DE10035854A1

DE10035854A1 - Schlangentoxin und dessen Verwendung als Arzneimittel

Info

Publication number: DE10035854A1
Application number: DE10035854A
Authority: DE
Inventors: Christoph Methfessel; Viktor Tsetlin; Yuri Utkin
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-07-24
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2002-02-07
Also published as: AU2001276394A1; WO2002007740A2; WO2002007740A3; US20020150975A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid mit der Aminosäuresequenz DOLLAR A Leu Thr Cys Leu Asn Cys Pro Glu Met Phe Cys Gly Lys Phe Gln Ile Cys Arg Asn Gly Glu Lys Ile Cys Phe Lys Lys Leu His Gln Arg Arg Pro Leu Ser Trp Arg Tyr Ile Arg Gly Cys Ala Asp Thr Cys Pro Val Gly Lys Pro Tyr Glu Met Ile Glu Cys Cys Ser Thr Asp Lys Cys Asn Arg DOLLAR A oder davon abgeleitete Allele beziehungsweise Peptide, die wesentliche Teile des Peptids (I) enthalten, ein Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch Inhibierung des alpha7-nACh-Rezeptors therapiert werden können, wobei es sich insbesondere um die Behandlung von Krebs wie das kleinzellige Lungenkarzinom handelt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Schlangentoxin sowie davon abgeleitete Peptide oder Verbindungen, dessen Gewinnung und dessen Verwendung zur Hemmung des Wachstums von Krebszellen, und zwar speziell des kleinzelligen Lungenkarzinoms (SCLC = Small Cell Lung Carcinoma).

Nikotinerge Acetylcholinrezeptoren (nAChR) sind eine wichtige Klasse von ligandengesteuerten Ionenkanälen. Sie kommen im menschlichen Körper wie auch im Tierreich außerordentlich weit verbreitet vor und sind an vielen wichtigen Prozessen der Signalübertragung und der Zellerkennung im Organismus beteiligt (vgl. Lindstrom, Jon M., Nicotinic acetylcholine receptors, in: Ligand-Voltage- Gated Ion Channels, 153-75, Editor(s): North, R. Alan, CRC Press (1995); Bertrand D. und Changeux J.-P., Nicotinic Receptor: an allosteric protein specialized for inter cellular communication, Seminars in The Neurosciences 7, 75-90 (1995)).

Die bisher bekannten nAChR des menschlichen Organismus lassen sich auf ca. 15 eindeutig identifizierte und molekularbiologisch charakterisierte DNA-Sequenzen oder Gene zurückführen. Jedes dieser Gene kodiert für ein Protein, das durch eine Reihe von charakteristischen chemischen, biochemischen und strukturellen Merk malen als potentielle Untereinheit eines nAChR-Komplexes erkennbar ist (Lindstrom J. M., Purification and Cloning of Nicotinic Acetylcholine Receptors, p. 3-23, in: Arneric SP and Brioni JD, eds., Neuronal Nicotinic Receptors: Pharmacology and Therapeutic Opportunities, Wiley-Liss (1998)).

Ein funktioneller nAChR-Komplex in der Zellmembran einer menschlichen Körper zelle besteht aus fünf solchen nAChR-Proteinen. Diese fünf Untereinheiten eines solchen Rezeptorkomplexes können von verschiedenen nAChR-Genen kodiert sein, und in der Regel bestimmt die Art und Funktion einer Zelle, welche Kombinationen von nAChR Untereinheiten zur Expression funktioneller nAChR-Pentamere in ihrer Membran beitragen (Ramirez-Latorre J, Crabtree G, Turner J, Role L., Molecular Composition and Biophysical Properties of Nicotinic Receptors, p. 43-64, in: Arneric SP and Brioni JD, eds., Neuronal Nicotinic Receptors: Pharmacology and Thera peutic Opportunities, Wiley-Liss (1998)).

Es ist bekannt, dass die Untereinheiten α1, β1, γ, δ und ε vorzugsweise in den Muskelzellen vorkommen und dort für die Übertragung der Nervenerregung auf den Muskel verantwortlich sind. Dies ist die erste Unterfamilie der nAChR im mensch lichen Organismus. Die Untereinheiten α2, α3, α4, α5, und α6 sowie die Unterein heiten β2, β3 und β4 werden bevorzugt in Nervenzellen und neuroendocrinen Zellen exprimiert, wo sie in unterschiedlichen Zusammensetzungen funktionelle nAChR- Komplexe bilden und wichtige, im Einzelnen noch nicht vollständig aufgeklärte Funktionen bei der zellulären Signalübertragung haben. Diese "neuronalen" nAChR bilden die zweite Familie nikotinerger Rezeptoren im Organismus. Schließlich gibt es die Untereinheiten α7 und α9, die im Gegensatz zu allen anderen nAChR-Unter einheiten bereits allein, also als homopentamere Proteinkomplexe, funktionelle nAChR-Kanäle bilden können, wobei aber nicht ausgeschlossen ist, dass die α7- oder α9-Untereinheiten auch gemeinsam mit anderen Untereinheiten aus der ersten oder zweiten Familie funktionelle nAChR bilden können (Peng X, Katz M, Gerzanich V, Anand R, Lindstrom J., Human α7 acetylcholine receptor: cloning of the α7 subunit from the SH-SY5Y cell line and determination of pharmacological properties of native receptors and functional α7 homomers expressed in Xenopus oocytes, Molecular Pharmacology 45, 546-554 (1994); Alkondon M, Albuquerque EX, Diversity of Nicotinic Acetylcholine Receptors in Rat Hippocampal Neurons, I. Pharmacological and functional evidence for distinct structural subtypes., J. Pharmacol. Expt. Ther. 265, 1455-1473 (1993); Bertrand D, Bertrand S, Ballivet M, Pharmacological properties of the homomeric alpha-7 receptor, Neurosci. Lett. 146, 87-90 (1992); Castro NG, Albuquerque EX, Alpha-bungarotoxin sensitive hippocampal nicotinic receptor channel has a high calcium permeability, Biophysical Journal 68, 516-524 (1995), Zhang ZW, Vijayaraghavan S, Berg DK, Neuronal acetylcholine recepotrs that bind alpha-Bungarotoxin with high affinity function as ligand-gated ion channels, Neuron 12, 167-177 (1994)).

Funktionelle nAChR Komplexe, die mindestens eine α7-Untereinheit enthalten, werden hierin als "α7-nAChR" bezeichnet. Sie sind im Zentralen Nervensystem (ZNS) sehr weit verbreitet, aber kommen auch in anderen Geweben und Zellen vor, zum Beispiel auch in Epithel-, Haut-, oder sekretorischen Zellen und besonders in neuroendocrinen Zellen, unter anderem auch in der Lunge.

Gegenüber den anderen Arten von nAChR zeichnen sich α7-nAChR durch eine Reihe von besonderen Eigenschaften aus. Sie lassen sich nicht nur vom natürlichen Botenstoff Acetylcholin, sondern auch von dessen natürlichem Abbauprodukt Cholin aktivieren (Albuquerque EX, Pereira EFR, Braga MFM, Alkondon M, Contribution of nicotinic receptors to the function of synapses in the central nervous system: The action of choline as a selective agonist of 7 receptors, J. Physiology (Paris) 92, 309-316 (1998)). Sie lassen bei ihrer Aktivierung nicht nur vorrangig Natrium, sondern auch zweiwertiges Calcium durch die Zellmembran fließen, wobei bekannt ist, dass in solcher Weise eindringendes Calcium eine ganze Reihe von biochemischen, regulatorischen und wachstumsfördernden Effekten in Zellen auszulösen vermag. Auch lassen sich α7-nAChR durch bestimmte Schlangentoxine, Schneckentoxine oder Pflanzengifte blockieren oder inaktivieren, die auf andere neuronale nAChR keine oder nur geringe Wirkung haben (Bertrand D, Bertrand S, Ballivet M, Pharmacological properties of the homomeric alpha-7 receptor, Neurosci. Lett. 146, 87-90 (1992); Castro NG, Albuquerque EX, Alpha-bungarotoxin sensitive hippocampal nicotinic receptor channel has a high calcium permeability, Biophysical Journal 68, 516-524 (1995)).

Es ist bekannt, dass die Giftseren von verschiedenen Schlangen peptidische Toxine enthalten, die nAChR biochemisch erkennen und binden sowie funktionell blockieren und inaktivieren können (sog. alpha-Toxine). Zu den Schlangentoxinen, die bekanntermaßen den α7-nAChR blockieren können, gehören zum Beispiel das alpha-Bungarotoxin (αBgTx) aus Bungarus multicinctus oder das alpha-Cobratoxin (αCbTx) aus Naja kaouthia (früher Naja siamensis) (Hucho, F, Peptide Toxins acting on the Nicotinic Acetylcholine Receptor. Chap. 16, p. 577-610 in: Handbook of Experimantal Pharmacology (1992), Loring, RH, The molecular basis of curaremimetic snake neurotoxin specificity for neuronal nicotinic receptor subtypes, J. Toxicology - Toxin Reviews 12 (2), p. 105-153 (1993)). Ein wichtiges Merkmal der Proteinstruktur solcher alpha-Toxine ist die Ausbildung von drei Schleifen oder Fingern, wonach diese Toxine auch als "three finger toxins" bezeichnet werden (Menez, A, Functional architectures of animal toxins: a clue to drug design?, Toxicon 36 (11), 1557-1572 (1998); Tsetlin V., Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger' proteins, Eur. J. Biochem. 264 (2), 281-286 (1999)). Entsprechend den Merkmalen ihrer Sequenzen und der Anzahl disulfidischer Verknüpfungen werden diese Toxine weiter in "short sequence" und "long sequence" Toxine unterschieden (Tsetlin V., Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger' proteins, Eur. J. Biochem. 264 (2), 281-286 (1999)).

Hervorzuheben ist, dass die bereits genannten Toxine neben dem α7-nAChR vorrangig auch die nAChR der Muskulatur angreifen und blockieren, so dass diese Toxine zu einer starken und langanhaltenden Lähmung der Muskulatur führen, und mithin für eine therapeutische Anwendung völlig ungeeignet sind.

Es ist bekannt, dass die Schlangentoxine neben diesen nAChR aktiven alpha-Toxinen eine Vielzahl weiterer, mehr oder weniger toxischer Komponenten enthalten, die ganz unterschiedliche Wirkungen im Organismus hervorrufen können. Für viele dieser Komponenten sind das biologische Target und die Wirkung auf den tierischen Organismus noch nicht oder nur unvollständig bekannt.

Eine solche Komponente, die in der Literatur schon in den 70er Jahren beschrieben wurde, aber über die sonst bisher nur wenig bekannt war und die insbesondere noch nicht in reiner Form isoliert worden ist, sind die als "weak toxin" bezeichneten Peptidfraktionen aus dem Gift von Naja melanoleuca. Sie zeigten im Tierversuch an Mäusen oder Ratten keine auffallende toxische Wirkung. Deshalb war bisher völlig unklar, welche biologischen Funktionen ein solches Weak Toxin haben könnte (Carlsson FHH, Snake venom toxins, The primary structure of protein S4C11, A neurotoxin homologue from the venom of forest cobra (Naja melanoleuca), Biochim. Biophys. Acta 400, 310-321 (1975); Joubert FJ, Taljaard N, Snake venoms, The amino acid sequences of two Melanoleuca-type toxins, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 361, 425-436 (1980), Shafqat J., Siddiqi A. R., Zaidi Z. H., Joernvall H., Extensive multiplicity of the miscellaneous type of neurotoxins from the venom of the cobra Naja naja naja and structural characterization of major components, FEBS Lett. 284, 70-72 (1991)).

Das kleinzellige Lungenkarzinom SCLC ist eine der bösartigsten Krebserkrankungen und ist für etwa 25% der Todesfälle durch Lungenkrebs verantwortlich. Es gilt als unheilbar. Deshalb sind neue Methoden oder Wirkstoffe, die das Wachstum dieser Zellen hemmen könnten, von großer Bedeutung.

Es existieren zahlreiche Stämme kultivierter SCLC-Zellinien, die aus SCLC Tumoren isoliert worden sind. An diesen Zellen kann man die biochemischen Vor gänge untersuchen, die das Wachstum und die Proliferation dieser Zellen beein flussen und eventuell auch Wirkstoffe erproben, die das Zellwachstum unterbinden und damit als Therapeutika zur Behandlung von SCLC-Tumoren geeignet sein könnten.

Es ist bekannt, dass die Proliferation von SCLC-Zellen durch die Aktivierung von nAChR gefördert wird (Maneckjee R, Minna JD, Opioid and nicotine receptors affect growth regulation of human lung cancer cell lines, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3294-3298 (1990); Cattaneo MG, Codignola A, Vincentini LM, Clementi F, Sher E, Nicotine stimulates a serotonergic autocrine loop in human small cell lung carcinoma, Cancer Res. 53, 5566-5568 (1993); Codignola A, Tarroni P, Cattaneo MG, Vincentini LM, Clementi F, Sher E, Serotonin release and cell proliferation are under the control of alpha-bungarotoxin sensitive nicotinic receptors in small cell lung carcinoma cell lines, FEBS Letters 342, 286-290 (1994)) und dass bestimmte Stoffe im Tabakrauch wie Nikotin oder das Nitrosamin NNK auf diesem Wege das Wachstum und die Proliferation von SCLC-Zellen beschleunigen (Schuller, H, Nitrosamine-induced Lung Carcinogenesis and Ca2+/Calmodulin Antagonists, Cancer Res. Suppl. 52, 2723s-2726s (1992); Schuller HM, Orloff M; Tobacco specific carcinogenic nitrosamines; Biochem. Pharmacol. 55, 1377-1384 (1998)). Auch ist bekannt, dass α7-nAChR in den malignen kleinzelligen Lungenkrebszellen (SCLC) vorkommen (Tarroni P, Rubboli F, Chini B, Zwart R, Oortgiesen M, Sher E, Clementi F, Neuronal-type nicotinic receptors in human neuroblastoma and small cell lung carcinoma cell lines, FEBS Letters 312, 66-70 (1992); Sciamanna MA, Griesmann GE, Williams CL, Lennon VA, Nicotinic Acetylcholine Receptors of Muscle and Neuronal alpha-7 Types Coexpressed in a Small Cell Lung Carcinoma, J. Neurochemistry 69, 3202-3211 (1997)), so dass Blocker dieser speziellen nAChR- Unterart für die Erkennung oder Therapie von SCLC Erkrankungen besonders interessant sein sollten.

Wie bereits oben dargelegt wurde, lassen sich α7-nAChR aber auch durch endogen verfügbare Stoffe wie Acetylcholin sowie Cholin aktivieren, so dass die prolifera tionsfördernde Wirkung der Aktivierung von α7-nAChR in den SCLC-Zellen nicht notwendigerweise auf die Zufuhr exogener α7-nAChR Agonisten wie Nikotin oder NNK angewiesen ist.

Es ist bereits gezeigt worden, dass die Blockade der α7-nAChR mit einem geeig neten Wirkstoff die Proliferation der SCLC-Zellen hemmen oder unterbinden kann, zumindest soweit diese Proliferation durch die Aktivierung der α7-nAChR befördert wird. Insbesondere ist beschrieben, dass die Proliferation von SCLC-Zellen in vitro durch Schlagentoxine wie besiepielsweise α-Bungarotoxin, α-Cobratoxin oder Conotoxin-ImI gehemmt wird (Codignola A, Tarroni P, Cattaneo MG, Vincentini LM, Clementi F, Sher E, Serotonin release and cell proliferation are under the control of alpha-bungarotoxin sensitive nicotinic receptors in small ell lung carcinoma cell lines, FEBS Letters 342, 286-290 (1994); Codignola A, McIntosh JM, Cattaneo MG, Vicentini LM, Clementi F, Sher E, Alpha-conotoxin Imperialis I inhibits nicotine evoked hormone release and cell proliferation in human neuroendocrine carcinoma cells, Neurosci. Lett. 206, 53-56 (1996)).

Zusätzlich ist beschrieben worden, dass bei SCLC Zellen von bestimmten Wirk stoffen wie Morphin der Vorgang der Apoptose ausgelöst werden kann, der zu einem Absterben der Zellen führt. Diese Wirkung kann mit Agonisten des Nikotinrezeptors unterbunden werden und mit Antagonisten des Nikotinrezeptors, wie z. B. den bereits genannten Schlangentoxinen, kann diese Unterdrückung der Apoptose wieder rück gängig gemacht werden.

Dies lässt es denkbar erscheinen, dass Blocker von Nikotinrezeptoren geeignet sind, um das Wachstum und die Vermehrung von SCLC-Zellen zu kontrollieren oder sogar - ggf. in Kombination mit anderen Wirkstoffen - zu einem Absterben dieser Zellen zu führen. Bedauerlicherweise sind die bisher beschriebenen Schlangentoxine, die eine hemmende Wirkung auf den α7-nAChR ausüben können, für eine solche Therapie ungeeignet, insbesondere weil diese Toxine mit noch höherer Potenz die nAChR des Muskels blockieren und somit zu schweren, sogar lebensbedrohlichen Lähmungen führen.

Es ist auch wie bereits erwähnt ein Schneckentoxin, Conotoxin Im-I, bekannt, das ein potenter und selektiver Blocker des α7-nAChR ist. Dieses Toxin zeichnet sich jedoch dadurch aus, dass seine Bindung an den α7-nAChR rasch reversibel ist, so dass zu einer dauerhaften Blockade des α7-nAChR eine ständige Präsenz des Wirkstoffs erforderlich wäre.

Es war daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die praktisch irreversibel an α7-nAChR binden, jedoch nicht die erheblichen Nebenwirkungen wie beispielsweise die Hemmung von nAChR im Muskel unter Verursachung schwerer Lähmungen aufweisen, und somit zur Behandlung von Krebs, insbesondere des Small cell lung cancer (SCLC) geeignet sind.

Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Peptid mit der Amino säuresequenz

oder davon abgeleitete Allele beziehungsweise durch Verbindungen, die wesentliche Teile des Peptids (I) enthalten und die vorstehende Wirkung aufweisen, gelöst. Dieses Peptid (I) ist Bestandteil des weak toxins aus dem Gift von Naja kaouthia. Es ist eine neue chemische Verbindung, denn es enthält im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen ähnlichen Peptiden einen Tryptophan-Rest W36, der in anderen gleichartigen Peptiden nicht vorkommt.

Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Peptide potente und praktisch irreversible Blocker des α7-nAChR sind. Wendet man zum Beispiel das Peptid (I) in relativ niedriger Konzentration von 10 µM auf α7-nAChR der Ratte an, die in einem heterologen Expressionssystem (der Xenopus Oocyte, s. Literaturangabe) zur Expres sion gebracht worden sind, so wird der normalerweise durch die Gabe von 100 µM Acetylcholin in solchen Zellen ausgelöste Ionen-Einwärtsstrom fast vollständig blockiert. In einem gleichartigen Experiment kann man zeigen, dass diese Wirkung auch an humanen α7-nAChR stattfindet.

Weiter konnte gezeigt werden, dass die blockierende Wirkung des Peptids (I) auf α7- Nikotinrezeptorkanäle sehr lang anhaltend ist. Während die Blockade des Rezeptors durch andere Schlangentoxine, wie z. B. α-Bungarotoxin, nach den Auswaschen des Toxins wieder nachlässt, ist die Blockade des Peptids (I) fast irreversibel und hält nach Auswaschen des Toxins für längere Zeit an.

Somit sind die erfindungsgemäßen Peptide die ersten Peptide, die eine hohe Selektivität für α7-nAChR mit einer praktisch irreversiblen Wirkung verbinden und damit die Voraussetzungen bieten, eine gezielte Hemmung der Proliferation von SCLC-Zellen zu erreichen. Zugleich sind die erfindungsgemäßen Peptide gut ver träglich und löst keine größeren Nebenwirkungen aus. Damit sind die erfindungsge mäßen Peptide potente, aber physiologisch gut verträgliche Hemmer der Funktion von α7-nAChR.

Die erfindungsgemäßen Peptide können direkt zur Hemmung des Wachstums von SCLC-Zellen oder Tumoren in Patienten eingesetzt werden.

Weiterhin kann die erfindungsgemäßen Peptide auch an einen Marker gekoppelt werden, der dann nach der Bindung an die Oberfläche der SCLC-Zellen in einem zweiten Therapieschritt von einem cytotoxischen Wirkstoff, wie z. B. einem Kompelementsystem, erkannt wird, was zur gezielten Zerstörung dieser markierten Zellen führt. Als cytotoxischer Wirkstoff kann hierbei jede für die Krebstherapie beim Menschen geeignete cytotoxische Substanz eingesetzt werden.

Auch können die erfindungsgemäßen Peptide dazu verwendet werden, die Apoptose auslösende Wirkung von Morphin oder anderen Opiaten zu unterstützen und auf diesem Wege zu einer Therapie des SCLC zu gelangen. Wie vorstehend beschrieben wird diese Wirkung von Morphin oder anderen Opiaten durch Hemmer des Nikotin rezeptors wie zum Beispiel den erfindungsgemäßen Peptiden ermöglicht und/oder verstärkt.

Indem die erfindungsgemäßen Peptide die α7-nAChR auf der Oberfläche von SCLC- Zellen erkennen und binden, sind sie auch geeignet, diese Zellen zu markieren und für diagnostische Zwecke erkennbar zu machen. Dazu können die Peptide durch geeignete herkömmlich für diesen Zweck verwendete radioaktive, fluoreszente, oder andere zusätzliche chemische Gruppen derivatisiert werden, so dass Zellen, die den α7-nAChR tragen und wahrscheinlich Krebszellen sind, von anderen harmlosen Zellen differenziert werden können oder dass Krebszellen eindeutig der Erkrankung SCLC oder einer anderen Krebsart zugeordnet werden könnten.

Dazu gehört auch, die erfindungsgemäßen Peptide chemisch so zu modifizieren, dass sie leichter erkannt werden können. Als chemische Derivatisierungen, die zu diesem Zweck eingesetzt werden könnten, kommen unter anderem in Betracht: Radioaktive oder fluoreszierende Markierungen, Ferritin, anorganische Nanopartikel, magne tische oder andere Beads, Linker zu polymeren Substraten, chemische Gruppen, die Erkennungsmerkmale für Antikörper tragen, Biotin, Enzyme, DNA- oder RNA- Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch kurzkettige Peptide, die vom Peptid (I) abgeleitet sind, indem bis zu fünf einzelne Aminosäuren weggelassen, durch andere Aminosäuren ausgetauscht, oder durch kurze Sequenzen von bis zu fünf beliebigen anderen Aminosäuren ersetzt worden sind, und welche eine dem Peptid (I) ent sprechende Wechselwirkung mit dem α7-nAChR zeigen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Peptide oder Proteine mit einer längeren Aminosäurensequenz, welche als Teil ihrer Sequenz wesentliche Teile der Sequenz des Peptids (I) enthalten, und die dadurch in der Lage sind, α7-nAChR zu erkennen und an sie zu binden.

Die erfindungsgemäßen Peptide können die Zellteilung, das Wachstum, die Morpho logie, oder das physiologische Verhalten von menschlichen Zellen beeinflussen. Ins besondere können die Zellteilung, das Wachstum, die Morphologie oder das Verhalten solcher menschlicher Zellen beeinflusst werden, die in ihrer Zellmembran nikotinerge Acetylcholinrezeptoren ausprägen. Unter den nikotinerg empfindlichen Zellen bezieht sich die Erfindung ganz besonders auf die Beeinflussung von Zellen, die den α7-Subtyp des nikotinergen Rezeptors ausprägen. Dazu zählen insbesondere Nervenzellen, Neuroendocrine Zellen (wie z. B. Chromaffinzellen), endocrine Zellen der Lunge, Zellen der Haut und des Epithelialgewebes, und ganz besonders auch Krebszelten.

Ganz ausdrücklich bezieht sich die Erfindung auf die Beeinflussung von endocrinen Zellen der Lunge sowie auf Krebszellen, die zu malignen Erkrankungen des Lungen gewebes und der Atemwege führen, und dabei ganz speziell die kleinzelligen Lungentumorzellen (SCLC).

Gegenstand der Erfindung sind weiter auch pharmazeutische Darreichungsformen, welche die erfindungsgemäßen Peptide enthalten, sei es allein oder zusammen mit pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen.

Erfindungsgemäß sind insbesondere Darreichungsformen, die den Zweck haben, dass die erfindungsgemäßen Peptide gezielt an jene Stelle im Organismus gebracht werden, an der die cytostatische oder proliferationshemmende Wirkung erwünscht ist, und von anderen Bereichen des Organismus weitgehend ferngehalten wird.

Erfindungsgemäß ist insbesondere die Darreichung der erfindungsgemäßen Peptide in einer solchen pharmazeutischen Form, dass die Zubereitung vom Patienten in der Weise inhaliert werden kann, so dass die erfindungsgemäßen Verbindungen bevor zugt in die Atemwege und die Lunge gelangen. Besonders erfindungsgemäß ist darüber hinaus die Darreichung in einer solchen Form, dass die mittlere Teilchen größe der pharmazeutischen Zubereitung im Bereich von 100 nm-10 µM liegt, so dass bei der Inhalation eines Aerosols mit einer besonders tiefen und nachhaltigen Applikation der Verbindungen in die feineren Verästelungen der Lunge zu rechnen ist. Andere herkömmliche pharmazeutische Darreichungsformen wie beispielsweise eine intravenöse Verabreichung sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst.

Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch Abbildungen veranschaulicht. Es zeigen:

Fig. 1 Die Inhibierung der Bindung von [125I] α-Bgt an das GST-α7-(1-209)- Fusions-Protein durch das erfindungsgemäße weak toxin, α-Cobratoxin von naja kouthia und naja oxiana neurotoxin NT-II.

Fig. 2 Die Inhibierung der α7-nAChR von Ratten und von humanen α7-nAChR durch das erfindungsgemäße weak toxin. Die Diagramme auf der linken Seite stellen typische Ströme dar, die durch kurze ACh-Impulse (100 µM, 35) von Oozyten, welche entweder α7-Rezeptoren von Ratten (obere Spuren) oder von Menschen (untere Spuren) exprimieren, vor und nach 30-minütiger Be handlung mit 2 µM des erfindungsgemäßen weak toxins erzeugt wurden. Die Diagramme auf der rechten Seite stellen Dosis-Wirkungs-Inhibierungskurven mit dem erfindungsgemäßen weak toxin dar, die durch Auftragung der Signalströme als Funktion der Toxin-Konzentration ermittelt wurden. In unterschiedlichen (2 bis 4) Zellen gemessene Werte wurden auf den Kon trollstrom normiert, der durch 100 µM ACh ausgelöst wurde. Die Zellen wurden bei -80 mV gehalten.

Fig. 3 Die durch ein Auswaschexperiment gezeigte praktisch irreversible Blockade von Ratten-α7-Rezeptoren, die in Xenopus oocytes exprimiert wurden. Die Ströme, die bei einer 4 s Anwendung von 50 µM ACh zu Beginn, nach 20 min. Inkubation in 10 µM des erfindungsgemäßen weak toxins, and nach 20 min. und 60 min. Auswaschen gemessen wurden, zeigen eine praktisch irreversible Blockade des Rezeptors durch das erfindungsgemäße weak toxin an.

Die Erfindung wird nachstehend durch bevorzugte Ausführungsbeispiele näher er läutert, auf welches sie jedoch nicht eingeschränkt ist. Soweit nicht anders ange geben, beziehen sich nachstehend alle Mengenangaben auf Gewichtsprozente.

Beispiele 1. Isolierung des Weak Toxin

Schlangen der Gattung Naja kaouthia wurden in Gefangenschaft gehalten und durch manuelle Massage der Giftdrüse gemolken. Das Gift wurde über wasserfreiem CaCl₂ getrocknet und bei -20°C aufbewahrt.

200-300 mg Naja kaouthia-Gift wurden auf einer Sephadex G-50 sf (2.5 × 95 cm) Säule fraktioniert. Die toxische Hauptfraktion wurde auf einer HEMA BIO 1000 cm Säule (8 × 250 mm, Firma Tessek, Tschechien) in einem Ammoniumacetat- Gradienten (pH 7.5) von 20 mM bis 1 M weiter getrennt. Die das weak toxin enthaltende Fraktion wurde schließlich durch Reverse-phase HPLC auf einer Vydac C18 Säule (4.6 × 250 mm) in einem Acetonitril/Wasser-Gradienten (von 15 bis 45%) in Gegenwart von 0.1% Trifluoressigsäure gereinigt. Die Ausbeute an weak toxin beträgt etwa 1 mg.

Die Molekülmasse des Toxins wurde durch MALDI TOF unter Verwendung eines BRUKER REFLEX (BRUKER)-Mass-spektrometers bestimmt. Das Toxin hat ein Molekulargewicht von 7613 Dalton.

Die Struktur des Toxins wurde weiterhin durch Edman-Abbau von proteolytischen Fragmenten unter Verwendung eines Proteinsequenziergeräts 473A (Applied Bio systems, Foster City, Ca., USA) bestimmt. Daraus ergibt sich eindeutig die ange gebene Sequenz dieses Toxins.

2. Nachweis der Interaktion des Weak toxins mit α7-nAChR durch Ver drängung der Bindung von α-Bungarotoxin

Eine Lösung aus GST-α7-(1-209)-Fusions-Protein (17 µg/ml, pH 8.0, 0.1% CHAPS; vgl. Ariel, S., Asher, O., Barchan, D., Ovadia, M., Fuchs, S., Ann. N. Y. Acad. Sci. 841 (1998), 93-96) welches die ligandenbindende Domäne des alpha-7 Nikotin rezeptors enthält, wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen des zu prüfenden Toxins in einem Flüssigkeitsvolumen von 190 µl für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 10 µl 0.4 µM [¹²⁵I]α-Bungarotoxin (αBgt) (dargestellt gem. Klukas, O., Peshenko, I. A., Rodionov, I. L., Telyakova, O. V., Utkin, Yu. N., Tsetlin, V. I., Bioorgan. Khim. 21 (1995), 152-155) zugegeben und das Gemisch eine weitere Stunde inkubiert. Das nicht gebundene [¹²⁵I]αBgt wurde durch Schnellfiltration durch DE-81-Filter (Whatman, England) entfernt, die Filter wurden viermal mit 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8.0) mit 0.1% Triton X-100 gewaschen und mittels eines γ-Zählers (Ultragamma (LKB)) gezählt. Das Weak Toxin verdrängt α-Bgt in diesem Versuch mit einem IC₅₀-Wert von 4,3 µM, während mit α-Cobratoxin unter diesen Bedingungen ein IC₅₀-Wert von 9,1 µM erhalten wird (siehe Fig. 1).

3. Nachweis der Blockade von α7-nAChR durch das Weak Toxin mit elektro physiologischen Experimenten in Xenopus Oocyten

Es ist bekannt und Stand der Technik, die Wirkung von Agonisten oder Antagonisten eines Nikotinrezeptors mit elektrophysiologischen Methoden nachzuweisen. Die entsprechenden Methoden und Versuchsanordnungen sind in der Literatur an vielen Stellen beschrieben worden (s. z. B. Kettenmann & Grantyn, eds. 1992). Besonders einfach und zweckmässig ist es hierbei, klonierte Rezeptorgene in Xenopus Oocyten zu injizieren und so zur Expression zu bringen. An diesen Zellen können die not wendigen elektrophysiologischen Messungen dann besonders einfach und bequem durchgeführt werden. (z. B. Bertrand D, Bertrand S, Ballivet M, Pharmacological properties of the homomeric alpha-7 receptor, Neurosci. Lett. 146, 87-90 (1992), Amar M, Thomas P, Johnson C, Lunt GG, Wonnacott S, Agonist Pharmacology of the neuronal a7 nicotinic receptor expressed in Xenopus Oocytes, FEBS Lett. 327, 284-288 (1993), Cooper JC, Gutbrod O, Witzemann V, Metrifessel C, Pharmacology of the nicotinic acetylcholine receptor from fetal rat muscle expressed in Xenopus oocytes, Eur. J. Pharmacol. 309, 287-298 (1996)).

Xenopus oocytes wurden isoliert und wie bereits beschrieben bereitgestellt (Bertrand, D. et al., Methods in Neuroscience, 4 (1991), New York, Academic Press, 174-193). Am ersten Tag nach der Isolierung der Oocyten wurden jeweils 10 nl einer Lösung mit 2 ng eines entsprechenden cDNA-Expressionsvektors in die Zellkerne der Oocyten injiziert. Die Oocyten wurden 3-5 Tage in einem geeigneten Medium ge halten (BARTH-Lösung bestehend (in mM) aus NaCl 88, KCl 1, NaHCO₃ 2.4, MgSO₄ 0.82, Ca(NO₃)₂ 0.33, CaCl₂ 0.41, HEPES 10, pH 7.4). Um eine Konta mination möglichst gering zu halten, wurde das Medium vor der Verwendung bei 0.2 µm filtriert und mit Antibiotika versetzt (20 µg/ml Kanamycin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin).

Elektrophysiologische Experimente

Elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden unter Verwendung einer Dual elektroden-Spannungsklemme (GENECLAMP 500 von Axon Instruments, Forster CA) wie bereits beschrieben angefertigt [Bertrand D, Bertrand S, Ballivet M, Pharmacological properties of the homomeric alpha-7 receptor, Neurosci. Lett. 146, 87-90 (1992)]. Eine Superfusion mit OR2 Oozyten-Ringerlösung, enthaltend: 82.5 mM NaCl; 2.5 mM KCl; 2.5 mM CaCl₂; 1 mM MgCl₂; 5 mM HEPES; bei pH 7.4 (eingestellt mit NaOH) wurde für diese electrophysiologischen Experimenten verwendet. Acetylcholin (Fluka, Buchs, Schweiz) wurde als Stammlösung bei -20°C aufbewahrt und unmittelbar vor dem Experiment dem OR2 zugegeben. Weak toxin- Inkubationen wurden durch Zugabe des Toxins zum Perfusionsmedium durchgeführt. Um die Adsorption des Toxins an Plastikoberflächen zu verhindern, wurden der Lösung 20 ug/ml Rinderserumalbumin (Sigma, Fraktion V) zugegeben.

Ein Beispiel für die Blockade der α7-nAChR durch das Weak Toxin ist in Fig. 2 ge zeigt. Aus den Dosis-Wirkungs-Kurven ist erkennbar dass das Toxin am α7-nAChR der Ratte noch stärker wirkt als am humanen α7-nAChR. In Fig. 3 ist ein Beispiel dafür gezeigt, dass die Blockade der α7-nAChR durch das weak toxin fast irre versibel ist. Auch nach 60-minütigem Auswaschen des Toxins bleibt der durch ACh ausgelöste Strom weit unterhalb des Anfangswertes.

4. Nachweis der Hemmung der Proliferation von SCLC Zellen

Die Proliferation von Zellen lässt sich quantifizieren, indem die Zellen in einem Kulturmedium nach den üblichen Verfahren gezüchtet werden. Nach einer geeig neten Inkubationszeit sind die Zellen zu dissoziieren, mit einem geeigneten Farbstoff anzufärben, und direkt in einer Kammer zu zählen (Schuller, H. Cell type specific, receptor mediated modulation of growth kinetics in human lung cancer cell lines by nicotine and tobacco-related nitrosamines, Biochemical Pharmacology 38, 3439-3442, 1998). Auf diese Weise lässt sich nachweisen, dass Nikotin oder andere Agonisten der α7-nAChR das Wachstum dieser Zellen beschleunigen, während Schlangentoxine wie Alpha-Cobratoxin, alpha-Bungarotoxin oder eben auch weak toxin die Proliferation dieser Zellen verlangsamen oder unterbinden können.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Peptid mit der Aminosäuresequenz
oder davon abgeleitete Allele beziehungsweise Peptide, die wesentliche Teile des Peptids (I) enthalten.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bis zu fünf einzelne Aminosäuren weggelassen, durch andere Aminosäuren ausgetauscht, oder durch kurze Sequenzen von bis zu fünf beliebigen anderen Aminosäuren ersetzt worden sind.

3. Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend die Isolierung des Gifts von Schlangen der Gattung Naja kaouthia durch manuelle Massage der Giftdrüse, das Trocknen des Gifts über wasserfreiem CaCl₂, und die Isolierung des Peptids durch sequentielle Ionenaustausch- und Reverse-Phase-Chromatographie.

4. Peptid, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 3.

5. Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Molekular gewicht von 7613 Dalton besitzt.

6. Peptid nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, das es die Amino säure Tryptophan in seiner Primärsequenz enthält.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein Peptid gemäß Anspruch 1 oder 4.

8. Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 1 oder 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch Inhibierung des α7-nACh-Rezeptors therapiert werden können.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit Krebs ist.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das kleinzellige Lungenkarzinom (SCLC) handelt.

11. Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 1 oder 4 zur Herstellung eines Mittels zur Diagnose von Krebs,.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch, gekennzeichnet, dass es sich um die Diagnose des kleinzelligen Lungenkarzinoms (SCLC) handelt.

13. Verfahren zur Markierung von Tumorzellen in vitro, umfassend die Bindung eines Peptids gemäß Anspruch 1 oder 4 an die Zielzellen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zielzellen um Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms (SCLC) handelt.