒素が神経伝達物質（例えば、抑制系神経伝達物質または興奮系神経伝達物質）に由来する各種シグナル伝達を制御することは従来から知られていた。しかしながら、従来の神経毒素を用いた薬剤は、Ａ）制御できる神経伝達物質の特異性が低い、Ｂ）特定の（例えば、１種類の）神経伝達物質しか制御できない、Ｃ）複数の神経伝達物質を同時に制御できるものの、主に制御したい神経伝達物質に対する制御効果が低い、などの問題点を有していた。
そして、このような状況の下、新たな作用特異性（例えば、効果を示す神経伝達物質の種類に関する特異性、および／または、神経伝達物質の種類に応じた作用強度の特異性）を示す神経毒素の発見が望まれていた。というのも、新たな作用特異性を有する神経毒素の発見は、個々の患者の疾患に合わせた最適な治療を可能とするからである。
本発明は、上記従来の課題に鑑みなされたものであって、その目的は、神経伝達物質に対して新たな作用特異性を示す薬学的組成物およびその利用を提供することにある。
ボツリヌス毒素の最も基本的な作用は、神経筋接合部で神経終末に作用し、神経伝達物質の放出を抑制することである。ボツリヌス毒素は、この作用により患者に対して治療効果を発揮する薬剤として知られている。発明者は、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）よりも抑制性神経伝達物質であるグリシン（Ｇｌｙ）やγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を特異的に阻害するボツリヌス毒素としてＡ２ＮＴＸを見出した。さらに、発明者は、Ａ２ＮＴＸが、中枢神経疾患患者または末梢神経疾患患者の中枢神経系または末梢神経系へ直接投与することによって、神経伝達物質の種類と量とを調整し得る治療剤（ニューロモデュレーター）であることを確認した。
現在市販されている治療用Ａ型ボツリヌス製剤は、関係する無毒蛋白質と結合した分子形態を取ったＬＬ毒素のみを精製した製剤である。市販のＡ型ボツリヌス毒素製剤の製造に使用されている菌株については、ＢＯＴＯＸ（登録商標）はＨＡＬＬ株であり、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）はＮＣＴＣ２９１６株であることが知られており、これらはＨＡ蛋白質を含むＡ型ボツリヌス毒素、つまりＡ１型ボツリヌス毒素に分類される。今回の発明に先立ち、発明者は、ボツリヌス毒素の中でも最も致死活性が高いＡ型ボツリヌス毒素の中でも、Ａ１型ボツリヌス毒素とは異なる亜型のＡ２ボツリヌス毒素に着目した。これは、１９９０年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたＡ２型ボツリヌス毒素であり、ＨＡ蛋白を含まないＭ毒素のみを産生するボツリヌス菌由来のＡ２型ボツリヌス毒素に分類される。これら２つのボツリヌス毒素アイソタイプのアミノ酸配列は、全体では１０．１％異なり、重鎖領域では１３％、軽鎖領域では４．９％が異なるにすぎない。このように、これら２つのボツリヌス毒素アイソタイプのアミノ酸配列は非常に類似しているため、これらの生物活性に違いがあるという発想は従来考えられていなかった。
さらに、発明者は、Ａ２型ボツリヌス毒素を高度に精製することに成功した。これは、１９９０年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたタイプのＡ型ボツリヌス毒素であり、ＨＡ蛋白を含まないＭ毒素から、ＮＴＸ部分を高度に精製したものである。
ボツリヌス毒素が運動神経終末部からのアセチルコリン遊離を特異的に抑制することは従来からよく知られている事実であり、これに関する基礎研究も半世紀も前より数多く報告されている。しかし近年になり培養細胞などを用いた研究で、ボツリヌス毒素が興奮性伝達物質であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）の遊離にも作用する可能性が示唆されている。ところで、神経終末部からの化学伝達物質の遊離には２つの異なる機序、すなわち、活動電位に依存性しない自発性遊離と活動電位でトリガーされる誘発性遊離とが存在する。しかし、これら両遊離へのボツリヌス毒素の阻害効果の定性的、定量的報告は十分とは言えない。よって本発明では、ラット中枢神経系における主要な抑制性化学伝達物質であるγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）およびグリシン（Ｇｌｙ）と、興奮性化学伝達物質であるＧｌｕとの自発性と誘発性遊離の機構を、Ａ２ＮＴＸがいかに阻害するかを確認した。この結果、Ａ２ＮＴＸは興奮性神経伝達物質であるＧｌｕよりも抑制性神経伝達物質であるＧｌｙやＧＡＢＡを特異的に阻害することを見出した。
また、今回の発明では、発明者は情報を中枢へと伝導する生体信号システムである活動電位を構成する興奮性イオンチャネル（ＮａチャネルとＣａチャネル）に対するボツリヌス毒素の効果を比較検討するため、ホールセルパッチ記録法によるチャネル電流を記録する電気生理学的実験を行い、ボツリヌス毒素がＮａチャネルとＣａチャネルとに及ぼす作用の違いを確認した。これにより、高度精製Ａ２型ボツリヌス毒素は、ＬＬ毒素よりもＮａチャネルとＣａチャネルとに対する効果が弱いことが証明された。このことは、ボツリヌス毒素が神経細胞膜におけるＮａチャネルおよびＣａチャネルに作用するという新たな作用機序を発見しただけではなく、ボツリヌス毒素の種類によって作用の大小が違うということを意味している。
さらに、ボツリヌス毒素は神経筋接合部などでアセチルコリンの放出を妨げる働きをするが、薬理効果として筋弛緩・鎮痛作用などが確認されている。その作用は末梢性に限局すると考えられており、中枢への効果については、ほとんど報告がない。そこで本発明では、ボツリヌス毒素の中枢への影響を観察するため、てんかん発作による同期性放電を示すマウス海馬にボツリヌス毒素を直接投与し、行動学的・生理学的・細胞生物学的効果を確認した。この結果、Ａ２ＮＴＸは、側頭葉てんかんモデルにおけるてんかん発作の出現を抑制することが明らかになった。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１１）の発明を含むものである。
（１）ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有する、Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナル伝達がＧｌｕに由来するシグナル伝達に比べて増強することにより引き起こされる疾患に対する薬学的組成物。
（２）患者の海馬、扁桃体、視床または大脳皮質帯状回に投与されるものである上記（１）に記載の薬学的組成物。
（３）上記ＨＡ非生産性のボツリヌス菌は、Ａ２型ボツリヌス菌である上記（１）または（２）に記載の薬学的組成物。
（４）上記Ａ２型ボツリヌス菌は、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株またはＫＺ１８２８株である上記（３）に記載の薬学的組成物。
（５）上記疾患は、てんかん、気分障害躁病、うつ病、アルツハイマー病、自閉症、睡眠障害、成長ホルモン分泌低下に伴う成長阻害、女性の性周期不順、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症の発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、または、咀嚼筋攣縮である上記（１）〜（４）の何れかに記載の薬学的組成物。
（６）ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有する薬学的組成物を投与する、Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナル伝達がＧｌｕに由来するシグナル伝達に比べて増強することにより引き起こされる疾患に対する治療方法。
（７）上記薬学的組成物を患者の海馬に投与する工程を有する上記（６）に記載の治療方法。
（８）ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を、非ヒト哺乳動物の中枢神経に投与する工程を有する、てんかん発作モデル動物の作製方法。
（９）ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素と、中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞と、を備える実験キット。
（１０）ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を、中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞に対して投与することにより正常レベルへ戻す実験方法。
本発明に用いる乳児ボツリヌス症原因菌より分離されたＨＡ陰性のボツリヌス菌に由来する高度精製ボツリヌス毒素（Ａ２ＮＴＸ）は、興奮性神経伝達物質であるＧｌｕよりも抑制性神経伝達物質であるＧｌｙやＧＡＢＡを特異的に阻害する。このため、神経伝達物質としてＧｌｙ，ＧＡＢＡが関与する中枢神経疾患または末梢神経疾患患者の中枢神経または末梢神経へ直接投与することで、神経伝達物質の種類及び量を正常な状態に戻すことが可能となる。
しかも、Ａ２ＮＴＸは、てんかん発作による同期性放電を示すマウス海馬におけるてんかん発作の出現を抑制したことから、側頭葉てんかんなどのてんかんの治療剤として使用することができる。このことは、気分障害躁病、うつ病、アルツハイマー病、自閉症、睡眠障害、成長ホルモン分泌低下に伴う成長阻害や女性の性周期不順などへも使用できる可能性を示唆している。また、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮などの末梢神経疾患の治療への可能性をも示唆している。
Ｇｌｙ作動性自発性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）へのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果を示した図である。 Ｇｌｙ作動性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）の頻度（ａ）と電流振幅（ｂ）へのＮＴＸの効果を示した図である。 Ｇｌｙ作動性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）の電流振幅へのＮＴＸの経時的効果を示した図である。 Ｇｌｙ作動性の活動電位依存性シナプス後電流（ｅＩＰＳＣ）の振幅へのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果を示した図である。 Ｇｌｙ作動性シナプス後電流（ｅＩＰＳＣ）の振幅へのＮＴＸの効果を示した図である。 ＧＡＢＡ作動性自発性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）へのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果を示した図である。 ＧＡＢＡ作動性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）の頻度（ａ）と振幅（ｂ）へのＮＴＸの効果を示した図である。 ＧＡＢＡ作動性の活動電位依存性シナプス後電流（ｅＩＰＳＣ）へのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果を示した図である。 ＧＡＢＡ作動性シナプス後電流（ｅＩＰＳＣ）へのＮＴＸの効果を示した図である。 Ｇｌｕ作働性の自発性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）へのＮＴＸ（１０−１２Ｍ）の効果を示した図である。 Ｇｌｕ作働性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）の振幅（ａ）と頻度（ｂ）へのＮＴＸの効果を示した図である。 Ｇｌｕ作働性の活動電位依存性シナプス後電流（ｅＥＰＳＣ）へのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果を示した図である。 Ｇｌｕ作働性シナプス後電流（ｅＥＰＳＣ）へのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果を示した図である。 Ｇｌｕ作働性の活動電位依存性シナプス後電流（ｅＥＰＳＣ）へのＮＴＸ（１０−１１Ｍ）の効果を示した図である。 Ｇｌｕ作働性シナプス後電流（ｅＥＰＳＣ）の振幅と失敗率へのＮＴＸ（１０−１１Ｍ）の効果を示した図である。 ＮＴＸ、ＢＴＸおよびＬＬ＋Ｌボツリヌス毒素成分によるラット海馬ＣＡ１錐体細胞Ｎａチャネルに対する用量依存性抑制曲線を示した図である。 ラット知覚神経節ニューロンの電位依存性ＣａチャネルＬＶＡとＨＶＡ電流成分への各種ボツリヌス毒素の抑制効果を示した図である。 正常マウス海馬へのＮＴＸ投与によるてんかん様発作の誘導を示した図である。 側頭葉てんかんモデルマウス海馬へのＮＴＸ投与によるてんかん症状の改善効果を示した図である。
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の薬学的組成物は、ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有するものであって、Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナル伝達がＧｌｕに由来するシグナル伝達に比べて増強することにより引き起こされる疾患に対して用いられるものである。
「Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナル伝達がＧｌｕに由来するシグナル伝達に比べて増強する」とは、Ｇｌｕに由来するシグナルの強度に対するＧｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナルの強度の比が、通常時（または、正常時）よりも上昇していることを意図する。その一例としては、例えば、Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナルの強度が通常時（または、正常時）よりも上昇している場合、または、Ｇｌｕに由来するシグナルの強度が通常時（または、正常時）よりも低下している場合などを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の薬学的組成物中に含まれ得るＡ２ＮＴＸは、乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたＨＡ陰性のＡ型ボツリヌス菌株より得られるＭ毒素のＮＴＮＨをさらに精製した高度精製Ａ型ボツリヌス毒素、すなわち、ＮＴＸを有効成分とする。Ａ２ＮＴＸは、興奮性神経伝達物質であるＧｌｕよりも抑制性神経伝達物質であるＧｌｙ、ＧＡＢＡを特異的に阻害する。このため、神経伝達物質としてＧｌｙ、ＧＡＢＡが関与する中枢性疾患患者の中枢神経へＡ２ＮＴＸを直接投与することで、神経伝達物質の種類及び量を変化し、治療することが可能である。
乳児ボツリヌス症の患者から単離されたタイプのボツリヌス毒素はＡ型ではあるものの、ＨＡ蛋白を含まないＭ毒素のみを産生する。ＨＡ蛋白を含まないボツリヌス毒素を産生するＡ型ボツリヌス菌の例として、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株またはＫＺ１８２８株が挙げられる。
上述したようにＡ２型ボツリヌス菌に分類される菌株は複数種類存在するが、これらは同じ亜型に分類される菌株であるため、当然のことながら各菌株が生産するＡ２ＮＴＸは極めて類似している。例えば、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株が生産するＡ２ＮＴＸのアミノ酸配列と比較した場合、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株が生産するＡ２ＮＴＸは１００％の相同性を示し、ＣＤＣ１４３６株が生産するＡ２ＮＴＸは９９％の相同性を示し、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株が生産するＡ２ＮＴＸは９９％の相同性を示し、７Ｉ０３−Ｈ株は１００％の相同性を示す。
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、Ａ２型ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを含むものである。
ボツリヌス毒素安定化物質は、上記薬学的組成物が保存される条件において、ボツリヌス神経毒素を安定化することができ、かつボツリヌス毒素の筋緊張疾患治療効果を損なわないものであればよい。例えば、ボツリヌス毒素安定化物質の例としては、ヒト血清アルブミンが挙げられる。
本発明における好ましい薬学的組成物は、Ａ２型ボツリヌス毒素をヒト血清アルブミンと混合する工程により製造することができる。
高度精製Ａ型ボツリヌス毒素は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて精製することができる。具体的にはボツリヌス菌の培養液をろ過して除菌を行い、得られるＭ毒素をＵＦ膜等の方法により濃縮する。Ｍ毒素をｐＨ７以上の条件にすることで、神経毒素と無毒蛋白質とに分離する。その後、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製し、毒素活性のある分画を集めて、更にゲルろ過で精製するなどの方法があげられる。毒素活性は、例えばマウス腹腔内注射法（マウス腹腔内に投与してＬＤ５０から毒素活性を求める方法）により測定し、マウス１ＬＤ５０を１Ｕとする。
また、精製工程の後の製剤化工程では、例えばボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを溶媒に溶解後、無菌ろ過し、アンプル、バイアル等に充填して本発明の組成物を製造することができる。また、ボツリヌス毒素を予めボツリヌス毒素安定化物質を溶解した溶媒に溶解後、無菌ろ過しアンプル等に充填することもできる。溶媒は、注射用蒸留水、生理食塩水、０．０１Ｍ〜０．１Ｍのリン酸緩衝液等を用いることができ、必要に応じて、エタノール、グリセリン等を混合することもできる。
更に、ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを溶媒に溶解後、無菌ろ過し、バイアル等に充填後、凍結乾燥して発明の薬学的組成物を製造することもでき、また、ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを混合後、バイアル等に無菌充填して本発明の薬学的組成物を製造することもできる。
具体的には、精製したボツリヌス毒素に、ボツリヌス毒素安定化物質、好ましくはヒト血清アルブミン、更に好ましくはヒトでの安全性が確保された治療用ヒト血清アルブミンを、最終濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌになるように加え、冷蔵保存、冷凍保存あるいは凍結乾燥することが挙げられる。
本発明の薬学的組成物には、必要に応じさらに、マンニトール、グルコース、乳糖等の糖類、食塩、リン酸ナトリウム等の添加剤を混合することができる。溶解状態での本発明にかかる薬学的組成物のｐＨは、通常３〜８であり、好ましくは４〜７であり、より好ましくは５〜７である。
本発明の薬学的組成物において、ボツリヌス毒素は、本発明の使用目的において有効な量が含まれていればよい。また、ボツリヌス毒素安定化物質が含まれる場合には、ボツリヌス毒素安定化物質は、ボツリヌス神経毒素を安定化するのに十分な量含まれていればよい。
本発明の薬学的組成物は、治療に有効な量投与される。ヒトに投与する場合、その投与形態は好ましくは局所的投与、更に好ましくは筋肉内注射である。また、それらの投与タイミングや投与量も、特に限定されず、症状の程度等により異なる。投与量は症状の程度、年齢、性別、体重、投与部位および形態等に応じて異なるが、例えば体重６０ｋｇの成人ならば０．０１〜１５００Ｕを、好ましくは５〜１５００Ｕを、１回筋肉内注射する。ここで１Ｕとは、マウスに腹腔内投与した時に半数のマウスが死亡する毒素の量（１ＬＤ50）である。患者に対する総用量は、約０.０１〜１５００Ｕの範囲である。
注射後、すべての患者において、全身的または局所的副作用は無く、治療対象となる部位以外での大きな局所的緊張低下は見られないことと、治療対象筋肉の機能改善が見られることと、を筋電計などにより確認しながら治療を行う。
本発明の薬学的組成物は、例えば中枢神経疾患患者または末梢神経疾患などの中枢神経または末梢神経に対して投与されることが好ましい。換言すれば、本発明の薬学的組成物は、中枢神経疾患または末梢神経疾患に対する治療剤として用いることが可能である。また、本発明の薬学的組成物は、海馬または海馬を構成する神経細胞、扁桃体、視床または大脳皮質帯状回に対して投与されることが更に好ましく、これらの中では、海馬または海馬を構成する神経細胞に対して投与されることが更に好ましい。例えば、てんかんに対する従来の治療では、薬剤を、三叉神経に対して投与していた。一方、本願の薬学的組成物は、実施例でも示すように、海馬に対して投与することによっても効果を発揮することができる。また、難治てんかんの５０％を占める側頭葉てんかんの発作伝播経路には、例えば、扁桃体、海馬、視床および大脳皮質帯状回等が含まれることが知られている。したがって、これらの組織の少なくとも１つに本発明の薬学的組成物を投与すれば、てんかん等の疾患を効果的に治療することが可能となる。
海馬のＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＳＮＡＰ２５よりもＳＮＡＰ２３が多く分布していることが知られており、このことは、従来から使用されているＡ１型毒素では、ＧＡＢＡの放出抑制効果が弱いことを示している。一方、Ａ２ＮＴＸは、実施例でも示すようにＧＡＢＡ作動性ニューロンに強く作用する。このことは、Ａ２ＮＴＸが、例えば異常病体ではＧＡＢＡ応答が抑制性から興奮性に逆転していることから、Ｇｌｙ／ＧＡＢＡの亢進に起因するてんかん発作等の疾患に有効であることを示している。更に、海馬歯状回は、脆弱性が低く、異常可塑性の獲得に関与する神経領域であり、特に難治てんかん発症に強く関与すると考えられるが、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対して有効であるＡ２ＮＴＸは、この難治てんかんの発症に関与する海馬で、特に有効であると考えられる。
本発明の薬学的組成物は、側頭葉てんかんなどのてんかん、気分障害躁病、うつ病、アルツハイマー病、自閉症、睡眠障害、成長ホルモン分泌低下に伴う成長阻害、女性の性周期不順、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、または、咀嚼筋攣縮などの治療に用いることが可能である。高度精製ボツリヌス毒素、投与方法、製造方法等については上記に説明した通りである。
本発明の治療方法は、ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有する薬学的組成物を投与する、Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナル伝達がＧｌｕに由来するシグナル伝達に比べて増強することにより引き起こされる疾患に対する治療方法である。
薬学的組成物の詳細に関しては既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
本発明の治療方法では、上記薬学的組成物が、例えば中枢神経疾患患者または末梢神経疾患などの中枢神経または末梢神経に対して投与されることが好ましく、海馬または海馬を構成する神経細胞、扁桃体、視床または大脳皮質帯状回に対して投与されることが更に好ましく、これらの中では、海馬または海馬を構成する神経細胞に対して投与されることが更に好ましい。上記構成によれば、各種疾患を効果的に治療することができる。
また、本発明のてんかん発作モデル動物の作製方法は、ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を、非ヒト哺乳動物の中枢神経に投与する工程を有する方法である。
上記ボツリヌス毒素の詳細に関しては既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
上記非ヒト哺乳類動物としては特に限定されず、適宜、公知の実験動物を用いることが可能である。例えば、マウス、ラット、モルモット、サルなどを用いることが可能であるが、これらに限定されない。
上記非ヒト哺乳動物に対するボツリヌス毒素の投与部位は特に限定されないが、例えば中枢神経疾患患者または末梢神経疾患などの中枢神経または末梢神経に対して投与されることが好ましく、海馬または海馬を構成する神経細胞、扁桃体、視床または大脳皮質帯状回に対して投与されることが更に好ましく、これらの中では、海馬または海馬を構成する神経細胞に対して投与されることが更に好ましい。
また、本発明の実験キットは、ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素と、中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞と、を備えるものである。
上記中枢神経細胞または末梢神経細胞としては特に限定されないが、例えば、てんかん等のモデルマウス由来の中枢神経細胞または末梢神経細胞の初代培養、単離細胞、脳/脊髄薄切片標本または生体内脳/脊髄パッチ標本を用いることが好ましい。
また、本発明の実験方法は、ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を、中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞に対して投与することにより正常レベルへ戻す方法である。
上記中枢神経または末梢神経としては特に限定されないが、例えば、海馬または海馬を構成する神経細胞、扁桃体、視床または大脳皮質帯状回であることが好ましく、これらの中では、海馬または海馬を構成する神経細胞であることが更に好ましい。
さらに本発明は、Ａ２ＮＴＸを、中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞に対して投与することにより、神経ネットワークを正常レベルへ戻す実験材料を提供することができる。これまでの実験では、個別に一つの抑制系神経伝達物質をコントロールするか、すべての神経伝達物質の作用を抑えるフグ毒テトロドトキシンのようなイオンチャネル阻害剤を使用するしか方法がなかった。Ａ２ＮＴＸのように抑制系神経伝達物質のみを選択的に抑制することは、抑制系神経伝達物質と興奮系神経伝達物質とを分けて実験、分析することを可能にする。
なお、本発明は、以下の（１）〜（７）のように構成することも可能である。
（１）：ＨＡ非産生性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａの高度精製ボツリヌス毒素を有効成分とし、当該高度精製ボツリヌス毒素を中枢神経または末梢神経疾患患者の中枢神経または末梢神経へ直接投与することにより、神経ネットワークの主体である神経伝達物質の種類及び量を調整可能なニューロモデュレーターである中枢神経及び末梢神経疾患治療剤。
（２）：中枢神経細胞及び末梢神経細胞に直接作用して神経伝達物質の誘導を発現させるトリガーとなる活動電位の閾値を上げることにより神経伝達物質の誘導を抑制する上記（１）に記載の治療剤。
（３）：当該ボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａの高度精製ボツリヌス毒素が、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌に由来するＨＡ非産生性のＫｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株、またはＫＺ１８２８株の菌株のいずれかから産生されることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の治療剤。
（４）：当該中枢神経疾患が、てんかん、気分障害躁病、うつ病、アルツハイマー病、自閉症、睡眠障害、成長ホルモン分泌低下に伴う成長阻害や女性の性周期不順である上記（１）から（３）のいずれかに記載の治療剤。
（５）：当該末梢神経疾患が、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮である上記（１）から（３）のいずれかに記載の治療剤。
（６）：中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞に対して、ＨＡ非産生性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａの高度精製ボツリヌス毒素を投与することにより正常レベルへ戻すことを特徴とする、高度精製ボツリヌス毒素を含有する実験材料。
（７）：中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞に対して、ＨＡ非産生性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａの高度精製ボツリヌス毒素を投与することにより正常レベルへ戻すことを特徴とする実験方法。
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限られるものではない。上述したように、Ａ２型ボツリヌス菌が生産するＡ２ＮＴＸは、極めて類似している。以下の実施例では、一例として、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株から精製されるＡ２ＮＴＸを用いたが、本発明は、これに限定されない。
〔実施例１．Ａ２ＮＴＸの精製〕
使用するボツリヌス菌としては、乳児ボツリヌス症の患者から分離されたＡ２型ボツリヌス菌であるＣｈｉｂａ−Ｈ株を用い、Sakaguchi G., Biochemical aspects of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins.,21-34,Lewis GE.,1981, Academic Press,New Yorkに記載された方法に従って、Ａ２型Ｍ毒素を精製した。
得られたＡ２型Ｍ毒素を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムに吸着させ、０〜０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ濃度勾配を有する上記緩衝液にて溶出し、神経毒素と無毒蛋白質とに分離した。得られた高度精製ＮＴＸ（Ａ２ＮＴＸ）は、ＹＭ−１０メンブラン（アミコン社製）で１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、当該濃縮物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、使用時まで−８０℃に保存した。これを、Ａ２ＮＴＸとした。
〔実施例２．ＮＴＸによる抑制性ならびに興奮性化学伝達物質遊離の阻害実験〕
実験には、ラット脊髄の背側交連核（ＳＤＣＮ）ニューロンと海馬ＣＡ１錐体ニューロンとの２種類を用いた。ＳＤＣＮニューロンは、皮膚や内臓器官からの求心性知覚情報を中枢へ伝える中継ニューロンであって、本ニューロンには求心性知覚神経や介在ニューロンを介してＧｌｕ、ＧＡＢＡおよびＧｌｙが直接入力している。一方、ＣＡ１錐体ニューロンは、ＧｌｕおよびＧＡＢＡの入力を受けている。本実施例では、ＧｌｕとＧｌｙの遊離によって生じる興奮性と抑制性のシナプス後電流（ＥＰＳＣとＩＰＳＣ）をＳＤＣＮニューロンで、またＧＡＢＡ作動性の抑制性のシナプス後電流（ＩＰＳＣ）をＣＡ１ニューロンで主に観察したが、ＣＡ１ニューロンでも、Ｇｌｕの遊離によって生じるＥＰＳＣに対するＮＴＸの効果を調べた。
なお、Ｇｌｕ、ＧＡＢＡ、Ｇｌｙの自発性遊離で発生するｍＥＰＳＣやｍＩＰＳＣ、活動電位によってトリガーされる誘発性のｅＥＰＳＣやｅＩＰＳＣそれぞれについて、ＮＴＸの効果を比較検討した。
ＳＤＣＮニューロンまたはＣＡ１ニューロンへ入力する興奮性シナプス入力と抑制性シナプス入力とを正確に解析するために、まず、ＳＤＣＮニューロンおよびＣＡ１ニューロンそれぞれを含む脊髄ならびに脳薄切片標本を作製した。引き続きＳＤＣＮニューロン存在領域とＣＡ１ニューロン存在領域とを実体顕微鏡下に観察しながら、その部位に機械的振動を与えて、生理機能を十分に維持した多くの神経終末部が付着したＳＤＣＮニューロンとＣＡ１ニューロンとを単離した。このような標本を以下‘シナプス・ブートン標本’と呼ぶ。フグ毒素のテトロドトキシン（ＴＴＸ）存在下で、Ｇｌｕ、ＧＡＢＡまたはＧｌｙの遊離による自発性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣまたはｍＩＰＳＣ）を記録した。またＧｌｕ、ＧＡＢＡ、Ｇｌｙの単一シナプスにおけるシナプス前の一つの神経終末部（ブートン）を電気的に選択的に刺激（フォーカル刺激）して単一シナプスレベルでのｅＥＰＳＣやｅＩＰＳＣを記録した。
また、ｍＥＰＳＣとｍＩＰＳＣについては、その電流の大きさ（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）と発生頻度（frequency）とを、ｅＥＰＳＣとｅＩＰＳＣとについては、その電流の大きさ（amplitude）とフォーカル刺激に対するシナプス後電流の発生率（success rate/Rsuc）とをそれぞれ解析した。
ラット脊髄の背側交連核（ＳＤＣＮ）ニューロンを用いて検討したところ、ＴＴＸ（３×１０−７Ｍ）存在下で記録されるＧｌｙ作動性のｍＩＰＳＣは、ＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の添加により電流のamplitudeとfrequencyとが共に一過性に増加した後、減少した。この一過性に増加している時間は、比較的長かった（図１Ａ〜図１Ｃ）。また、図１Ａ〜図１Ｃにみられるように、ＮＴＸによって完全に抑制されたｍＩＰＳＣは、外液中のＫ＋濃度（［Ｋ＋］０）を正常の５ｍＭから３０ｍＭへと上昇させることにより、除去された状態から再出現した。
ｅＩＰＳＣへのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果も、ｍＩＰＳＣへの効果と同様な傾向を示した。図２Ａおよび図２ＢではＮＴＸ存在下、ほんのわずかにamplitudeが増加したあと、経時的な減少を示し、ＮＴＸ投与７分後には完全に消失した。他方、Ｒｓｕｃは、ＮＴＸによる一過性の増加を示さず、ＮＴＸ投与５分後より急速に減少、消失した。
なお、図２Ａおよび図２Ｂで明らかなように、外液中の正常Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］０）を２ｍＭから１０ｍＭへと増加させると、完全消失していたｅＩＰＳＣが再発現し、その時のamplitudeもＲｓｕｃもコントロール値へと回復した。
海馬ＣＡ１錐体ニューロンを用いて検討したところ、ＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の存在下で、ｍＩＰＳＣは軽度のamplitudeとfrequencyとの増加を示した後、漸時両者とも減少した。しかし、ＮＴＸによるＧＡＢＡ作働性ｍＩＰＳＣへの抑制効果の発現には、Ｇｌｙ作動性ｍＩＰＳＣへの抑制効果の発現よりも時間がかかり、また抑制の程度も軽度であった（図３Ａおよび図３Ｂ）。
海馬ＣＡ１錐体ニューロンを用いて検討したところ、ＧＡＢＡ作働性のｅＩＰＳＣへのＮＴＸ（１０−１３Ｍ）の効果も、Ｇｌｙ作働性のｅＩＰＳＣでみられたように、まず一過性のamplitudeの増強にはじまり、その後、漸時抑制が発現した。Ｒｓｕｃも、最終的には減少した（図４Ａおよび図４Ｂ）。このようなＧＡＢＡ作動性のｅＩＰＳＣへのＮＴＸの抑制効果は、ｍＩＰＳＣでもみられるように、Ｇｌｙ作働性のｅＩＰＳＣに対する抑制効果よりも軽度であった。
ラット脊髄の背側交連核（ＳＤＣＮ）ニューロンを用いて検討したところ、興味深いことに、Ｇｌｕ作働性のｍＥＰＳＣは１０−１３ＭのＮＴＸでは全く影響されず、１０−１２ＭのＮＴＸでも、ほとんど影響されなかった（図５Ａおよび図５Ｂ）。
ラット脊髄の背側交連核（ＳＤＣＮ）ニューロンを用いて検討したところ、ＮＴＸ（１０−１３Ｍ）はｅＥＰＳＣのamplitudeにほとんど影響与えずに、Ｒｓｕｃのみを軽度に抑制するのみのケース（図６Ａおよび図６Ｂ）と、ＮＴＸ（１０−１１Ｍ）はamplitudeとfrequencyとを一過性に増加した後、両者を減少するケース（図７Ａおよび図７Ｂ）とが存在した。
これらの結果より、以下のことが明らかになった。
（１）ＮＴＸは、Ｇｌｙ、ＧＡＢＡ、Ｇｌｕ作働性のｍＩＰＳＣやｍＥＰＳＣのamplitudeおよびfrequencyの一過性の増加と、その後の経時的減少または消失とをもたらした。
（２）ＮＴＸは、Ｇｌｙ、ＧＡＢＡ、Ｇｌｕ作働性のｅＩＰＳＣやｅＥＰＳＣのＲｓｕｃにはあまり影響を与えることなくamplitudeのみを一過性に増加させ、その後amplitudeとＲｓｕｃとを減少、抑制した。
（３）ＮＴＸは、ＧｌｙおよびＧＡＢＡのｍＩＰＳＣとｅＩＰＳＣとの両者を１０−１３Ｍ以上の濃度にて抑制したが、その抑制作用はＧｌｙに対してより強く発現した。一方、ＧｌｕのｍＥＰＳＣとｅＥＰＳＣとに対しては、ＮＴＸは１０−１３Ｍで無効、１０−１２Ｍで多少抑制、１０−１１Ｍ〜１０−１０Ｍで明らかな抑制を生じた。
（４）結論の（１）〜（３）をまとめると、ＮＴＸの化学伝物質遊離への抑制効果は、Ｇｌｙ＞ＧＡＢＡ＞＞＞Ｇｌｕとなり、ＧｌｙやＧＡＢＡと比較して、ＧｌｕのＮＴＸに対する感受性は５０〜１００倍低い。
（５）Ｇｌｙ、ＧＡＢＡ、Ｇｌｕ全ての遊離のＮＴＸによる抑制は、外液中にＣａ２＋や高濃度のＫ＋を添加することによって除去されるか減弱される。つまりＮＴＸは、これら化学物質放出機構へのＣａ２＋の促進効果を減弱させると結論できる。これは、ｍＩＰＳＣ、ｍＥＰＳＣ、ｅＩＰＳＣおよびｅＥＰＳＣに共通して認められる現象である。
〔実施例３．海馬ＣＡ１ニューロンを用いたホールセルパッチ記録法による電気生理学的実験〕
生後１０〜１６日齢のウスターラットをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔後、３５０〜４００μｍの海馬脳薄切片標本を作製した。室温（２１〜２４℃）の外液中で海馬脳薄切片標本を１時間回復させた後、酵素を使用することなく機械的処理のみで海馬ＣＡ１錐体ニューロンを単離した。その後、これら単離ニューロンを正常外液にて満たした培養皿に移し、３０分後より電気生理学的実験に供した。
ホールセルパッチ記録法によるＮａチャネル電流（ＩＮａ）の記録に用いた外液は、ＮａＣｌ ６０ｍＭ；ｃｈｏｌｉｎｅ−Ｃｌ １００ｍＭ；ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ；ＣｓＣｌ ５ｍＭ；ＴＥＡ−Ｃｌ ５ｍＭ；ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ；ＬａＣｌ３ １０−５Ｍ；ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ；ｐＨ７．４。ホールセル記録用電極パッチ内液は、ＣｓＣｌ ５ｍＭ；ＣｓＦ １０５ｍＭ；ＮａＦ ３０ｍＭ；ＥＧＴＡ ２ｍＭ；ＴＥＡ−Ｃｌ ５ｍＭ；ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ；ｐＨ７．２を用いた。Ｃａチャネル電流の記録にはニスタチン突孔パッチ記録法を使用し、常法に従い外液中のＣａ２＋を等モル濃度のＢａ２＋に置換した以下の外液を用いた。ＮａＣｌ １４５ｍＭ；ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ；ＢａＣｌ２ ５ｍＭ；ＣｓＣｌ ５ｍＭ；ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ；ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ；ＴＴＸ ３×１０−７Ｍ；ｐＨ７．４。内液は、ＣｓＣｌ １３５ｍＭ；ＴＥＡ−Ｃｌ ５ｍＭ；ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ；ＡＴＰ−Ｍｇ ４ｍＭ；ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ；ＥＧＴＡ ２ｍＭ；ｐＨ７．２を用いた。
図８は、ＮＴＸ、ＢＯＴＯＸ（登録商標：アラガン社：以下、ＢＴＸとする）とＬＬ＋Ｌボツリヌス毒素成分による用量依存性抑制曲線である。なお、ＬＬ＋Ｌボツリヌス毒素成分は公知の方法に基づいて精製した。具体的には、ＨＡ陽性のＡ１型ボツリヌス株である６２Ａ株を用い、実施例１と同様に、Sakaguchi，G．，Biochemical aspects of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins．，21−34，Lewis GE．，1981，Academic Press，New Yorkに記載された方法に従って、ＬＬ＋Ｌボツリヌス毒素成分を得た。
本図で明らかなように、全ての毒素のＩＮａ抑制率は、一定以上の薬物の濃度で飽和する、いわゆる‘鍋底パターン’の抑制を示した。このことは、ＤＲＧニューロンの結果からも推定されたことではあるが、本実験でより明らかになった。また、用量抑制曲線から得られた抑制の強さは、ＢＴＸ＞ＬＬ＋Ｌ＞ＮＴＸであった。
電位依存性Ｃａチャネルは、５種類のサブタイプ（Ｌ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ型）を有する高閾値（ＨＶＡ）Ｃａチャネルと、Ｔ型からなる低閾値（ＬＶＡ）Ｃａチャネルとに２分される。このうちＨＶＡ Ｃａチャネルは、化学伝達物質の遊離、筋収縮、分泌、発光、または細胞内Ｃａ２＋を利用する代謝に関与し、Ｔ型のＣａチャネルは、ニューロン発火のトリガーとして機能する。本実施例では、ＨＶＡ ＩＢａとＬＶＡ ＩＢａとを、それぞれ記録した。ＨＶＡを観察する場合はＶＨを−６０ｍＶに固定し、ＬＶＡを観察する場合はＶＨを−９０ｍＶに固定して、前者は０ｍＶ、後者は−３５ｍＶまでに脱分極させて、各値を得た。これらのＬＶＡ電流成分およびＨＶＡ電流成分へのボツリヌス毒素の抑制効果を比較したのが、図９である。ＬＶＡ電流成分およびＨＶＡ電流成分の両方において、同様の抑制効果を得るためには、ＮＴＸは、ＢＴＸに比べて濃い毒素濃度が必要であることを確認した。つまり、Ｃａチャネルの抑制の強さは、ＢＴＸ＞ＮＴＸであった。
〔実施例４．正常マウス海馬へのＮＴＸ投与〕
９週令マウスの海馬（ｎ＝２ ｅａｃｈ）へＮＴＸを投与し、マウスの行動を観察した。２５ ｐｇを注入した場合、マウスは、注入後２〜３分で非常にａｃｔｉｖｅに動き回るようになった。５０ ｐｇでは、さらに激しく動き回り、ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎの様相を示した。次に２５０ ｐｇでは、注入後約３０〜４５秒でてんかん様発作を示した。てんかん発作後、麻痺様症状を呈し、特に後肢麻痺が観察された。翌朝、一匹のマウスが死亡した。死亡時に、眼球の異常が観察された（図１０）。ＮＴＸは、正常なマウス海馬への投与により、濃度依存的にてんかん様発作を誘導した。このことは、ＮＴＸが、海馬を中心にした同期性放電を誘導したことを示唆する。
〔実施例５．側頭葉てんかんモデルマウス海馬へのＮＴＸ投与〕
キンドリングマウス作成は、常法に従い作成した（Matteo Marti et. al., Journal of Neurochemistry, Vol.74, No.6, 2000, pp2497-2503）。情動学習の中枢である扁桃体に、けいれん閾値以下（４５０μＡ，２００μｓｅｃ ｄｕｒａｔｉｏｎ，６０Ｈｚ，２ ｓｅｃ）の軽微な電気刺激を１日１度加え、約４週間かけて、てんかん発作を誘導した。てんかん発作能を獲得したマウス（ｋｉｎｄｌｉｎｇ）とてんかん発作誘導途中のマウス（ｓｔａｇｅ３）を実験に供した。てんかん発作誘導後のマウスにＮＴＸ（５０ ｐｇ）注入後、翌日よりてんかん発症の程度を観察した。てんかん刺激およびＮＴＸ投与は、すべて無拘束下でおこなった。ＮＴＸの投与は、マイクロシリンジポンプ（KD Scientific, KDS210）を用いて行い、フロリナートにより投与した（１μｌ／２ｍｉｎ）。ＮＴＸおよびｖｅｈｉｃｌｅ（３％ ｈｕｍａｎ ａｌｂｕｍｉｎ）は、２００μｌ ０．８５％ ＮａＣｌ，ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅで溶解後、マウス海馬に投与した。
てんかんモデルマウス海馬にＮＴＸ（５０ ｐｇ）を投与した（図１１）。投与後、てんかんモデルマウス（ｋｉｎｄｌｉｎｇ）の行動に変化は観察されなかった。その一方で、Ｓｔａｇｅ３マウス海馬への投与後、マウスはわずかにａｃｔｉｖｅに動き回るようになった。一方で、手術後未刺激マウス（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）海馬への投与後、マウスはＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎの様相を示した。
ＮＴＸ投与翌日から、キンドリング刺激をおこなった（図１１）。その結果、ｋｉｎｄｌｉｎｇマウスは、ＮＴＸ注入２日後にてんかん発作を生じなくなるが、その後、間歇的に２回発作を生じた。しかしながら、９日後以降は、まったく発作を示さなかった。その一方で、９日後以降は、てんかんマウスの元気がないように感じられた。一方で、ｓｔａｇｅ３のマウスは、ＮＴＸ注入後、刺激に反応する時間の短縮が見られたが、その後１０日後には、てんかん発作を示すようになった。
以上のことから、ＮＴＸは、側頭葉てんかんモデルにおけるてんかん発作の出現を抑制した。
ラット脊髄の背側交連核（ＳＤＣＮ）ニューロンと海馬ＣＡ１錐体ニューロンとの２種類の正常神経細胞におけるＡ２ＮＴＸの作用は、興奮性神経伝達物質であるＧｌｕと比較した場合、抑制性神経伝達物質であるＧｌｙ、ＧＡＢＡを５０〜１００倍強く抑制した。従って、正常マウスにＡ２ＮＴＸを投与した場合は、抑制性神経伝達物質の産生と興奮性神経伝達物質の産生とのバランスが壊れ、興奮性神経伝達物質の産生が相対的に増加するため、正常マウスが、てんかん様発作を起こして死亡したと考えられる。
これに対して側頭様てんかんのモデルであるキンドリングマウスのシナプスにおいては、抑制性伝達物質が興奮性神経伝達物質より増加している状態であり、そこにＡ２ＮＴＸを直接投与することにより抑制性神経伝達物質の産生を抑えた結果、相対的に抑制性の神経伝達物質と興奮性の神経伝達物質との脳内バランスが調整され（ニューロモデュレーター作用）、その結果、てんかん発作が改善されたと考えられた。
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
各種疾患を治療するための治療剤、改善薬、治療方法として用いることが可能である。

Claims (10)

  1. ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有する、Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナル伝達がＧｌｕに由来するシグナル伝達に比べて増強することにより引き起こされる疾患に対する薬学的組成物。
  2. 患者の海馬、扁桃体、視床または大脳皮質帯状回に投与されるものである請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 上記ＨＡ非生産性のボツリヌス菌は、Ａ２型ボツリヌス菌である請求項１または２に記載の薬学的組成物。
  4. 上記Ａ２型ボツリヌス菌は、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株またはＫＺ１８２８株である請求項３に記載の薬学的組成物。
  5. 上記疾患は、てんかん、気分障害躁病、うつ病、アルツハイマー病、自閉症、睡眠障害、成長ホルモン分泌低下に伴う成長阻害、女性の性周期不順、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症の発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、または、咀嚼筋攣縮である請求項１〜４の何れか１項に記載の薬学的組成物。
  6. ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有する薬学的組成物を投与する、Ｇｌｙおよび／またはＧＡＢＡに由来するシグナル伝達がＧｌｕに由来するシグナル伝達に比べて増強することにより引き起こされる疾患に対する治療方法。
  7. 上記薬学的組成物を患者の海馬に投与する工程を有する請求項６に記載の治療方法。
  8. ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を、非ヒト哺乳動物の中枢神経に投与する工程を有する、てんかん発作モデル動物の作製方法。
  9. ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素と、
    中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞と、を備える実験キット。
  10. ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を、中枢神経または末梢神経における神経ネットワークにおいて抑制系を亢進させた中枢神経細胞または末梢神経細胞に対して投与することにより正常レベルへ戻す実験方法。
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