DE3639796A1

DE3639796A1 - Wachstumhinderndes schlangengift-peptid

Info

Publication number: DE3639796A1
Application number: DE19863639796
Authority: DE
Inventors: Hans Marquardt; George J Todaro; Daniel R Twardzik
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1985-11-22
Filing date: 1986-11-21
Publication date: 1987-07-09
Also published as: ZA868849B; GB2185023B; KR870005014A; BE905790A; PT83790B; SE8604991L; FR2590576A1; US4731439A; AU6667590A; DK560986D0; DK560986A; GB8627710D0; NL8602939A; SE8604991D0; GR862788B; IT1207580B; FI864715A; CN86108593A; GB2185023A; AU6560986A

Description

Toxische Mittel können eine Vielfalt von Anwendungen finden. Besonders dort, wo cytotoxische Mittel spezifisch gegenüber bestimmten Stämmen oder Zelltypen sind oder durch Modifikation spezifisch gemacht werden können, können diese cytotoxischen Mittel bei der Beseitigung eines bestimmten Stammes oder Zelltyps aus einer Kultur oder einem Gewebe, welche eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen umfassen, angewendet werden. Beispielsweise ist es im Falle von bösartigen Erkrankungen wünschenswert, die malignen Zellen ohne ernsthafte Mortalität der normalen oder gesunden Zellen spezifisch eliminieren zu können.

Eine Quelle für Toxine ist Schlangengift. Eine Anzahl von Toxinen ist bekannt. Es besteht jedoch nach wie vor Interesse an der Zurverfügungstellung zusätzlicher Toxine, um das Arsenal an verfügbaren Toxinen für den Einsatz in bestimmten Anwendungen zu vergrößern. Toxine können variieren in Bezug auf Immun-Response gegenüber dem Toxin, Leichtigkeit der Kupplung mit anderen Reagentien, Wirkungsstelle des Toxins u. dgl. Die Zurverfügungstellung eines neuen Toxins aus Schlangengift erfordert eine Wirksamkeitsprüfung, ausgedehnte Extraktionen, Reinigung und Analyse, um Reinheit zu erreichen und die Aminosäure-Sequenz festzustellen.

Cytotoxische Peptide, die aus Gift von einigen Arten von Klapperschlangen isoliert wurden, wurden isoliert und beschrieben und ihre Sequenz aufgeklärt. Myotoxin ist abgeleitet aus dem Gift der Prärie-Klapperschlange, Crotalus (Fox et al., Biochemistry (1979) 18: 678-83); Crotamin ist abgeleitet vom Gift der südamerikanischen Klapperschlange, Crotalus durissus terrificus (Lauree und Hoppe-Seyler, Physiol. Chem. (1975) 356 : 213-15); und toxisches Peptid C ist abgeleitet aus dem Gift der südpazifischen Klapperschlange, Crotalus viridis helleri (Maeda et al., Toxicon (1978) 16 : 431-41).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, toxische wachstumhindernde Peptide bereitzustellen.

Durch die Erfindung werden neue cytotoxische oder das Zellwachstum hindernde Peptide bereitgestellt, die mit einem Peptid verwandt sind, das aus dem Gift der Western Diamondback- Klapperschlange, Crotalus atrox, isoliert wurde. Konjugate dieser Peptide mit spezifischen Bindungsgliedern, wie Liganden und Receptoren können zur selektiven Entfernung von Zellen aus einer Zellmischung verwendet werden.

Die cytotoxischen Mittel nach der Erfindung umfassen ein ungefähr 6 Kilodalton (kD) Peptid, das aus dem Gift von Crotalus atrox isoliert ist, cytotoxische Analoge davon sowie Konjugate der cytotoxischen Mittel mit Peptiden, insbesondere Liganden und Receptoren für die spezifische Bindung an ein komplementäres Bindungsglied. Der aktive Bereich setzt sich zusammen aus mindestens ca. 15 Aminosäuren, in der Regel mindestens ca. 25 Aminosäuren und insbesondere mindestens ca. 35 Aminosäuren, aber nicht mehr als ca. 60 Aminosäuren, insbesondere nicht mehr als ca. 50 Aminosäuren. Diese aktiven Bereiche können mit einem breiten Spektrum von anderen Verbindungen verbunden werden, wie nachfolgend beschrieben wird.

Den Peptiden nach der Erfindung wird folgende Formel zugeschrieben:

pp¹QC₁aa⁴aa⁵aa⁶GGaa⁹C₂aa¹¹aa¹²aa¹³aa¹⁴C₃aa¹⁶-aa¹⁷
aa¹⁸aa¹⁹SDaa²²GKaa²⁵aa²⁶C₄aa²⁸aa²⁹aa³⁰
WKC₅C₆Kaa³⁶aa³⁷aa³⁸aa³⁹pp²

pp¹ ist dabei das N-Ende und kann sein Wasserstoff, eine einzelne Aminosäure, vorzugsweise eine polare Aminosäure, insbesondere eine hydroxy-substituierte Aminosäure oder basische Aminosäure, oder ein Polypeptid mit 2-20, insbesondere 2-10 Aminosäuren, welche eine Anzahl von Funktionen bieten können, wie Bindungsgruppen, Modifizierungsgruppen u. dgl.;
pp² ist das C-Ende. Es kann die endständige Hydroxylgruppe sein oder eine einzelne Aminosäure, vorzugsweise eine polare Aminosäure, insbesondere eine Carboxamidogruppe enthaltende Aminosäure oder ein Polypeptid mit 2-20, insbesondere 2-10 Aminosäuren, welche die gleichen Funktionen wie pp¹ übernehmen können;
die einzelnen Buchstaben haben ihre normale Bedeutung als Teil des Einzelbuchstaben-Aminosäurecodes, welcher nachstehend angegeben ist;
bis zu 5, normalerweise nicht mehr als ca. 3 der Aminosäuren können als Bindungen dienen, um Löschungen bzw. Leerstellen (deletions) in der Struktur zu sein;
C₁ bildet mit C₅, C₂ mit C₄ und C₃ mit C₆ Cystein- bzw. Cystin-Brücken, wenn solche Brücken vorhanden sind;
aa⁴ ist eine aliphatische saure oder aromatische Aminosäure, insbesondere D, E, H;
aa⁵ ist eine aliphatische polare oder basische Aminosäure, vorzugsweise eine carboxamido-substituierte oder basische Aminosäure, insbesondere N, Q, K, R;
aa⁶ ist eine aliphatische geladene Aminosäure, entweder sauer oder basisch, insbesondere D, E, K oder R;
aa⁹ ist eine aromatische Aminosäure, insbesondere F, H, W, Y;
aa¹¹ ist eine aliphatische geladene Aminosäure, vorzugsweise eine basische Aminosäure, insbesondere K, R;
aa¹² ist eine aromatische Aminosäure oder aliphatische polare oder geladene Aminosäure, vorzugsweise eine saure oder neutrale, insbesondere hydroxy-substituierte neutrale Aminosäure und kann F, H, W, Y, D, E, S, T sein;
aa¹³ ist eine aliphatische nichtpolare oder geladene Aminosäure, vorzugsweise eine nichtpolare oder basische, insbesondere eine Aminosäure mit 4 bis 6 C-Atomen, und kann L, I, V, K, R sein;
aa¹⁴ ist eine aliphatische nichtpolare Aminosäure, insbesondere eine solche mit 4 bis 6 C-Atomen, vorwiegend L, I, V;
aa¹⁶ ist eine aliphatische nichtpolare Aminosäure mit 4 bis 6 C-Atomen, insbesondere P, I, L, V;
aa¹⁷ ist eine aliphatische nichtpolare oder polare Aminosäure mit 3 bis 5 C-Atomen, vorzugsweise hydroxy-substituiert, wenn polar, und insbesondere S, T, A, P, V;
aa¹⁸ ist eine aliphatische geladene oder nichtpolare Aminosäure, insbesondere basisch, wenn geladen, und besitzt 3 bis 6, normalerweise 4 bis 6 C-Atome und ist insbesondere P, I, L, V, K, R;
aa¹⁹ ist eine aliphatische polare Aminosäure mit 3 bis 4 C-Atomen, vorzugsweise hydroxy-substituiert, insbesondere S, T;
aa²² ist eine aliphatische nichtpolare oder aromatische Aminosäure, und besitzt, wenn aliphatisch, 5 bis 6 C-Atome, und ist insbesondere F, I, L, V;
aa²⁵ ist eine aliphatische neutrale Aminosäure mit 3 bis 6, insbesondere 4 bis 6 C-Atomen, die polar oder nichtpolar ist, und, wenn sie polar ist, ein Schwefelatom besitzt, und insbesondere M, I, L, V ist;
aa²⁶ ist eine aliphatische geladene oder nichtpolare Aminosäure, die, wenn polar, insbesondere sauer ist, 2 bis 5, insbesondere 2 bis 4 C-Atome besitzt und insbesondere G, A, P, D, E ist;
aa²⁸ ist eine aliphatische geladene Aminosäure mit 4 bis 6 C-Atomen, welche basisch oder sauer sein kann und insbesondere D, E, K, R ist;
aa²⁹ ist eine aliphatische oder aromatische Aminosäure, die, wenn sie aliphatisch ist, 3 bis 5 C-Atome besitzt, insbesondere A, P, V, F, H, W, Y ist;
aa³⁰ ist eine aliphatische neutrale nichtpolare oder basische Aminosäure, die, wenn neutral nichtpolar, 4 bis 6, insbesondere 5 bis 6 C-Atome besitzt, und insbesondere I, L, V, K, R ist;
aa³⁶ ist eine aliphatische basische Aminosäure, insbesondere K, R;
aa³⁷ ist eine aliphatische oder aromatische Aminosäure, die, wenn aliphatisch, 2 bis 3 C-Atome besitzt und, insbesondere G, A, F, H, W, Y ist;
aa³⁸ ist eine aliphatische neutrale polare oder nichtpolare Aminosäure mit 2 bis 4 C-Atomen, die, wenn polar, insbesondere hydroxy-substituiert ist, insbesondere G, A, P, S, T;
aa³⁹ ist eine aliphatische nichtpolare Aminosäure mit 2 bis 6, insbesondere 2 bis 3 C-Atomen, insbesondere G, A, P, I, L, V.

Die Eingruppierung der verschiedenen Aminosäuren und die Einzelbuchstaben-Bezeichnung sind nachfolgend angegeben:
aliphatisch
neutral
nichtpolarG, A, P, V, I, L polarS, T, M, C, N, Q geladen
sauerD, E basischK, R aromatischF, H, W, Y

G - GlycinN - Asparagin A - AlaninQ - Glutamin P - ProlinD - Asparaginsäure V - ValinE - Glutaminsäure I - IsoleucinK - Lysin L - LeucinR - Arginin S - SerinF - Phenylalanin T - ThreoninH - Histidin M - MethioninW - Tryptophan C - CysteinY - Tyrosin

Von besonderem Interesse sind Peptide der folgenden Formel:

Hierbei gilt:
wenn zwei Aminosäuren an derselben Stelle angegeben sind, kann eine von beiden an dieser Stelle vorhanden sein, es ist jedoch bevorzugt, daß die Aminosäuren oberhalb der Linie gemeinsam vorhanden sind und die Aminosäuren unterhalb der Linie gemeinsam vorhanden sind.

Es sei weiterhin erwähnt, daß konservative Substitutionen der Aminosäuren zulässig sind. Unter konservativen Substitutionen ist zu verstehen, daß die folgenden Aminosäuren auf derselben Linie gegeneinander austauschbar sind.

G, A
V, I, L
D, E
K, R
S, T
F, H, W, Y

Das N-Ende des Peptids kann blockiert oder unblockiert sein, wobei die Blockierung normalerweise eine aliphatische Säure, wie Essigsäure oder Ameisensäure, eine Alkylierung u. dgl. umfaßt. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen wärme- und säurestabil unter den im experimentellen Abschnitt beschriebenen Bedingungen sind.

Von besonderem Interesse ist das natürlich vorkommende, das Wachstum hindernde Peptid, welches zumindest ca. 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere 99% rein ist. Es kann für sich allein oder in Kombination mit anderen Toxinen verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen cytotoxischen oder das Wachstum hemmenden Verbindungen können mit einem weiten Spektrum von Liganden und Receptoren durch herkömmliche Techniken konjugiert werden. Die funktionellen Gruppen, die in die Bindung eingehen, können eine Anzahl von sauren Gruppen, wie Carboxyl, Sulfonyl und Phosphoryl sein, weiterhin Kombinationen von Thiol und Olefinen, Dithio, Aldehyden, Azogruppen, Diazogruppen o. dgl. In den meisten Fällen werden die funktionellen Verbindungen verwendet, welche stufenweise umgesetzt werden können, obwohl auch die funktionelle Verbindungen, bei denen beide Funktionen gleichzeitig reagieren, verwendet werden können. Zur Erläuterung seien als Reagentien genannt:
Glutaraldehyd, Formaldehyd, para-Maleimidobenzoesäure, Methyldithioessigsäure, Diazobenzoesäure u. dgl. Die Verfahrensweise, welche im einzelnen für die Anknüpfung des cytotoxischen Wirkbereiches an ein spezifisches Bindungsglied verwendet wird, ist nicht kritisch.

Spezifische Bindungsglieder können Liganden und Receptoren sein, wobei die Bindungsglieder dazu dienen, eine spezifische Bindung an ein besonderes Angriffsziel zu schaffen. Zum Beispiel haben Zellen normalerweise Oberflächen-Antigene und Receptoren, welche charakteristisch für einen bestimmten Zelltyp sind. Durch Verwendung geeigneter Liganden oder Receptoren, die mit dem toxischen Mittel konjugiert sind, kann somit das toxische Mittel bevorzugt auf solche Zellen gerichtet werden, die das reziproke spezifische Bindungsglied besitzen.

Die zahlreichen Verbindungen, welche als Liganden verwendet werden können, umfassen Steroide, Lipoproteine mit geringer Dichte, Wachstumsfaktoren, Virusproteine u. dgl. Demgegenüber werden entweder natürliche Receptoren oder vorzugsweise Immunglobuline oder deren Fragmente in den Fällen verwendet, in denen die Receptoren auf bestimmte Oberflächenantigene gerichtet werden. Die hier besonders interessierende Immunglobuline umfassen IgA, IgD, IgM, IgE und IgG, insbesondere IgG, einschließlich eines jeden Untertyps. Die Immunglobuline können aus jeder geeigneten Quelle abgeleitet werden, insbesondere von Maus oder Mensch. Die Immunglobuline können aus Hybridomen, aus transformierten Zellen, z. B. EBV-transformierten Lymphocyten, oder durch Rekombinanten-DNA-Technologie erhalten werden. Es können insbesondere variable Regionen aus Mäusen verbunden werden mit einer konstanten Region vom Menschen oder einem anderen Wirt, um chimere Immunglobuline zu schaffen, welche eine geringere Antigenität zeigen. Weiterhin braucht nicht das gesamte Immunglobulin verwendet zu werden, es reichen auch Fragmente davon, wie z. B. Fab, F(ab′)₂, Fv u. dgl.

Ligand und Toxin können durch Bindungen miteinander verbunden sein, die in der Zielzelle stabil oder instabil sind, so daß das Toxin und das das Ziel ansteuernde Reagens in der Zelle voneinander getrennt werden können. Es ist wünschenswert, daß das Toxin endocytosiert wird, so daß es seine Wirkung intrazellulär entfalten kann. In Fällen, in denen das das Ziel anstrebende Mittel die toxische Wirkung des Toxins nicht nachteilig beeinflußt, besteht kein Bedarf, eine spaltbare Bindung bzw. Verknüpfung vorzusehen. In Fällen, in denen eine spaltbare Bindung bzw. Verknüpfung erwünscht ist, kann herkömmlicherweise eine Disulfidbindung angewendet werden, die in der Wirtzelle reduziert werden kann.

Die Konjugate können eine breite Fächerung des Mengenverhältnisses zwischen dem das Ziel anstrebenden Mittel, dem speziellen Bindungsglied und dem Toxin umfassen. Normalerweise ist mindestens ein Toxin pro Zielmittel vorgesehen, jedoch nicht mehr als ca. ein Toxin pro 0,5 Kilodalton (kD) Zielmittel bzw. Treffmittel. In der Regel ist mindestens ein Toxinmolekül pro 100 kD Ziel- bzw. Treffmittel, insbesondere mindestens ein Molekül pro 50 kD Ziel- bzw. Treffmittel vorgesehen. In Fällen, in denen das Ziel- bzw. Treffmittel klein ist, wie z. B. ein ein geringes Molekulargewicht aufweisendes Hapten, können 2 oder mehr Liganden pro Toxin, normalerweise nicht mehr als ca. 5 Liganden pro Toxin vorgesehen sein.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in vitro oder in vivo angewandt werden. Bei in vitro-Einsatz können sie zur selektiven Zerstörung von Zellen verwendet werden, welche von anderen Zellen einer Zellkultur oder eines Gewebes unterscheidbar sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dem Medium in einer für die Zerstörung der unerwünschten Zellen ausreichende Menge zugegeben werden. Beispielsweise kann man zum Aufspüren besonderer Histocompatibilitäts-Antigene Reagentien zugeben, die Antikörper enthalten, die spezifisch gegenüber dem besonderen Histocompatibilitäts-Antigen sind. Gibt man einen Farbstoff zu, der nur von toten Zellen absorbiert wird, dann ist die Gegenwart des Farbstoffs in den Zellen ein Hinweis für den besonderen Histocompatibilitäts- Typ. Die Menge an dem Reagens, das dem Toxin die Zielrichtung gibt, kann in breitem Umfang variiert werden und kann für besondere Situationen durch in vitro-Anwendung optimiert werden. Zu viel an dem dem Toxin die Zielrichtung gebenden Reagens sollte nicht verwendet werden, da dies zu einer nichtspezifischen Bindung und falschen Positiv- Ergebnissen führen könnte, wogegen auch nicht zu wenig an dem Reagens verwendet werden sollte, weil dies zu falschen Negativ-Ergebnissen aufgrund eines niedrigen Bindungswertes führen könnte, der nicht leicht erfaßbar ist.

Für die in vivo-Anwendung kann das Konjugat parenteral oder durch Injektion, insbesondere intravenös verabreicht werden. Die Menge des angewendeten Konjugats kann in weiten Bereichen variieren in Abhängigkeit von der Natur der Zellen, die getötet werden sollen, dem Ausmaß der Zellpopulation, der Resistenz der Zelle gegenüber dem Konjugat, der Wirksamkeit des Konjugats u. dgl. Wenn anders als an einer bestimmten Stelle verabreicht, dann kann die Menge an Protein normalerweise von ca. 1 µg bis 10 mg, insbesondere bis 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Wirtes variieren. Bei Verabreichung an bestimmter Stelle ist die Proteinmenge normalerweise mehr im unteren Teil des Konzentrationsbereiches. Das Konjugat kann in einem physiologisch akzeptierbaren Medium, wie z. B. einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung, einer Kochsalzlösung selbst oder einem anderen herkömmlichen Träger verabreicht werden. In Pulverform kann das Konjugat mit anderen Materialien compoundiert werden, welche geeignet sind, die Zusammensetzung zu einem bestimmten Organ zu führen, die Freigabe zu verzögern o. dgl. Die Art und Weise, in der proteinhaltige Zusammensetzungen einem Wirt verabreicht werden können, ist im Stand der Technik hinreichend ausführlich beschrieben und braucht hier nicht im Detail diskutiert zu werden.

Von besonderem Interesse als Zielzellen sind Tumorzellen und pathogene Mikroorganismen. Wegen ihrer weiten Verbreitung von besonderem Interesse sind Lungenkarzinome, Colon- und Rectum-Krebszellen, Brustkrebs, Uteruskarzinom, Prostatakarzinom, Blasen- und Nierenkrebs, Lymphom, Leukämie und Hodgkin′sche Krankheit.

Beispiele für pathogene Mikroorganismen sind Protozoen, wie Plasmodium vivas, P. maleriae, P. ovale und P. falciparum, Gram-negative Bakterien, wie Pseudomonas, Klebsiella und Neisseria, Gram-positive Bakterien u. dgl.

Experimentelles MATERIALIEN UND METHODEN Reinigung des das Wachstum hemmenden Peptids aus dem Gift von Crotalus atrox

Das rohe Peptid wurde durch Melken des Giftes von Crotalus atrox gewonnen und vor der Lyophilisation durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt. Das gefriergetrocknete Gift wurde aufgelöst (10 mg/ml) in 1M Essigsäure, und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt.

Die anfängliche Reinigung wurde erreicht durch Auftragen der Probe in Mengen von 7,5 ml auf eine Bio-Gel P10-Säule, die mit 1M Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht war, und es wurden Fraktionen (3,5 ml) gesammelt und gleiche Anteile wurden entfernt und gefriergetrocknet. Die Anteile wurden zunächst auf ihre inhibitierende Wirkung auf die DNA-Synthese in A549 Zellkulturen von humanem Lungenkarzinom geprüft. Kurz gesagt, wurden 2 × 10⁴ A549 Zellen in 96-Lochplatten eingesiedelt, und nach der Anheftung der Zellen wurden sie mit den geeigneten Säulenfraktionen behandelt. Fünf Tage später wurden die Löcher mit ¹²⁵I Deoxyuridin pulsiert, und die DNA-Synthese wurde relativ zu den Kontroll-Löchern auf der Grundlage der Einlagerung von ¹²⁵I-Deoxyuridin gemessen. Zwei Hauptpeaks der Inhibition waren zu sehen. Ein erster Peak von Inhibitions-Aktivität von niederem Molekulargewicht, der in der Nähe des 6000 M _r Isulinmarkers eluiert wurde, wurde weiter gereinigt unter Anwendung der Hochdruck- Flüssigkeits-Chromatographie (High pressure liquid chromatography - HPLC).

Die Probe wurde gefriergetrocknet und in 0,05%iger Trifluoressigsäure (TFA) in gereinigtem Wasser (Water′s Associates) mit Qualität für HPLC resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt, und die Probe wurde in eine C₁₈-Novapack-Säule injiziert. Die Probe wurde mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% Acetonitril in 0,05%iger Trifluoressigsäure (TFA) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 22°C eluiert. Jedes A₂₁₄ absorbierendes Peptid wurde getrennt gesammelt und gleiche Anteile wurden auf ihre Inhibitionswirkung der DNA-Synthese geprüft. Das bei 54% Acetonitril eluierte Peptid inhibierte die DNA-Synthese der A549-Zellen. Keine Inhibition wurde gesehen unter Anwendung der anderen Säulenfraktionen. SDS- PAGE dieser Aktivität zeigte ein einzelnes silbergefärbtes Band. Keine anderen Banden wurden auf diesem Gel sichtbar, woraus zu schließen ist, daß das Peptid bis zur Homogenität gereinigt war.

Inhibierte Zellen zeigten einen schlagartigen morphologischen Wechsel 24 Stunden nach der Behandlung mit diesem Peptid, das als wachstumhinderndes Peptid (Growth Arresting Peptide - GAP) bezeichnet wurde. Sowohl menschliche Tumorzellen als auch nichttransformierte Fibroplasten wurden in dieser Probe (50% der Zellen wurden angesiedelt) bei einer Peptidkonzentration von annähernd 100 ng/ml inhibiert. Die Zellen wurden nach der Behandlung rund und die meisten dendritartigen Vorsprünge fehlten bemerkenswerterweise. Die Zellen waren jedoch immer noch an der Platte angeheftet. Dieser Effekt war irreversibel, da das Waschen der behandelten Zellen und eine erneute Zugabe von frischem Medium, das 10% Serum enthielt, die Zellen nicht veranlaßte, ihren ursprünglichen Phänotyp wiederzugewinnen.

Die Aminosäuresequenz des wachstumhindernden Peptids (GAP) wurde durch Mikrosequenzanalyse von Peptiden bestimmt, die durch enzymatische Verdauung von reduzierter und S-Carboxamidomethylierter GAP mit (a) der Endoproteinase Lysin-C; (b) TPCK-Trypsin (L-(1-Tosylamido-2-phenyl)-äthylchlormethyl- keton); und (c) Staphylococcus aureus V8 erhalten wurden. Die Peptidfragmente wurden durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung flüchtiger Lösungsmittel gereinigt. Amino-endständig blockierte Peptide wurden in 12N HCl bei Umgebungstemperatur während 16 Stunden inkubiert. Proben wurden dann durch Lyophilisation getrocknet. Die Peptide wurden einer automatisierten Edman-Degradation im Modell 470A Gasphasen-Proteinsequencer (Applied Biosystems, Inc.) unterworfen. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (rpHPLC) analysiert.

Die Aminosäuresequenz von GAP ist wie folgt:

Die Struktur wurde bestimmt durch Mikrosequenz-Analyse. Kurz gesagt, wurde GAP mit Dithiothreitol reduziert, mit Iodoacetamid S-Carboxamidomethyliert, und ein 10%iger Anteil wurde dann der automatisierten Edman-Degradation unterworfen. Keine N-endständige Aminosäure wurde gefunden, selbst wenn mehrere Zyklen der Edman-Degradation durchgeführt wurden, woraus geschlossen wird, daß die endständige Aminogruppe von GAP blockiert ist.

Ein 45%iger Anteil von S-Carboxamidomethylierter GAP wurde mit Lysin-S-Enzym verdaut. Peptide K1-24 und K25-32 wurden durch rpHPLC aufgetrennt. Die Peptide K33-35 und K36-39 wurden von der Säule nicht zurückgehalten und wurden als Mischung eluiert. Kein Versuch wurde unternommen, diese Peptide zu reinigen. Ein 50%iger Anteil der Peptide K1-24 bzw. K25-32 wurde der automatisierten Edman-Degradation unterworfen. Keine N-endständige Aminosäure wurde gefunden, wenn K1-24 einer Sequenzanalyse unterworfen wurde. Der verbleibende 50%-Anteil von K1-24 wurde anschließend mit TPCK- Trypsin verdaut. Die tryptischen Peptide T1-11, T12-18 und T19-24 wurden rpHPLC getrennt und der Edman-Degradation unterworfen. Keine N-endständige Aminosäure wurde gefunden, wenn ein 50%-Anteil des Peptids T1-11 auf Sequenz untersucht wurde, woraus zu schließen ist, daß T1-11 das N-endständige Peptid von K1-24 ist. Der verbleibende 50%- Anteil von T1-11 wurde anschließend mit 12N HCl entblockiert, und die Sequenz des säurebehandelten T1-11 wurde bestimmt. T12-18 enthielt einen C-endständigen Arginin-Rest, wogegen K1-24 einen C-endständigen Lysin-Rest enthielt, und es wurde so angenommen, daß es das Carboxyl-endständige Peptid von K1-24 ist. Peptid K25-32 wurde vollständig auf Sequenz analysiert. Die erhaltenen Daten stützen die vorgeschlagene Aminosäuresequenz von GAP aus den Resten 1-32.

Der verbliebene 45%-Anteil von S-Carboxamidomethylierter GAP wurde mit Staphylokokken aureus V8 verdaut. Die Peptide E1-6, E7-21 und E22-39 wurden durch rpHPLC getrennt. Ein 50%-Anteil der Peptide E1-6, E7-21 und E22-39 wurde der automatisierten Edman-Degradation unterworfen. Keine N-endständige Aminosäure wurde für das Peptid E1-6 gefunden. Die vollständige Sequenz von E7-21 und E22-39 erweiterte die angenommene Struktur von GAP aus den Resten 1-39 und bestätigte die Annahmen, die aus den Peptiden T12-18, T19-24 und K25-32 gemacht wurden. Ein 50%-Anteil von Peptid E1-6 wurde danach mit 12N HCl entblockiert, möglicherweise durch eine säurekatalysierte N-O-Acetyl-Verschiebung bei Ser-1. Die Sequenz des säurebehandelten E1-6 wurde bestimmt. Die Möglichkeit blieb, daß zusätzliche Peptide in der Struktur jenseits des Restes Gly-39 vorhanden sind, da keine Carboxypeptidase- Behandlung von GAP, das Gly-39 als C-endständige Aminosäure bestätigte. Die weitgehende Homologie zwischen GAP und Crotamin, Myotoxin A und dem toxischen Peptid C in der Sequenz läßt die vorgeschlagene Struktur glaubhaft erscheinen.

Strukturmäßig gehört GAP zu der Familie der Klapperschlangen- Toxine, einer Gruppe von Polypeptiden, die Muskelschwund durch Beschädigung des endoplasmatischen Reticulums als erstes Angriffsziel verursacht. Ein Vergleich von GAP mit allen Proteinsequenzen, die in der Proteinsequenz-Datenbank (PIR Version 5.0, Mai 1985) gespeichert sind, ergab keine irgendwie geartete weitgehende Homologie mit irgendeiner anderen bekannten Sequenz. Die Sequenzen von GAP und den Klapperschlangen-Toxinen können miteinander ausgerichtet werden, so daß die Cystein-Reste homologe Stellen zeigen, indem zwei Leerstellen zwischen die Reste 10 und 11 von GAP eingesetzt werden. Das Vorhandensein von sechs Halb-Cystin- Resten in GAP läßt auf drei Disulfid-Brücken im Polypeptid schließen. Die oben angegebene Aminosäuresequenz kann in breitem Rahmen unter Beibehaltung der konformativen Struktur und cytotoxischen Aktivität variiert werden.

Die erfindungsgemäßen Toxine können anstelle von Toxinen, wie Ricin, Diphterietoxin, Abrin u. dgl. in Übereinstimmung mit bekannter Methodologie eingesetzt werden. Vergleiche beispielsweise Jansen et al., Recept.-Mediated Binding Intern. Toxins Horm. [Proc. Symp.] 1980 (Pub. 1981) 351-356 (C.A. 95 : 126185u); Masuho et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1979) 90 : 130-326; US-Patent Nr. 43 40 535.

Obwohl die Erfindung vorstehend zum Zwecke der Erläuterung und als Beispiel zum Zwecke des besseren Verstehens im Detail beschrieben wurde, soll sie nicht darauf beschränkt sein, es ist vielmehr für den Fachmann ersichtlich, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne daß der Umfang der Erfindung und der Rahmen der Ansprüche verlassen wird.

Claims

1. Toxisches Peptid der Formel:

pp¹QC₁aa⁴aa⁵aa⁶GGaa⁹C₂aa¹¹aa¹²aa¹³aa¹⁴C₃aa¹⁶-aa¹⁷
aa¹⁸aa¹⁹SDaa²²GKaa²⁵aa²⁶C₄aa²⁸aa²⁹aa³⁰
WKC₅C₆Kaa³⁶aa³⁷aa³⁸aa³⁹pp²
pp¹ ist das N-Ende und ist Wasserstoff oder eine Aminosäure-Kette mit 1-20 Aminosäuren;
pp² ist das C-Ende und kann Hydroxyl oder eine Aminosäure-Kette mit 1-20 Aminosäuren sein;
die einzelnen Buchstaben haben ihre normale Bedeutung nach dem Einzelbuchstaben-AminosäureCode;
bis zu fünf der mit einer Zahl versehenen Aminosäuren können als Bindungen dienen;
wenn Cystein-Brücken vorhanden sind, paart sich C₁ mit C₅, C₂ mit C₄ und C₃ mit C₆;
aa⁴ ist eine aliphatische saure oder aromatische Aminosäure;
aa⁵ ist eine aliphatische polare oder basische Aminosäure;
aa⁶ ist eine aliphatische geladene Aminosäure;
aa⁹ ist eine aromatische Aminosäure;
aa¹¹ ist eine aliphatische basische Aminosäure;
aa¹² ist eine aromatische Aminosäure oder eine aliphatische polare oder geladene Aminosäure;
aa¹³ ist eine aliphatische nichtpolare oder geladene Aminosäure;
aa¹⁴ ist eine aliphatische nichtpolare Aminosäure;
aa¹⁶ ist eine aliphatische nichtpolare Aminosäure mit 4 bis 6 C-Atomen;
aa¹⁷ ist eine aliphatische nichtpolare oder polare Aminosäure mit 3 bis 5 C-Atomen;
aa¹⁸ ist eine aliphatische nichtpolare oder basische Aminosäure mit 3 bis 6 C-Atomen;
aa¹⁹ ist eine aliphatische polare Aminosäure mit 3 bis 4 C-Atomen;
aa²² ist eine aliphatische nichtpolare oder aromatische Aminosäure;
aa²⁵ ist eine aliphatische neutrale Aminosäure mit 3 bis 6 C-Atomen;
aa²⁶ ist eine aliphatische geladene oder nichtpolare Aminosäure mit 2 bis 5 C-Atomen;
aa²⁸ ist eine aliphatische geladene Aminosäure mit 4 bis 6 C-Atomen;
aa²⁹ ist eine aliphatische Aminosäure mit 3 bis 5 C-Atomen oder eine aromatische Aminosäure;
aa³⁰ ist eine aliphatische nichtpolare oder basische Aminosäure mit 4 bis 6 C-Atomen;
aa³⁶ ist eine aliphatische basische Aminosäure;
aa³⁷ ist eine aliphatische Aminosäure mit 2 bis 3 C-Atomen oder eine aromatische Aminosäure;
aa³⁸ ist eine aliphatische neutrale Aminosäure mit 2 bis 4 C-Atomen; und
aa³⁹ ist eine aliphatische nichtpolare Aminosäure,

wobei das N-Ende blockiert oder unblockiert sein kann.

2. Toxisches Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das N-Ende unblockiert ist.

3. Toxisches Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß pp¹ Wasserstoff und pp² Hydroxyl ist.

4. Toxisches Peptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das N-Ende blockiert ist.

5. Toxisches Peptid, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit der Formel: wobei an den Stellen, an denen zwei Aminosäuren angegeben sind, eine von beiden vorhanden sein kann.

6. Toxisches Peptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß an den Stellen, an denen zwei Aminosäuren angegeben sind, nur die oberen Aminosäuren vorhanden sind.

7. Toxisches Peptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß an den Stellen, an denen zwei Aminosäuren angegeben sind, nur die unteren Aminosäuren vorhanden sind.

8. Toxisches Peptid-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß ein toxisches Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 an ein Glied eines spezifischen Bindungspaars kovalent gebunden ist.

9. Toxisches Peptid-Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Glied des spezifischen Bindungspaars ein Ligand ist.

10. Toxisches Peptid-Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Glied des spezifischen Bindungspaars ein Receptor ist.

11. Toxisches Peptid-Konjugat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Receptor ein Antikörper ist.

12. Toxisches Peptid-Konjugat, bei dem ein Toxin aus Crotalus atrox kovalent an ein spezifisches Bindungspaar- Glied gebunden ist.

13. Verfahren zum Hemmen des Wachstums einer vorbestimmten Zellgruppe in einer Mischung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellmischung mit einem toxischen Peptid-Konjugat nach Anspruch 10 in einer zur Hinderung des Wachstums dieser Zellen ausreichenden Menge zusammenbringt und dadurch das Wachstum der Zellen inhibiert, wobei der Receptor spezifisch für ein Antigen auf der Oberfläche der Gruppe von Zellen ist.