WO2018115341A1 - D-enantiomere peptide zur therapie von chronischem und neuropathetischem schmerz - Google Patents

D-enantiomere peptide zur therapie von chronischem und neuropathetischem schmerz Download PDF

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WO2018115341A1
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Dagmar JÜRGENS
Janine Kutzsche
Gustavo Adolfo Guzman CASTRO
Patricia Hidalgo JIMENEZ
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Definitions

  • the present invention relates to a composition consisting of or containing peptides selected from the group consisting of or containing RD2, D3, homologs having at least 50% identity and derivatives of RD2 or D3 and polymers containing or consisting of RD2-D3 homologs having at least 50% identity and derivatives of RD2 and D3 for use as analgesics, for use in analgesic therapy, for use in the treatment of chronic and / or neuropathic pain, and / or for inhibiting N-type neuronal calcium channels (NCC).
  • the invention further relates to a method for reducing the release of neurotransmitters compared to a control and to a method for inhibiting an N-type NCC using the composition as defined above.
  • Figures from the Deutscheratetician show that more than 12 million people in Germany are affected by long-lasting, chronic pain and / or neuropathic pain. Neuropathic pain develops after damage or disease of afferent systems in the peripheral or central nervous system.
  • Drug therapy is possible with a 50-80% pain reduction, one
  • antidepressants tri- / tetracyclic antidepressants, selective serotonin / norepinephrine reuptake inhibitors
  • long-acting opioids eg carbamazepine
  • anticonvulsants with effect on neuronal sodium channels eg carbamazepine
  • topical therapeutics lidocaine patches, capsaicin high-dose patches
  • pharmacological therapies that have an effect on neuronal calcium channels, such as gabapentin, pregabalin and ziconotide (Prialt®).
  • gabapentin and pregabalin-specific P / Q-type calcium channel inhibitors and ziconotide are the only approved specific N-type calcium channel inhibitor.
  • Ziconotide is a cyclic peptide of 25 amino acids and was originally derived from the venom of the
  • Ziconotide is used in people who suffer from extreme pain and for whom all other treatment options are unsuccessful. Prialt® approval is based on the results of three Phase III clinical trials involving more than 1,200 patients. In all studies, ziconotide was able to reduce pain well compared to placebo, including severe treatment-resistant chronic pain as a result of Cancer or AIDS. Among other things, the additional amount of opioids required was reduced by the additional intrathecal use of ziconotide. Ziconotide causes less adverse effects compared to morphine.
  • ziconotide causes severe central nervous effects such as dizziness, nausea, nystagmus, confusion, gait, memory, blurred vision, headache, asthenia, vomiting and somnolence in 88% of patients.
  • Ziconotide is used for pain therapy as it is the only approved specific N-type
  • Calcium channel inhibitor which, even with very severe pain, e.g. caused by
  • compositions are to be provided which have fewer side effects and accordingly inhibit N-type NCC specifically and selectively and have no influence on the function of L-type NCC.
  • the compositions to be provided should be administrable in a simple manner, preferably by oral administration.
  • inhibition of N-type NCC channels should be reversible to avoid permanent pain insensitivity and damage.
  • Concentration changes of a drug have great effects. This can easily lead to under- or overdoses, which may each be dependent on the specific metabolism and can lead to unwanted side effects or long-term damage.
  • Another object was to provide a composition containing active ingredients that ensure passage of the blood-brain barrier.
  • Another object was to provide stable, by the way of the enteral, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intrarhinal and / or oral application of compositions that unfold their effect at the target site, the N-type NCC.
  • This object is achieved in one embodiment by a composition consisting of or containing peptides selected from the group consisting of or containing RD2, D3, homologs having at least 50% identity and derivatives of RD2 or D3 and polymers containing or consisting of RD2, D3, homologs with at least 50% identity and derivatives of RD2 and D3 for use as analgesics.
  • Another object of the present invention is a composition consisting of or containing peptides selected from the group consisting of or containing RD2, D3, homologues having at least 50% identity and derivatives of RD2 or D3 and polymers containing or consisting of RD2, D3, homologues with at least 50% identity and derivatives of RD2 and D3 for use in pain therapy.
  • the invention further provides a composition consisting of or containing peptides selected from the group consisting of or containing RD2, D3, homologs having at least 50% identity and derivatives of RD2 or D3 and polymers containing or consisting of RD2, D3, homologues having at least 50 % identity and derivatives of RD2 and D3 for use in the treatment of chronic and / or neuropathic pain.
  • Another object of the invention is a composition consisting of or containing peptides selected from the group consisting of or containing RD2, D3, homologues having at least 50% identity and derivatives of RD2 or D3 and polymers containing or consisting of RD2, D3, homologues with at least 50% identity and derivatives of RD2 and D3 for inhibiting N-type neuronal calcium channels (NCC).
  • NCC N-type neuronal calcium channels
  • the peptide consists essentially of D-amino acids.
  • the term "essentially of D-amino acids” means that the peptides to be used according to the invention are at least 50%, 60%, preferably 75%, 80, 81, 82, 83, 84%, particularly preferably 85, 86, 87, 88, 89%, 90, 91, 92, 93, 94, 95%, in particular 96%, 97%, 98%, 99%, 100% contain or consist of D-amino acids.
  • D-peptides in vivo are much more resistant to proteases, offering the potential for oral administration with long elimination half-lives. Furthermore, they are usually not or only slightly immunogenic.
  • Another embodiment relates to the composition described above for use in an application of 1 microgram to 1 gram per kilo of body weight, preferably 100 micrograms to 10 mg / kg of body weight, more preferably from 0.5 to 5 mg / kg of body weight.
  • One embodiment relates to the above-described composition for enteral,
  • the composition described above exhibits an IC 50 value of 1 nanomolar to 1 millimolar for N-type NCC, preferably from 10 nM to 100 ⁇ , particularly preferably from 100 nM to 10 ⁇ , in particular from 100 nM to 1 ⁇ .
  • composition to be used according to the invention contains in a variant or consists of peptides selected from the group consisting of or comprising
  • ANK2 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rkrirl06yhinr (SEQ ID NO: 9);
  • ANK3 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rkrirl06yhwnr (SEQ ID NO: 10);
  • ANK4 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rkrirlvyhwnr (SEQ ID NO: 11);
  • ANK6 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rkrirlvtkkkr (SEQ ID NO: 13);
  • ANK7 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rkrvr102thikr (SEQ ID NO: 14);
  • ANK15 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rprvrl06yhwnr (SEQ ID NO: 15);
  • ANK16 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rkr07rlvtkrnr (SEQ ID NO: 16);
  • ANK18 (free N-terminus, preferably amidated C-terminus): rpr07rlhtkkkr (SEQ ID NO: 18); with 02: 4-fluoro-phenylalanine (D) 06: phenylglycine (D) 07: D-homoarginine.
  • the derivatives of the peptides to be used according to the invention and described above are cyclized or amidated peptides.
  • the peptides to be used according to the invention are covalently linked to the free N-terminus at the free C-terminus and are then cyclized accordingly. Also by the ring closure is advantageously effected that the carboxyl group is no longer present at the free C-terminus.
  • the peptides advantageously have an amino acid sequence in which the cyclization of the linear molecule z. B. by a covalent bond of the first with the last amino acid, z. B. over a Condensation reaction, is done.
  • z. B. by other amino acids are linked together.
  • the linkage of the second amino acid with the last amino acid may be mentioned.
  • ptihthnrrrrr (SEQ ID NO: 1) represents tlhthnrrrrrp with the cyclized peptides of the sequence Ihthnrrrrrpt, hthnrrrrrptl, thnrrrrrptlh, hnrrrrrptlht, nrrrrrptlhth, rrrrrptlhthn, rrrptlhthnr, rrptlhthnrr, rrptlhthnrr, rptlhthnrrr, rptlhthnrrr, rptlhthnrrr, rptlhthnrrr, rptlhthnrrrr and the label "CRD2
  • the production of cyclized peptides is state of the art, and can be carried out, for example, by the
  • cyclization across the first and last amino acid of the peptide causes no "open" ends of the peptide chain to exist which are often targets for peptide degrading activities in cells, animals or humans, for example, by aminopeptidases and carboxypeptidases.
  • the peptides to be used according to the invention are amidated in a further embodiment of the invention at the free C-terminus, and therefore an acid amide group is present instead of the carboxyl group.
  • an acid amide group is present instead of the carboxyl group.
  • carboxyl group (-COOH group) is thus a
  • the peptide is therefore particularly advantageously amidated at the free C-terminus.
  • the further object is achieved with particular advantage that a peptide without negative charge excess is present, which can bind affine to the target molecule and is obtainable in a simple manner.
  • the peptides to be used according to the invention are each extended by one or two amino acids at the N-terminus and / or C-terminus or shortened compared to the original sequence.
  • One alternative has one terminus of one or two additional amino acids, while the other term has one or two
  • the peptides are preferably extended from the original sequence at the C-terminus by an amino acid selected from the group of the amino acids rlht, preferably r.
  • Preferred derivatives are cyclized (cyclic) peptides, amidated peptides and / or peptide sequence extended by one amino acid, preferably Aginin r at the C-terminus, in particular D3r rprtrlhthrnrr (SEQ ID NO: 5), and cyclized D3r.
  • Further preferred derivatives are cyclized RD2 and the respective linear amidated forms and / or peptide sequence RD2r ptlhthnrrrrrrrr (SEQ ID NO: 19) extended by one amino acid, preferably Aginin r at the C terminus.
  • the subject of the present invention is therefore also the peptide RD2r ptlhthnrrrrrrr (SEQ ID NO: 19); a 13-mer based on RD2 which is extended at the C-terminus by one amino acid, preferably r.
  • the subject of the invention is also the amidated and / or cyclized form cRD2r (analogous to cRD2).
  • Another object is the peptide RD2r as well as the amidated and / or cyclized form, preferably cRD2r for use in medicine, or as a medicament, preferably for use in the treatment of
  • peptides to be used according to the invention are:
  • identity in the present description, the terms "homologous" or
  • Nucleic acid sequence / polypeptide sequence defined over the respective entire sequence length, as determined by comparison with the aid of the program GAP based on the algorithm of
  • Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443-153) is calculated by setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acid gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • Two amino acid sequences are identical for the purposes of the present invention if they have the same amino acid sequence.
  • the homology or identity is determined by the respective total length of the corresponding peptides.
  • the comparison, and thus the determination of the identity or homology takes place only over subareas.
  • polypeptides to be used according to the invention have a homology of at least 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.
  • composition contains or consists of
  • the polymer to be used according to the invention contains 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more of the monomer peptides described above.
  • dimers selected from the group consisting of or containing RD2D3, D3RD2, D3D3 and RD2RD2 or homologs or derivatives thereof.
  • Polymers can be prepared, for example, via chemical synthesis or peptide synthesis.
  • the peptides can be linearly linked to one another, in particular as described above.
  • the peptides are branched together to form the polymer according to the invention.
  • a branched polymer may according to the invention be a dendrimer in which the monomers are covalently or non-covalently linked to one another.
  • the peptides may also be linked to a platform molecule (such as PEG or sugar) to form a branched polymer.
  • the monomer peptides are coupled head to head, tail to tail, or head to tail, with or without additional linkers, and in one alternative by total covalent linkage, with or without additional linkers (eg, one or more amino acids), the two remaining ends cycled.
  • the peptides to be used according to the invention are covalently linked to further amino acids, linkers, spacers and / or functional groups.
  • these other amino acids, linkers, spacers and / or functional groups do not alter the properties of the peptide.
  • the further amino acids, linkers, spacers and / or functional groups cause a change in the properties of the peptide.
  • the selectivity and / or affinity of the polymers of the invention with respect to the N-type NCC is enhanced.
  • a linker is to be understood as meaning one or more molecules that are covalent
  • Binders are bound to the peptides, which linkers may also be linked to each other by covalent bonds.
  • functional groups molecules which are covalently bound to the peptides.
  • the functional groups contain biotin groups. This allows strong covalent attachment to streptavidin.
  • the peptides contain so-called spacers.
  • a spacer is understood to mean a molecule which is bound to the peptide via covalent bonds and possesses certain physical and / or chemical properties by which the properties of the peptide are changed.
  • hydrophilic or hydrophobic, preferably hydrophilic, spacers are used.
  • Hydrophilic spacers are selected from the group of molecules formed from polyethylene glycol, sugar, glycerol, poly-L-lysine or beta-alanine. The peptides are linked in one alternative with another substance.
  • these substances are drugs or active ingredients, defined in accordance with the Medicinal Products Act ⁇ 2 respectively. ⁇ 4 (19), as of September 2012.
  • active substances are therapeutically active substances which are used as medicinally active substances.
  • the substances are carriers for the controlled reaction
  • Drug release also called drug carrier systems
  • drug carrier systems drugs that transport the active substances specifically to the vicinity of specific organs or cells and release them in a controlled manner.
  • the substances are substances that enhance the action of the peptides.
  • such compounds are aminopyrazole and / or aminopyrazole derivatives.
  • Aminopyrazole derivatives according to the invention is 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid or 3-nitropyrazole-5-carboxylic acid and all derivatives in which the heterocyclic CH group has been replaced by -CR- or -N- or -O- or -S- , as well as any derived peptidic dimers, trimers or tetramers
  • Aminopyrazole trimer Another alternative is compounds which improve the solubility of the peptides and / or the passage of the blood-brain barrier.
  • the substance is linked to the peptide, where the linkage is a covalent bond or the linkage is not a covalent bond.
  • the link is over here
  • Hydrogen bridge hydrophilic, hydrophobic, electrostatic interaction or binding and / or steric immobilization.
  • Another object of the present invention is a method for reducing the release of neurotransmitters compared to a control characterized in that a composition consisting of or containing peptides selected from the group consisting of or containing RD2, D3, homologues having at least 50% identity and derivatives of RD2 or D3 and polymers containing or consisting of RD2, D3,
  • Homologs with at least 50% identity and derivatives of RD2 and under D3 for use as analgesics with the N-type NCC is brought into contact.
  • the calcium influx through an NCC is reduced as compared to a control by the method of the invention.
  • the subject of the invention is also a method for inhibiting an N-type NCC in comparison to a control characterized in that it comprises a composition consisting of or containing peptides selected from the group consisting of or containing RD2, D3, homologs with at least 50% Identity and derivatives of RD2 or D3 and polymers containing RD2, D3, homologues with at least 50% identity and
  • contacting means that there are conditions which allow interaction between the peptides to be used according to the invention and the N-type NCC, in particular physical and / or chemical interactions, such as the formation of coordinative bonds or hydrogen bonds.
  • Selecting a control is a routine part of an experimental approach.
  • an organism is used which is identical to the organism to be examined in an alternative.
  • the organism to be examined is treated as in the composition according to the invention or brought into contact in the broadest sense, while the control is not subjected to this method.
  • organism also includes parts of organisms, tissues, tissue samples, individual cells or cell cultures, parts of cells such as membrane-containing NCC channels, preferably of the N-type or L-type, or artificial membranes such.
  • B double lipid membrane containing neuronal calcium channels, preferably of the N-type and / or L-type. Both the control and the organism to be examined are selected from the list above.
  • the control is defined according to the specifications of the clinical trials.
  • inhibition means the reduction of the activity of neuronal calcium channels, preferably of the N-type, with respect to a control by the composition to be used according to the invention.
  • the control according to the invention is not brought into contact with this composition.
  • the control may be contacted with known inhibitors.
  • inhibition is determined at a concentration equal to or equal to the IC50 value.
  • compositions to be used according to the invention inhibit N-type NCC at least 10%, 15%, 20%, 25%, preferably 30%, particularly preferably 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, in particular 90% or 100%.
  • the inhibition according to the invention by means of the so-called patch Clamp technique determined.
  • the ion current through the calcium channel is measured at different voltages.
  • the inhibition of the neuronal calcium channel is thus determined by the reduction of the ion current.
  • a reduction of the ionic current by at least 10%, 15%, 20%, 25%, preferably 30%, 35%, more preferably 40, 42, 44, 46, 48, 50%, 52, 54, 56, 58, 60%, 70%, 80%, especially 90% or 100%.
  • the reduction is determined at a concentration of peptides equal to the IC 50 value.
  • the patch clamp measurement is determined by contacting the corresponding channel with a composition of concentration 150 nM to be used according to the invention.
  • the methods according to the invention are characterized in that the function of L-type NCC is not changed with respect to a control. In other words, the calcium influx through the L-type NCC is not changed from a control.
  • the peptides to be used according to the invention act specifically and / or selectively on N-type NCC.
  • the present invention also provides the use of the peptides to be used according to the invention as a replacement for conotoxin.
  • contacting the NCC or membrane containing NCC or the corresponding sources containing NCC can be performed in vitro (ex vivo).
  • the invention also relates to the treatment of chronic and / or neuropathic pain, ie a treatment for pain relief, in which the individual to be treated by enteral, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intrarhinal or oral administration, preferably oral administration, the peptides according to the invention to be used in a Concentration of 1 micrograms to 1 g / kg body weight.
  • the invention also relates to a process in which the peptides to be used according to the invention are incorporated into pharmaceutical formulations by means of customary processes known to the person skilled in the art.
  • the invention also relates to the use of the above-described peptides in pharmaceutical formulations.
  • a pharmaceutical formulation comprising the peptides to be used according to the invention and described above is therefore likewise an object of the present invention.
  • the present invention further relates to the use of a composition of claim 1 for the preparation of a painkiller, a medicament for use in pain therapy and / or a medicament for the treatment of chronic and neuropathic pain.
  • Another object of the invention is the use of a composition according to claim 1 for inhibiting N-type neuronal calcium channels NCC.
  • the coding regions of the two different alpha-pore-forming units (CaValphal) of the voltage-gated calcium channel were fused in frame (C-terminal fusion) to the fluorescent proteins as follows: the rabbit CaV1.2 unit
  • CaVbeta2e (UniProtKB: Q8VGC3-2) was coupled to mRFP (CaVbeta2e-mRFP) and CaVbeta4 (UniProtKB: O00305.2) to mCherry (CaVbeta4-mCherry).
  • tsA201 cells were transiently transfected with either CaV1.2-YFP and CaVbeta2e-mRFP or CaV2.2-GFP and CaVbeta4-mCherry. Transfection was by Lipofectamine 2000TM (Invitrogen) and the successfully transfected cells were identified by fluorescence signal. Electrophysiological recordings were made 24-48 hours after transfection.
  • Ion currents were measured by Whole Cell Patch-Clamp technique with an EPC-10 amplifier with implemented PatchMaster software (HEKA, Electronics). Barium was used as a carrier. Borosilicate glass pipettes with resistances of 0.9-2 ⁇ were connected to a Sutter P 1000 puller (Harvard Apparatus) used and heat-smoothed by means of Narishige MF-830 microforge superficially on the top.
  • the external measurement solution was 140 mM TEA-MeSO.sub.3, 10 mM BaCl.sub.2, 10 mM HEPES (pH 7.3) and, as the inner measurement solution, 135 mM Cs-MeSO.sub.3, 10 mM EGTA, 5 mM CsCl.sub.2, 1 mM MgCl.sub.2, 4 mM MgATP, 0.4 mM Na2GTP and 10 mM HEPES (pH 7.3).
  • the data analysis was done using a
  • RD2 In order to investigate the pharmacological effect of RD2, cells were detached and transferred to a perfusion flow which either contained the test substance or not. The observations were performed under constant perfusion to ensure a constant concentration of the test substance.
  • RD2 was in DMSO with a
  • CaV2.2 is located in the pre-synaptic nerve terminals and mediate the
  • CaV1 .2 the L-type calcium channel is predominantly expressed in the heart and responsible for coupling the electrical activation of cardiomyocytes with myofilament contraction.
  • the ion currents were recorded by CaV1.2 and CaVbeta2e co-expressing cells and remained nearly unchanged after exposure to 150 nM RD2 (Figure 2A: Representative uptake of current mediated by a CaV1.2 channel elicited during a 40 ms pulse , starting from a holding potential of -90 mV to + 10 mV before and after contact with a composition containing 150mM RD2
  • Fig. 2B no change in current on perfusion with 150 nM RD2).
  • RD2 was tested at a concentration of 150 nM for its ability to block ion currents mediated via the CaV2.2 and CaV1.2 channels. Assays were performed in CaV2.2 and CaV1 .2 channel expressing tsA201 cells using the whole-cell patch clamp technique. RD2 blocks the CaV2.2 channel while the CaV1.2 channel is insensitive to RD2 at the concentration tested ( Figure 3).
  • the coding region of the human alpha pore-forming units (CaValphal) of the voltage-gated calcium channel CaV2.2 (UniProtKB: Q00975-1) was fused with GFP to CaV2.2-GFP.
  • the beta subunit CaVbeta4 (UniProtKB: O00305.2) was fused to mCherry to form CaVbeta4 mCherry.
  • tsA201 cells were transiently co-transfected with CaV2.2-GFP and CaVbeta4-mCherry. Transfection was by Lipofectamine 2000TM (Invitrogen) and the successfully transfected cells were identified by fluorescence signal. Electrophysiological recordings were made 24-48 hours after transfection.
  • Ion currents were measured by Whole Cell Patch-Clamp technique with an EPC-10 amplifier with implemented PatchMaster software (HEKA, Electronics). Barium was used as a carrier. Borosilicate glass pipettes with resistors of 0.9-2 ⁇ were attached to a Sutter P-1000 puller (Harvard Apparatus) and heat-finished with Narishige MF-830 microforge superficially on the tip.
  • the external measurement solution was 140 mM TEA-MeSO.sub.3, 10 mM BaCl.sub.2, 10 mM HEPES (pH 7.3) and, as internal measurement solution, 135 mM Cs-MeSO.sub.3, 10 mM EGTA, 5 mM CsCl.sub.2, 1 mM MgCl.sub.2, 4 mM MgATP, 0.4 mM Na.sub.2 GTP and 10 mM HEPES (pH 7.3).
  • the data analysis was done using a
  • D3 was in DMSO with a
  • FIG. 4A, B Representative recording of the current intensity mediated by a CaV 2.2- Channel, generated during a pulse of 40 ms, starting from a holding potential of -90 mV to + 20 mV before and after in contact bring with a composition containing 150mM D3 .; 4B: D3-induced inhibition is reversible after reperfusion with an external Ringer's solution. The current was recorded during successive pulses of -90 mV + 20 mV, every 5 sec.).
  • Representative ion current leads mediated by the CaV2.2 channel were triggered during a 40 ms pulse from -90 mV to +20 mV before and after exposure to 150 nM cD3r (7A left panel).
  • 8A Representative ion current leads mediated by the CaV2.2 channel were triggered during a 40 ms pulse from -90 mV to +20 mV before and after exposure to 150 nM cRD2r (8A left panel).
  • the right figure 8A shows the time course of blockage in a representative cell during successive pulses from -90 mV to +20 m every five seconds.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2-D3 Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und unter D3 zur Verwendung als Schmerzmittel, zur Verwendung bei der Schmerztherapie, zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen und/oder neuropathischen Schmerzen und/oder zum Inhibieren von neuronalen Calciumkanälen (NCC) des N-Typs.

Description

D-enantiomere Peptide zur Therapie
von chronischem und neuropathischem Schmerz
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2-D3 Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und unter D3 zur Verwendung als Schmerzmittel, zur Verwendung bei der Schmerztherapie, zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen und/oder neuropathischen Schmerzen und/oder zum Inhibieren von neuronalen Calciumkanälen (NCC) des N-Typs. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verringerung der Ausschüttung von Neurotransmittern im Vergleich zu einer Kontrolle sowie ein Verfahren zum Inhibieren eines N-Typ NCC unter Verwendung der oben definierten Zusammensetzung. Zahlen der Deutscher Schmerzgesellschaft belegen, dass mehr als 12 Millionen Menschen in Deutschland von lang anhaltenden, chronischen Schmerzen und/oder neuropathischen Schmerzen betroffen sind. Neuropathische Schmerzen entstehen nach einer Schädigung oder Erkrankung afferenter Systeme im peripheren oder zentralen Nervensystem. Eine
medikamentöse Therapie ist mit einer 50-80%igen Schmerzreduktion möglich, eine
Schmerzfreiheit kann aber häufig nicht erreicht werden. Bei allen medikamentösen Optionen sprechen ca. 20-40% der Patienten nur unzureichend auf die Therapie an (<30%
Schmerzreduktion, sog. Non-Responder) oder leiden an nicht tolerierbaren Nebenwirkungen. Neben Antidepressiva (tri-/tetrazyklische Antidepressiva, selektive Serotonin-/Noradrenalin- Wiederaufnahme- Hemmer), lang wirksamen Opioiden, Antikonvulsiva mit Wirkung auf neuronale Natriumkanäle (z. B. Carbamazepin) und topische Therapeutika (Lidocain-Pflaster, Capsaicin-Hochdosis-Pflaster) werden pharmakologische Therapien angewandt, die eine Wirkung auf neuronale Calciumkanäle ausüben, wie Gabapentin, Pregabalin und Ziconotid (Prialt®). Dabei sind Gabapentin und Pregabalin spezifische P/Q-Typ Calciumkanal Inhibitoren und Ziconotid der einzige zugelassene spezifische N-Typ Calciumkanal Inhibitor. Ziconotid ist ein zyklisches Peptid aus 25 Aminosäuren und wurde ursprünglich aus dem Gift der
Kegelschnecke Conus magus als ω-Conotoxin MVIIA isoliert.
Ziconotid wird bei Patienten angewandt, die unter extrem starken Schmerzen leiden und bei denen alle anderen Behandlungsoptionen keinen Erfolg zeigen. Die Zulassung von Prialt® basiert auf den Ergebnissen von drei klinischen Phase-Ill-Studien mit mehr als 1200 Patienten. In allen Studien konnte Ziconotid im Vergleich zu Placebo Schmerzen gut reduzieren, unter anderem auch schwere behandlungsresistente chronische Schmerzen als Folge einer Krebserkrankung oder von AIDS. Unter anderem konnte durch den zusätzlichen intrathekalen Einsatz von Ziconotid die benötigte Opioidmenge reduziert werden. Im Vergleich zu Morphin verursacht Ziconotid weniger unerwünschte Wirkungen.
Die intrathekale (i. th.) Anwendung von Ziconotid, birgt allerdings das Risiko von potenziell schwerwiegenden Infektionen wie Meningitis, die lebensbedrohlich sein können. Eine
Meningitis aufgrund des Eindringens von Organismen entlang des Katheters oder die versehentliche Kontamination des Infusionssystems ist eine bekannte Komplikation der intrathekalen Gabe von Arzneimitteln, insbesondere mit externen Systemen. Des Weiteren verursacht Ziconotid bei 88% der Patienten starke zentral nervöse Nebenwirkungen wie Schwindel, Übelkeit, Nystagmus, Verwirrtheit, Gangunsicherheit, Gedächtnisstörungen, Verschwommensehen, Kopfschmerzen, Asthenie, Erbrechen und Somnolenz. Trotz der sehr aufwendigen und risikoreichen Applikationsart und den starken Nebenwirkungen wird Ziconotid zur Schmerztherapie angewandt, da es der einzige zugelassene spezifische N-Typ
Calciumkanal Inhibitor ist, der auch bei sehr starken Schmerzen z.B. verursacht durch
Tumoren oder AIDS, bei denen selbst Morphine keine Linderung mehr bringen, Erfolg zeigt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden. Insbesondere sollen Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt werden, die weniger Nebenwirkungen haben und dementsprechenden spezifisch und selektiv N-Typ NCC inhibieren und keinen Einfluss auf die Funktion der L-Typ NCC haben. Die zur Verfügung zu stellenden Zusammensetzungen sollen auf einfache Art und Weise applizierbar sein, bevorzugt durch orale Applikation. Ferner sollte die Inhibierung der N-Typ NCC-Kanäle reversibel sein, um eine dauerhafte Schmerzunempfindlichkeit und Schädigung zu vermeiden. Wünschenswert wäre außerdem ein IC 50-Wert überhalb des pikomolaren Bereichs, um eine Applikation zu ermöglichen, die unabhängig vom spezifischen Metabolismus des Empfängerorganismus ist. Bei IC 50-Werten im pikomolaren Bereich oder darunter zeigen schon kleine
Konzentrationsänderungen eines Wirkstoffs große Auswirkungen. Dadurch kann es leicht zu Unter- oder Überdosierungen kommen, die jeweils vom spezifischen Metabolismus abhängig sein können und zu unerwünschten Nebenwirkungen oder Langzeitschädigungen führen können.
Weitere Aufgabe war es eine Zusammensetzung, enthaltend Wirkstoffe zur Verfügung zu stellen, die eine Passage der Blut- Hirnschranke gewährleisten.
Weitere Aufgabe war es, stabile, auf dem Weg der enteralen, intravenösen, subcutanen, intraperitonealen, intrarhinalen und/oder oralen Applikation von Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die ihre Wirkung am Zielort, den N-Typ NCC entfalten. Gelöst wird diese Aufgabe in einer Ausführung durch eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zur Verwendung als Schmerzmittel.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zur Verwendung zur Verwendung bei der Schmerztherapie.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen und/oder neuropathischen Schmerzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zum Inhibieren von neuronalen Calciumkanälen (NCC) des N-Typs.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht das Peptid im Wesentlichen aus D- Aminosäuren. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff„im Wesentlichen aus D-Aminosäuren", dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide mindestens 50%, 60%, bevorzugt 75%, 80, 81 , 82, 83, 84%, besonders bevorzugt 85, 86, 87, 88, 89%, 90, 91 , 92, 93, 94, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-Aminosäuren enthalten oder daraus bestehen.
Im Vergleich zu L-enantiomeren Peptiden, wie dem Ziconotid, sind D- Peptide (in vivo) sehr viel resistenter gegenüber Proteasen und bieten damit die Möglichkeit einer oralen Verabreichung mit langen Eliminierungs-Halbwertszeiten. Des weiteren sind sie meist nicht oder nur gering immunogen. Eine weitere Ausführung betrifft die oben beschriebene Zusammensetzung zur Verwendung in einer Applikation von 1 Mikrogramm bis 1 Gramm pro Kilo Körpergewicht, bevorzugt 100 μg bis 10 mg/kg Körpergewicht, besonders bevorzugt von 0,5 bis 5 mg/kg Körpergewicht.
Eine Ausführung betrifft die oben beschriebene Zusammensetzung zur enteralen,
intravenösen, subcutanen, intraperitonealen, intrarhinalen oder oralen Applikation, bevorzugt oralen Applikation. Vorteilhaft zeigt die oben beschriebene Zusammensetzung einen IC-50-Wert von 1 nanomolar bis 1 millimolar für N-Typ NCC, bevorzugt von 10 nM bis 100 μΜ, besonders bevorzugt von 100 nM bis 10 μΜ, insbesondere von 100 nM bis 1 μΜ.
Die erfindungsgemäß einzusetzende Zusammensetzung enthält in einer Variante oder besteht aus Peptiden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend:
ANK1 ; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrirlvyhinr (SEQ ID NO: 8);
ANK2; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrirl06yhinr (SEQ ID NO: 9);
ANK3; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrirl06yhwnr (SEQ ID NO: 10);
ANK4; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrirlvyhwnr (SEQ ID NO: 1 1 ); ANK5; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrvrlvyhkkr (SEQ ID NO: 12);
ANK6; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrirlvtkkkr (SEQ ID NO: 13);
ANK7; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrvrl02thikr (SEQ ID NO: 14);
ANK15; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rprvrl06yhwnr (SEQ ID NO: 15);
ANK16; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkr07rlvtkrnr (SEQ ID NO: 16); ANK17; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rkrirl06yhikr (SEQ ID NO: 17);
ANK18; (freier N-terminus, bevorzugt amidierter C-terminus): rpr07rlhtkkkr (SEQ ID NO: 18); mit 02: 4-Fluoro-phenylalanin (D) 06: Phenylglycin (D) 07: D-Homoarginin.
In einer Alternative sind die Derivate der erfindungsgemäß einzusetzenden und oben beschriebenen Peptide zyklisierte oder amidierte Peptide.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide sind in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung am freien C-terminus mit dem freien N- terminus kovalent miteinander verbunden und liegen dann entsprechend zyklisiert vor. Auch durch den Ringschluss wird vorteilhaft bewirkt, dass die Carboxylgruppe am freien C-terminus nicht mehr vorhanden ist. Die Peptide weisen vorteilhaft eine Aminosäuresequenz auf, bei der die Zyklisierung des linearen Moleküls z. B. durch eine kovalente Bindung der ersten mit der letzten Aminosäure, z. B. über eine Kondensationsreaktion, erfolgt ist. Selbstverständlich existieren weitere Möglichkeiten der Zyklisierung, z. B. indem andere Aminosäuren miteinander verknüpft werden. Lediglich beispielhaft sei die Verknüpfung der zweiten Aminosäure mit der letzten Aminosäure genannt. Genauso denkbar ist jede mögliche andere Verknüpfung. Im Falle, dass die erste und die letzte Aminosäure des Peptids miteinander verknüpft werden, wird vorteilhaft bewirkt, dass keine offenen Enden in der Peptidkette (Aminosäuresequenz) vorliegen. Diese Maßnahme bewirkt ferner, dass alle Peptide mit linearen Aminosäuresequenzen, die nach der Zyklisierung die gleiche, nicht mehr unterscheidbare Aminosäure-Reihenfolge ergeben, in diesem Sinne identisch sind.
Beispiel: Die lineare Aminosäuresequenz des bekannten Peptids D3 ist rprtrlhthrnr (SEQ ID
NO: 2). Das entsprechende durch eine Amidbindung zwischen der N-terminalen Aminogruppe und der C-terminalen Carboxylgruppe verknüpfte, zyklisierte Peptid„cD3" ist nicht mehr zu unterscheiden von den zyklisierten Peptiden der Sequqenz prtrlhthrnrr, rtrlhthrnrrp, trlhthrnrrpr, rlhthrn rrprt, Ihthrnrrprtr, hthrnrrprtrl, thrnrrprtrlh, hrnrrprtrlht, rnrrprtrlhth, nrrprtrlhthr, oder rrprtrlhthrn. Aus jeder dieser Sequenzen lässt sich das cD3 weiterhin auch ableiten.
Analog stellt sich der Sachverhalt für RD2: ptihthnrrrrr (SEQ ID NO: 1 ) dar, mit den zyklisierten Peptiden der Sequenz tlhthnrrrrrp, Ihthnrrrrrpt, hthnrrrrrptl, thnrrrrrptlh, hnrrrrrptlht, nrrrrrptlhth, rrrrrptlhthn, rrrrptlhthnr, rrrptlhthnrr, rrptlhthnrrr, rptlhthnrrrr und der Bezeichnung„cRD2". Die Herstellung zyklisierter Peptide ist Stand der Technik, und kann beispielsweise nach den Verfahren wie beschrieben in DE 10 2005 049 537 A1 erfolgen.
Vorteilhaft bewirkt die Zyklisierung über die erste und letzte Aminosäure des Peptids, dass keine„offenen" Enden der Peptidkette mehr existieren, die oft Angriffspunkte für Peptid- abbauende Aktivitäten in Zellen, Tieren oder Menschen sind, z. B. durch Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen .
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide sind in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung am freien C-terminus amidiert, mithin liegt an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe vor. Statt der Carboxylgruppe (-COOH-Gruppe) ist also eine
Säureamidgruppe (-CONH2-Gruppe) am C-terminus angeordnet. Das Peptid ist demnach besonders vorteilhaft am freien C-Terminus amidiert. Dadurch wird besonders vorteilhaft die weitere Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negativen Ladungsüberschuss vorliegt, welches affiner an das Zielmolekül binden kann und auf einfache Weise erhältlich ist.
In einer Alternative der Erfindung liegen an Stelle der Carboxylgruppe eine Gruppe aus: COH, COCI, COBr, CONH- alkyl-Rest, CONH-alkyl-Amin-Rest (positive Netto-Ladung) vor, wobei man hierauf nicht beschränkt. Ferner sind die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide in einer Ausgestaltung um jeweils eine oder zwei Aminosäuren am N-Terminus und/oder C-Terminus jeweils verlängert oder verkürzt gegenüber der ursprünglichen Sequenz. Eine Alternative weist einen Terminus ein oder zwei zusätzlicher Aminosäuren auf, während der andere Terminus ein oder zwei
Aminosäuren weniger aufweist. Die Peptide werden bevorzugt gegenüber der ursprünglichen Sequenz am C-Terminus, um eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren rlht verlängert, bevorzugt r.
Bevorzugte Derivate sind zyklisierte (cycl-) Peptide, amidierte Peptide und/oder um eine Aminosäure, bevorzugt Aginin r am C-Terminus verlängerte Peptidsequenz, insbesondere D3r rprtrlhthrnrr (SEQ ID NO: 5), und zyklisiertes D3r. Weitere bevorzugte Derivate sind zyklisierte RD2 und die jeweils linearen amidierten Formen und/oder um eine Aminosäure, bevorzugt Aginin r am C-Terminus verlängerte Peptidsequenz RD2r ptlhthnrrrrrr (SEQ ID NO: 19) .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist mithin auch das Peptid RD2r ptlhthnrrrrrr (SEQ ID NO: 19); ein 13-mer basierend auf RD2 welches am C-Terminus um eine Aminosäure verlängert ist, bevorzugt r. Gegenstand der Erfindung ist auch die amidierte und/oder zyklisierte Form cRD2r (analog zu cRD2). Weiterer Gegenstand ist das Peptid RD2r sowie auch die amidierte und/oder zyklisierte Form, bevorzugt cRD2r zur Verwendung in der Medizin, beziehungsweise als Medikament, bevorzugt zur Verwendung bei der Behandlung von
Schmerz, beziehungsweise als bei der Therapie von Schmerz, insbesondere von chronischem und neuropathischem Schmerz. Weitere erfindungsgemäß einzusetzende Peptide sind:
RD2RD2, ptl hth n rrrrrptl ht h n rrrrr (SEQ ID NO: 3) RD2D3 ptlhthnrrrrrrprtrlhthrnr (SEQ ID NO: 4), cycl-RD2RD2, ptl hth n rrrrrptl hth n rrrrr, cycl-D3r, rprtrlhthrnrr, D3p, rprtrlhthrnrp (SEQ ID NO: 6) und cycl-D3p sowie D3a, rprtrlhthrnra (SEQ ID NO: 7) und cycl-D3a.
„Homologe Sequenzen" oder "Homologe" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine
Aminosäurese- quenz eine Identität mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% aufweist. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder
"Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T. F. und Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981 )) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der
Nukleinsäuresequenz/Polypeptidequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von
Needleman, S. B. und Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443^153) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.
Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen.
In einer Alternative wird die Homologie bzw. die Identität über die jeweilige Gesamtlänge der entsprechenden Peptide bestimmt. In einer anderen Alternative erfolgt der Vergleich und mithin die Bestimmung der Identität bzw. Homologie lediglich über Teilbereiche.
Auch in dieser Alternative haben die erfindungsgemäß einzusetzenden Polypeptide eine Homologie von mindestens 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung enthält oder besteht die Zusammensetzung
Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 oder der weitere, oben beschriebenen Peptide. Das erfindungsgemäß einzusetzende Polymer enthält 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr der oben beschriebenen Monomeren-Peptide.
Bevorzugt werden Dimere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2D3, D3RD2, D3D3 und RD2RD2 oder Homologe oder Derivate davon eingesetzt.
Es kann auch jede beliebige Kombination aus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr der oben beschriebenen Sequenzen in linearer oder zyklisierter Form das Polymer ausbilden.
Polymere können beispielsweise über chemische Synthese bzw. Peptidsynthese hergestellt werden.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Peptide linear miteinander verknüpft sein, insbesondere wie oben beschrieben. In einer anderen Variante sind die Peptide verzweigt miteinander zu dem erfindungsgemäßen Polymer verknüpft. Bei einem verzweigten Polymer kann es sich erfindungsgemäß um ein Dendrimer handeln, bei dem die Monomere kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind. Alternativ können die Peptide auch mit einem Plattform-Molekül (wie z. B. PEG oder Zucker) verknüpft sein und so ein verzweigtes Polymer bilden. Die Monomer-Peptide sind Kopf an Kopf, Schwanz an Schwanz oder Kopf an Schwanz linear gekoppelt, mit oder ohne zusätzliche Linker, und in einer Alternative insgesamt durch kovalente Verknüpfung, mit oder ohne zusätzliche Linker (z. B. ein oder mehrere Aminosäuren), der beiden verbleibenden Enden zyklisiert.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide kovalent verknüpft mit weiteren Aminosäuren, Linker, Spacer und/oder funktionelle Gruppen.
In einer Alternative der vorliegenden Erfindung werden durch diese weiteren Aminosäuren, Linker, Spacer und/oder funktionelle Gruppen die Eigenschaften des Peptids nicht verändert. In einer weiteren Alternative bewirken die weiteren Aminosäuren, Linker, Spacer und/oder funktionelle Gruppen eine Veränderung der Eigenschaften des Peptids. In einer solchen Ausführung wird die Selektivität und/oder Affinität der erfindungsgemäßen Polymere bezüglich der N-Typ NCC verstärkt.
Unter einem Linker sind ein oder mehrere Moleküle zu verstehen, die über kovalente
Bindungen an die Peptide gebunden sind, wobei diese Linker untereinander auch durch kovalente Bindungen verknüpft sein können.
Unter funktionellen Gruppen sind Moleküle zu verstehen, die kovalent an die Peptide gebunden sind. In einer Variante enthalten die funktionellen Gruppen Biotin-Gruppen. Dadurch wird eine starke kovalente Bindung an Streptavidin ermöglicht.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung enthalten die Peptide sog. Spacer. Unter einem Spacer ist ein Molekül zu verstehen, das über kovalente Bindungen an das Peptid gebunden ist, und bestimmte physikalische und/oder chemische Eigenschaften besitzt, durch welche die Eigenschaften des Peptids verändert werden. In einer Ausführung werden hydrophile oder hydrophobe, bevorzugt hydrophile Spacer, eingesetzt. Hydrophile Spacer werden ausgewählt aus der Gruppe der Moleküle, gebildet aus Polyethylenglycol, Zucker, Glycerin, Poly-L-Lysin oder beta-Alanin. Die Peptide sind in einer Alternative mit einer weiteren Substanz verknüpft.
Bei dieser Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise. §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe die als arzneilich wirksame Stoffe verwendet werden.
In einer anderen Variante handelt es sich bei den Substanzen um Träger zur kontrollierten
Wirkstofffreisetzung (auch Drug Carrier Systems genannt), Ziel ist es einerseits, ein schnelles Ausscheiden von Wirkstoffen aus dem Körper zu verhindern. Die meisten konventionellen Wirkstoffe sind klein und verweilen deshalb nur kurz im Blutkreislauf, da sie aufgrund ihrer Größe unterhalb der Nierenschwelle liegen, und deshalb vom Blut getrennt und wieder ausgeschieden werden. Andererseits werden durch diese Trägersysteme die Wirkstoffe spezifisch in die Nähe bestimmter Organe oder Zellen transportiert und dort kontrolliert freigesetzt.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Substanzen, die die Wirkung der Peptide verstärken. In einer Alternative sind solche Verbindungen Aminopyrazol und/oder Aminopyrazolderivate. Aminopyrazolderivate im Sinne der Erfindung ist 3- Aminopyrazol-5- carbonsäure oder 3-Nitropyrazol-5-carbonsäure sowie alle Abkömmlinge, in denen die heterocyclische CH-Gruppe gegen -CR- oder -N- oder -O- oder -S- ausgetauscht wurde, sowie alle daraus abgeleiteten peptidischen Dimere, Trimere oder -Tetramere, bevorzugt
Aminopyrazol-Trimer. In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen, die die Löslichkeit der Peptide und/oder die Passage der Blut-Hirn-Schranke verbessern.
Die Substanz ist mit dem Peptid verknüpft, wobei die Verknüpfung eine kovalente Bindung ist oder die Verknüpfung keine kovalente Bindung ist. Die Verknüpfung erfolgt hier über
Wasserstoff brücken, hydrophile, hydrophobe, elektrostatische Wechselwirkung bzw. Bindung und/oder sterische Immobilisierung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verringerung der Ausschüttung von Neurotransmittern im Vergleich zu einer Kontrolle dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3,
Homologen mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und unter D3 zur Verwendung als Schmerzmittel mit dem N-Typ NCC in Kontakt gebracht wird. Insbesondere wird der Calciumeinstrom durch ein NCC im Vergleich zu einer Kontrolle durch das erfindungsgemäße Verfahren verringert.
Ferner ist Gegenstand der Erfindung auch ein Verfahren zum Inhibieren eines N-Typ NCC im Vergleich zu einer Kontrolle dadurch gekennzeichnet, dass dieser mit einer Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und
Derivaten von RD2 und/oder D3 in Kontakt gebracht wird.
Im Sinne der Erfindung bedeutet,„in Kontakt bringen", dass Bedingungen vorliegen, die eine Wechselwirkung zwischen den erfindungsgemäß einzusetzenden Peptiden und dem N-Typ NCC ermöglichen, insbesondere physikalisch und/oder chemische Wechselwirkungen, wie z.B. die Ausbildung von koordinativen Bindungen oder Wasserstoffbrücken.
Die Auswahl einer Kontrolle ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes. Als Kontrolle wird ein Organismus verwendet, der mit dem zu untersuchenden Organismus in einer Alternative identisch ist. Der zu untersuchende Organ ismus wird wie mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung behandelt bzw. im weitesten Sinne in Kontakt gebracht, während die Kontrolle diesem Verfahren nicht unterzogen wird. Erfindungsgemäß umfasst der Begriff Organismus auch Teile von Organismen, Gewebe, Gewebeproben, einzelne Zellen oder Zellkulturen, Teile von Zellen wie membranenthaltend NCC-Kanäle, bevorzugt des N-Typs oder L-Typs, oder künstliche Membranen wie z. B. Doppellipidmembran enthaltend neuronale Calciumkanäle, bevorzugt des N-Typs und/oder L-Typs. Sowohl die Kontrolle als auch der zu untersuchende Organismus wird aus der oben genannten Liste ausgewählt. In einer anderen Alternative ist die Kontrolle definiert gemäß den Vorgaben der klinischen Studien.
Im Sinne der Erfindung bedeutet Inhibieren die Herabsetzung der Aktivität von neuronalen Calciumkanälen, bevorzugt des N-Typs in Bezug auf eine Kontrolle durch die erfindungsgemäß zu verwendende Zusammensetzung. Die Kontrolle wird erfindungsgemäß nicht mit dieser Zusammensetzung in Kontakt gebracht. Alternativ dazu kann die Kontrolle auch mit bekannten Inhibitoren in Kontakt gebracht werden.
Aus dem Vergleich der Anwendung bekannter Inhibitoren mit der Anwendung der erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzung kann der Fachmann ebenfalls Schlüsse zur Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung suchen.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Inhibierung bei einer Konzentration entsprechend bzw. gleich dem IC-50 Wert bestimmt.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Zusammensetzungen inhibieren N-Typ NCC mindestens 10%, 15%, 20%, 25%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, insbesondere 90% oder 100%.
In einer Ausführung wird die Inhibierung erfindungsgemäß mittels der sogenannten Patch- Clamp-Technik bestimmt. Dabei wird der lonenstrom durch den Calciumkanal bei verschiedenen Spannungen gemessen. Die Inhibierung des neuronalen Calciumkanals wird mithin über die Reduktion des lonenstroms bestimmt. In einer Alternative findet eine Reduktion des lonenstroms um mindestens 10%, 15%, 20%, 25%, bevorzugt 30%, 35%, besonders bevorzugt 40, 42, 44, 46, 48, 50%, 52, 54, 56, 58, 60%, 70%, 80%, insbesondere 90% oder 100%. Bevorzugt wird die Reduktion bei einer Konzentration an Peptiden bestimmt, die dem IC50-Wert gleich ist. In einer Ausführung wird die Patch-Clamp-Messung bei in Kontakt bringen des entsprechenden Kanals mit einer erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzung einer Konzentration von 150 nM bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass die Funktion von L-Typ NCC gegenüber einer Kontrolle nicht geändert wird. Mit anderen Worten, der Calciumeinstrom durch die L-Typ NCC wird gegenüber einer Kontrolle nicht geändert. Die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide wirken spezifisch und/oder selektiv auf N-Typ NCC.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide als Ersatz für Conotoxin.
So kann das in Kontakt bringen der NCC, bzw. Membrane, enthaltend NCC oder der entsprechenden Quellen enthaltend NCC, in vitro (ex vivo) durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Behandlung von chronischen und/oder neuropathischen Schmerzen, also eine Behandlung zur Schmerzlinderung, bei welcher dem zu behandelnden Individuum durch enterale, intravenöse, subcutane, intraperitoneale, intrarhinale oder orale Applikation, bevorzugt orale Applikation, die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide in einer Konzentration von 1 μg bis 1 g/kg Körpergewicht verabreicht werden.
Mithin betrifft die Erfindung auch ein Verfahren, bei welchem die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide mittels gängiger, dem Fachmann bekannter Verfahren, in pharmazeutische Formulierungen eingearbeitet werden. Somit ist Gegenstand der Erfindung auch die Verwendung der oben beschriebenen Peptide in pharmazeutischen Formulierungen. Eine pharmazeutische Formulierung, enthaltend die erfindungsgemäß und oben beschriebenen, einzusetzenden Peptide, ist mithin ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung einer Zusammensetzung aus Anspruch 1 zur Herstellung eines Schmerzmittels, eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Schmerztherapie und/oder eines Arzneimittels zur Behandlung von chronischen und neuropathischen Schmerzen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Inhibieren von N-Typ neuronalen Calciumkanälen NCC.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch die weiteren, oben beschriebenen Peptide, Derivate und Homologe eingesetzt werden.
Die weiteren Beispiele können mit jedem der oben beschriebenen Peptide durchgeführt werden.
Beispiele:
1 . RD2 (C-terminal amidiert) A. Protein Konstrukte:
Die kodierenden Regionen der beiden unterschiedlichen alphal porenbildenden Einheiten (CaValphal ) des spannungsabhängigen Calcium-Kanals wurden in frame (C-terminale Fusion) mit den Fluoreszenzproteinen wie folgt fusioniert: die Einheit aus Kaninchen CaV1.2
(UniProtKB:P15381 ) mit YFP (CaV1.2-YFP) während die humane Einheit CaV2.2
(UniProtKB:Q00975-1 ) mit GFP (CaV2.2-GFP) fusioniert wurde. Die beta-Untereinheit
CaVbeta2e (UniProtKB:Q8VGC3-2) wurde an mRFP (CaVbeta2e-mRFP) und CaVbeta4 (UniProtKB:O00305.2) an mCherry (CaVbeta4-mCherry) gekoppelt.
B: Zell Transfektion:
Da die normale Funktion und die Oberflächenexpression der CaValphal Untereinheit die
Assoziation an die CaVbeta Untereinheit benötigt, wurden tsA201 Zellen transient mit entweder CaV1 .2-YFP und CaVbeta2e-mRFP oder CaV2.2-GFP und CaVbeta4-mCherry co-transfiziert. Die Transfektion erfolgte mittels Lipofectamine 2000TM (Invitrogen) und die erfolgreich transfizierten Zellen wurden mittels Fluoreszenzsignal identifiziert. Elektrophysiologische Ableitungen wurden 24-48 Stunden nach Transfektion durchgeführt.
C. Elektrophysiologie:
lonenströme wurden mittels Whole Cell Patch-Clamp Technik mit einem EPC-10 Verstärker mit implementierter PatchMaster Software (HEKA, Elektronik) gemessen. Barium wurde als Träger verwendet. Borosilicatglaspipetten mit Widerständen von 0.9-2 ΜΩ wurden an eine Sutter P- 1000 Abziehvorrichtung (Harvard Apparatus) herangezogen und mittels Narishige MF-830 microforge oberflächlich an der Spitze hitzegeglättet. Als äußere Messlösung wurde 140 mM TEA-MeS03, 10 mM BaCI2, 10 mM HEPES (pH 7.3) und als innere Messlösung 135 mM Cs- MeS03, 10 mM EGTA, 5 mM CsCI2, 1 mM MgCI2, 4 mM MgATP, 0,4 mM Na2GTP und 10 mM HEPES (pH 7,3) verwendet. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung einer
Kombination der Sofware FitMaster (HEKA), Origin (OriginLab) und Excel (Microsoft) durchgeführt. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt, lonenströme wurden unter Verwendung des P/4 Protokolls korrigiert (Leak-subtraction).
Um den pharmakologischen Effekt von RD2 zu untersuchen, wurden Zellen abgelöst und in eine Perfusionsströmung überführt, die entweder die Testsubstanz enthielt, oder auch nicht. Die Beobachtungen wurden unter konstanter Perfusion durchgeführt, um eine konstante Konzentration der Testsubstanz zu gewährleisten. RD2 wurde in DMSO mit einer
Endkonzentration von 1 mM gelöst und kurz vor Anwendung auf 150 nM in der äußeren Messlösung gelöst. Kontrollexperimente wurden mit den bekannten CaV1.2 und CaV2.2 Calcium Kanalblockern Nimodipine (10 μΜ) und omega-Conotoxin (1 nM) durchgeführt.
D. Ergebnisse:
Effekt von RD2 auf die CaV2.2-vermittelten lonenströme:
CaV2.2 ist in den prä-synaptischen Nervenendigungen lokalisiert und vermitteln die
Neurotransmission an zentralen Synapsen. CaV2.2- vermittelte lonenströme wurden von tsA201 Zellen aufgenommen, die CaV2.2/CaVbeta4 exprimieren. Die Perfusion der Zellen mit einer RD2 (150 nM) enthaltenden externen Messlösung, jedoch nicht mit der externen
Messlösung allein, führte zu einer signifikanten Reduktion des lonenstroms (Fig. 1 A,B; mit A: Repräsentative Aufnahme der Stromstärke vermittelt durch einen CaV 2.2-Kanal,
hervorgerufen während eines Pulses von 40 MS, ausgehend von einem Haltepotenzial von -90 mV zu + 20 mV bevor und nach in Kontakt bringen mit einer 150mM RD2 enthaltenden Zusammensetzung.; B: Zeitverlauf der Inhibierung, aufgenommen in einer repräsentativen Zelle, während sukzessive Pulse von -90 mV zu + 20 mV, jeder fünf Sekunden. ). Der current- to-voltage plot (l-V) zeigte eine Reduktion des lonenstromes bei allen getesteten Spannungen in Höhe von bis zu 55% (Fig.l C: Durchschnittliche Stromstärke zum Spannungsverhältnis von Zellen, die CaV 2.2 exprimieren in Anwesenheit und Abwesenheit von RD2 (n = 7).). Eine Blockade des lonenstroms war nicht von einer Veränderung der spannungsabhängigen Aktivierung des Kanals begleitet was zu der Annahme eines Poren blockierenden
Mechanismus von RD2 führt (Fig. 1 D: Fraktion von aktivierten Kanälen, aufgetragen gegen den Spannungsplot (Aktivierungskurve) für dieselben Zellen wie in Abb. C; als Kontrolle; es findet mithin keine Funktions- oder Mechanismusänderung des Kanals statt, da die Kurven übereinander liegen und nicht verschoben sind), lonenströme werden nach Applikation von 1 nM des CaV2.2 Blockers omega-Conotoxin unterbrochen was bestätigt, dass sie über den CaV2.2 Kanal vermittelt wurden. (Fig. 1A Insert). Effekt von RD2 auf die CaV1 .2-vermittelten lonenströme:
CaV1 .2 ist der L-type Calcium Kanal vorwiegend im Herzen exprimiert und verantwortlich für die Kopplung der elektrischen Aktivierung der Kardiomyozyten mit der Myofilament Kontraktion. Die lonenströme wurden von CaV1 .2 und CaVbeta2e co-exprimierenden Zellen aufgenommen und blieben nahezu unverändert nach Exposition mit 150 nM RD2 (Fig. 2A: Repräsentative Aufnahme der Stromstärke vermittelt durch einen CaV 1 .2-Kanal, hervorgerufen während eines Pulses von 40 ms, ausgehend von einem Haltepotenzial von -90 mV zu + 10 mV bevor und nach in Kontakt bringen mit einer 150mM RD2 enthaltenden Zusammensetzung. Fig. 2B: keine Änderung der Stromstärke bei Perfusion mit 150 nM RD2). Im Gegensatz dazu, führte die Perfusion mit 10 μΜ Nimodipine, einem bekannten Blocker des CaV1 .2 Kanals, zu einer nahezu vollständigen Blockade des lonenstroms. The Spannungsabhängigkeit der Aktivierung des CaV1.2 Kanal wurde also nicht durch die Anwesenheit von RD2 beeinflusst (Fig. 2C und 2D).
E: Schlussfolgerung
RD2 wurde mit einer Konzentration von 150 nM auf seine Fähigkeit getestet, lonenströme zu blockieren, die über den CaV2.2 und CaV1.2 Kanal vermittelt wurden. Die Untersuchungen wurden in CaV2.2 und CaV1 .2 Kanal exprimierenden tsA201 Zellen unter Verwendung der Whole-Cell Patch Clamp Technik durchgeführt. RD2 blockiert den CaV2.2 Kanal, während der CaV1 .2 Kanal insensitive gegenüber RD2 in der getesteten Konzentration ist (Fig. 3).
2. D3 (C. terminal amidiert) A. Protein Konstrukte:
Die kodierende Region der humanen alphal porenbildenden Einheiten (CaValphal ) des spannungsabhängigen Calcium-Kanals CaV2.2 (UniProtKB:Q00975-1 ) wurde mit GFP zu CaV2.2-GFP fusioniert. Die beta-Untereinheit CaVbeta4 (UniProtKB:O00305.2) wurde an mCherry zu CaVbeta4-mCherry fusioniert.
B: Zell-Transfektion: Da die normale Funktion und die Oberflächenexpression der CaValphal Untereinheit die Assoziation an die CaVbeta Untereinheit benötigt, wurden tsA201 Zellen transient mit CaV2.2- GFP und CaVbeta4-mCherry co-transfiziert. Die Transfektion erfolgte mittels Lipofectamine 2000TM (Invitrogen) und die erfolgreich transfizierten Zellen wurden mittels Fluoreszenzsignal identifiziert. Elektrophysiologische Ableitungen wurden 24-48 Stunden nach Transfektion durchgeführt.
C. Elektrophysiologie:
lonenstrome wurden mittels Whole Cell Patch-Clamp Technik mit einem EPC-10 Verstärker mit implementierter PatchMaster Software (HEKA, Elektronik) gemessen. Barium wurde als Träger verwendet. Borosilicatglaspipetten mit Widerständen von 0.9-2 ΜΩ wurden an eine Sutter P- 1000 Abziehvorrichtung (Harvard Apparatus) herangezogen und mittels Narishige MF-830 microforge oberflächlich an der Spitze hitzegeglättet. Als äußere Messlösung wurde 140 mM TEA-MeS03, 10 mM BaCI2, 10 mM HEPES (pH 7.3) und als innere Messlösung 135 mM Cs- MeS03, 10 mM EGTA, 5 mM CsCI2, 1 mM MgCI2, 4 mM MgATP, 0.4 mM Na2GTP und 10 mM HEPES (pH 7.3) verwendet. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung einer
Kombination der Sofware FitMaster (HEKA), Origin (OriginLab) und Excel (Microsoft) durchgeführt. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt, lonenstrome wurden unter Verwendung des P/4 Protokolls korrigiert (Leak-subtraction).
Um den pharmakologischen Effekt von D3 zu untersuchen, wurden Zellen abgelöst und in eine Perfusionsströmung überführt, die entweder die Testsubstanz enthielt, oder auch nicht. Die Beobachtungen wurden unter konstanter Perfusion durchgeführt, um eine konstante
Konzentration der Testsubstanz zu gewährleisten. D3 wurde in DMSO mit einer
Endkonzentration von 1 mM gelöst und kurz vor Anwendung auf 150 nM in der äußeren Messlösung gelöst. Kontrollexperimente wurden mit den bekannten CaV2.2 Calcium
Kanalblocker omega-Conotoxin (1 nM) durchgeführt.
D. Ergebnisse:
Effekt von D3 auf die CaV2.2-vermittelten lonenstrome:
CaV2.2- vermittelte lonenstrome wurden von tsA201 Zellen aufgenommen, die
CaV2.2/CaVbeta4 exprimieren. Die Perfusion der Zellen mit einer D3 (150 nM) enthaltenden externen Messlösung, jedoch nicht mit der externen Messlösung allein, führte zu einer signifikanten Reduktion des lonenstroms (Fig. 4A,B; mit A: Repräsentative Aufnahme der Stromstärke vermittelt durch einen CaV 2.2-Kanal, hervorgerufen während eines Pulses von 40 ms, ausgehend von einem Haltepotenzial von -90 mV zu + 20 mV bevor und nach in Kontakt bringen mit einer 150mM D3 enthaltenden Zusammensetzung.; 4B: Die von D3 induzierte Inhibierung ist reversibel nach Reperfusion mit einer externen Ringerlösung. Die Stromstärke wurde aufgezeichnet während sukzessiven Pulsen von -90 mV + 20 mV, jede 5 Sek.). Der current-to-voltage plot (l-V) zeigte eine Reduktion des lonenstromes bei allen getesteten Spannungen in Höhe von bis zu 54% (Fig.4C). Eine Blockade des lonenstroms war nicht von einer Veränderung der spannungsabhängigen Aktivierung des Kanals begleitet was zu der Annahme eines Poren blockierenden Mechanismus von D3 führt (Fig. 4D). lonenströme werden nach Applikation von 1 nM des CaV2.2 Blockers omega-Conotoxin unterbrochen was bestätigt, dass sie über den CaV2.2 Kanal vermittelt wurden. (Fig. 4A Insert).
E: Schlussfolgerung
D3 blockiert den CaV2.2 Kanal (Fig. 5).
3. cD3 (zyklisiertes D3) und cRD2 (zyklisiertes RD2)
Die Experimente wurden analog zu den Beispielen 1 und 2 durchgeführt.
Zusammenfassung der Effekte von cD3r und cRD2r auf den Cav2.2 und Cav1 .2 Kanal (Fig. 6). Die beiden Balkendiagramme fassen die durchschnittlichen lonenströme zusammen, die den Stromstärke zu Spannungs-Diagrammen bei +20mV für den Cav2.2 und bei +10mV für den Cav1 .2 entnommen wurden. **p<0.01
Effekt von cD3r auf den CaV2.2 und den CaV1 .2 Kanal (Fig. 7).
Repräsentative lonenstrom Ableitungen, die vom CaV2.2 Kanal vermittelt werden, wurden während eines 40ms Impulses von -90 mV bis +20 mV vor und nach Exposition mit 150 nM cD3r ausgelöst (7A linke Abbildung). Die rechte Abbildung 7A zeigt den Zeitverlauf der Blockade in einer repräsentativen Zelle während aufeinanderfolgender Impulse von -90 mV bis +20 m alle fünf Sekunden.7B, Durchschnittliches Stromstärke zu Spannungs- Verhältnis von CaV2.2 exprimierenden Zellen in der An- und Abwesenheit von cD3r (n=8) und Fraktion der aktivierten Kanäle versus Spannung (Aktivierungskurve). 7C Repräsentative lonenstrom Ableitungen, die vom CaV2.1 Kanal vermittelt werden, wurden während eines 40ms Impulses von -90 mV bis +20 mV vor und nach Exposition mit 150 nM cD3r ausgelöst (7C linke Abbildung). Die rechte Abbildung 7C zeigt den Zeitverlauf der Blockade in einer
repräsentativen Zelle während aufeinanderfolgender Impulse von -90 mV bis +20 m alle fünf Sekunden. 7D Durchschnittliches Stromstärke zu Spannungs- Verhältnis in der An- und Abwesenheit von cD3r (n=8) und Aktivierungskurve CaV2.1 exprimierender Zellen (n=7). Effekt von cRD2r auf den CaV2.2 und den CaV1.2 Kanal (Fig. 8).
8A Repräsentative lonenstrom Ableitungen, die vom CaV2.2 Kanal vermittelt werden, wurden während eines 40ms Impulses von -90 mV bis +20 mV vor und nach Exposition mit 150 nM cRD2r ausgelöst (8A linke Abbildung). Die rechte Abbildung 8A zeigt den Zeitverlauf der Blockade in einer repräsentativen Zelle während aufeinanderfolgender Impulse von -90 mV bis +20 m alle fünf Sekunden. 8B, Durchschnittliches Stromstärke zu Spannungs- Verhältnis von CaV2.2 exprimierenden Zellen in der An- und Abwesenheit von cRD2r (n=7) und Fraktion der aktivierten Kanäle versus Spannung (Aktivierungskurve). 8C, Repräsentative lonenstrom Ableitungen, die vom CaV2.1 Kanal vermittelt werden, wurden während eines 40ms Impulses von -90 mV bis +20 mV vor und nach Exposition mit 150 nM cRD2r ausgelöst (linke Abbildung). Die rechte Abbildung 8C zeigt den Zeitverlauf der Blockade in einer repräsentativen Zelle während aufeinanderfolgender Impulse von -90 mV bis +20 m alle fünf Sekunden. 8D, Durchschnittliches Stromstärke zu Spannungs- Verhältnis in der An- und Abwesenheit von cRD2r (n=8) und Aktivierungskurve CaV2.1 exprimierender Zellen (n=6).

Claims

Ansprüche:
1 . Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zur Verwendung als Schmerzmittel.
2. Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zur Verwendung bei der Schmerztherapie.
3. Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Schmerzen.
4. Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zur Verwendung bei der Behandlung von neuropathischen Schmerzen.
5. Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 zum Inhibieren von neuronalen Calciumkanälen (NCC) des N-Typs.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide im Wesentlichen aus D-Enatiomeren bestehen.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einer Applikation von 1 Mikrogramm bis 1 Gramm pro Kilo Körpergewicht.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur enteralen, intravenösen, subcutanen, intraperitonealen, intrarhinalen oder oralen Applikation, bevorzugt oralen
Applikation.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 gekennzeichnet durch einen IC- 50-Wert von 1 nanomolar bis 1 millimolar für N-Typ NCC.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet dass die Derivate zyklisierte oder amidierte Peptide sind.
1 1. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet dass die Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend oder bestehend aus RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und D3 mit weiteren Aminosäuren, Linker, Spacer, funktionellen Gruppen und/oder Substanzen verknüpft sind.
12. Verfahren zur Verringerung der Ausschüttung von Neurotransmittern im Vergleich zu einer Kontrolle dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und/oder D3 zur Verwendung als Schmerzmittel mit einem N-Typ NCC in Kontakt gebracht wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet dass der Calciumeinstrom durch ein NCC im Vergleich zu einer Kontrolle verringert wird.
14. Verfahren zum Inhibieren eines N-Typ NCC im Vergleich zu einer Kontrolle dadurch gekennzeichnet dass dieser mit einer Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 % Identität und Derivate von RD2 oder D3 sowie Polymere enthaltend RD2, D3, Homologe mit mindestens 50 %-iger Identität und Derivaten von RD2 und/oder D3 in Kontakt gebracht wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14 dass die Funktion von L-Typ NCC gegenüber einer Kontrolle nicht geändert wird.
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