DE3726380A1 - Ein neuer inhibitor fuer die proteinsynthese - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Inhibitor der Proteinsynthese sowie Verfahren zu seiner Isolierung, Reinigung und Identifizierung der N-terminalen Sequenz seiner Peptidkette.

Es ist ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diesen Inhibitor der Proteinsynthese mit monoklonalen Antikörpern unter Bildung von Immunotoxinen oder mit anderen Molekülen unter Bildung spezifischer Hybride, welche für therapeutische Zwecke nützlich sind, zu konjugieren.

Proteine, welche die Proteinsynthese inhibieren, werden ebenfalls als Ribosom inaktivierende Proteine (RIPs) bezeichnet und wurden in Samen, Wurzeln und Blättern einer Reihe von Pflanzen nachgewiesen. L. Barbieri und F. Stirpe (Cancer Surveys Bd. 1, 1982, S. 489) haben vorgeschlagen, diese RIPS, die in der Natur in Form von einkettigen Proteinen existieren, als "RIPS Typ 1" und jene, die in einer A-(aktiven)-Kette mit RIP-Eigensschaften, kovalent gebunden an eine B-(Bindungs)-Kette mit Lecithin-Eigenschaften, als "RIPs Typ 2" zu bezeichnen.

Die "RIPs Typ 2" wie Ricin, Abrin, Modeccin, können in die Zellen leichter eintreten, und sie inhibieren die Proteinsynthese in Zellen wie auch in zellfreien Systemen, und sie sind somit gegenüber Tieren stark toxisch.

Die "RIPs Typ 1" sind nur in zellfreien Systemen wirksam, da sie nicht in die Zellen eindringen können: so sind sie für alle Tiere kaum oder sogar nicht toxisch.

Im allgemeinen inaktivieren diese Proteine eukaryotische Ribosome in einer katalytischen (enzymatischen) Weise und setzen die 60S-ribosomalen Untereinheiten in einen Zustand, daß sie den Dehnungsfaktor 2 nicht binden können und somit die Proteinsynthese unterbrechen bzw. stören. Wie oben erwähnt, bestehen die "RIPs Typ 2" (beispielsweise Ricin, Abrin, Modeccin) aus zwei funktionell unterschiedlichen Ketten, d. h. aus einer Ribosom inaktivierenden A-Kette, die durch eine einfache Disulfidbindung an die schwere B-Kette gebunden ist, welche Zucker mit der Konfiguration der D-Galactose bindet. Der eine Teil, die B-Kette, ist an der Bindung der Toxine an die Rezeptoren der Zelloberfläche beteiligt, wohingegen der andere Teil, die A-Kette, in die cytoplasmische Phase eindringen kann, wo er die Proteinsynthese inhibiert.

Die A- und B-Kette können getrennt werden, und es wurde gefunden, daß die Ketten nicht die intakten Zellen betreten können, sofern sie nicht an die B-Ketten gebunden sind.

F. Stirpe und L. Barbieri (FEBS Letter. 195, S. 1-8, Januar 1986) haben einen Übersichtsartikel über Ribosom inaktivierende Proteine des "Typs 1" als auch des "Typs 2" publiziert.

Die Anmelderin hat jetzt überraschenderweise einen neuen exzeptionell potenten Proteininhibitor isoliert, indem sie eine geeignete Extraktion der Wurzeln einer Pflanze der Cucurbitaceae-Familie, genannt Bryonia dioica (weiße Zaunrübe), durchgeführt hat. Die Anmelderin hat diesen neuen Proteininhibitor als "Bryodin" bezeichnet. Bryodin scheint ein Glycoprotein mit einer einzigen Kette aufgrund seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften und biologischen Eigenschaften sehr ähnlich den RIPs Typ 1 zu sein.

Bryodin inhibiert die Proteinsynthese durch Beschädigung der Ribosomen in Abwesenheit von irgendeinem Cofaktor. Die niedrige Toxizität gegenüber Tieren, verglichen mit anderen RIPs, ist ein Merkmal von Bryodin. Bryodin scheint auch recht beständig gegenüber starken chemischen Behandlungen. Dies bewirkt, daß Bryodin für die Herstellung von Immunotoxinen oder anderen Konjugaten geeignet ist, wie sie mit anderen RIPs erhalten werden (Stirpe & Barbieri, 1986).

Bryodin besitzt eine niedrige inhärente Toxizität gegenüber Mäusen als Saporin 6, ein RIP, mit dem ein wirksames Immunotoxin hergestellt worden ist (Thorpe et al. J. N. C. I., 75, 1, S. 151-159, 1985). Immunotoxine, die mit Saporin 6 hergestellt worden sind, sind gegenüber Tieren toxischer als das freie Protein, und diese Toxizität scheint auf den RIP-Molekülteil zurückzuführen zu sein. Konjugate, die mit einem gleich aktiven, aber weniger toxischen RIP hergestellt werden, können unter Verwendung von Bryodin erhalten werden.

Das Molekulargewicht von Bryodin, bestimmt nach dem Polyacrylamid-Gel-Elektrophoreseverfahren von Laemmli (1970), beträgt etwa 30 000. Seine N-terminale Aminosäuresequenz ist entsprechend dem Einbuchstabencode:

Es ist ein wesentlicher Vorteil von Bryodin, verglichen mit den A-Ketten der zuvor beschriebenen Cytoxine, daß es leicht durch einfache Verfahren, wie sie im folgenden beschrieben werden, erhalten werden kann und daß es nicht durch Gesamt-Cytotoxine, wie es bei den A-Ketten von Ricin und Abrin der Fall ist, kontaminiert ist.

Bryodin wird durch Isolierung von den Wurzeln von Bryonia dioica gemäß Verfahren, die für die Isolierung von Proteinen geeignet sind, erhalten. Bryodin kann somit nach einem Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man:

• a) Gewebe von Bryonia dioica zerkleinert und zentrifugiert und den so erhaltenen Saft sammelt;
• b) den festen Rückstand mit Wasser extrahiert und das unlösliche Material durch Zentrifugieren entfernt;
• c) den vereinigten Saft und wäßrigen Extrakt durch eine vernetzte Dextransäule leitet;
• d) die aus dieser Säule eluierten Proteine durch eine Ionenaustauschsäule leitet;
• e) Bryodin aus der Säule eluiert.

Beispielsweise können Wurzeln, die man von Bryonia dioica erhält, in kleine Stücke geschnitten und mit Wasser, welches bevorzugt einen Elektrolyten und Puffer, beispielsweise Natriumchlorid und einen Phosphatpuffer, enthält, bei ungefähr neutralem pH, wie 7,4, extrahiert werden. Das Gemisch wird unter Brechen der individuellen Zellen der Wurzeln homogenisiert. Dies kann man mit irgendeiner Art einer im Handel erhältlichen Homogenisierungsvorrichtung erreichen. Unlösliches Material, welches durch Zentrifugieren entfernt werden soll und Material mit niedrigem Molekulargewicht können durch Durchleiten durch eine vernetzte Dextransäule, wie eine Sephadex-Säule, beispielsweise eine Sephadex-G-25-Säule, die zuvor mit einem Natriumphosphatpuffer equilibriert wurde, bei einer Konzentration und einem pH, der für die nachfolgende Ionenaustausch-Chromatographie geeignet ist, beispielsweise 5 nM Natriumphosphatpuffer mit einem fast neutralen pH-Wert, entfernt werden. Das proteinhaltige Material wird dann durch eine Ionenaustauschsäule, beispielsweise eine solche, welche Carboxymethyl- oder Sulfopropylgruppen enthält, die zuvor mit dem gleichen Puffer, der bei der vorhergehenden Chromatographie verwendet worden ist, equilibriert worden ist, geleitet. Bryodin wird an die Ionenaustauschmatrix gebunden und wird dann eluiert. Dies wird typischerweise erreicht, indem man eine Lösung mit einem Konzentrationsgradienten, beispielsweise 0 bis 150 mM Natriumchlorid, verwendet. Die größte chromatographische Fraktion, die eluiert, ist die von Bryodin. Mittels einer darauffolgenden Dialyse gegenüber Wasser und/oder einer Chromatographie des rohen Bryodins, das so isoliert wurde, kann die reine Substanz erhalten werden.

Bryodin zeigt eine signifikante Ribosom inaktivierende Proteinaktivität; es inhibiert die Proteinsynthese hauptsächlich in zellfreien Systemen. Die Proteinsynthese inhibierende Aktivität wird weder durch Übernacht-Inkubation bei 37°C noch durch Behandlung mit Trypsin oder Chymotrypsin beeinflußt und etwas durch Behandlung mit Harnstoff oder N-Ethylmaleimid in Anwesenheit von Harnstoff verschlechtert und vollständig durch Kochen oder durch Behandlung mit Natriumdodecylsulfat oder mit 0,1 M NaOH beseitigt.

Obgleich Bryodin gegenüber der Hauptzahl der Säugetierzellen nicht toxisch ist, kann es in den cytotoxischen Zustand durch Bindung an ein Haptomeres überführt werden, welches an Zellen gebunden werden kann. Beispielsweise gibt es bekannte monoklonare Antikörper, die selektiv an Tumorzellen gebunden werden. Die Erfindung betrifft daher ebenfalls ein Immunotoxin, welches Bryodin, konjugiert an ein Haptomeres, enthält, das an eine Zelle gebunden werden kann, wie an einen monoklonalen Antikörper. Wo der monoklonale Antikörper spezifisch für ein Tumorzellen-Antigen ist, geben die entstehenden Konjugate Bryodin an die Tumorzellenoberfläche ab, und beim Betreten der Zellen tötet Bryodin die Zelle auf spezifische Art.

Ähnlich können Haptomere, die selektiv an Zellen eukaryotischer Parasiten gebunden werden, nützlich als Träger für Bryodin verwendet werden.

Analog sind bestimmte Hormonproteine sehr spezifisch bei ihrer Bindung an Rezeptorstellen und können als Haptomere mit konjugiertem Bryodin Toxine bilden, welche selektiv für solche Stellen aktiv sind.

Die erfindungsgemäßen physiologisch aktiven Produkte können für die Verabreichung auf irgendeine zweckdienliche Weise zubereitet werden. Das aktive Material wird normalerweise durch Injektion verabreicht, und es kann als sterile, pyrogenfreie Flüssigkeit, bevorzugt mit Wasser, welches bestimmte physiologisch annehmbare Träger enthalten kann, formuliert werden, die bevorzugt isotonisch ist. Gegenstand der Erfindung ist somit auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel und als aktiven Bestandteil ein erfindungsgemäßes Immunotoxin enthält.

Für die Antitumor-Verabreichung liegt die tägliche Dosis von Bryodin in dem geeigneten Konjugat oder Immunotoxin bevorzugt im Bereich von 1 bis 100 mg. Dosiseinheiten, welche Bryodin als Konjugat enthalten, beispielsweise Ampullen für die Injektion, werden somit normalerweise 1 mg bis 100 mg Bryodin enthalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Fig. 1 zeigt den modifizierten Sequencer, der in Beispiel 1 beschrieben wird.

Beispiel 1 Extraktion, Reinigung und Charakterisierung von Bryodin

Bryony-Wurzeln (etwa 2 bis 3 kg) werden in kleine Stücke geschnitten, welche zerkleinert und in einer Braun-(registriertes Warenzeichen)-Küchenzerkleinerungszentrifuge unter Extraktion des Saftes zentrifugiert werden. Der feste Rückstand wird mit einem Volumen an phosphatgepufferter Salzlösung (0,14 M Natriumchlorid, enthaltend 5 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4), das dem extrahierten Saftvolumen gleich ist, gerührt, und die Suspension wird durch die gleiche Küchenzentrifuge geleitet. Der Saft wird mit dem Extrakt vereinigt, und das Gemisch wird bei 10 000 g während 45 min bei 2°C zentrifugiert, und der Überstand wird mit festem (NH₄)₂SO₄ gesättigt.

Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren, wie oben beschrieben, gesammelt und erneut in 1,5 l 5 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,66, gelöst. Diese Lösung wurde durch Zentrifugieren, wie oben beschrieben, geklärt und auf eine Sephadex-G-25-grobe-Säule (1 m×10 cm), die zuvor mit 5 mM Natriumphosphatpuffer bei 20°C equilibriert worden ist, gegeben. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer in einer Geschwindigkeit von 4 l/h eluiert, und der frontproteinhaltige Peak wurde gesammelt und zentrifugiert und dann auf eine CM-Sepharose-Fast-Flow-Säule (15×10 cm) bei 20°C gegeben.

Nach dem Waschen mit Natriumphosphatpuffer wurde die Säule in einer Geschwindigkeit von 1 l/h mit einem 0 bis 150 mM NaCl-Gradienten des gleichen Puffers (Gesamtvolumen 20 l) eluiert. Es wurden Fraktionen von 400 ml gesammelt und solche, welche eine proteinsynthetische Inhibitoraktivität aufwiesen, wurden vereinigt, ausgiebig gegenüber Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.

Physikalisch-chemische Eigenschaften

M_r-(Molekulargewichts)-Bereiche wurden gemäß dem Polyacrylamid-Gel-Elektrophoreseverfahren von Laemmli (Nature, 227, S. 680, 1970) mit den folgenden Markern (alle von Bio-Rad Laboratories s.r.l., Segrate, Mailand, Italien) bestimmt: Lysozyme (M_r 14 400), Sojabohnentrypsin-Inhibitor (21 500), Kohlensäureanhydrase (31 000), Ovalbumin (45 000), Rinderserumalbumin (66 200) und Phosphorylase B (92 500). Die M_r-Werte wurden ebenfalls durch Gel-Filtration durch eine Säule (95 cm×2,6 cm) von Sephacryl S 200, equilibriert mit 0,3 M NACl, welches 5 mM Natriumphosphatpuffer enthielt, pH 7,2, bestimmt, wobei mit einer Geschwindigkeit von 36 ml/h bei Raumtemperatur (20°C) eluiert wurde. Die Säule wurde mit Rinderserumalbumin (68 000), Ovalbumin (43 000), Chymotrypsinogen (25 000), Ribonuclease (13 700) kalibriert. Der isoelektrische Punkt und die Aminosäure-, Aminozucker- und Neutralzuckerzusammensetzung des Proteins wurden, wie von Falasca et al. (Biochem. J., 207, S. 505, 1982) beschrieben, bestimmt.

Die Eigenschaften des gereinigten Bryodins sind in der folgenden Tabelle I angegeben. Wie andere RIPs (Stirpe & Barbieri, 1986) ist Bryodin ein Glycoprotein mit M_r 30 000 und stark basischem pI. Die Aminosäure- und Neutralzuckerzusammensetzungen sind ebenfalls angegeben.

Verglichen mit anderen RIPs besitzt Bryodin einen niedrigeren Gehalt an Lysin und insbesondere an Schwefelaminosäuren und einen hohen Gehalt an Serin und in geringerem Umfang von Leucin und Tyrosin. Bryodin bildet kein Präzipitat in einem Outcherlony-Test mit Kaninchen-Antisera gegenüber anderen RIPs (Gelonin, Momordin, Dianthin 30 und Dianthin 32, vgl. RIPs, die in FEBS Letter 195, S. 1-8, 1986 beschrieben werden).

Tabelle I

Physikalisch-chemische Eigenschaften von Bryodin

pI9,5

Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von Bryodin

Die N-terminale Sequenz von Bryodin wurde gemäß dem Verfahren von Montecucchi et al. (Manuskript in Bearbeitung) mit einem Gasphasen-Sequencer bestimmt. Insbesondere wurde eine automatische Edman-Sequenzanalyse unter Verwendung eines Gas-Phasensequencers (Mod. 470 A - Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), der mit einem Umwandlungskolben en miniature ausgerüstet ist. Eine Probe (100 bis 200 pMol) wird auf den Patronenfilter gegeben, mit Trifluoressigsäure gewaschen und mit 30 µl Wasser, welches 3 mg Polybren und 0,2 mg NaCl enthält, behandelt. Die Phenylthiohydantoinderivate der Aminosäuren werden auf einer 5 µ C-18-Säule (2,1 mm×22 cm, Applied Biosystems) unter Verwendung einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographievorrichtung (120 App. Applied Biosystems), die on-line mit dem Sequencer verbunden ist, mit einer Gradienteneluierung (Lösungsmittel A: 0,1 M Natriumacetat, pH 3,6, plus 5% Tetrahydrofuran in Wasser; Lösungsmittel B: Acetonitril plus Dimethylphenylthioharnstoff (500 nMol/l) bei 55°C (Strömungsgeschwindigkeit: 2 ml/min; UV-Nachweis bei 269 nm; Empfindlichkeit: 5 pMol).

In dem Sequencer ist der Behälter für wasserfreie Trifluoressigsäure auf geeignete Weise modifiziert, verglichen mit dem, den man von Applied Biosystems Co. kauft (vgl. Fig. 1). In der neuen Bauart (ungefähr 40 ml) wird eine Hauptoberfläche für R-3-Dämpfe zur Verfügung gestellt. In der Tat erstreckt sich die Abgabeleitung für R-3-Reagenzien in den Kopfraum des Reservoirs, jedoch nicht unter die Oberfläche der Flüssigkeit (ca. 0,5 cm über der Oberfläche). Zusätzlich wurden die Manometer zur Messung des Druckes [0,34 bar (0-5 psi)] der Reagenzien und Lösungsmittel, die in dem Sequencer verwendet wurden, durch solche ersetzt, die von Germany WIKA Co. (Mailand, Italien), der italienischen Tochtergesellschaft von Alexander Wiegand GmbH & Co. (Deutschland), gekauft wurden.

Die N-terminale Sequenz der Peptidkette des Bryodins, die auf solche Weise bestimmt wurde, ist im folgenden angegeben. Entsprechend der IUPAC-JUB-Joint Commission on Biochemical Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (Eur. J. Biochem. 138, 1984, S. 9-37) wurde der sogenannte "Einbuchstabencode" für jeden Aminosäurerest verwendet. Die N-terminale Sequenz ist:

Beispiel 2 Zellfreie Proteinsynthese-Inhibierungsaktivität von gereinigtem Bryodin

Die Wirkung auf die Proteinsynthese des gereinigten Bryodins wurde unter Verwendung eines Kaninchen-Reticulocytenlysats bestimmt. Die Proteinsynthese wurde unter Verwendung eines Kits, das von Progema Biotech (Madison, WI, USA) gekauft wurde, analysiert. Dieses Kit entspricht den Standardverfahren für die Analyse von RIPs (vgl.: Stirpe et al., Biochem. J., 216, S. 617-625, 1983).

Kaninchen-Reticulocyten wurden unter Bildung eines funktionellen Proteinsynthesesystems lysiert, bei dem das radioaktive Aminosäure-Leucin in die Proteine eingebaut wird. Die Proteinsynthese wurde durch die Menge der Radioaktivität in der Proteinfraktion gemessen. In 62,5 µl des Reaktionsgemisches sind 25 µl Kaninchen-Reticulocytlysat, hergestellt wie von Allen und Schweet (J. Biol. Chem., 237, S. 760-767, 1962) beschrieben, enthalten; 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 100 mM Ammoniumacetat; 2 mM Magnesiumacetat; 1 mM ATP; 2 mM GTP; 15 mM Phosphocreatin; 3 µg Creatinkinase; 0,05 mM Aminosäure (minus Leucin) und 89 nCi L-[^-14C]-Leucin. Das Reaktionsgemisch wird während 5 min bei 28°C inkubiert, und die Reaktion wird mit 1 ml 0,1 M Kaliumhydroxid beendigt.

Die Farbe der Lösung wird mit 50 µl und 30%igem Wasserstoffperoxid gebleicht, und die Proteine werden mit 1 ml kalter Trichloressigsäure präzipitiert. Die Lösung wird an GF/C-Filtern filtriert und mit Trichloressigsäure gewaschen. Die Filter werden dann auf ihre Radioaktivität mit einem Flüssigkeits-Scintillationszähler geprüft, wie es von Gasperi-Campani et al. (Biochem. J., 174, S. 491-496, 1978) beschrieben wird.

Da bei der Analyse bzw. dem Assay lysierte Zellen verwendet wurden, war es für das Protein nicht erforderlich, die Grenze der Zellmembran zu kreuzen. Bryodin kann nur Zellmembranen bei extrem hohen Konzentrationen ohne Hilfe von beispielsweise einem Antikörper, der es direkt auf die Zelloberfläche abgeben kann, kreuzen. Dementsprechend besitzt das Protein selbst eine niedrige Toxizität.

Bei der Analyse wurde das gereinigte Bryodin, welches gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, bei verschiedenen Konzentrationen zugegeben, und die Abnahme in der Menge an radioaktivem Leucin in dem Protein wurde gemessen und gegen die Konzentration von RIP graphisch eingezeichnet. Die Konzentration, bei der 50% der Proteinsynthese der Kontrolle (Null Konzentration RIP) inhibiert wird, wird als ID₅₀ (Inhibierungsdosis 50) in Mikrogramm (µg/ml) ausgedrückt. Die ID₅₀ für das gereinigte Bryodin beträgt 0,0036 µg/ml. Somit zeigt Bryodin eine extrem hohe Aktivität für die Inhibierung der Proteinsynthese.

Die Konzentration der Ribosomen in dem Analysegemisch beträgt 6,4×10^-8 M, bestimmt von den Ribosomen, die durch Zentrifugieren des Lysats erhalten wurden, und gemessen, wie von Stirpe et al. (Biochem. J., 195, 399-405, 1981) beschrieben. Unter der Annahme, daß eine gesamte Wiedergewinnung der gesamtaktiven Ribosomen erhalten wurde, inaktiviert ein Molekül Bryodin Ribosomen in einer Rate von 53/min. Somit wirkt Bryodin in einem weniger als äquimolaren Verhältnis, was eine katalytische, möglicherweise enzymatische Wirkung anzeigt.

Beispiel 3 Toxizitätswerte

Die Toxizität des gereinigten Bryodins wurde in weiblichen Schweizer Mäusen mit einem Gewicht von 27 bis 32 g, welche ad libitum gefüttert wurden, bestimmt. Das Bryodin wurde, gelöst in 0,9% NaCl, intraperitoneal bei 6 unterschiedlichen Dosismengen im Bereich von 5,6 bis 23,7 mg/kg Körpergewicht mit einem Verhältnis zwischen den Dosismengen von 1,33 Gruppen mit sechs Tieren für jede Dosis verabreicht. Eine akute und eine akut verzögerte LD₅₀ werden nach 48 h bzw. 14 Tagen gemäß dem Verfahren von Spearman-Kärber, wie durch Finney ("Statistical Methods in Biological Assay", S. 524, 1984) beschrieben, bestimmt.

Intraperitoneal injiziertes Bryodin tötet Mäuse mit einer LD₅₀ von 14,5 mg/kg Körpergewicht (95% Konfidenzgrenzen 11,7 bis 19,2) bei 48 h und von 12,1 mg/kg (9,3 bis 15,7) bei 14 Tagen. Die histologische Prüfung zeigt Zeichen einer Nekrose in der Leber und in der roten Pulpe der Milz und in den proximalen Tubuli der Nieren der toten Tiere.

Claims (4)

1. Ein Protein mit der Bezeichnung Bryodin, welches ein Ribosom inaktiviert.

2. Verfahren zur Herstellung eines Ribosom inaktivierenden Proteins mit der Bezeichnung Bryodin, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) Gewebe von Bryonia dioica zerkleinert und zentrifugiert und den so erhaltenen Saft sammelt;
• b) den festen Rückstand mit Wasser extrahiert und das unlösliche Material durch Zentrifugieren entfernt,
• c) den vereinigten Saft und wäßrigen Extrakt durch eine vernetzte Dextransäule leitet;
• d) die aus dieser Säule eluierten Proteine durch eine Ionenaustauschsäule leitet;
• e) Bryodin von der Säule eluiert.

3. Ein Immunotoxin, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Ribosom inaktivierendes Protein mit der Bezeichnung Bryodin, konjugiert an ein Haptomeres, welches sich an die Zelle binden kann, enthält.

4. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel und als aktiven Bestandteil ein Immuntoxin nach Anspruch 3 enthält.