JPS6348300A - 新規な蛋白質合成インヒビタ− - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/42—Cucurbitaceae (Cucumber family)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Botany (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な蛋白質合成インヒビターとその単離及
び精製方法、並びに該インヒビターのペプチド鎖のN末
端配列の同定方法に係わる。
び精製方法、並びに該インヒビターのペプチド鎖のN末
端配列の同定方法に係わる。
本発明はまた、上記蛋白質合成インヒビターをモノクロ
−ナル抗体と複合(conjugation) してイ
ムノトキシン(抗毒素)を形成するか、あるいは他の分
子と複合して治療目的に有用な特異的ハイブリッドを得
ることを目的とする。リボソーム不活性化蛋白質(’R
IP)とも呼称される、蛋白質合成を阻害する蛋白質は
、幾つかの植物の種子、根及び葉において発見されてい
る。L、 Barbieri及びF。
−ナル抗体と複合(conjugation) してイ
ムノトキシン(抗毒素)を形成するか、あるいは他の分
子と複合して治療目的に有用な特異的ハイブリッドを得
ることを目的とする。リボソーム不活性化蛋白質(’R
IP)とも呼称される、蛋白質合成を阻害する蛋白質は
、幾つかの植物の種子、根及び葉において発見されてい
る。L、 Barbieri及びF。
5tirpe(Cancer 5urveys、 Vo
l、 1.1982. p、 489)は、単一゛鎖蛋
白質の形態で天然に存在するR I ’Pをパ第1型R
IP“と呼称し、少ノチン特性を有するB(結合)鎖と
共有結合したR■−P特性を有するA(作用)鎖から成
るRIPを゛第2型RI P ”と呼称することを提案
している。
l、 1.1982. p、 489)は、単一゛鎖蛋
白質の形態で天然に存在するR I ’Pをパ第1型R
IP“と呼称し、少ノチン特性を有するB(結合)鎖と
共有結合したR■−P特性を有するA(作用)鎖から成
るRIPを゛第2型RI P ”と呼称することを提案
している。
リジン、アブリン、モデクシンなどの“第2型RI P
”は細胞に比較的容易に侵入し得、従2て細胞内でも
セルフリー(無細胞)系においてと同様に蛋白質合成を
阻害するので、動物にとって非常に有毒である。
”は細胞に比較的容易に侵入し得、従2て細胞内でも
セルフリー(無細胞)系においてと同様に蛋白質合成を
阻害するので、動物にとって非常に有毒である。
゛′第1型RIP”は、細胞内に浸透し得ないのでセル
フリー系でのみ有効であり、従って動物にとって殆どあ
るいは全く有毒でない。
フリー系でのみ有効であり、従って動物にとって殆どあ
るいは全く有毒でない。
これらの蛋白質は通常、真核細胞のリボソームを触媒(
酵素)的に不活性化して、60Sリボソームサブユニツ
トが延長因子2と結合し得ないようにし、それによって
蛋白質合成を阻止する。
酵素)的に不活性化して、60Sリボソームサブユニツ
トが延長因子2と結合し得ないようにし、それによって
蛋白質合成を阻止する。
上述のように、第2型RIP(例えばリシン、アプリ′
ン、モデクシン)は機能の点で相違する2個の鎖から成
り、即ちD−ガラクトースの立体配置を有する糖と結合
するより重いB鎖と単一のジスルフィド結合によって結
合された、リボソームを不活性化するA鎖から成る。B
鎖はこれらの毒素と細胞表面上のレセプターとの結合に
関与し、−方A鎖は細胞質相内に進入し得、そこで蛋白
質合成を阻害する。A鎖とB鎖とは分離され得るが、A
鎖はB鎖と結合されていなければ無傷の細胞には進入し
得ないことが判明した。
ン、モデクシン)は機能の点で相違する2個の鎖から成
り、即ちD−ガラクトースの立体配置を有する糖と結合
するより重いB鎖と単一のジスルフィド結合によって結
合された、リボソームを不活性化するA鎖から成る。B
鎖はこれらの毒素と細胞表面上のレセプターとの結合に
関与し、−方A鎖は細胞質相内に進入し得、そこで蛋白
質合成を阻害する。A鎖とB鎖とは分離され得るが、A
鎖はB鎖と結合されていなければ無傷の細胞には進入し
得ないことが判明した。
F、 5tirpe及びり、 Barbieri(FE
BS Letter、’195゜pp、 1−8. J
anuary、 1986)は、パ第1型”及びパ第2
型″両方のリボソーム不活性化蛋白質についての概括的
な検討を公表している。
BS Letter、’195゜pp、 1−8. J
anuary、 1986)は、パ第1型”及びパ第2
型″両方のリボソーム不活性化蛋白質についての概括的
な検討を公表している。
驚くべきことに、本発明者は今や、7
dioica(ブリオニア)と呼称されるウリCu’c
urbjta−ceae科の一植物の根からの適当な抽
出によらて、効力の著しく大きい新規な蛋白質インヒビ
ターを単離することに成功した。本発明者はこの新規な
蛋白質インヒビターを″ブリオジン(bryodin)
”と命名した。ブリオジンは、物理化学特性及び生物学
特性に関して第1型RIPにきわめて類似の単一鎖糖蛋
白質であると考えられる。
urbjta−ceae科の一植物の根からの適当な抽
出によらて、効力の著しく大きい新規な蛋白質インヒビ
ターを単離することに成功した。本発明者はこの新規な
蛋白質インヒビターを″ブリオジン(bryodin)
”と命名した。ブリオジンは、物理化学特性及び生物学
特性に関して第1型RIPにきわめて類似の単一鎖糖蛋
白質であると考えられる。
ブリオジンは補因子の全くの不在下にリボソームを損傷
することによって蛋白質合成を阻害する。
することによって蛋白質合成を阻害する。
ブリオジンの一特徴は、動物に対する毒性が他のRIP
に比較して低いことである。そのうえ、ブリオジンは幾
つかの化学的処理に対して十分耐性であると考えられる
。従ってブリオジンは、他のRIPで実施される(St
irpe & Barbieri、 L986)ような
イムノトキシンその他の複合体の調製に適当である。
に比較して低いことである。そのうえ、ブリオジンは幾
つかの化学的処理に対して十分耐性であると考えられる
。従ってブリオジンは、他のRIPで実施される(St
irpe & Barbieri、 L986)ような
イムノトキシンその他の複合体の調製に適当である。
ブリオジンはマウスに対する真性毒性が、有効なイムノ
トキシンの調製に用いられたRIPであるサポリン(s
aporin)6 (Thorpe、et al、、
J、 N、 C。
トキシンの調製に用いられたRIPであるサポリン(s
aporin)6 (Thorpe、et al、、
J、 N、 C。
1、、75.1. pp、 151−159.1985
)より低い。サボリン6で製造されたイムノトキシンは
動物に対する毒性が遊離の蛋白質より高く、このような
毒性はRIP部分に起因すると考えられた。作用は同様
であるが毒性はより低いRIPを用いて調製される複合
体を、ブリオジンを用いて実現することができる。
)より低い。サボリン6で製造されたイムノトキシンは
動物に対する毒性が遊離の蛋白質より高く、このような
毒性はRIP部分に起因すると考えられた。作用は同様
であるが毒性はより低いRIPを用いて調製される複合
体を、ブリオジンを用いて実現することができる。
Laemm l iのポリアクリルアミドゲル電気泳動
法(1970)で決定されるブリオジンの分子、量は、
約30’000である。ブリオジンの、−文字コーVに
よ。
法(1970)で決定されるブリオジンの分子、量は、
約30’000である。ブリオジンの、−文字コーVに
よ。
るN末端アミノ酸配列は、
D−V−3−F−R−L−8−G−A−T−T−T−S
−Y−G−V−F−I−に−N−L−R−E−A−(2
5)、 (30) (35
)L−P−Y−E−R−に−V−Y−N−I−P−L−
L−L−R−)I−X−I−G− である。
−Y−G−V−F−I−に−N−L−R−E−A−(2
5)、 (30) (35
)L−P−Y−E−R−に−V−Y−N−I−P−L−
L−L−R−)I−X−I−G− である。
既に報告されている細胞毒素のA鎖との比較におけるブ
リオジンの重要な利点は、後述するような単純な技術に
よって容易に得られること、またリジン及びアブリンの
A鎖の場合のように細胞毒素全体による汚染を被らない
ことである。
リオジンの重要な利点は、後述するような単純な技術に
よって容易に得られること、またリジン及びアブリンの
A鎖の場合のように細胞毒素全体による汚染を被らない
ことである。
ブリオジンは、蛋白質の単離に適した方法で険l庶1i
2d i o i c aの根から単離することによっ
て得られる。即ち、ブリオジンは、 a)7エdioieaの組織を細断して遠心分離し、こ
のようにして得られる汁(液)を集めること、 b)固体残渣を水で抽出し、不溶物質を遠心分離によっ
て除去すること、 C)貯留(プール)した汁並びに水性抽出物を架橋デキ
ストランカラムに通すこと、 d) 前記架橋デキストランカラムから溶離した蛋白質
をイオン交換カラムに通すこと、及びe) 前記イオン
交換カラムからブリオジンを溶離すること を含む方法によって調製し得る。
2d i o i c aの根から単離することによっ
て得られる。即ち、ブリオジンは、 a)7エdioieaの組織を細断して遠心分離し、こ
のようにして得られる汁(液)を集めること、 b)固体残渣を水で抽出し、不溶物質を遠心分離によっ
て除去すること、 C)貯留(プール)した汁並びに水性抽出物を架橋デキ
ストランカラムに通すこと、 d) 前記架橋デキストランカラムから溶離した蛋白質
をイオン交換カラムに通すこと、及びe) 前記イオン
交換カラムからブリオジンを溶離すること を含む方法によって調製し得る。
例えば、7エdioicaかち得た根を小片に刻み、水
、有利には電解質と緩衝液、例えばほぼ中性のpH1即
ち例えばpl(7,4を有する塩化ナトリウム及びリン
酸ナトリウム緩衝液を含有する水で抽出し得る。根の個
々の細胞を破壊するべく、混合物を均質化(ホモジナイ
ズ)する。この均質化は、任意の種類の市販ホモジナイ
ザーによって実施し得る。不溶物質は遠心分離によって
除去するべきであり、また低分子量物質はセファデック
スカラムのような架橋デキストランカラムの通過によっ
て除去し得、上記セファデックスカラムは例えば、次の
イオン交換クロマトグラフィーに適当な濃度及びpHを
有するリン酸ナトリウム緩衝液、即ち例えばほぼ中性の
piを有する5jIMリン酸ナトリウムM衝液で予め平
衡にしたセファデックスG25カラムである。次に、蛋
白質含有物質を、先のクロマトグラフイーにおいて用い
たのと同じ緩衝液で予め平衡にした、例えばカルボキシ
メチルあるいはスルホプロピル基を含有するイオン交換
カラムに通す。ブリオジンがイオン交換マトリックスと
結合するので、このブリオジンを溶離する。上記溶離は
一般的には、濃度勾配を有する溶液、即ち例えばO〜1
50zM塩化ナトリウム溶液を用いて実施する。溶離す
るべき最大のクロマトグラフィー画分は、ブリオジン画
分である。このように単離した粗製ブリオジンに、続い
て水での透析及び/またはクロマトグラフィーを行なう
ことによって、純粋な物質を得ることができる。
、有利には電解質と緩衝液、例えばほぼ中性のpH1即
ち例えばpl(7,4を有する塩化ナトリウム及びリン
酸ナトリウム緩衝液を含有する水で抽出し得る。根の個
々の細胞を破壊するべく、混合物を均質化(ホモジナイ
ズ)する。この均質化は、任意の種類の市販ホモジナイ
ザーによって実施し得る。不溶物質は遠心分離によって
除去するべきであり、また低分子量物質はセファデック
スカラムのような架橋デキストランカラムの通過によっ
て除去し得、上記セファデックスカラムは例えば、次の
イオン交換クロマトグラフィーに適当な濃度及びpHを
有するリン酸ナトリウム緩衝液、即ち例えばほぼ中性の
piを有する5jIMリン酸ナトリウムM衝液で予め平
衡にしたセファデックスG25カラムである。次に、蛋
白質含有物質を、先のクロマトグラフイーにおいて用い
たのと同じ緩衝液で予め平衡にした、例えばカルボキシ
メチルあるいはスルホプロピル基を含有するイオン交換
カラムに通す。ブリオジンがイオン交換マトリックスと
結合するので、このブリオジンを溶離する。上記溶離は
一般的には、濃度勾配を有する溶液、即ち例えばO〜1
50zM塩化ナトリウム溶液を用いて実施する。溶離す
るべき最大のクロマトグラフィー画分は、ブリオジン画
分である。このように単離した粗製ブリオジンに、続い
て水での透析及び/またはクロマトグラフィーを行なう
ことによって、純粋な物質を得ることができる。
ブリオジンは、著しいリボソーム不活性化蛋白質活性を
示し、主にセルフリー系で蛋白質合成を阻害する。蛋白
質合成阻害作用は、−晩生37℃に保温(インキュベー
ション)することによっても、またトリプシンあるいは
キモトリプシンでの処理によっても影響されず、尿素で
の、あるいは尿素−8= の存在下におけるN−エチルマレイミドでの処理によっ
ては僅かに損なわれ、更に煮沸によって、あるいはドデ
シル硫酸ナトリウムあるいは0.1MNa1lでの処理
によって完全に消滅した。
示し、主にセルフリー系で蛋白質合成を阻害する。蛋白
質合成阻害作用は、−晩生37℃に保温(インキュベー
ション)することによっても、またトリプシンあるいは
キモトリプシンでの処理によっても影響されず、尿素で
の、あるいは尿素−8= の存在下におけるN−エチルマレイミドでの処理によっ
ては僅かに損なわれ、更に煮沸によって、あるいはドデ
シル硫酸ナトリウムあるいは0.1MNa1lでの処理
によって完全に消滅した。
ブリオジンは、大半の哺乳動物細胞に対して毒性を有し
ないが、細胞と結合し得るハプトマー(haptome
r)と結合させることによって細胞毒性とし得る。例え
ば腫瘍細胞と選択的に結合するモノクローナル抗体が公
知である。従って本発明は、モノクローナル抗体のよう
な細胞と結合し得るハプトマーと複合したブリオジンを
含有するイムノトキシンも提供するニモノクローナル抗
体・が腫瘍細胞抗原に対して特異的である場合、得られ
る複合体はブリオジンを腫瘍細胞表面へと放出し、細胞
に進入したブリオジンは当該細胞を特異的に殺す。
ないが、細胞と結合し得るハプトマー(haptome
r)と結合させることによって細胞毒性とし得る。例え
ば腫瘍細胞と選択的に結合するモノクローナル抗体が公
知である。従って本発明は、モノクローナル抗体のよう
な細胞と結合し得るハプトマーと複合したブリオジンを
含有するイムノトキシンも提供するニモノクローナル抗
体・が腫瘍細胞抗原に対して特異的である場合、得られ
る複合体はブリオジンを腫瘍細胞表面へと放出し、細胞
に進入したブリオジンは当該細胞を特異的に殺す。
同様に、真核寄生生物の細胞と選択的に結合するハプト
マーも、ブリオジンの担体として有利に用いることがで
きる。
マーも、ブリオジンの担体として有利に用いることがで
きる。
また、幾つかのホルモン蛋白質はそのレセプタ一部位と
の結合において非常に特異的であり、これらの蛋白質は
ブリオジンと複合するハプトマーとして、上記部位にお
いて選択的に作用する毒素の生成を可能にする。
の結合において非常に特異的であり、これらの蛋白質は
ブリオジンと複合するハプトマーとして、上記部位にお
いて選択的に作用する毒素の生成を可能にする。
本発明の生理学的に活性な生成物は、任意の好ましい方
法で投与用に製剤化し得る。作用物質は通常注射によっ
て投与され、即ち作用物質は、生理学的に許容可能な基
剤を含有し得、かつ好ましくは等張性であり得る無菌で
かつピロゲンを含有しない液体、好ましくは水の中に存
在させて製剤化し得る。従って本発明は、医薬に許容可
能な基剤(carrier)あるいは稀釈剤を含有し、
がっ有効成分として本発明のイムノトキシンを含有する
薬剤組成物をも提供する。
法で投与用に製剤化し得る。作用物質は通常注射によっ
て投与され、即ち作用物質は、生理学的に許容可能な基
剤を含有し得、かつ好ましくは等張性であり得る無菌で
かつピロゲンを含有しない液体、好ましくは水の中に存
在させて製剤化し得る。従って本発明は、医薬に許容可
能な基剤(carrier)あるいは稀釈剤を含有し、
がっ有効成分として本発明のイムノトキシンを含有する
薬剤組成物をも提供する。
抗腫瘍投与に関し、好ましい複合体もしくはイムノトキ
シン中のブリオジンの1日当たりの投与量は、好ましく
は1〜100IIIFである。即ち、ブリオジンを複合
体として収容する単位投与形態、例えば注射液アンプル
は、普通1〜100yyのブリオジンを収容する。
シン中のブリオジンの1日当たりの投与量は、好ましく
は1〜100IIIFである。即ち、ブリオジンを複合
体として収容する単位投与形態、例えば注射液アンプル
は、普通1〜100yyのブリオジンを収容する。
本発明を、以下の実施例によって非限定的に説明する。
ブリオニアの根(約2〜3&g)を小片に刻み、更にB
raun(登録商標)のキッチン用細断−遠心分離機で
細断及び遠心分離して、上記根の汁を抽出した。
raun(登録商標)のキッチン用細断−遠心分離機で
細断及び遠心分離して、上記根の汁を抽出した。
固体残渣を、抽出した汁と等容量のリン酸緩衝生理食塩
水溶液(p)17.4の5xMリン酸ナトリウム緩衝液
含有の0.14M塩化ナトリウム溶液)と共に攪拌し、
懸濁液を上記と同じキッチン用遠心分離機に掛けた。得
られた抽出物を上記汁と一緒に、2℃において1000
0gで45分間遠心分離し、上澄みを固体(NO,>2
SO,で飽和させた。
水溶液(p)17.4の5xMリン酸ナトリウム緩衝液
含有の0.14M塩化ナトリウム溶液)と共に攪拌し、
懸濁液を上記と同じキッチン用遠心分離機に掛けた。得
られた抽出物を上記汁と一緒に、2℃において1000
0gで45分間遠心分離し、上澄みを固体(NO,>2
SO,で飽和させた。
沈澱物を上述のような遠心分離で集め、pH6,66の
5ffMリン酸ナトリウムM′tfI液1.5pで再び
溶解させた。この溶液を上述のような遠心分離によって
澄ませ、予め20℃において5*Mリン酸ナトリウムM
m液て平衡にしたセファデックスG25粗カラム(lx
X 10cm)に通した。上記カラムにおいて同じ緩
衝液を用いて、4N/hの割合で溶離を実施し、蛋白質
含有のフロントピークを集めて遠心分離した後、20℃
でCM−セファローズ速流型カラム(15CJIX10
cz)に通した。 ・ リン酸ナトリウム緩衝液での洗浄後、上記セファローズ
カラムにおいて、上記と同じ緩衝液にNaClを濃度勾
配O〜150yMで溶解させたものを用いて1リツトル
/hの割合で(総量201)溶離を実施した。
5ffMリン酸ナトリウムM′tfI液1.5pで再び
溶解させた。この溶液を上述のような遠心分離によって
澄ませ、予め20℃において5*Mリン酸ナトリウムM
m液て平衡にしたセファデックスG25粗カラム(lx
X 10cm)に通した。上記カラムにおいて同じ緩
衝液を用いて、4N/hの割合で溶離を実施し、蛋白質
含有のフロントピークを集めて遠心分離した後、20℃
でCM−セファローズ速流型カラム(15CJIX10
cz)に通した。 ・ リン酸ナトリウム緩衝液での洗浄後、上記セファローズ
カラムにおいて、上記と同じ緩衝液にNaClを濃度勾
配O〜150yMで溶解させたものを用いて1リツトル
/hの割合で(総量201)溶離を実施した。
画分を400y(l集め、蛋白質合成阻害作用を有する
両分を貯留して、水での透析を充分に実施し、凍結乾燥
した。
両分を貯留して、水での透析を充分に実施し、凍結乾燥
した。
物1更」二学特性−
Mr(分子量範囲)の値を、Laemmliのポリアク
リルアミドゲル電気泳動法(Nature、 227.
p、68o。
リルアミドゲル電気泳動法(Nature、 227.
p、68o。
1970 )によって、(総てBio−Rad Lab
oratories s、r。
oratories s、r。
L、、、 Segrate、旧、 Itajy製である
)次のマーカニ、即ちリゾチーム(M、14400)、
大豆トリプシンインヒビター(2,150,0)、カル
ボニックアンヒドラーゼ(31000)、オボアルブミ
ン(45000)、ウシ血清アルブミン(66200)
及びホスホリラーゼB(92500)を用いて決定しな
。また、pH7,2の!5zMリン酸ナトリウム緩衝液
含有の0.3MNaC1で平衡にした、溶離が室温(2
0℃)において36m(llhの割合で実施されるセフ
ァクリル5200カラム(95cIIX 2.6c11
)に通すゲル濾過によってもMr値を決定した。このカ
ラムは、ウシ血清アルブミン(680()O)、オボア
ルブミン(4300fl)、キモトリプシノーゲン(2
5,000)及びリボヌクレアーゼ(1,3700)で
較正した。
)次のマーカニ、即ちリゾチーム(M、14400)、
大豆トリプシンインヒビター(2,150,0)、カル
ボニックアンヒドラーゼ(31000)、オボアルブミ
ン(45000)、ウシ血清アルブミン(66200)
及びホスホリラーゼB(92500)を用いて決定しな
。また、pH7,2の!5zMリン酸ナトリウム緩衝液
含有の0.3MNaC1で平衡にした、溶離が室温(2
0℃)において36m(llhの割合で実施されるセフ
ァクリル5200カラム(95cIIX 2.6c11
)に通すゲル濾過によってもMr値を決定した。このカ
ラムは、ウシ血清アルブミン(680()O)、オボア
ルブミン(4300fl)、キモトリプシノーゲン(2
5,000)及びリボヌクレアーゼ(1,3700)で
較正した。
蛋白質の等電点並びにアミノ酸組成、アミノ糖組成及び
中性糖組成を、Falasca et al、が述べて
いる(Biochem、 J、、 207. p、 5
05.1982)ようにして決定した。
中性糖組成を、Falasca et al、が述べて
いる(Biochem、 J、、 207. p、 5
05.1982)ようにして決定した。
精製ブリオジンの特性を下記の表1にまとめる。
他のRI P (Stirpe & Barbieri
、 1986)同様、ブリオジンはMr30000及び
強塩基性pIの糖蛋白質である。アミノ酸組成及び中性
糖組成も表Iに示した。
、 1986)同様、ブリオジンはMr30000及び
強塩基性pIの糖蛋白質である。アミノ酸組成及び中性
糖組成も表Iに示した。
他のRIPと比較すると、ブリオジンはアミノ酸のりシ
ン及び特にイオウ含有アミノ酸の含量がより低く、一方
セリンの含量はより高く、またより小規模にではあるが
ロイシン及びチロシンの含量もより高い。ブリオジンは
、他のRIP(ゲロニン、モモルジン、ジアンチン30
及びジアンチン32゜FEBS Letter、 19
5. pp、 1−8.1986に記載されたRIP参
照)に対するウサギ抗血清での0uch−terlon
y試験において沈澱物を一切生じなかっな。
ン及び特にイオウ含有アミノ酸の含量がより低く、一方
セリンの含量はより高く、またより小規模にではあるが
ロイシン及びチロシンの含量もより高い。ブリオジンは
、他のRIP(ゲロニン、モモルジン、ジアンチン30
及びジアンチン32゜FEBS Letter、 19
5. pp、 1−8.1986に記載されたRIP参
照)に対するウサギ抗血清での0uch−terlon
y試験において沈澱物を一切生じなかっな。
表 I−ブリオジンの物理化学特性
Mr ゲル濾過により決定 3000
0ゲル電気泳動により決定 27000pl
≧9.5 Lys s、e 中性糖の総量64
33%His 1.9 Thr”″ 15.l 5er今 30.2 Glx 17.7 Fue
3.47Pro 6.7 Glc
1.551/2Cys” 0.24 Val 15.6 Net” 1.6 11e 15.I Leu 28.3 Tyr” 14.2 Phe 8.3 −1954.1967)ように決定した。
0ゲル電気泳動により決定 27000pl
≧9.5 Lys s、e 中性糖の総量64
33%His 1.9 Thr”″ 15.l 5er今 30.2 Glx 17.7 Fue
3.47Pro 6.7 Glc
1.551/2Cys” 0.24 Val 15.6 Net” 1.6 11e 15.I Leu 28.3 Tyr” 14.2 Phe 8.3 −1954.1967)ように決定した。
ブリオジンのN末 アミノ 1のゞ
ブリオジンのN末端配列を、Montecucchi
etal、の方法(原稿準備中)により気相シーケンサ
−を用いて決定した。特に、小型変換フラスコを具備し
た気相シーケンサ−(Nod、 470^−^ppli
edBiosystems、 Foster C1ty
、 C^、υS^)を用いて自動エドマン配列分析を実
施した。試料(100〜200pmo l )をカート
リッジフィルターに装填し、トリフルオロ酢酸で洗浄し
、ポリブレン3xg及びNaCl0.2zgを含有する
水301J1で処理した。アミノ酸のフェニルチオヒダ
ントイン誘導体を5. C−18カラム(2,1zzX
22clI、^pplied Biosystems
)で同定した。その際シーケンサ−とオンラインで接続
された高圧液体クロマトグラフィー装置(120^pp
。
etal、の方法(原稿準備中)により気相シーケンサ
−を用いて決定した。特に、小型変換フラスコを具備し
た気相シーケンサ−(Nod、 470^−^ppli
edBiosystems、 Foster C1ty
、 C^、υS^)を用いて自動エドマン配列分析を実
施した。試料(100〜200pmo l )をカート
リッジフィルターに装填し、トリフルオロ酢酸で洗浄し
、ポリブレン3xg及びNaCl0.2zgを含有する
水301J1で処理した。アミノ酸のフェニルチオヒダ
ントイン誘導体を5. C−18カラム(2,1zzX
22clI、^pplied Biosystems
)で同定した。その際シーケンサ−とオンラインで接続
された高圧液体クロマトグラフィー装置(120^pp
。
^pplied Biosystems)を用い、また
勾配溶離(溶剤A 、 p[!3.6の0.1M酢酸ナ
トリウム+5%のテトラヒドロフラン(水中)、溶剤B
;アセトニトリル+ジメチルフェニルチオ尿素(1リツ
トル当たり500nmol))を55℃で実施した(流
景毎分2xIl; 269nazでのuv検出;感度5
pmol)。
勾配溶離(溶剤A 、 p[!3.6の0.1M酢酸ナ
トリウム+5%のテトラヒドロフラン(水中)、溶剤B
;アセトニトリル+ジメチルフェニルチオ尿素(1リツ
トル当たり500nmol))を55℃で実施した(流
景毎分2xIl; 269nazでのuv検出;感度5
pmol)。
シーケンサ−において、無水トリフルオロ酢酸用容器は
^pp、1ied 、B、ios、ys、tems C
o、から購入した。ものを適宜改良したく第1図参照)
。新設計(40111に適当)では主要表面はR−,3
蒸気用とされる。実1際、R−3試薬の送出管哄貯留容
器の頭部スペ4−ス内へと伸長するが、液面下には達し
ないく液面、上方0..5c1)。更に、シーケンサi
で用いられる試薬及び溶剤の圧力(0〜5p、si)を
測定するマノメーターは、^1exander W、i
egand GmbH& Co、(Germany)の
イタリアの子会社であるGermany IIIIKA
Co、(Mi−Ian、 Italy)が蝉供してり
るものと寥換した。
^pp、1ied 、B、ios、ys、tems C
o、から購入した。ものを適宜改良したく第1図参照)
。新設計(40111に適当)では主要表面はR−,3
蒸気用とされる。実1際、R−3試薬の送出管哄貯留容
器の頭部スペ4−ス内へと伸長するが、液面下には達し
ないく液面、上方0..5c1)。更に、シーケンサi
で用いられる試薬及び溶剤の圧力(0〜5p、si)を
測定するマノメーターは、^1exander W、i
egand GmbH& Co、(Germany)の
イタリアの子会社であるGermany IIIIKA
Co、(Mi−Ian、 Italy)が蝉供してり
るものと寥換した。
こうして決定されたブリオジンのペプチド鎖のN末端配
列を下記に示す。アミノ酸及びペプチドのための生化学
命名法及び記号体系に関するIUPAC−JUB合同委
員会(Eur、 J、 Biochem、。
列を下記に示す。アミノ酸及びペプチドのための生化学
命名法及び記号体系に関するIUPAC−JUB合同委
員会(Eur、 J、 Biochem、。
ν移−,pp、 9−37.1984)に従って、各ア
ミノ酸残基のいわゆる゛′−文字コード゛′を採用した
。N末端配列は、 D、−V−,5−F−R−L−8−G−A−T−T−T
−S−Y−G−V−F−I−に−N−L−R−E−A−
L−P−Y−E−R−に−V−Y−N−I−P’−L−
L−L−R−H−X−I−(、− である。
ミノ酸残基のいわゆる゛′−文字コード゛′を採用した
。N末端配列は、 D、−V−,5−F−R−L−8−G−A−T−T−T
−S−Y−G−V−F−I−に−N−L−R−E−A−
L−P−Y−E−R−に−V−Y−N−I−P’−L−
L−L−R−H−X−I−(、− である。
精製ブリオジンの蛋白質合成への影響を、ウサギ網状赤
血球溶解物を用いて決定した。PromegaBiot
ech(Madison、 WI、 USA)から購入
したキットで蛋白質合成をアッセイした。上記キットは
、標準的なRIPアッセイ法に従うものである(Sti
r−pe et al、、 Biochem、 J、、
216. pp、 617−625゜1983参照)
。
血球溶解物を用いて決定した。PromegaBiot
ech(Madison、 WI、 USA)から購入
したキットで蛋白質合成をアッセイした。上記キットは
、標準的なRIPアッセイ法に従うものである(Sti
r−pe et al、、 Biochem、 J、、
216. pp、 617−625゜1983参照)
。
ウサギ網状赤血球を溶解させて、蛋白質中に放射性アミ
ノ酸ロイシンを取り込ませる蛋白質合成機能系を生成し
た。蛋白質合成を、蛋白質画分中の放射能の量で測定し
た。反応混合物62.5.1中に、^11en及び5c
hu+eetが述べている(J、 Biol、 Che
m、。
ノ酸ロイシンを取り込ませる蛋白質合成機能系を生成し
た。蛋白質合成を、蛋白質画分中の放射能の量で測定し
た。反応混合物62.5.1中に、^11en及び5c
hu+eetが述べている(J、 Biol、 Che
m、。
237、 pp、 760−767、1962)ように
して調製したウサギ網状赤血球溶解物25μlと、pH
7,4のトリスHC11(hMと、酢酸アンモニウム1
00i+Mと、酢酸マグネシウム2JIMと、A T
P 1zMと、G T P 2zMと、ホスホクレアチ
ン15zMと、クレアチンキナーゼ3同と、(ロイシン
を除いた)アミノ酸0.05IMと、L (14c)
−ロイシン89nCiとが含有されていた。反応混合物
を28℃に5分間保温し、1i+1の0.1M水酸化カ
リウムで反応を停止させた。
して調製したウサギ網状赤血球溶解物25μlと、pH
7,4のトリスHC11(hMと、酢酸アンモニウム1
00i+Mと、酢酸マグネシウム2JIMと、A T
P 1zMと、G T P 2zMと、ホスホクレアチ
ン15zMと、クレアチンキナーゼ3同と、(ロイシン
を除いた)アミノ酸0.05IMと、L (14c)
−ロイシン89nCiとが含有されていた。反応混合物
を28℃に5分間保温し、1i+1の0.1M水酸化カ
リウムで反応を停止させた。
溶液を50μlの30%過酸化水素で脱色し、低温トリ
クロロ酢酸111で蛋白質を沈澱させた。溶液をGF/
Cフィルターで濾過し、トリクロロ酢酸で洗浄した。そ
の後、Gasperi−Campani et al、
が述べている(Biochem、 J、、 174.
pp、 491−496.1978)ように液体シンチ
レーション計数器を用いて、上記フィルターをその放射
能について検査した。
クロロ酢酸111で蛋白質を沈澱させた。溶液をGF/
Cフィルターで濾過し、トリクロロ酢酸で洗浄した。そ
の後、Gasperi−Campani et al、
が述べている(Biochem、 J、、 174.
pp、 491−496.1978)ように液体シンチ
レーション計数器を用いて、上記フィルターをその放射
能について検査した。
アッセイに溶解細胞を用いたので、蛋白質が細胞膜の障
壁を透過する必要は無かった。ブリオジンは、例メば該
ブリオジンを細胞表面に直接放出し得る抗体による補助
無しでは、きわめて高濃度の場合にしか細胞膜を透過し
得ない。従って、蛋白質のみの毒性は低い。
壁を透過する必要は無かった。ブリオジンは、例メば該
ブリオジンを細胞表面に直接放出し得る抗体による補助
無しでは、きわめて高濃度の場合にしか細胞膜を透過し
得ない。従って、蛋白質のみの毒性は低い。
アッセイでは実施例1によって得られた精製ブリオジン
を様々な濃度で添加し、蛋白質中の放射性ロイシンの量
の減少を観測して、RI−P濃度に対してグラフ化した
。対照(RI P濃度ゼロ)の蛋白質合成の50%が阻
害される濃度を、ID5゜(50%阻害濃度)としてマ
イクログラムで表した(IIg/ytl)。精製ブリオ
ジンに関するID5゜は0.0036μg/I11であ
った。即ち、ブリオジンはきわめて高い蛋白質合成阻害
作用を示す。
を様々な濃度で添加し、蛋白質中の放射性ロイシンの量
の減少を観測して、RI−P濃度に対してグラフ化した
。対照(RI P濃度ゼロ)の蛋白質合成の50%が阻
害される濃度を、ID5゜(50%阻害濃度)としてマ
イクログラムで表した(IIg/ytl)。精製ブリオ
ジンに関するID5゜は0.0036μg/I11であ
った。即ち、ブリオジンはきわめて高い蛋白質合成阻害
作用を示す。
アッセイ混合物中のリボソームの濃度は、溶解物の遠心
分離によって回収して5tirpe et al、が述
べている(Biochem、 J、、 195.399
−405.1981)ように測定したところ6.4X
10−”Mであった。完全に活性であるリボソームを総
て回収したとすると、ブリオジン1分子がリボソームを
537m1n、の割合で不活性化したことになる。即ち
ブリオジンは等モル以下の比で作用し、このことは触媒
的な、恐らくは酵素的な作用を示唆している。
分離によって回収して5tirpe et al、が述
べている(Biochem、 J、、 195.399
−405.1981)ように測定したところ6.4X
10−”Mであった。完全に活性であるリボソームを総
て回収したとすると、ブリオジン1分子がリボソームを
537m1n、の割合で不活性化したことになる。即ち
ブリオジンは等モル以下の比で作用し、このことは触媒
的な、恐らくは酵素的な作用を示唆している。
精製ブリオジンの毒性を、自由に給餌した体重27〜3
2.の雌のスイスマウスで評価した60.9%NaCl
に溶解させたブリオジンを、投与間の比を1.33とし
て体重IAg当なり5.6■から23.7肩gまで六つ
の異なる投与レベルで、各投与レベル毎に6匹の上記マ
ウスから成る群に対して腹腔的注入した。
2.の雌のスイスマウスで評価した60.9%NaCl
に溶解させたブリオジンを、投与間の比を1.33とし
て体重IAg当なり5.6■から23.7肩gまで六つ
の異なる投与レベルで、各投与レベル毎に6匹の上記マ
ウスから成る群に対して腹腔的注入した。
急性LD、。並びに急性遅延しD5oをそれぞれ48時
間後及び14日後に、Finneyが述べている(”5
ta−tistical Methods in
Biological 八5say″、 p、5
24゜1984)ようなSpearman−Kjirb
er法で計算した。
間後及び14日後に、Finneyが述べている(”5
ta−tistical Methods in
Biological 八5say″、 p、5
24゜1984)ようなSpearman−Kjirb
er法で計算した。
腹腔的注入したブリオジンは、48時間後には体重1に
g当たり14.5zyのLDso(95%信頼限界11
.7〜19.2)で、また14日後には体重1に1F当
たり12.1z1?のしD5゜(95%信頼限界9.3
〜15.7>でマウスを殺した。組織構造検査によって
、死んだマウスの肝臓及び赤牌髄、並びに腎臓の近位尿
細管において壊死の徴候が認められた。
g当たり14.5zyのLDso(95%信頼限界11
.7〜19.2)で、また14日後には体重1に1F当
たり12.1z1?のしD5゜(95%信頼限界9.3
〜15.7>でマウスを殺した。組織構造検査によって
、死んだマウスの肝臓及び赤牌髄、並びに腎臓の近位尿
細管において壊死の徴候が認められた。
第1図は実施例1に述べた改良シーケンサ−のFig、
7゜
7゜
Claims (4)
- (1)ブリオジンと名付けられたリボソーム不活性化蛋
白質。 - (2)ブリオジンと名付けられたリボソーム不活性化蛋
白質を調製する方法であって、 a)¥Bryonia¥ ¥dioica¥の組織を細
断して遠心分離し、このようにして得られる液を集める
こと、b)固体残渣を水で抽出し、不溶物質を遠心分離
によって除去すること、 c)貯留した液並びに水性抽出物を架橋デキストランカ
ラムに通すこと、 d)前記架橋デキストランカラムから溶離した蛋白質を
イオン交換カラムに通すこと、及びe)前記イオン交換
カラムからブリオジンを溶離すること を含む調製方法。 - (3)細胞と結合し得るハプトマーと複合したリボソー
ム不活性化蛋白質ブリオジンを含有するイムノトキシン
。 - (4)医薬に許容可能な基剤あるいは稀釈剤を含有し、
かつ有効成分として、特許請求の範囲第3項に記載のイ
ムノトキシンを含有する薬剤組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8619830 | 1986-08-14 | ||
GB868619830A GB8619830D0 (en) | 1986-08-14 | 1986-08-14 | Inhibitor of protein synthesis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6348300A true JPS6348300A (ja) | 1988-02-29 |
Family
ID=10602721
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62199661A Pending JPS6348300A (ja) | 1986-08-14 | 1987-08-10 | 新規な蛋白質合成インヒビタ− |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6348300A (ja) |
DE (1) | DE3726380A1 (ja) |
GB (2) | GB8619830D0 (ja) |
IT (1) | IT1225761B (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5597569A (en) * | 1993-10-25 | 1997-01-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Bryodin 2 a ribosome-inactivating protein isolated from the plant Bryonia dioica |
US5541110A (en) * | 1994-05-17 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb | Cloning and expression of a gene encoding bryodin 1 from Bryonia dioica |
-
1986
- 1986-08-14 GB GB868619830A patent/GB8619830D0/en active Pending
-
1987
- 1987-08-06 IT IT8721597A patent/IT1225761B/it active
- 1987-08-07 DE DE19873726380 patent/DE3726380A1/de not_active Withdrawn
- 1987-08-10 JP JP62199661A patent/JPS6348300A/ja active Pending
- 1987-08-14 GB GB8719341A patent/GB2194948B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB8619830D0 (en) | 1986-09-24 |
DE3726380A1 (de) | 1988-02-18 |
GB2194948A (en) | 1988-03-23 |
GB8719341D0 (en) | 1987-09-23 |
GB2194948B (en) | 1990-09-12 |
IT1225761B (it) | 1990-11-26 |
IT8721597A0 (it) | 1987-08-06 |
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