CN109646673A - 肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术 - Google Patents

肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术。本发明的肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术使得精确地控制肉毒杆菌毒素的浓度，当肉毒杆菌毒素施用于人体时减轻产生的疼痛成为可能，并且还使肉毒杆菌毒素能够精确地施用于所需的位置。因此，本发明可望大大有助于安全和方便的医疗使用肉毒杆菌毒素。

Description

肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术
技术领域
本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术。
背景技术
从1890s至今已发现了分泌具有神经毒性作用的毒素的各种梭菌属，并且在过去70年中研究了这些菌株分泌的毒素的特征(Schant，E.J.等，微生物评论(Microbiol.Rev.),56:80,1992)。在这些毒素中，肉毒杆菌毒素根据其血清学特征分为七种亚型(亚型A至G)，并且在具有神经系统功能的动物中，抑制乙酰胆碱在神经肌肉接头的胆碱能前突触的胞外分泌，从而引起全身性虚弱。已知肉毒毒素的亚型B、D、F和G在特定位点切割小突触泡蛋白，亚型A和E在特定位点切割SNAP25，亚型C在特定位点切割突触融合蛋白(Binz，T.等，生物化学期(J.Biol.Chem.),265：9153,1994)。因此，最近已经研究利用肉毒杆菌毒素的神经毒性用于美容或治疗目的。已提出或尝试利用肉毒杆菌毒素的技术治疗视神经疾病(美国专利号6,265,379)，疼痛(美国专利号6,113,915)，各种自主神经障碍，包括汗腺障碍(美国专利号5,766,605)，偏头痛(美国专利号5,714,468)，术后疼痛和内脏疼痛(美国专利号6,464,986)，牛皮癣和皮炎(美国专利号5,670,484)，各种癌症(美国专利号6,139,845和6,063,768)和神经源性炎症(美国专利号6,063,768)。
然而，肉毒杆菌毒素是已知的生物毒素中最致命的物质，静脉内或肌肉内估算的人半数致死量(LD50)为1.3-2.1ng/kg，吸入时为10-13ng/kg。如上所述，肉毒杆菌毒素对各种疾病具有很大的治疗效果，但是由于其强毒性，所以即使是非常少的量也是致命的。因此，当肉毒杆菌毒素用于活体时，需要精确地控制肉毒杆菌毒素的浓度。
同时，微结构包括微针(microneedles)、微刀片(microblades)、微刀(microknifes)、微纤维(microfibers)、微刺(microspikes)、微探针(microprobes)、微倒钩(microbarbs)、微阵列(microarrays)或微电极(microelectrodes)，其中术语“微针”是指通过使用细针穿过皮肤形成孔以增加药物渗透的技术。特别是当使用微针来输送肉毒杆菌毒素时，将毒素注射数十至数百个微针，因此可以减轻注射引起的疼痛，并且可以避免由于不能将毒素精确地施用于所需位置而导致的副作用。
因此，在这种情况下，存在优点，因为根据材料的选择和微针的制备方法可以控制药物释放速度。当将本发明的微结构用于施用肉毒杆菌毒素时，可以缓解疼痛，并且可将微量的毒素精确地施用于所需位置。因此，本发明的微结构可望大大有助于安全和方便的医疗使用肉毒杆菌毒素。
发明内容
技术问题
本发明是为了解决现有技术中出现的上述问题而提出的，本发明的一个目的是提供肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术。
然而，本发明要实现的技术目的不限于上述技术目的，并且本领域技术人员从下面的描述中可以清楚地理解上面未提及的其它目的。
技术方案
在下文中，将参照附图描述本文所述的各种具体实例。在下面的描述中，为了透彻理解本发明，阐述了许多具体细节，例如具体的配置、组成和过程等。然而，某些具体实例可以在没有一个或多个这些具体细节，或者与其他已知的方法和配置结合的情况下实施。在其他情况下，已知的方法和制备技术没有特别详细的描述，以免不必要地使本发明难理解。在本说明书中对“一个实施方式(one embodiment)”或“某实施方式(an embodiment)”的引用意味着在本发明的至少一个实施方式中包括结合实施方式描述的特定特征、配置、组成或特性。因此，在本说明书的各处出现的术语“一个实施方式”或“某实施方式”不必然指本发明的相同实施方式。另外，特定特征、配置、组成或特性可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合。
除本说明书另有规定外，本说明书中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
在本发明的一个实施方式中，“肉毒杆菌毒素”是由肉毒梭状芽孢杆菌产生的神经毒性蛋白。梭菌属有127多种，根据其形态学和功能进行分类。厌氧革兰氏阳性菌肉毒梭状芽孢杆菌产生强效的多肽神经毒素，肉毒杆菌毒素，其引起人类和动物称为肉毒中毒的神经麻痹症。肉毒梭状芽孢杆菌的孢子存在于土壤中，可以在未正确灭菌和密封的居家罐头的食品容器中生长，这是许多肉毒中毒事件的原因。肉毒中毒症状通常在食用感染肉毒梭状芽孢杆菌培养物或孢子的食物后18至36小时出现。肉毒杆菌毒素可以显著地无衰减通过肠道内壁，并显示出对胆碱能运动神经元的高亲和力。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以从步行、吞咽、说话困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。
A型肉毒杆菌毒素是已知的人类最致命的天然生物制剂。大约50皮克市售A型肉毒杆菌毒素(纯化神经毒素复合物)是1LD50(即1单位)。有趣的是，基于摩尔数，A型肉毒杆菌毒素比白喉毒素更致死约18亿倍，比氰化钠更致死约6亿倍，比眼镜蛇毒素更致死约3000万倍，比霍乱更致死约1200万倍。肉毒杆菌毒素的一个单位(U)被定义为腹膜内注射到每只体重18至20克的雌性瑞士韦伯斯特小鼠中的LD50。
七种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素通常表征为肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，其中每种都通过与特定类型的抗体中和来区分。肉毒杆菌毒素的不同血清型在其影响的动物物种以及它们引起的瘫痪的严重程度和持续时间方面不同。例如，据测定根据在大鼠中所测得的麻痹产生的速度，A型肉毒毒素比B型肉毒毒素强500倍。另外已经测定，在灵长类动物中B型肉毒杆菌毒素在480U/kg剂量时为无毒的，该剂量约为A型肉毒杆菌毒素灵长类的LD50的12倍。肉毒杆菌毒素明显地以高亲和力结合胆碱能运动神经元，被转运到神经元中并阻断乙酰胆碱的释放。额外的摄取可以通过低亲和力受体，以及吞噬作用和胞饮作用发生。
不管血清型如何，毒素中毒的分子机制似乎是相似的，并且涉及至少3个步骤。在该过程的第一步中，毒素通过重链(H链或HC)和细胞表面受体之间的特异性相互作用结合靶神经元的突触前膜。每种类型的肉毒杆菌毒素和破伤风毒素的受体被认为是不同的。HC的羧基末端片段对于将肉毒杆菌毒素靶向细胞表面似乎是重要的。
在第二步中，肉毒杆菌毒素穿过靶细胞的细胞质膜。肉毒杆菌毒素首先通过受体介导的内吞被细胞吞噬，形成含有肉毒杆菌毒素的内体。然后毒素逃离内体进入细胞的细胞质中。该步骤被认为是由重链的氨基末端片段的HN介导的，其引发了响应于约5.5或更低的pH的毒素的构象变化。已知内体具有降低内体内pH的质子泵。构象变化暴露了毒素中的疏水残基，这允许肉毒毒素将自身嵌入内体膜。肉毒杆菌毒素(或至少肉毒杆菌毒素的轻链)然后通过内体膜转运到细胞质中。
肉毒毒素活性机制的最后一步似乎涉及连接重链和轻链的二硫键的还原。肉毒杆菌和破伤风毒素的全部毒性活性包含在全毒素的轻链中；轻链是锌(Zn++)肽链内切酶，其选择性地切割蛋白，对于识别和对接含有神经递质的囊泡与质膜的细胞质表面，以及囊泡与质膜的融合是必需的。破伤风神经毒素，B型、D型、F型和G型肉毒杆菌毒素引起小突触泡蛋白(也称为囊泡相关膜蛋白(VAMP))，突触体膜蛋白的降解。作为这些切割事件中的任何一个的结果，去除了突触小泡的细胞质表面存在的大部分VAMP。血清型A和E切割SNAP-25。血清型C1最初被认为是切割突触融合蛋白，但是被发现切割突触融合蛋白和SNAP-25。每种肉毒杆菌毒素特异性地切割不同的键，除了切断相同的键的B型(和破伤风毒素)。每个这些切割阻断囊泡－膜对接的过程，从而防止囊泡内含物的胞外分泌。
肉毒杆菌毒素在临床上已被用于治疗以活动过度的骨骼肌(即运动障碍)为特征的神经肌肉障碍。1989年，美国食品和药物管理局批准了A型肉毒杆菌毒素复合物用于治疗眼睑痉挛，斜视和面肌痉挛。随后，A型肉毒杆菌毒素也被FDA批准用于治疗颈肌张力障碍和治疗眉间纹，并且B型肉毒杆菌毒素被批准用于治疗颈肌张力障碍。与A型肉毒杆菌毒素相比，非A型肉毒杆菌毒素血清型显然具有较低的效价和/或更短的作用持续时间。外周肌肉A型肉毒杆菌毒素的临床疗效通常在注射后一周内观察到。单次肌内注射A型肉毒杆菌毒素的症状缓解的典型持续时间平均约3个月，尽管已经报道了显著更长的治疗作用期。
尽管所有的肉毒杆菌毒素血清型明显抑制了神经肌肉接头处的神经递质乙酰胆碱的释放，它们通过影响不同的神经分泌蛋白并在不同部位切割这些蛋白质来实现。例如，A型和E型肉毒杆菌都切割25kDa突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但它们靶向该蛋白内的不同氨基酸序列。B型、D型、F型和G型的肉毒杆菌毒素作用于囊泡相关蛋白(VAMP，也称为小突触泡蛋白)，每种血清型在不同位点切割蛋白。最后，C1型肉毒杆菌毒素似乎能够切除突触融合蛋白和SNAP-25。这些作用机制的差异可能影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效价和/或作用持续时间。特别地，可以在各种不同的细胞类型中发现肉毒杆菌毒素的底物。
对于所有七种已知的肉毒杆菌毒素血清型，肉毒杆菌毒素的分子量约为150kDa。有趣的是，肉毒杆菌毒素作为包含150kDa肉毒杆菌毒素蛋白质分子以及相关的非毒素蛋白的复合物，被梭菌属细菌释放。因此，A型肉毒杆菌毒素复合物可以以900kDa、500kDa或300kDa形式被梭菌属细菌产生。B型和C1型肉毒杆菌毒素明显仅作为700kDa或500kDa复合物产生。D型肉毒杆菌毒素作为300kDa或500kDa复合物产生。最后，E型和F型肉毒杆菌毒素仅作为约300kDa的复合物产生。复合物(即分子量大于约150kDa)被认为含有非毒素血凝素蛋白、非毒素和无毒非血凝素蛋白。这两种非毒素蛋白(其与肉毒杆菌毒素分子包含相关的神经毒素复合物)可以起到针对肉毒杆菌毒素分子的变性提供稳定性和当肉毒杆菌毒素摄入时可以防止消化酸。另外，较大(大于约150kDa分子量)肉毒杆菌毒素复合物可能导致肉毒杆菌毒素从肌内注射肉毒杆菌毒素复合物的部位的扩散速率较慢。
体外研究已经表明，肉毒杆菌毒素抑制钾离子诱导的脑干组织原代细胞培养物中乙酰胆碱和去甲肾上腺素的释放。此外，据报道，肉毒杆菌毒素抑制脊髓神经元原代培养物中甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，并且在脑突触小体制剂中，肉毒杆菌毒素抑制了每种神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP、P物质和谷氨酸)的释放。因此，当使用足够的浓度时，肉毒杆菌毒素可阻断大多数神经递质的刺激诱发释放。
可以根据已知方法，通过在发酵罐中建立并培养生长肉毒杆菌培养物，然后收集和纯化发酵的混合物来获得A型肉毒杆菌毒素。所有的肉毒杆菌毒素血清型最初是作为非活性单链蛋白合成的，其必须被蛋白酶切割或切开才能变为神经活性的。产生肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可以主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反地，肉毒杆菌毒素血清型C1、D和E由非蛋白水解菌株合成，因此当从培养物中回收时通常是非活性的。血清型B和F由蛋白水解和非蛋白水解菌株产生，因此可以以活性或非活性形式回收。然而，即使产生例如B型血清型的肉毒杆菌毒素的蛋白水解菌株，也仅切割产生一部分毒素。切口到无切口分子的精确比例取决于培养时间长短和培养温度。因此，一定比例的任何制剂，如肉毒杆菌毒素B型毒素的制剂可能是无活性的，从而可能是与A型肉毒杆菌毒素相比，B型肉毒毒素的效价明显降低的原因。临床制剂中无活性肉毒毒素分子的存在将有助于制剂的全部蛋白质的负载，其与增加的抗原性相关，而不会有助于其临床疗效。此外，已知肉毒杆菌毒素B在肌内注射时具有较短的活性持续时间，并且在相同剂量水平下也比A型肉毒杆菌毒素效价低。
肉毒梭状芽胞杆菌的Hall A菌株可以产生高质量结晶的A型肉毒杆菌毒素，其特征为≥3×107U/mg，A260/A278小于0.60，凝胶电泳条带图不同。已知的Schantz方法可以用于获得结晶的A型肉毒杆菌毒素。通常，在合适的培养基中培养A型肉毒梭状芽孢杆菌，从厌氧发酵中分离和纯化肉毒杆菌毒素A型复合物。在分离出非毒素蛋白质之后，也可以使用已知的方法获得纯的肉毒杆菌毒素，例如：具有大约150kDa分子量的纯化的A型肉毒杆菌毒素，其特异效价为1-2×108LD50U/mg或更大；具有大约156kDa分子量的纯化的B型肉毒杆菌毒素，其特异效价为1-2×108LD50U/mg或更大；具有大约155kDa分子量的纯化的F型肉毒杆菌毒素，其特异效价为1-2×107LD50U/mg或更大。
肉毒杆菌毒素和/或肉毒杆菌毒素复合物可从本领域已知的化合物制造中商购获得，纯的肉毒杆菌毒素也可用于制备药物组合物。
与酶通常一样，肉毒杆菌毒素(其是细胞内肽酶)的生物活性至少部分依赖于它们的三维构象。因此，A型肉毒杆菌毒素通过加热，各种化学物质表面伸展和表面干燥而解毒。此外，已知将通过已知的培养、发酵和纯化获得的肉毒杆菌毒素复合物稀释为用于药物组合物制剂的非常低的毒素浓度，导致了毒素的快速解毒，除非存在适当的稳定剂。将毒素从毫克数量稀释至含每毫升纳克数的溶液存在显著的困难，这是因为在这种大量稀释下快速损失特异性毒性。因为肉毒杆菌毒素可能在配制含有毒素的药物组合物的几个月或几年后使用，所以毒素应该用合适的稳定剂稳定。因此，如本发明所揭露，开发最佳的稳定剂技术来控制肉毒杆菌毒素在体内以缓慢释放形式释放是必要的。
据报道，A型肉毒杆菌毒素已经在如下的临床背景下使用：
体内施用肉毒杆菌毒素的肌内注射的持续时间通常为约3至4个月。然而，在某些情况下，A型肉毒杆菌毒素可以达到12个月的功效(欧洲神经学杂志(EuropeanJ.Neurology)6(Supp 4)：S111-S1150:1999)，并且在某些情况下，当用于治疗腺体时，如治疗多汗症，长达27个月。
肉毒杆菌毒素除了在外周部位具有药理作用外，也可能在中枢神经系统中有抑制作用。Weigand等人，瑙纽-施密特伯格药物学(Nauny-Schmiedeberg’sArch.Pharmacol).1976；292,161-165,和Habermann，瑙纽-施密特伯格药物学.1974；281,47-56的研究成果表明肉毒杆菌毒素能够通过逆向运输上升到脊髓区域。因此，在外周位置(例如肌内)注射的肉毒毒素可以逆向转运到脊髓。
肉毒杆菌毒素也被提出或已经用于治疗皮肤骨和腱伤(美国专利号6,447,787)；鞘内疼痛(参见美国专利号6,113,915)；各种自主神经障碍，包括汗腺障碍(参见例如美国专利号5,766,605和Goldman(2000)，美容整形外科7月-8月24日(4):280-282)；紧张性头痛(美国专利号6,458,365)；偏头痛(美国专利号5,714,468)；手术后疼痛和内脏痛(美国专利号6,464,986)；毛发生长和保留毛发(美国专利号6,299,893)；银屑病和皮炎(美国专利号5,670,484)；损伤的肌肉(美国专利号6,423,319)；各种癌症(美国专利号6,139,845和6,063,768)，平滑肌障碍(美国专利号5,437,291)；神经卡压综合征(美国专利申请2003-0224019)；痤疮(WO 03/011333)；神经原性炎症(美国专利号6,063,768)；视觉障碍(参见美国专利号6,265,379)；胰腺障碍(参见美国专利号6,143,306和6,261,572)；前列腺障碍，包括前列腺增生、前列腺癌和尿失禁(参见美国专利号6,365,164和6,667,041和DoggweilerR.等人A型肉毒杆菌毒素引起大鼠前列腺的弥漫性和高度选择性萎缩，神经泌尿与尿动力学(Neurourol Urodyn)1998；17(4):363)；纤维肌痛(美国专利号6,623,742)和梨状肌综合症(参见Childers等人(2002)，美国物理医学与康复杂志(American Journal of PhysicalMedicine&Rehabilitation)，81：751-759)。
美国专利号5,989,545公开了经修饰的梭菌神经毒素或其片段，优选肉毒杆菌毒素，化学偶联或重组融合到特定的靶向基团(targeting moiety)，可用于施用该药剂到脊髓以治疗疼痛。此外，已经公开了靶向的肉毒杆菌毒素(即具有非天然结合部分(bindingmoiety))可用于治疗各种病症(参见WO 96/33273；WO 99/17806；WO 98/07864；WO 00/57897；WO 01/21213；WO 00/10598)。
此外，已经将肉毒杆菌毒素注射到胸肌中以控制胸部痉挛(Senior M.，肉毒杆菌毒素和在胸大肌移植插入后胸部痉挛的管理(Botox and the management of thectoralspasm after subpectorial implant insertion)，整形与再造外科(Plastic and ReconSurg)，2000年7月，224-225)。已知可控释放毒素植入物(参见美国专利号6,306,423和6,312,708)是经皮肉毒杆菌毒素给药(美国专利申请序号10/194,805)。已知肉毒杆菌毒素可以用于：削弱嘴巴的咀嚼或咬合肌肉，使得自身造成的伤口和由此导致的溃疡可以愈合(Payne M.等人，肉毒杆菌毒素作为Lesch-Nyhan综合征中自伤的新型治疗方法(Botulinumtoxin as a novel treatment for self mutilation in Lesch-Nyhan syndrome)，AnnNeurol 2002年9月；52(3Supp 1)：S157)；允许良性囊性病灶或肿瘤的治愈(Blugerman G.,等人，多发性小汗腺汗囊瘤：一种新的肉毒杆菌毒素治疗方案(Multiple eccrichidrocystomas：A new therapeutic option with botulinum toxin)，皮肤外科(Dermatol Surg)2003年5月；29(5):557-9)；治疗肛裂(Jost W.，十年关于肉毒杆菌毒素在肛裂的经验(Ten years’experience with botulinum toxin in anal fissure)，结直肠疾病国际期刊(Int J Colorectal Dis)2002年9月；17(5)：298-302)；并治疗某些类型的过敏性皮肤炎(Heckmann M.,等人，A型肉毒杆菌毒素注射治疗单纯性苔藓：一项开放的试点研究(Botulinum toxin type A injection in the treatment of lichen simplex:Anopen pilot study)，美国皮肤病学会杂志(J Am Acad Dermatol)2002年4月；46(4)：617-9)。
另外，肉毒杆菌毒素可以具有减少大鼠福尔马林模型中诱发炎性疼痛的作用(Aoki K.等人，皮下肉毒杆菌毒素的镇痛作用机制：抑制外周和中枢疼痛处理Mechanismsof the antinociceptive effect of subcutaneous Botox:Inhibition of peripheraland central nociceptive processing,头痛(Cephalalgia)2003年9月；23(7)：649)。此外，据报道，肉毒杆菌毒素神经阻塞可导致表皮厚度的减少(Li Y等人，感觉和运动去神经支配影响大鼠足无毛皮肤的表皮厚度Sensory and motor deenervation influenceepidermal thickness in rat foot glabrous skin，实验神经学(Exp Neurol)1997；147：452-462)。最后，已知向脚部施用肉毒杆菌毒素以治疗过度的脚出汗(Katsambas A.等人，脚皮肤病：未经批准的治疗(Cutaneous diseases of the foot:Unapproved treatments,临床皮肤学(Clin Dermatol)2002年11月至12月；20(6)：689-699；Sevim，S.,等人，肉毒杆菌毒素-A治疗手掌和足底多汗症(Botulinum toxin-A therapy for palmar and plantarhyperhidrosis)，Acta Neurol Belg 2002年12月；102(4)：167-70)，痉挛性脚趾(Suputtitada，A.,局部注射A型肉毒杆菌毒素治疗痉挛性脚趾Local botulinum toxintype A injections in the treatment of spastic toes，美国物理医学与康复杂志2002年10月；81(10)：770-5)，特发性脚趾行走(Tacks，L.,等人，特发性脚趾行走:注射肉毒杆菌毒素A治疗(Idiopathic toe walking:Treatment with botulinum toxin A injection),发育医学与儿童神经病学(Dev Med Child Neurol)2002；44(Suppl 91)：6)和足部肌张力障碍(Rogers J.,等人，足部肌张力障碍中注射肉毒毒素A(Injections of botulinumtoxin A in foot dystonia)，神经病学(Neurology)1993年4月；43(4Suppl 2))。
破伤风毒素，及其衍生物(即具有非天然靶向基团)、片段、杂交物和嵌合体也具有治疗效用。破伤风毒素与肉毒杆菌毒素有很多相似之处。因此，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素都是由紧密相关的梭菌(Clostridium)(分别为破伤风梭状芽胞杆菌和肉毒梭状芽胞杆菌)产生的多肽。此外，破伤风毒素和肉毒毒素均是由轻链(分子量为约50kD)和重链(分子量为约100kD)组成的双链蛋白质，所述轻链和重链通过单个二硫键共价结合。因此，破伤风毒素和七种肉毒杆菌毒素(非复合物)的分子量均为约150kDa。此外，对于破伤风毒素和肉毒杆菌毒素，轻链包含显示细胞内生物(蛋白酶)活性的结构域，而重链包含受体结合(免疫原性)和细胞膜转运结构域。
并且，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素对突触前胆碱能神经元表面的神经节(gangliocide)受体表现出高特异性亲和力。受体介导的外周胆碱能神经元对破伤风毒素的内吞作用导致逆向轴突运输，阻断中枢突触释放抑制性神经递质，并引发痉挛性麻痹。相反地，已经认为，受体介导的外周胆碱能神经元对肉毒杆菌毒素的内吞作用几乎未引起逆向运输，从而抑制中枢突触的乙酰胆碱胞吐作用并产生松弛性麻痹。然而，最近的报道表明，肉毒杆菌毒素也可以沿轴突进行逆向转运，并可能抑制中枢突触中乙酰胆碱的释放(Bomba-Warczak等人，破伤风毒素和肉毒杆菌神经毒素A和D在中枢神经元的神经元转移和远端作用(Interneuronal Transfer and Distal Action of Tetanus Toxin andBotulinum Neurotoxins A and D in Central Neurons)，细胞报告(CellReports)，2016年8月16日；16-1974-1987)。
最后，破伤风毒素和肉毒杆菌毒素在生物合成和分子结构中彼此相似。因此，破伤风毒素和A型肉毒杆菌毒素的蛋白序列之间总体有34％的同源性，对于某些功能结构域，序列同一性高达62％(Binz T.等人，A型肉毒杆菌神经毒素的完整序列以及与其他梭菌神经毒素比较(The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparativewith other Clostridial Neurotoxins)，生物化学期刊(J Biological Chemistry)265(16)；9153-9158：1990)。
在本发明的一个实施方式中，“乙酰胆碱”是胆碱和乙酸的酯，是第一个已知的神经递质。它分布在神经元中，具有的化学式为C7H16NO2，分子量为146.21kDa。
通常在哺乳动物的神经系统中，每一种神经元仅释放一种类型的小分子神经递质，尽管有证据表明相同的神经元可释放几种神经调节剂。神经递质乙酰胆碱由大脑很多区域中的神经元分泌，特别是由运动皮层的大锥体细胞、基底神经节中几种不同的神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统(交感神经和副交感神经)的神经节前神经元、肌梭纤维的袋1纤维、副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的某些神经节后神经元分泌。基本上，只有通向汗腺、竖毛肌(piloerector muscle)和少数血管的神经节后交感神经纤维是胆碱能性的，因为交感神经系统的大部分神经节后神经元分泌的神经递质是去甲肾上腺素。在多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。然而，已知乙酰胆碱在某些外周副交感神经末梢具有抑制作用(例如通过迷走神经抑制心率)。
自主神经系统的传出信号通过交感神经系统或副交感神经系统传递到身体中。交感神经系统的神经节前神经元从位于脊髓中间外侧角(intermediolateral horn)中的神经节前交感神经元细胞体延伸。从细胞体延伸出来的神经节前交感神经纤维与位于脊椎旁的交感神经节中或椎骨前神经节中的神经节后神经元形成突触。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能性的，因此对神经节应用乙酰胆碱将刺激交感和副交感神经节后神经元。
乙酰胆碱活化两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。毒蕈碱受体发现存在于所有由副交感神经系统的神经节后神经元所刺激的以及交感神经系统的神经节后胆碱能神经元所刺激的效应细胞中。烟碱受体发现存在于肾上腺髓质以及自主神经节中，即在神经节后神经元的细胞表面上，所述神经元在交感神经和副交感神经系统的神经节前与神经节后神经元之间的突触中。烟碱受体还发现存在于很多非自主性神经末梢中，例如神经肌接点处的骨骼肌纤维的膜中。
当小而透明的细胞内小泡与突触前神经元细胞膜融合时，乙酰胆碱即从胆碱能神经元中释放出来。多种非神经元分泌细胞，如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细胞分别从大致密核心小泡中释放儿茶酚胺和甲状旁腺激素。PC12细胞系是大鼠嗜铬细胞瘤细胞的克隆，被广泛用作研究交感肾上腺发育的组织培养模型。肉毒杆菌毒素经渗透(如电穿孔)或直接注射到去神经细胞中后，将在体外抑制两种类型的化合物从两种类型的细胞中的释放。还已知肉毒杆菌毒素阻断神经递质谷氨酸从皮质突触小体细胞培养物中的释放。
神经肌肉接点是通过轴突接近肌肉细胞而在骨骼肌中形成的。通过神经系统传递的信号引起末端轴突处的动作电位，并活化离子通道，导致神经递质乙酰胆碱从神经细胞内，例如神经肌肉接点的运动终板处的突触小泡中释放出来。乙酰胆碱穿过细胞外间隙与乙酰胆碱受体蛋白在肌肉终板的表面上结合。一旦发生了足够的结合，肌肉细胞的动作电位引起特异性的膜离子通道变化，从而导致肌肉细胞收缩。然后乙酰胆碱从肌肉细胞中释放出来并通过胆碱脂酶在细胞外间隙中代谢。代谢产物回收到末端轴突中以再加工为乙酰胆碱。
在本发明的一个实施方式中，“微结构”包括微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列或微电极，但不限于此。特别地，本发明中使用的微结构优选为微针。此外，当制造在本发明中公开的用于医疗应用的微针时，这些微针优选由“生物相容性或生物可降解材料”制成。如本文所用，术语“生物相容性材料”是指对人体无毒且化学惰性的材料。此外，术语“生物可降解材料”是指可以通过体液，酶或微生物在体内降解的材料。如本文所用，术语“微结构”是指制造成其中包含本发明的肉毒杆菌毒素组合物的制剂，其包含肉毒杆菌毒素、增稠剂和作为活性成分的稳定剂，或者一种包被本发明的肉毒杆菌毒素组合物。本发明中使用的微结构包括通过本领域中使用的微结构制造方法制造的任何微结构，并且不受制造方法的限制。
在本发明的一个实施方式中，术语“微针”是指通过使用微针在皮肤中形成孔以增加药物渗透的技术。微针主要用于体内药物输送、采血、体内分析物检测等。
1998年，佐治亚理工学院(Georgia Institute of Technology)(美国)通过利用半导体工艺技术将微结构芯片作为硅器件，首先提出了微结构芯片作为替代皮下注射技术的潜力。
与常规针头不同，微针在穿透皮肤时不会引起疼痛，对于无痛的皮肤穿透，最小锐度的顶部直径很重要。此外，微针应具有足以穿透皮肤中最强屏障的10-20μm厚角质层的物理硬度。此外，微针应具有合适的长度以达到毛细管，从而提高药物递送效率。
由于提出了平面(in-plane type)微针(“硅加工的微针”,微电化学系统期刊(Journal of microelectrochemical systems)8,1999),已经开发出来了各种微针。例如，使用蚀刻方法制成的固体硅微针芯片被提出为异面(out-of—plane)微针芯片(美国专利公开No.2002138049)。该方法所述的固体硅微针具有50-100μm的直径和500μm的长度，但是不可能实现无痛的皮肤穿透，并且不能可靠地实现药物或化妆品成分向目标部位的体内递送。同时，Prausnitz(美国佐治亚大学)提出了一种制备可生物降解的聚合物微针的方法，其包括通过蚀刻玻璃或通过光刻制备模具(可生物降解的聚合物微针：制造，结构和透皮药物递送(Biodegradable polymer microneedles:Fabrication,mechanics andtransdermal drug delivery),控制释放期刊(Journal of Controlled Release)104,2005,5166)。此外，2006年提出了一种制作可生物降解的微针的方法，该方法在用光刻法制造的模具的末端上负载以胶囊型物质(用于控制释放药物递送的聚合物微针(PolymerMicroneedles for Controlled-Release Drug Delivery)，药学研究(PharmaceuticalResearch)23,2006,1008)。该方法的使用具有容易负载胶囊型药物的优点。然而，随着负载药量的增加，微针的硬度降低，表明该方法对需要大量给药的药物的应用受到限制。
2005年，纳米器件和系统公司(Nano Device and Systems Inc.)(日本未审查专利申请公开号2005154321)提出了吸收式微针。这种吸收式微针用于药物输送或美容护理，而不需要移除插入皮肤的微针。在该方法中，通过将含有麦芽糖的组合物施用到模具中并固化组合物来制备微针。上述日本专利公报表明通过吸收式微针对药物进行透皮吸收，但是当穿透皮肤时微针引起疼痛。此外，模具制造中由于技术限制，不可能制造具有不产生疼痛的适当顶部直径，和有效药物递送所需范围的长度(即等于或大于1mm的长度)的微针。
2008年Prausnitz(美国佐治亚大学)提出，可生物降解的微针用聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和甲基丙烯酸(MAA)的混合物(具有快速溶解聚合物微针的微创蛋白质递送，新材料(Advanced Materials)2008,1)制备。此外，通过将羧甲基纤维素置于锥体模具中制备微针(溶解微针用于透皮药物递送，生物材料(Biomaterials)2007,1)。然而，使用模具的制造方法的局限性在于，需要通过复杂的工艺制造新的模板和模具来控制微针的直径和长度。此外，其缺点是通过将材料放置在模具中来制造微针的方法复杂并且耗时。
2008；Mukai等人(日本)公开了使用针结构制造皮肤针的装置和方法(美国专利公开号20080157421A1)。这种方法包括在底物的基底上加热粘性物质，并利用针的张力牵拉粘性物质。因为该方法涉及使用针结构拉动被熔化或粘稠的材料，所以还需要根据所需样式制造新的针结构的过程，导致生产成本的增加，并且加热过程难以负载各种热敏生物药物(激素、疫苗、其他蛋白质药物等)。
皮肤由角质层(<20μm)、表皮(<100μm)和真皮(300-2,500μm)构成，从皮肤的外层依次层叠。因此，为了将药物和生理活性物质递送到特定的皮肤层而不引起疼痛，使得微针的顶部直径为30μm或更小、有效长度为200-2000μm、硬度足以穿透皮肤，有效地递送药物和皮肤护理组分。另外，为了通过可生物降解的固体微针递送药物或生理活性物质，在制造微针的过程中应当避免可能会破坏所述药物和生理活性物质的活性的任何方法，如高温处理，有机溶剂处理等。
由于生产方法的限制，传统的固体微针由限定的材料(如硅、聚合物、金属、玻璃等)制成。此外，使用基于模具技术的制造方法导致复杂且耗时的过程，具有药物变性、硬度不足和药物损失等缺点。因此，不断需要一种制造微针的方法，其具有细径使能够无痛穿透皮肤，具有足够的长度，使得能够深入皮肤穿透，并且具有足够的硬度，而不管材料的种类如何也能使药物的损失最小化。
在本发明的一个实施方式中，术语“药物组合物”是指为特定目的施用的组合物。为了本发明的目的，本发明的药物组合物被配置成使得能够以精确控制的浓度将肉毒杆菌毒素精确施用于所需位置，并且药物组合物可以包括蛋白质和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂(包括在该施用中)。“药学上可接受的”载体或赋形剂是指所述的载体或赋形剂被政府的管理机构批准或在药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，尤其用于人类。
含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构，其适用于肠胃外给药，可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，或以固体或半固体的形式制备，并且可含有制剂如悬浮剂、稳定剂、增溶剂和/或分散剂。该形式可以被灭菌并且可以是流体。它在制造和储存条件下是稳定的，并且可以防止诸如细菌或真菌的微生物的污染。或者，含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构可以是无菌粉末的形式，用于在使用前用合适的载体重构。药物组合物以单位剂量形式、微针贴剂、在安瓿或其它单位剂量容器或在多剂量容器中存在。或者，药物组合物可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用盐水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒或片剂制备。
在一些非限制性实施方式中，含有作为活性成分的肉毒杆菌毒素的微球可以配制成液体，或者可以以液体的微球形式被包含在内。在任何非限制性实施方式中，含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构液体组合物含有浓度为0.001-100,000U/kg的肉毒杆菌毒素或药学上可接受的化合物和/或混合物。在任何非限制性实施方式中，适用于含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微球组合物的赋形剂，包括防腐剂、悬浮剂、稳定剂、染料、缓冲剂、抗菌剂、抗真菌剂和等渗剂(例如糖或氯化钠)。如本文所用，术语“稳定剂”是指任选用于本发明的药物组合物中的化合物，以增加保存期限。在非限制性实施方式中，稳定剂可以是糖、氨基酸或聚合物。药物组合物可以含有一种或多种药学上可接受的载体。载体可以是溶剂或分散介质。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油及其合适的混合物。
肠胃外制剂可以是灭菌的。灭菌技术的非限制性实例包括通过细菌截留过滤器的过滤、终端灭菌、灭菌剂的结合、照射、加热、真空干燥和冷冻干燥。
在本发明的一个实施方式中，术语“施用”是指通过任何合适的方法将本发明的组合物导入患者体内。本发明的组合物可以通过任何一般途径施用，只要其可以达到靶组织即可。组合物可以口服、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、鼻内、肺内、直肠内或鞘内给药。然而，根据本发明的含有肉毒杆菌毒素作为活性成分的微结构优选使用微针皮内施用。
本发明的治疗方法可以包括施用药学有效量的药物组合物。在本发明中，有效量可以根据各种因素而变化，包括疾病的种类，疾病的严重程度，组合物中含有的活性成分和其它成分的种类和含量，制剂的种类，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，组合物的分泌速率，治疗和药物同时使用的周期。
在一个实施方式中，本发明提供了一种肉毒杆菌毒素组合物，其含有作为活性成分的肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂。在本发明的肉毒杆菌毒素组合物中，肉毒杆菌毒素可以是选自下组的任何一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素；增稠剂可以是选自下组的任何一种或多种：羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮；增稠剂的含量可以为0.05-10wt％；稳定剂可以是选自下组的任何一种或多种：海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠、和人血清白蛋白和氯化钠的混合物；稳定剂的含量可以为0.03-50wt％。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含肉毒杆菌毒素组合物的微结构。微结构可以是选自下组的任何一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备肉毒杆菌毒素组合物的方法，其包括混合肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂的步骤。在本发明的方法中，肉毒杆菌毒素的组合物可以是选自下组的任何一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素；增稠剂可以是选自下组的任何一种或多种：羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮；增稠剂可以以0.05-10wt％的量混合；稳定剂可以是选自下组的任何一种或多种：海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠和人血清白蛋白和氯化钠的混合物；稳定剂的含量可以为0.03-50wt％。
在另一个实施方式中，本发明提供了用肉毒杆菌毒素组合物包被目标物体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用高分子化合物预包被物体；(b)混合肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂获得混合物；和(c)将步骤(b)中的混合物滴加到步骤(a)中的预包被的物体上，然后干燥。在本发明的包被方法中，高分子化合物可以是聚乙烯醇；聚乙烯醇的使用量可以为0.5-10wt％；肉毒杆菌毒素可能是A型肉毒杆菌毒素；增稠剂可以是选自下组的任何一种或多种：羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮；稳定剂可以是选自下组的任何一种或多种：海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠、和人血清白蛋白和氯化钠的混合物；目标物体可以是微结构；微结构可以是微针。
以下，对本发明的各步骤进行详细说明。
有益的效果
在具有神经功能的动物中，肉毒杆菌毒素抑制神经肌肉接头的胆碱能前突触处的乙酰胆碱的胞外分泌，从而引起虚弱。肉毒杆菌毒素由于其神经毒性功能而对各种疾病具有很大的治疗作用，但由于其强毒性，即使是非常少的量也是致命的。因此，当肉毒杆菌毒素用于活体时，需要精确地控制肉毒杆菌毒素的浓度。本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术。当本发明的微结构用于施用肉毒杆菌毒素时，可以缓解疼痛，并且可将微量的毒素精确地施用于所需位置。因此，本发明的微结构可望大大有助于安全和方便的医疗使用肉毒杆菌毒素。
附图说明
图1显示根据本发明实施例中的预包被材料的种类，测定相对于肉毒杆菌毒素的理论效价的回收率的结果。
图2显示在本发明的一个实施例中，根据与肉毒杆菌毒素混合的增稠剂的种类和浓度，测定相对于肉毒杆菌毒素的理论效价的回收率的结果。
图3显示在本发明的一个实施例中，根据与肉毒杆菌毒素混合的稳定剂的种类和浓度，测定相对于肉毒杆菌毒素的理论效价的回收率的结果。
图4显示在本发明的一个实施例中，SA或HA增稠剂与稳定剂的组合的长期稳定性的测定结果。
图5显示在本发明的一个实施例中，PVP或HEC增稠剂与稳定剂的组合的长期稳定性的测定结果。
最佳实施方式
本发明提供一种包被组合物，其含有：肉毒杆菌毒素；增稠剂和稳定剂。在包被组合物中，肉毒杆菌毒素的组合物可以选自下组：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素。所述肉毒杆菌毒素优选为A型肉毒杆菌毒素。增稠剂可以是选自下组的任何一种或多种：羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮，且增稠剂的含量可以为0.05-10wt％。稳定剂可以是选自下组的任何一种或多种：海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠、和人血清白蛋白和氯化钠的混合物，且稳定剂的含量可以为0.03-30wt％。包被组合物可以包被在微结构的表面上，微结构可以是微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列或微电极。微结构优选为微针。
发明实施方式
以下本发明的更进一步细节将通过参考实施例被描述。对于本领域技术人员显而易见的是，这些例子仅仅是用于说明目的，而并不旨在限定本发明的范围。
实施例1：测试肉毒杆菌毒素效价的稀释系数的检测
因为当2×包被组合物和2×肉毒杆菌毒素组合物彼此混合时发生的肉毒杆菌毒素效价的损失率是不可见的，所以进行了初步实验以便在制备肉毒杆菌毒素组合物后立即检测肉毒杆菌毒素效价的变化。
为此，单独制备2×包被组合物和2×肉毒杆菌毒素组合物，并以1:1的比例混合，从而制备如下表1所示的混合组合物。
【表1】
对于上述混合组合物，使用体外效价测定试剂盒(Matrix肉毒杆菌神经毒素检测试剂盒,Biosentinel,Inc.)测定肉毒杆菌毒素的效价。具体地，以与Dunning FM等人，J Vis Exp中所述相同的方式进行测量。2014年3月3；(85).doi:10.3791/51170。此外，考虑到在制备后效价立即降低的情况，应用两种稀释系数(75和112.5)。测量的结果如下表2所示。
【表2】
每种混合组合物的肉毒杆菌毒素效价的测量结果表明，相对于理论效价的回收率为50％或更高。然而，显示了当应用稀释系数为112.5时，测得的CMC回收率超出了标准曲线的范围，制备后立即检测的CMC和磷酸钠的回收率低于HAS或吐温20的测定值。
实施例2：预包被材料的选择
根据PLA(聚(乳酸))基板是否预包被以及预包被材料的种类，进行实验以检查肉毒杆菌毒素效价的变化。
将6.5μl的包被组合物(含有HSA+NaCl、吐温20、CMC和磷酸钠(pH6.0)中的各种与肉毒杆菌毒素的混合物)滴加到PLA基板(未包被；N)上，2％PVA预包被基板(PVA)或相应的增稠剂包被的基板(例如，当使用1％HSA+1.8％NaCl作为增稠剂时，PLA基板也用1％HSA+1.8％NaCl包被)，然后在室温下干燥过夜。干燥结束后，将各基板放入含有0.3mL 0.9％NaCl的1.5mL管中，并将该毒素在室温下洗脱30分钟。洗脱结束后，考虑到在滴加后回收期间肉毒毒素的效价保持100％的情况，将各组合物以83.3的稀释系数稀释，进行体外效价测定。测量结果如下表3和图1所示。
【表3】
(N/D；未检测到)
从上表3和图1中可以看出，当滴加后回收期间的效价高于标准曲线的上限，它被表示为N/D。考虑到磷酸钠的结果，表明当基板用2％PVA包被时，效价保持稳定。
吐温20在所有基板中显示低效价，表明它不适合作为包被组合物。此外，与磷酸钠相同的方式，除PVA预包被基板以外，CMC在其他基板中也没有显示效价。
实施例3：选择含有肉毒杆菌毒素的包被组合物的最佳增稠剂
为了从备选材料中选择包含在包被组合物中的增稠剂，8种包被备选材料(2％CMC、1％SA、1％HA、1％MC、1％HEC、2％PVP、1％HSA+1.8％NaCl和0.05M磷酸盐)各自以2×浓度制备，并以1：1的比例与肉毒杆菌毒素2×浓度溶液(5,000U/3.25μl)混合。然后，将各自制备的6.5μl溶液滴加到2％PVA预包被基板上，然后在室温下干燥过夜。干燥结束后，将各基板放入含有0.3mL 0.9％NaCl的1.5mL管中，并将该毒素在室温下洗脱30分钟。洗脱结束后，考虑到在滴加后回收期间肉毒毒素的效价保持100％的情况，将各包被溶液以83.3的稀释系数稀释，进行体外效价测定。测量结果如下表4和图2所示。
【表4】
每个试验组制备两个样品(样品1和2)，并测量从每个样品中洗脱的毒素两次。结果如上表4所示，显示在包被组合物中，相对于CMC、MC、HEC、PVP和HSA+NaCl各自的理论效价的回收率高达80％或更高。特别地，MC和HSA+NaCl显示90％以上的高效价回收率。此外，SA和HA也显示了60％或更高的平均效价回收率，其高于磷酸钠所示的平均效价回收率。
实施例4：选择含有肉毒杆菌毒素的包被组合物的最佳稳定剂
为了从备选材料中选择包含在包被组合物中的稳定剂，将如下表5所示制备的每种包被组合物与肉毒杆菌毒素2×浓度溶液(5,000U/3.25μl)以1:1的比例混合，并将各自制备的6.5μl溶液滴加到2％PVA预包被基板上，然后在室温下干燥过夜。干燥结束后，将各基板放入含有0.3mL 0.9％NaCl的1.5mL管中，并将该毒素在室温下洗脱30分钟。洗脱结束后，考虑到在滴加后回收期间肉毒毒素的效价保持100％的情况，将各包被溶液以83.3的系数稀释，进行体外效价测定。
【表5】
表6中的实验结果表明，相对于在所有稳定剂条件下HSA制备后立即检测的值，除了CMC之外的PVP和HEC显示出90％或更高的效价回收率。结果如图3所示。
实施例5：含有肉毒杆菌毒素的包被组合物的加速稳定性检测
基于上述实施例1至4的结果，对选择的增稠剂(SA，HA，PVP和HEC)和稳定剂(Tre和Met)的混合物的长期稳定性进行检测。
为了检测SA或HA增稠剂和稳定剂的组合的长期稳定性，将PLA基板用2％PVA预包被，并将如下表6所示制备的每种包被组合物与肉毒杆菌毒素2×浓度溶液(5,000U/3.25μl)混合，比例为1：1。将各自制备的6.5μl溶液滴加到每个PLA基板上，然后在室温下干燥过夜。干燥结束后，将各基板放入含有0.3mL 0.9％NaCl的1.5mL管中，并测量每个基板的效价回收率直至第8天。由于包被组合物本身(包含各种组合中增稠剂和稳定剂的混合物)将影响肉毒杆菌毒素效价的测定，因此将第1天的每个测试组测定的效价作为参考值100，在第8天测得的效价表示为相对于第1天测得的效价。结果如图4所示。测试结果表明，相对于第1天至第8天的效价，包括SA或HA增稠剂的大多数测试组保持50％或更高的效价。
【表6】
另外，为了检测PVP或HEC增稠剂和稳定剂的组合的长期稳定性，以与对SA和HA增稠剂进行的试验相同的方式制备和滴加肉毒杆菌毒素包被组合物，然后在37℃下进行加速稳定性试验5周。为了准确比较测定值，将每个样品制备后立即检测的效价作为参考值(100％)，并且5周内不同时间点的效价相对于参考值表示。此外，应用在BoTest测试中作为阳性对照的标准产品的值以最小化测试之间的误差。测试结果如下表7和图5所示。
【表7】
制备实施例 制备后立刻检测 1天 8天 22天 36天
1％PVP 100.0 92.3 71.2 61.1 N/D
1％PVP+10％Tre 100.0 107.9 85.1 70.2 57.2
1％PVP+Met 20 mM 100.0 108.4 105.9 87.7 55.0
0.5％HEC 100.0 80.7 65.2 N/D N/D
0.5％HEC+10％Tre 100.0 92.5 88.9 66.0 53.4
0.5％HEC+Met 20mM 100.0 104.0 59.9 N/D N/D
HSA+NaCl 100.0 112.7 86.0 61.5 45.6
磷酸钠(pH 6.0) 100.0 105.2 89.4 67.9 N/T
(N/D:未检测到,N/T:未测试)
测试结果表明，与阳性对照HSA相比，三种条件：1％PVP+10％Tre，1％PVP+Met20mM和0.5％HEC+10％Tre是制备肉毒杆菌毒素包被组合物的最佳稳定剂组合。
从上述实施例1-5的结果可以发现，在制造稳定的微结构的情况下，能够使肉毒杆菌毒素以精确控制的浓度精确施用于所需位置，而不引起诸如疼痛等不适，羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和/或聚乙烯吡咯烷酮作为增稠剂是有效的，海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠和/或人血清白蛋白和氯化钠的混合物作为稳定剂是非常有效的。
工业实用性
本发明涉及肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术。
本发明的肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术使得精确地控制肉毒杆菌毒素的浓度，并且当肉毒杆菌毒素施用于人体时减轻产生的疼痛成为可能，并且还使肉毒杆菌毒素能够精确地施用于所需的位置。因此，本发明可望大大有助于安全和方便的医疗使用肉毒杆菌毒素。

Claims (22)

1.一种肉毒杆菌毒素组合物，其特征在于，含有作为活性成分的肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂。
2.根据权利要求1所述的肉毒杆菌毒素组合物，其特征在于，所述肉毒杆菌毒素是选自下组中的任何一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素。
3.根据权利要求1所述的肉毒毒素组合物，其特征在于，所述增稠剂是选自下组中的任何一种或多种：羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
4.根据权利要求3所述的肉毒杆菌毒素组合物，其特征在于，所述增稠剂的含量为0.05-10wt％。
5.根据权利要求1所述的肉毒杆菌毒素组合物，其特征在于，所述稳定剂是选自下组中的任何一种或多种：海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠、以及人血清白蛋白和氯化钠的混合物。
6.根据权利要求5所述的肉毒杆菌毒素组合物，其特征在于，所述稳定剂的含量为0.03-50wt％。
7.一种微结构，其特征在于，所述微结构含有如权利要求1-6中任一所述的肉毒杆菌毒素组合物。
8.根据权利要求7所述的微结构，其特征在于，微结构可以是选自下组的任何一种或多种：微针、微刀片、微刀、微纤维、微刺、微探针、微倒钩、微阵列和微电极。
9.一种制备肉毒杆菌毒素组合物的方法，其特征在于，包括步骤：混合肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肉毒杆菌毒素是选自下组中的任何一种或多种：A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型肉毒杆菌毒素。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述增稠剂是选自下组中的任何一种或多种：羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述增稠剂的混合量为0.05-10wt％。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述稳定剂是选自下组中的任何一种或多种：海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠、以及人血清白蛋白和氯化钠的混合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述稳定剂的混合量为0.03-50wt％。
15.一种用肉毒杆菌毒素组合物包被目标物体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)用高分子化合物预包被物体；
(b)混合肉毒杆菌毒素、增稠剂和稳定剂，从而获得混合物；和
(c)将步骤(b)中所述混合物滴加到步骤(a)中所述预包被的物体上，然后干燥。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述高分子化合物是聚乙烯醇。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的用量为0.5-10wt％。
18.权利要求15的方法，其特征在于，所述肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述增稠剂是选自下组中的任何一种或多种：羧甲基纤维素钠盐、海藻酸钠、透明质酸、甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述稳定剂是选自下组中的任何一种或多种：海藻糖、甲硫氨酸、磷酸钠、以及人血清白蛋白和氯化钠的混合物。
21.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述目标物体是微结构。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述微结构是微针。
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