DE3724323C2

DE3724323C2 - Ein neuer Inhibitor für die Proteinsynthese

Info

Publication number: DE3724323C2
Application number: DE3724323A
Authority: DE
Inventors: Douglas A Lappi; Pier Carlo Montecucchi; Marco Soria
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1986-07-29
Filing date: 1987-07-22
Publication date: 1995-07-20
Anticipated expiration: 2007-07-23
Also published as: GB2194241B; GB8717932D0; IT8721475A0; DE3724323A1; GB2194241A; IT1231914B

Description

Die Erfindung betrifft Proteine, welche Ribosom inaktivieren, und Immunotoxine, die sie enthalten.

Proteine, welche die Proteinsynthese inhibieren, werden ebenfalls als Ribosom inaktivierende Proteine bzw. als Proteine, welche Ribosom inaktivieren (RIPs), bezeichnet, und sie wurden in Samen, Wurzeln und Blättern einer Reihe von Pflanzen nachgewiesen. L. Barbieri und F. Stirpe (Cancer Surveys, Bd. 1, 1982, Seite 489) haben vorgeschlagen, solche RIPs, welche in der Natur als Proteine mit einer einzigen Kette vorkommen, als "RIPs Typ 1" zu bezeichnen und solche, die eine A-(aktive)-Kette mit RIP-Eigenschaften, kovalent gebunden an eine B-(Bindungs)-Kette mit Lectineigenschaften, aufweisen, als "RIPs Typ 2" zu bezeichnen.

Die "RIPs Typ 2", wie Ricin, Abrin und Modeccin, können die Zellen leichter betreten. Sie inhibieren daher die Proteinsynthese in Zellen wie auch in zellfreien Systemen. Sie sind für Tiere stark toxisch. Andererseits sind "RIPs Typ 1" nur in zellfreien Systemen wirksam. Sie können nicht in die Zellen eindringen, daher sind sie für Tiere kaum oder überhaupt nicht toxisch. Im allgemeinen inaktivieren RIPs eukaryotische Ribosomen in katalytischer (enzymatischer) Weise, indem sie die 60S-ribosomalen Untereinheiten unfähig machen, den Elongationsfaktor 2 zu binden, und sie inhibieren somit die Proteinsynthese.

Wie oben erwähnt, bestehen die "RIPs Typ 2" aus zwei funktionell unterschiedlichen Ketten, d. h. einer Ribosom inaktivierenden A-Kette, die mittels einer einfachen Disulfidbindung an eine schwere B-Kette gebunden ist, welche Zucker mit der Konfiguration der D-Galactose bindet. Der eine Teil, die B-Kette, nimmt an der Bindung der Rezeptoren an der Zelloberfläche teil, wohingegen der andere, die A-Kette, die cytoplasmische Phase betritt, wo sie die Proteinsynthese inhibiert. Die A- und B-Kette können getrennt werden, und es wurde gefunden, daß die A-Ketten die intakten Zellen nicht betreten können, sofern sie nicht an die B-Ketten gebunden sind.

Immunotoxine sind Moleküle, die durch Konjugation von Antikörpern, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, und Proteinen, wie RIPs, gebildet werden, die, wenn sie einmal in die Zelle eingetreten sind, für die Zelle toxisch sein können. Immunotoxine können als therapeutische Mittel verwendet werden, wenn man Antikörper verwendet, die gegen bestimmte pathologische Zelltypen gerichtet sind. Beispielsweise können Immunotoxine verwendet werden, um Pfropf(graft)- versus-Wirt-Krankheiten unter Verwendung von Anti-T-Zellen- Antikörpern, gekuppelt an ein wirksames Protein, zu behandeln. Melanomas können unter Verwendung eines Anti-Melanoma- Antikörpers behandelt werden.

Es wurden verschiedene Arten von Proteinen an Antikörper konjugiert. Unter diesen sind Ricin, Ricin-A-Kette, Pseudomonas- aeruginosa-Exotoxin und Diphtheria-Toxin-A-Kette. Diese verschiedenen Proteine besitzen alle Vorteile und Nachteile, wenn sie für Immunotoxine verwendet werden, die als pharmazeutische Mittel in vivo eingesetzt werden. Beispielsweise behalten Ricin und Pseudomonas-Exotoxin ihre Toxizität bei, und wenn sich nicht genau an die richtige Zelle abgegeben werden, können sie "unschuldige nebenstehende" Zellen töten. Wenn das Immunotoxin aus dem Kreislauf durch ein Organ, wie die Leber, herausgenommen wird, können sie dieses Organ beschädigen.

Es wird angenommen, daß die Ricin-A-Kette dieses Problem umgehen könnte, da es nur ein Protein ist, welches die Proteinsynthese inhibiert und den Antikörper begleitet, und keine nichtspezifische Zellbindungskette besitzt. Immunotoxine, die mit Ricin-A-Kette hergestellt werden, besitzen nicht die Fähigkeit, "unschuldige nebenstehende Zellen" zu binden und sollten somit eine verringerte nichtspezifische Toxizität aufweisen.

Jedoch haben kürzliche Berichte Zweifel hinsichtlich der Aktivität der Ricin-A-Ketten-Immunotoxine bei in-vivo-Bedingungen entstehen lassen. Jansen et al. [(1986) J. Cell. Biochem. Supplement 10b, Abstract G16] berichten, daß, ohne spezielle "Aktivatoren", das Ricin-A-Ketten-Immunotoxin, welches gegen T-Zellen (für die Behandlung von Graft-versus- Wirt-Krankheit) hergestellt wurde, inaktiv war. Casellas et al. [(1982) Int. J. Cancer 30, 437-443] berichten, daß ein Anti-Melanoma-Antikörper-Ricin-A-Ketten-Immunotoxin ebenfalls eine Aktivierung benötigt, um seine volle Aktivität zu entfalten. Es ist daher fraglich, ob Ricin-A-Ketten- Immunotoxine in vivo wirksam sein können.

Schließlich ist die Diphtheria-Toxin-A-Kette wahrscheinlich nicht nützlich. Große Segmente der Population der industrialisierten Welt sind gegenüber Diphtheria-Toxin immunisiert.

Stripe et al. (Biochem. J. 1983, 216, Seite 617) beschreiben unter anderem RIPs aus den Samen von Saponaria officinalis (Seifenkraut), wie Fraktionen SO-5 und SO-6.

Diese Proteine besitzen die Eigenschaften von RIPs Typ 1. Die Anmelderin hat jetzt überraschenderweise einen neuen exzeptionell potenten Proteininhibitor isoliert, indem sie eine geeignete Extraktion nicht der Samen, sondern der Blätter von Saponaria officinalis durchführte. Die Anmelderin hat diesen neuen Proteininhibitor als "Substanz SO-4" bezeichnet. Die "Substanz SO-4" scheint ein Protein mit einer Kette zu sein, welches analog zu den A-Ketten von Ricin, Abrin und Modeccin ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Ribosom inaktivierendes Protein mit einer einzigen Kette, welches als "Substanz SO-4" bezeichnet wird und welches ein Molekulargewicht von etwa 30 000, bestimmt nach dem Polyacrylamidgel-Elektrophoreseverfahren von Laemmli, aufweist, welches einen isoelektrischen Punkt von über 9,5 besitzt und dessen N-terminale Aminosäuresequenz entsprechend dem Einbuchstabencode:

beträgt.

In den beigefügten Zeichnungen bedeuten:

Fig. 1 das UV-Spektrum der "Substanz SO-4", wobei die Abszisse die Wellenlänge (nm) und die Ordinate die Absorption bedeuten. Der Peak A ist bei einer Wellenlänge von 276,7 nm und bei einer Absorption von 0,8545, und der Peak B tritt bei einer Wellenlänge von 281,7 nm und einer Absorption von 0,8469 auf;

Fig. 2 zeigt das Ergebnis der Eluierung der Mono-S-Säule in Beispiel 1, wobei AU₂₈₀ die Absorptionseinheiten bei 280 nm und (der Einsatz) die Ergebnisse der Elektrophorese in Beispiel 1 für die Molekulargewichtbestimmung bedeuten;

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Umkehrphasenchromatographie der "Substanz SO-4" in Beispiel 1, wobei AU₂₈₀ die Absorptionseinheiten bei 280 nm bedeutet;

Fig. 4 zeigt die Proteinsynthese-Inhibierungsaktivität von gereinigter "Substanz SO-4" in Beispiel 2, wobei auf der Abszisse die Menge an "Substanz SO-4" in ng/ml (log-Scala) aufgetragen ist und wobei auf der Ordinate die Prozentkontrolle der Proteinsynthese angegeben ist. Der Pfeil bedeutet eine ID50 von 16,5 ng/ml; und

Fig. 5 zeigt den modifizierten Sequencer, der in Beispiel 1 beschrieben wird.

Ein wesentlicher Vorteil der "Substanz SO-4", verglichen mit den A-Ketten von zuvor beschriebenen Cytotoxinen, ist der, daß sie leicht mit einfachen Verfahren, wie sie im folgenden beschrieben werden, erhalten werden kann und daß sie nicht durch Gesamt-Cytotoxine verunreinigt ist, wie es bei den A-Ketten von Ricin und Abrin der Fall ist. Ebenfalls wichtig ist die wesentlich längere jahreszeitliche Verfügbarkeit der Blätter, verglichen mit den Samen.

Die "Substanz SO-4" kann durch Isolierung aus den Blättern von Saponaria officinalis nach Verfahren erhalten werden, die für die Isolierung von Proteinen geeignet sind. Die "Substanz SO-4" kann nach einem Verfahren hergestellt werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) Blattgewebe von Saponaria officinalis zerkleinert und mit Wasser extrahiert,
(b) unlösliches Material aus dem Extrakt durch Zentrifugieren entfernt,
(c) den Überstand von der Zentrifugation dialysiert,
(d) das Dialysat der Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines negativ geladenen Ionenaustauschträgers unterwirft,
(e) die "Substanz SO-4" von dem Träger eluiert.

Beispielsweise können Blätter, die man von Saponaria officinalis erhält, kleingeschnitten und mit Wasser extrahiert werden, wobei dieses vorteilhafterweise einen Elektrolyten und einen Puffer, beispielsweise Natriumchlorid und Phosphatpuffer, bei ungefähr neutralem pH enthält. Das Gemisch wird zur Brechung der individuellen Zellen der Blätter homogenisiert. Dies kann mit irgendwelchen im Handel erhältlichen Homogenisierungsvorrichtungen erfolgen. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt, und das Material mit niedrigem Molekulargewicht kann durch Dialyse entfernt werden. Die Dialyse bei einem pH-Wert von 9 mit verdünntem Boratpuffer ergibt den Extrakt für die Ionenaustausch- Chromatographie. Unter Verwendung eines negativ geladenen Ionenaustauschträgers wird bei diesem pH nur die "Substanz SO-4" und weniger andere Proteine an den Träger gebunden. Die Eluierung kann unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten, beispielsweise 0 bis 0,3 M Natriumchlorid, erfolgen. Die größte chromatographische Fraktion, die eluiert, ist die der "Substanz SO-4". Mittels einer darauffolgenden Chromatographie der rohen, so isolierten "Substanz SO-4" kann die reine Substanz erhalten werden.

Die "Substanz SO-4" zeigt eine signifikante Ribosom inaktivierende Proteinaktivität. Sie inhibiert die Proteinsynthese hauptsächlich in zellfreien Systemen, und sie zeigt eine signifikante niedrigere Toxizität in Mäusen als andere Fraktionen von Saponaria officinalis. Das UV-Spektrum der "Substanz SO-4" ist in Fig. 1 dargestellt, 0,98 mg/ml Puffer von 0,1 M Natriumsulfat und 0,1 M Natriumchlorid bei pH 7,5. Das Spektrum wird auf einem Beckman-DU-8-Spektrophotometer mit einer Abtastgeschwindigkeit von 100 nm/min aufgenommen.

Obgleich die "Substanz SO-4" für die Hauptzahl der Säugetierzellen nicht toxisch ist, kann sie cytotoxisch gemacht werden, indem man sie an ein Haptomeres bindet, welches sich an die Zellen binden kann. Es gibt beispielsweise bekannte monoklonale Antikörper, die selektiv an Tumorzellen gebunden werden. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Immunotoxin, welches die "Substanz SO-4", konjugiert an ein Haptomeres, welches an eine Zelle gebunden werden kann, wie einen monoklonalen Antikörper oder sein F(ab′)₂-Fragment, enthält.

Ein monoklonaler Antikörper, welcher für ein Tumorzellen- Antigen spezifisch ist, oder sein F(ab′)₂-Fragment kann an die "Substanz SO-4" konjugiert werden. Das entstehende Konjugat kann die "Substanz SO-4" an die Tumorzellenoberfläche abgeben, und beim Betreten der Zellen tötet die "Substanz SO-4" die Zelle in spezifischer Weise.

Der monoklonale Antikörper oder das Antikörperfragment kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Es kann ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment von Menschen, Ratten oder Mäusen sein.

Die "Substanz SO-4" kann an einen monoklonalen Anti-T-Zellen- Antikörper unter Bildung eines Immunotoxins gebunden werden. Bevorzugt ist er für humane T-Zellen oder eine besondere Art solcher Zellen spezifisch. Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit geeigneter Spezifizität können Immunotoxine hergestellt werden, die zur Bekämpfung von Graft-versus-Wirts-Reaktionen (graft-versus-host reactions) oder zur Bekämpfung oder Verhinderung von T-Zellen-Krebs verwendet werden können (Pastan et al., Cell, Bd. 47, 641- 648, 5. Dezember 1986). Sie können daher bei der Prophylaxe der Graft-Rejektion verwendet werden, wobei T-Zellen die Hauptrolle spielen. Anstelle von Anti-T-Zellen-monoklonalem- Antikörper kann sein F(ab′)₂-Fragment verwendet werden.

Um die "Substanz SO-4" an den monoklonalen Antikörper oder sein Fragment zu konjugieren, kann man irgendein geeignetes Verfahren verwenden. Beispielsweise kann die "Substanz SO-4" an den monoklonalen Antikörper oder sein Fragment mittels einer Disulfidbindung gebunden werden. N-Succinimidyl- 3-(2-pyridyldithio)-propionat kann verwendet werden, um dies zu erreichen oder um eine Konjugation an andere Haptomere zu erreichen.

Haptomere, welche selektiv an die Zellen von eukaryotischen Parasiten gebunden werden, können nützlicherweise als Träger für die "Substanz SO-4" verwendet werden. Analog sind bestimmte Hormonproteine sehr spezifisch in ihrer Bindung zu Rezeptorenstellen, und Haptomere, die an die "Substanz SO-4" konjugiert sind, können eine toxinaktive Selektivität an diesen Stellen ergeben.

Die erfindungsgemäßen Immunotoxine können für die Verabreichung auf irgendeine zweckdienliche Weise formuliert werden. Sie werden normalerweise durch Injektion verabreicht, und sie können somit als sterile pyrogenfreie Flüssigkeit, bevorzugt mit Wasser, welches physiologisch annehmbare Träger enthalten kann und welches zweckdienlich isotonisch ist, formuliert werden. Gegenstand der Erfindung sind somit pharmazeutische Zubereitungen, welche einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel und als aktiven Bestandteil ein erfindungsgemäßes Immunotoxin enthalten.

Für die Antitumorverabreichung liegt die tägliche Dosis der "Substanz SO-4" in dem Immunotoxin bevorzugt im Bereich von 1 bis 100 mg. Dosiseinheiten, welche SO-4 als Immunotoxin enthalten, beispielsweise Ampullen für die Injektion, werden so normalerweise 1 mg bis 100 mg der "Substanz SO-4" enthalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Extraktion, Reinigung und Charakterisierung der "Substanz SO-4"

4 g gefrorene Saponaria officinalis werden mit einer Schere in kleine Stücke geschnitten. Sie werden in 40 ml 0,1 M Natriumphosphat, 0,1 M Natriumchlorid bei pH 7,0 suspendiert. Die Lösung wird durch Behandlung mit einer Ultraturrax-Homogenisierungsvorrichtung während insgesamt 3 min homogenisiert. Die einzelnen Behandlungen dauern nicht länger als 15 s. Das homogenisierte Material wird durch Mull filtriert und dann bei 38 000 g während 30 min zentrifugiert. Der Überstand, 33 ml, wird über Nacht gegen 50 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,0 dialysiert.

Am nächsten Morgen werden 10 ml des Dialysats auf eine Mono-S-Chromatographiesäule (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) nach Filtration durch ein 0,45-µm-Filter injiziert. Die Säule ist negativ geladen. Somit wird das positiv geladene SO-4 an sie gebunden.

Die Säule wird dann mit ausreichend 50 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,5 (Puffer A) gewaschen, bis die UV-Absorption der Lösung sich von der Grundabsorption um weniger als 0,01 Absorptionseinheit unterscheidet. Die Absorption wird bei 280 nm, in diesem Falle unter Verwendung eines ultravioletten Monitors, der im Handel von Pharmacia (Schweden) erhältlich ist, bestimmt. Wenn die ursprüngliche Grundlinie 0 Absorptionseinheiten bei 280 nm zeigt, kehrt nach dem Waschen die Absorption auf weniger als 0,01 Absorptionseinheit bei der der gleichen Wellenlänge zurück. Dann wird die "Substanz SO-4" mit einem Gradienten von 0 bis 80% Puffer (Puffer 0,3 M NaCl in 50 mM Natriumborat, pH 9,5) eluiert, was 20 min dauert, wobei die Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min beträgt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Man erhält zwei Haupt-Porteinpeaks. Der erste ist SO-4. Er zeigt eine signifikante RIP-Aktivität und ist in der größten Gewichtsmenge vorhanden. Somit ist das Ribosom inaktivierende Protein quantitativ in der größten Gewichtsmenge in den Blättern vorhanden. Der zweite Peak des Proteins, der als wesentlich kleinerer Peak vorhanden ist und aus dieser Säule eluiert wird, ist eine Fraktion, die als SO-5 bezeichnet wird, ein zuvor charakterisiertes Protein aus den Blättern (Lappi et al., J. Cell Biochemistry, Ergänzung 10b, 66, 1986).

Polyacrylamidgel-Elektrophoreseverfahren von Laemmli (1970)

Die Mr-(Molekularbereichs)-Werte werden mit dem Polyacrylamidgel- Elektrophoreseverfahren von Laemmli (1970) mit den folgenden Markern bestimmt: Rinderserumalbumin (Mr 68 000), Kaninchenmuskel-Glyceraldhyd-3-phosphat (Mr 36 000), Rindererythrocyten- Kohlensäureanhydrase (Mr 30 000), Sojabohnentrypsin- Inhibitor (Mr 20 100) und Pferdeherzcytochrom c (Mr 12 600).

Die Proteinfraktionen werden so hergestellt, daß sie 2 Gew.-% Natriumdodecylsulfat, 60 mM Tris-(hydroxymethyl)- aminomethanhydrochlorid (im folgenden kurz als "Tris HCl" bezeichnet), 10% Glycerin und 5% Mercaptoethanol enthalten. Die Proben werden in Schlitze von Polyacrylamidtafeln bzw. -scheiben in einer Konzentration von 12,5% in dem Trennungsgel und 3% in dem Konzentrierungsgel mit den von Laemmli (1970) beschriebenen Puffern gegeben. Die Gele werden dann bei einer konstanten Spannung (150 V) betrieben, bis der Markierungsfarbstoff das untere Ende des Gels erreicht. Die Gele werden mit Coomassie-Blau angefärbt.

Die Elektrophorese zeigt, daß das Material in zwei Banden (Fig. 2, Einsatz, auf der linken Seite) auftritt. Dieses Erscheinungsbild ist für diese Proteine mit hohem isoelektrischen Punkt (<9,5) normal, beispielsweise besitzt die Fraktion SO-5 das gleiche Erscheinungsbild. Die Umkehrphasen- Chromatographie des gereinigten Materials zeigt, daß es bei der Chromatographie als reiner scharfer symmetrischer Peak erhalten wird, was ein Protein anzeigt (Fig. 3). Die Chromatographie erfolgt mit einer Pharmacia-Prorpc-Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. Die Lösungsmittel sind (A) 0,1% TFA in H₂O und (B) 0,1% TFA in CH₃CN : H₂O (75 : 25). Der Gradient beträgt 40 bis 60% B in 20 min.

Das Molekulargewicht der "Substanz SO-4" beträgt etwa 30 000. Die Gesamtausbeute an gereinigter "Substanz SO-4" beträgt etwa 100 µg von 1 g Blätter. Dieser Wert ist die höchste Menge an Ribosom inaktivierendem Protein, die vorhanden ist, bezogen auf das Gewicht der Blätter von Saponaria officinalis.

Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz der "Substanz SO-4"

Die N-terminale Sequenz der "Substanz SO-4" wird mit einer Gasphasensequenz bestimmt. Genauer wird eine automatische Edman-Sequenzanalyse unter Verwendung eines Gasphasen-Sequencers (Mod 470 A - Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), der mit einem Umwandlungskolben in Miniaturgröße ausgerüstet ist, durchgeführt. Eine Probe (100 bis 200 pMol) wird auf ein Patronenfilter gegeben und mit Trifluoressigsäure gewaschen und mit 30 µl Wasser, welches 3 mg Polybren und 0,2 mg NaCl enthält, gewaschen. Die Phenylthiohydantoinderivate der Aminosäuren werden an einer 5u-C-18-Säule (2,1 mm×22 cm, Applied Biosystems) unter Verwendung einer Hochdruckflüssigkeits-Chromatographievorrichtung (120 App. Applied Biosystems), die on-line mit dem Sequencer verbunden ist, mit einer Gradienteneluierung [Lösungsmittel A: 0,1 M Natriumacetat, pH 3,6 plus 5% Tetrahydrofuran in Wasser; Lösungsmittel B: Acetonitril plus Dimethylphenylthioharnstoff (500 nMol/l) bei 55°C (Strömungsgeschwindigkeit: 2 ml/min; UV-Nachweis bei 269 nm; Empfindlichkeit: 5 pMol)] identifiziert.

In dem Sequencer ist der Behälter für wasserfreie Trifluoressigsäure geeigneterweise modifiziert, verglichen mit dem, den man von Applied Biosystems Co. kauft (vgl. Fig. 5). In der neuen Bauart (ungefährt für 40 ml) wird eine Hauptoberfläche den R-3-Dämpfen angeboten. In der Tat erstreckt sich die Abgabelinie für R-3-Reagens in den Kopfraum des Reservoirs, aber nicht unter die Oberfläche der Flüssigkeit (0,5 cm über der Oberfläche). Zusätzlich werden die Manometer, die zur Messung des Druckes [0,34 bar (0-5 psi)] der Reagenzien und Lösungsmittel, die in dem Sequencer verwendet werden, durch solche ersetzt, die von Germany WIKA Co. (Mailand, Italien), der italienischen Tochterfirma von Alexander Wiegand GmbH & Co. (Deutschland), erhalten werden.

Die N-terminale Sequenz der Peptidkette der "Substanz SO-4", die so bestimmt wurde, ist im folgenden angegeben. Entsprechend IUPAC-JUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (Eur. J. Biochem. 138, 1984, Seite 9-37) wurde der sogenannte "Einbuchstabencode" für jeden Aminosäurerest verwendet. Die N-terminale Sequenz ist:

Beispiel 2 Inhibierungsaktivität für die Proteinsynthese von gereinigter "Substanz SO-4"

In der Fig. 4 ist die Aktivität bei der Inhibierung der Proteinsynthese der gereinigten "Substanz SO-4" dargestellt. Das Proteinsynthese-Assay ist ein Kit, welches von Promega Biotech (Madison, WI, USA) gekauft wird. Dieses Kit nutzt Standardverfahren für den Assay bzw. die Analyse von RIPs aus.

Kaninchen-Reticulocyten werden unter Bildung eines funktionellen Proteinsynthesesystems lysiert, so daß das radioaktive Aminosäureleucin in die Proteine eingearbeitet wird. Die Proteinsynthese wird durch die Menge der Radioaktivität in der Proteinfraktion bestimmt. In 62,5 µl Reaktionsgemisch sind 25 µl Kaninchen-Reticulocytlysat, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM Ammoniumacetat, 2 mM Magnesiumacetat, 1 mM ATP, 2 mM GTP, 15 mM Phosphocreatin, 3 µg Creatinkinase und 2,5 µCi tritiertes Leucin enthalten. Das Reaktionsgemisch wird bei 30°C 5 min inkubiert, und die Reaktion wird mit 1 ml Kaliumhydroxid beendigt.

Die Farbe der Lösung wird mit 50 µl konzentriertem Wasserstoffperoxid gebleicht, und die Proteine werden mit 1 ml kalter Trichloressigsäure präzipitiert. Die Lösung wird an GF/C-Filtern filtriert und mit Trichloressigsäure gewaschen. Die Filter werden dann auf ihren Tritiumgehalt mit einem flüssigen Scintillationszähler geprüft.

Da bei der Analyse lysierte Zellen verwendet werden, ist es nicht erforderlich, daß das Protein die Grenze der Zellmembran kreuzt. Die "Substanz SO-4" kann nur die Zellmembran bei extrem hohen Konzentrationen ohne Hilfe eines Antikörpers kreuzen, der sie direkt in die Zelloberfläche abgeben kann. Dementsprechend besitzt das Protein selbst vermutlich eine sehr geringe Toxizität.

Bei der Analyse wird das geprüfte RIP bei verschiedenen Konzentrationen zugegeben, und die Abnahmemenge an radioaktivem Leucin in das Protein wird beobachtet und gegen die Konzentration von RIP graphisch aufgetragen. Die Konzentration, bei der 50% der Proteinsynthese des Vergleichsversuches (Konzentration an RIP gleich Null) inhibiert wird, wird als ID50 (Inhibierungsdosis 50) bezeichnet. Die ID50 für die "Substanz SO-4" beträgt 16,5 und 21,8 ng bei zwei unterschiedlichen Bestimmungen. Somit zeigt SO-4 eine extrem hohe Aktivität für die Inhibierung der Proteinsynthese. In der Fig. 4 sind die Ergebnisse von einer dieser Bestimmungen dargestellt. Die ID50 der "Substanz SO-4" ist ebenfalls signifikant niedriger als die ID50 der Fraktion SO-6, dem Protein von den Samen von Saponaria (Stirpe et al., Biochem. J. 216, 1983, Seite 617).

Beispiel 3

Die "Substanz SO-4" wird an einen monoklonalen Ratten-Antikörper gegen Mäuse-T-Zellen mittels einer Disulfidbindung konjugiert. Der Antikörper erkennt das Thy-1-Antigen. Die Aktivität des entstehenden Konjugats gegenüber Mäuse-T- Zellen wird dann geprüft. Das Immunotoxin inhibiert die Einarbeitung von radioaktiven Vorstufen (Aminosäuren) in das Protein.

In einer Gewebekultur wird die Menge an Immunotoxin, die zur Inhibierung von 50% (ED₅₀) der Einarbeitung der Vorstufen in das Protein erforderlich ist (dies wird als Inhibierung der Proteinsynthese bezeichnet), gemessen. In diesen Versuchen werden RL-männliche-1-Zellen verwendet, die von einer durch Strahlung induzierten Leukämie in Balb/C-Mäusen stammen. Das Immunotoxin ist bei extrem niedrigen Mengen: 4,9×10^-11 M, aktiv. Gegenüber diesen gleichen Zellen zeigt die "Substanz SO-4", die nicht an den Antikörper konjugiert ist, eine Toxizität in einem wesentlich höheren Wert: 1,5×10^-7 M, oder sie ist ungefähr 3000mal weniger toxisch. Die Aktivität des Immunotoxins gegenüber einem Zelltyp, der auf seiner Zelloberfläche das Antigen-Thy-1 nicht trägt, welches den Antikörper erkennt, wurde bestimmt. Dieser Zelltyp ist ein humaner Melanoma-Zelltyp Colo 38. Eine ED₅₀ gegenüber diesem Zelltyp konnte nicht bestimmt werden, bedingt durch die großen Mengen, die erforderlich waren, aber er wäre höher als 10^-8 M.

Somit ist das Immunotoxin, welches aus der relativ nicht- toxischen "Substanz SO-4" hergestellt wurde, extrem spezifisch und extrem aktiv gegenüber den Zielzellen. Das Immunotoxin wurde dann untersucht, um festzustellen, ob es in vivo aktiv ist.

Mäusen wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder 20 oder 50 µg des gleichen Immunotoxins, wie es in den vorherigen Experimenten beschrieben wurde, injiziert. Ratten- Anti-Mäuse-T-Zellen-Antikörper kuppelt kovalent an die "Substanz SO-4". Nach 25 h wurde die Milz entfernt, und die Anwesenheit von T-Zellen wurde nach zwei unterschiedlichen Methoden geprüft. Bei der ersten wurden Milzzellen in eine primäre Kultur gegeben und mit entweder Lipopolysaccharid (welches spezifisch B-Zellen stimuliert) oder mit Conconavalin A (welches spezifisch T-Zellen stimuliert) stimuliert. Die Zellen wurden dann mit radioaktivem Thymidin, einer DNA-Vorstufe, inkubiert. Auf diese Art konnte die Wirkung des Immunotoxins auf T-Zellen und andere Zellen (B-Zellen) der Milz geprüft werden.

Die Kontrollmäuse, die mit PBS behandelt wurden, zeigten die Einarbeitung von 2917 cpm (Durchschnitt von Doppelversuchen). Stimulierte B-Zellen zeigten eine Einarbeitung von 33 800 cpm. Stimulierte T-Zellen in den Vergleichsmäusen zeigten eine Aufnahme von 30 101. Mit Milzzellen von Mäusen, die mit 20 µg Immunotoxin behandelt worden waren, bauten stimulierte B-Zellen 37 237 cpm ein. Stimulierte T-Zellen bauten 3461 cpm ein. Dieser Versuch zeigt eine schnelle und ausgeprägte Reduktion in der Lebensfähigkeit von T-Zellen nach der Behandlung in vivo. Die B-Zellen zeigten keine Wirkung bei dieser Behandlung, was anzeigte, daß Immunotoxin spezifisch ist.

Bei einem anderen Versuch wurden Mäuse mit entweder PBS als Vergleich oder 50 µg Immunotoxin behandelt. Nach 24 h wurde die Milz entfernt, und die T-Zellen wurden numerisch durch einen begrenzenden Verdünnungsassay (Kernan et al., Transplantation 40, 317-322, 1985) quantitativ bestimmt. In den Vergleichsmäusen waren 4500 T-Zellen pro 100 000 Zellen vorhanden. In den behandelten Milzzellen waren 16 T-Zellen vorhanden, oder es entsprach einer Verringerung von 99,6%. Somit ist das "Substanz-SO-4"-Immunotoxin extrem wirksam bei der Entfernung von T-Zellen in vivo.

Claims

1. Ein Protein mit einer einzigen Kette, welches Ribosom inaktiviert und als "Substanz SO-4" bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht von etwa 30 000, bestimmt nach dem Polyacrylamidgel-Elektrophoreseverfahren nach Laemmli, besitzt, einen isoelektrischen Punkt über 9,5 aufweist und dessen N-terminale Aminosäuresequenz entsprechend dem Einbuchstabencode: ist.

2. Verfahren zur Herstellung des Proteins, welches Ribosom inaktiviert, nämlich der "Substanz SO-4", nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) das Blattgewebe von Saponaria officinalis zerkleinert und extrahiert,
(b) aus dem Extrakt das unlösliche Material durch Zentrifugieren entfernt,
(c) den Überstand von der Zentrifugation dialysiert,
(d) das Dialysat der Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines negativ geladenen Ionenaustauschträgers unterwirft,
(e) die "Substanz SO-4" von dem Träger eluiert.

3. Ein Immunotoxin, dadurch gekennzeichnet, daß es das Ribosom inaktivierende Protein "Substanz SO-4" nach Anspruch 1, konjugiert an ein Haptomeres, welches sich an die Zelle binden kann, enthält.

4. Immunotoxin nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Haptomere ein monoklonaler Antikörper oder sein F(ab′)₂-Fragment ist.

5. Immunotoxin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein monoklonaler Antikörper, der für ein Tumorzellen-Antigen spezifisch ist, an die "Substanz SO-4" konjugiert ist.

6. Immunotoxin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das F(ab′)₂-Fragment des monoklonalen Antikörpers, das für ein Tumorzellen-Antigen spezifisch ist, an die "Substanz SO-4" konjugiert ist.

7. Immunotoxin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein monoklonaler Anti-T-Zellen-Antikörper oder sein F(ab′)₂-Fragment an die "Substanz SO-4" konjugiert ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Immunotoxins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die "Substanz SO-4" an das Haptomere konjugiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konjugation mit N-Succinimidyl- 3-(2-pyridyldithio)-propionat erfolgt.

10. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel und als aktiven Bestandteil ein Immunotoxin nach einem der Ansprüche 3 bis 7 oder eines, welches nach einem der Verfahren der Ansprüche 8 oder 9 hergestellt worden ist, enthält.