DE10240894A1

DE10240894A1 - Verstärkung der Resorption von Subtanzen über die Haut und Schleimhaut

Info

Publication number: DE10240894A1
Application number: DE10240894A
Authority: DE
Inventors: Peter Hans Prof. Dr. Dr. Hofschneider; Trutz Dr. Podschun; Eberhard Dr. Hildt
Original assignee: ProCom Biotechnologische Produktions GmbH
Current assignee: DIAFERON GMBH, 80935 MUENCHEN, DE
Priority date: 2002-09-04
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2004-03-11
Also published as: AU2003273817A1; JP2005537328A; WO2004022657A8; WO2004022657A3; WO2004022657A2; AU2003273817A8; EP1534315A2; US20070172516A1; CA2497696A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verstärkung der Resorption von Substanzen über die Haut und Schleimhaut. Ferner betrifft die Erfindung Substanzen mit einer erhöhten Fähigkeit, von der Haut und Schleimhaut resorbiert zu werden, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Substanzen umfassen.

Description

Die Erfindung betrifft die Verstärkung der Resorption von Substanzen über die Haut und Schleimhaut. Ferner betrifft die Erfindung Substanzen mit einer erhöhten Fähigkeit, von der Haut und Schleimhaut resorbiert zu werden und pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Substanzen umfassen.
Die Verabreichung von biologisch aktiven Substanzen durch eine parenterale Applikation (z.B. intravenöse, intramuskuläre und subkutane Injektion) wird häufig als die geeignetste Art der Verabreichung betrachtet, falls eine schnelle und starke systemische Wirkung erreicht werden soll und die aktive Substanz nicht oder nur geringfügig vom Körper resorbiert oder im Gastrointestinaltrakt oder durch den Lebermetabolismus inaktiviert wird.
Jedoch weist die Verabreichung durch eine Injektion eine Reihe von Nachteilen auf. So ist die Verwendung von sterilen Spritzen und Nadeln oder anderen mechanischen Vorrichtungen erforderlich und es können Schmerzen, Reizungen und Infektionen auftreten, insbesondere im Fall von wiederholten Injektionen. Des weiteren sollten Injektionen nur durch geschulte Personen verabreicht werden.
Es ist bekannt, dass bestimmte Arzneimittel an einen Patienten transdermal (perkutan, über die – unverletzte – Haut) oder transmucosal (über die Schleimhaut) verabreicht werden können. Diese Verabreichung umfasst im Wesentlichen das Auftragen des Arzneimittels auf die Oberfläche der Haut und/oder der Mucosa und ein Durchdringen der Haut oder Mucosa durch das Arzneimittel in den Blutkreislauf des Patienten.
Eine kutane oder mucosale Verabreichung ist dadurch interessant, dass dabei eine lokale sowie eine systemische Wirkung eines Arzneimittels erzeugt werden kann. Ferner kann diese Art der Verabreichung als Alternative zu einer parenteralen Verabreichung interessant sein, falls ein schnelles Einsetzen einer Wirkung des verabreichten Arzeimittels erforderlich ist.
Eine nicht-invasive Applikation erspart Arzt und Patienten ferner die Unannehmlichkeiten und Risiken, die mit Injektionen und Infusionen verbunden sind, und kann auch durch ungeschulte Personen, d.h. auch selbständig durch den Patienten, erfolgen. Diese Art der Arzneimittelapplikation ist daher mit einer höheren Patienten-Compliance verbunden als invasive Techniken. Dies gilt insbesondere für die topische (lokale) oder enterale Verabreichung, d. h. die Verabreichung auf oralem oder rektalem Wege.
Allerdings ist die Haut und Schleimhaut eine physikalische Barriere, die bei einer Verabreichung von Arzneimitteln, die zu inneren Geweben gelangen sollen, überschritten werden muss. Oral verabreichte Arzneimittel müssen zudem gegenüber dem niedrigen pH-Wert und den Verdauungsenzymen im Gastrointestinaltrakt resistent sein.
Eine transdermale oder transmucosale Verabreichung ist daher nur für solche Arzneimittel geeignet, die gut von der Haut oder Mucosa resorbiert werden.
Die Resorptionsgeschwindigkeit und die Resorptionsquote, d. h. das Verhältnis von resorbiertem Anteil zu applizierter Menge, und letztlich die erzielbaren Blutplasmaspiegel, d. h. die biologische Verfügbarkeit eines Wirkstoffes, hängen neben anderen Faktoren unter anderem von der ausreichenden Wasserlöslichkeit, anderen chemischen Stoffeigenschaften und den physiologischen Gegebenheiten am Applikations- bzw. Resorptionsort ab. Viele Arzneimittelwirkstoffe sind extrem groß und praktisch impermeabel für die Haut und Schleimhaut. Zudem sind viele Arzneimittelwirkstoffe aufggrund ihrer schlechten Wasserlöslichkeit bis Wasserunlöslichkeit schwierig über Schleimhäute zu resorbieren, was gegen deren Applikation über eben diese Schleimhäute beispielsweise auf enteralem (oralem und rektalem), nasalem, bukkalem, vaginalem oder urethralem Wege spricht.
Daher wurde versucht, die perkutane oder transmucosale Resorption von Arzneimitteln zu erhöhen, d.h. eine größere Menge der Substanz muss in einem bestimmten Zeitraum die Haut oder Schleimhaut durchdringen. Substanzen, die die Resorption oder den Transport von gering resorbierbaren Molekülen über biologische Membranen verstärken und somit die Bioverfügbarkeit dieser Moleküle verstärken, sind als Resorptionsverstärker bekannt (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 8, 91, 1991).
Resorptionsverstärker wurden Arzneimitteln zugegeben, um deren Resorption über die Haut oder Schleimhaut zu verstärken. Diese Verbindungen verstärken dabei die Geschwindigkeit der Permeation des Arzneimittels durch die Haut oder Schleimhaut.
Beispiele solcher Resorptionsverstärker sind Alkohole und Glykole ( US-A-5,296,222 ), Harnstoffderivate, Hyaluronsäuren, N,N-Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO), Terpene ( DE-A-10053383 ), Gallensäuresalze ( JP-A-59-130820 ), Chelatoren (Cassidy and Tidball, 7. Cell. Biol. 32, 685, 1967), Tenside ( JP-A-4-247034 , George et al., J. Infect. Dis. 136, 822, 1977), Salze von Fettsäuren ( US-PS 4,476,116 und 6,333,046 ), synthetische hydrophile und hydrophobe Verbindungen, biodegradierbare polymere Verbindungen und Glycyrrhizinsäuresalze ( JP-A-2-42027 ; US-A-6,333,046 ).
Verschiedene Mechanismen für die Wirkung von Resorptionsverstärkern wurden vorgeschlagen. Diese Wirkungsmechanismen umfassen zumindest für Protein- und Peptidarzneimittel (1) eine Verringerung der Viskosität und/oder Elastizität der Schleimhäute, (2) ein erleichterter transzellulärer Transport durch Erhöhung der Fluidität der Bilayer von Membranen und (3) eine Erhöhung der thermodynamischen Aktivität von Arzneimitteln (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 8, 91, 1991).
Jedoch befindet sich momentan kaum ein resorptionsverstärkendes Produkt auf dem Markt. Die Gründe dafür umfassen die geringe Wirksamkeit und Sicherheit bezüglich einer Reizung und Schädigung der Schleimhäute, der unangenehme Geschmack und Geruch, usw.
Es treten beispielsweise Probleme bezüglich des Verhältnisses zwischen der verstärkenden Wirkung und der Konzentration des Resorptionsverstärkers in der Zubereitung auf. Bei DMSO hängt der resorptionsverstärkende Effekt größtenteils von seiner Konzentration ab und man glaubt, dass es bei einer Konzentration von weniger als 50% fast unwirksam ist. Ferner zeigt es nachteilige Wirkungen auf die Augen und weist auch Nebenwirkungen betreffend die Haut auf. Die resorptionsverstärkende Wirkung von Harnstoffderivaten, Hyaluronsäuren, N,N-Dimethylformamid und Tensiden ist im Vergleich zu Dimethylsulfoxid gering.
Auch verstärken nicht alle Resorptionsverstärker die Resorption aller Arzneimittel. Der Resorptionsverstärker muss daher auf das jeweilige Arzneimittel abgestimmt sein.
Ferner reizen bekannte Resorptionsverstärker häufig die Mucosa oder sind aufgrund eines unangenehmen Geruchs oder Geschmacks ungeeignet, führen häufig schon nach einer einzigen Verabreichung zu Schmerz und Lakrimation oder führen zu einer Reizung und Entzündung der Mucosa nach mehreren Anwendungen. Dies trifft beispielsweise für Derivate von Fusidinsäure, Gallensäuren, Tenside und die verschiedenen Glykole (Polyethylenglykol, Polypropylenglykol) zu.
Weiterhin führen viele dieser Resorptionsverstärker zu einer Schädigung der resorbierenden Gewebe und es wurde sogar vermutet, dass eine Schädigung der Mucosa, die durch diese Stoffe verursacht wird, der Grund für eine verbesserte Resorption ist (LeCluyse and Sutton, Advanced Drug Delivery Reviews 23, 163, 1997).
Daher sind die bekannten Verstärker der transdermalen oder transmucosalen Resorption im Hinblick auf ihre Wirkung und die Sicherheit unzureichend.
Des weiteren sind aus dem Stand der Technik so genannte Transferosomen bekannt ( DE 41 07 152 , DE 41 07 153 und DE 44 47 287 ). Sie dienen der nicht-invasiven Verabreichung geeigneter Wirkstoffe durch die Haut. Transferosomen zeichnen sich gegenüber anderen für die topische Anwendung beschriebenen Liposomen durch eine verbesserte Penetrationsfähigkeit aus. Transferosomen sind in der Regel viel größer als herkömmliche mizellenartige Trägerformulierungen und unterliegen daher anderen Diffusionsgesetzen. Die gesteigerte Penetrationsfähigkeit wird durch ihre spezielle Zusammensetzung erreicht, die sie genügend elastisch (hyperflexibel) macht, um die Konstriktionen in der Barriere, z.B. in der Haut, überwinden zu können.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Resorptionsfähigkeit an sich schwer über die Haut und Schleimhaut resorbierbarer Substanzen zu verbessern, um so eine bessere Resorptionsquote für diese Substanzen bereitzustellen.
Dadurch soll eine nicht-invasive Anwendung von Substanzen ermöglicht werden, die normalerweise nicht oder nur schlecht von Haut oder Schleimhäuten resorbiert werden, ohne gleichzeitig einen großen technischen Aufwand und einen hohen Wirkstoffverbrauch in Kauf nehmen zu müssen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe dadurch, dass ein Mittel, das die Resorption einer Substanz durch die Haut oder Mucosa verstärkt, mit der Substanz gekoppelt wird und so eine höhere Bioverfügbarkeit für die Substanz bereitgestellt wird.
Die erfindungsgemäße Kombination einer Substanz und einem die Resorption verstärkenden Mittel ermöglicht überraschenderweise eine Verbesserung der Resorptionsquote und/oder Permeation von Substanzen über die Haut und Schleimhäute, die bislang als schlecht oder nicht resorbierbar betrachtet wurden.
Die verstärkende Wirkung (Enhancerwirkung) von Mitteln auf die Resorption von Substanzen über bzw. durch die Haut oder Schleimhäute macht Applikationsformen von therapeutischen oder diagnostischen Substanzen über die Haut und Mucosa wie die Nasenschleimhaut, die Mundschleimhaut, die Magendarmschleimhäute, die Vaginalschleimhaut oder auch die Harnleiterschleimhaut auch für bisher schlecht oder nicht resorbierbare Substanzen zugänglich.
Das die Resorption verstärkende Mittel bewirkt hier als Resorptionsenhancer eine höhere Bioverfügbarkeit der Substanz. Trotz der schlechten ursprünglichen Resorption und damit verbunden geringen Bioverfügbarkeit kann somit eine befriedigende Resorption mit allen therapeutischen Konsequenzen erzielt werden, die Dosierung des Stoffs kann gegebenenfalls auch gegenüber der herkömmlichen Dosierung gesenkt bzw. bei gleich bleibender Dosierung eine verbesserte Wirkung erzielt werden.
Die Erfindung betrifft somit in einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines perkutanen oder transmucosalen Präparats, umfassend die Kopplung einer Substanz mit mindestens einem Mittel, das die Resorption der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Verstärkung der Bioverfügbarkeit einer Substanz bei einer Applikation an die Haut oder Mucosa, umfassend die Kopplung der Substanz mit mindestens einem Mittel, das die Resorption der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verstärkung der Fähigkeit einer Substanz, bei einer Applikation an die Haut oder Mucosa von dieser resorbiert zu werden, umfassend die Kopplung der Substanz mit mindestens einem Mittel, das die Resorption der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der Permeationsfähigkeit einer Substanz für Haut oder Mucosa, umfassend die Kopplung der Substanz mit mindestens einem Mittel, das die Resorption der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Substanzen mit verstärkter Bioverfügbarkeit, verstärkter Fähigkeit von Haut oder Mucosa resorbiert zu werden und/oder verstärkter Permeationsfähigkeit und pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere dieser Substanzen.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Substanzen mit verstärkter Bioverfügbarkeit, verstärkter Fähigkeit von Haut oder Mucosa resorbiert zu werden und/oder verstärkter Permeationsfähigkeit und deren pharmazeutische Zusammensetzungen zur Applikation an die Haut oder Mucosa und zur Behandlung oder Diagnose von Erkrankungen, die mit diesen Substanzen ohne die erfindungsgemäße Veränderung gewöhnlich behandelt oder diagnostiziert werden.
Das resorptionsverstärkende Mittel kann erfindungsgemäß kovalent oder nicht kovalent mit einer Substanz verbunden sein. Vorzugsweise ist eine Bindung eine kovalente Bindung.
In einer Ausführungsform liegt zwischen der Substanz und dem resorptionsverstärkenden Mittel ein Linker. Vorzugsweise ist der Linker z.B. enzymatisch oder chemisch, insbesondere durch in vivo Prozesse spaltbar, so dass die Substanz von dem resorptionsverstärkenden Mittel getrennt werden kann. Der Linker enthält in einer Ausführungsform eine spaltbare Ester- oder Carbamatfunktionalität oder ein durch eine Proteinase wie eine im Serum auftretende Proteinase erkennbares Peptid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Substanz von dem resorptionsverstärkenden Mittel nach Resorption durch die Haut oder Mucosa getrennt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das resorptionsverstärkende Mittel ein Polypeptid oder Protein. Das Polypeptid oder Protein umfasst vorzugsweise eine von einem Virus abgeleitete Sequenz und insbesondere eine von einem Oberflächenprotein eines Virus abgeleitete Sequenz oder ein Derivat oder einen Teil davon. Der Ausdruck "Virus" umfasst DNA-und RNA-Viren, insbesondere Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Vacciniaviren, Baculoviren, Hepatitis C-Viren, Hepatitis A-Viren, Influenzaviren, Herpesviren und Hepadna-Viren. Beispiele letzterer sind HBV, WHV ("woodchuck hepatitis virus"), GSHV ("ground squirrel hepatitis virus"), RBSHV ("red-bellied squirrel hepatitis virus"),DHV ("Pekin duck hepatitis virus") und HHV ("heron hepatitis virus"). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid oder Protein eine von einem Hepatitis Virus, Hepadnavirus oder HN, insbesondere einem Hepatitis B Virus abgeleitete Sequenz, ein Derivat oder einen Teil davon. Vorzugsweise umfasst das Peptid oder Protein eine von Antennapedia-abgeleitete, eine von HIV tat abgeleitete oder eine von VP22 eines Herpesvirus abgeleitete Sequenz.
Das Polypeptid oder Protein, das als resorptionsverstärkendes Mittel fungiert, umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform eine Sequenz, die unter die folgende allgemeine Formel fällt: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12, worin X1, X6, X7, X9, X10 und X12 variabel sind, X2 und X5 hydraphobe Aminosäurereste und X3, X4, X8 und X11 hydrophile Aminosäurereste sind.
Aminosäureseitenketten mit geladenen Gruppen, Wasserstoffbrücken-bildenden Gruppen oder Dipolen können als hydrophil klassifiziert werden. Im Gegensatz dazu können neutrale organische Aminosäweseitenketten mit einem Kohlenwasserstoffcharakter, die keine signifikanten Dipole aufweisen und nicht die Fähigkeit besitzen, Wasserstoffbrücken zu bilden als hydrophil klassifiziert werden.
Die nachstehende Tabelle zeigt den Hydropathie-Index von Aminosäure-Seitenketten nach Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105, 1982:
Zu den hydrophoben Aminosäuren zählen erfindungsgemäß Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan, Phenylalanin und Methionin. Zu den hydrophilen Aminosäuren zählen erfindungsgemäß Glycin, Serin, Tyrosin, Threonin, Cystein, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin, Arginin, Histidin und Prolin. Ein variabler Aminosäurerest kann eine jegliche der vorstehend aufgeführten Aminosäuren sein.
In einer Ausführungsform umfasst das Polypeptid oder Protein, das als resorptionsverstärkendes Mittel fungiert, eine der nachstehend aufgeführten Aminosäuresequenzen oder eine hiervon abgeleitete Aminosäuresequenz:

(1) P-L-S-S-I-F-S-R-I-G-D-P;
(2) P-I-S-S-I-F-S-R-I-G-D-P;
(3) P-I-S-S-I-F-S-R-T-G-D-P;
(4) H-I-S-S-I-S-A-R-T-G-D-P;
(5) L-L-N-Q-L-A-G-R-M-I-P-K;
(6) T-I-D-H-V-L-D-H-V-Q-T-M;
(7) T-I-Q-H-V-M-D-H-I-D-S-V;
(8) T-L-S-P-V-V-P-T-V-S-T-I;
(9) T-L-S-P-V-V-P-T-V-S-T-T.

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid oder Protein, das als resorptionsverstärkendes Mittel fungiert, die Aminosäuresequenz:

(1) P-L-S-S-I-F-S-R-I-G-D-P

Die erfindungsgemäß beschriebenen Polypeptide oder Proteine, die als resorptionsverstärkende Mittel fungieren, können auch nicht . natürlich auftretende Aminosäuren wie D-Aminosäuren umfassen.
Falls die Substanz, mit der das Peptid oder Protein, das als resorptionsverstärkendes Mittel fungiert, gekoppelt werden soll ebenfalls ein Peptid oder Protein ist, kann das resorptionsverstärkende Polypeptid oder Protein am N- oder C-Terminus oder sowohl am N-, als auch am C-Terminus der zu koppelnden Substanz vorliegen. In dieser Ausführungsform kann das Konstrukt rekombinant dadurch hergestellt werden, das eine für das resorptionsverstärkende Polypeptid oder Protein kodierende Nukleinsäure mit der Nukleinsäure, die für die zu koppelnde Substanz kodiert, fusioniert wird und die fusionierte Sequenz z.B. in einer Zelle exprimiert wird.
Die Erfindung umfasst auch solche Nukleinsäuren und Derivate davon.
Erfindungsgemäß kann eine jegliche Substanz, anorganischer oder organischer Natur, mit einem Mittel gekoppelt werden, das die Resorption der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt. Die Substanz kann als solches resorbiert, schlecht resorbiert oder nicht resorbiert werden. Vorzugsweise handelt es sich bei der Substanz um einen pharmazeutischen Wirkstoff, dessen transdermale oder transmucosale Resorption verbessert werden kann. Der pharmazeutische Wirkstoff kann tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein, und ist bevorzugt eine Reinsubstanz tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, oder kann synthetischen Ursprungs sein.
Ein pharmazeutischer Wirkstoff kann erfindungsgemäß eine jede biologisch aktive Substanz umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Analgetika, Aminosäuren, Anorektika, Antibiotika, Antiallergika, Antiarrythmika, Anticholinergika, Antidepressiva, Antidiabetika, Antidots, Antiepileptika, antiinfektiöse Mittel, Antihistamine und Histamine, Antihypertonika, Antikoagulanzien, Antineoplastika, Antiphlogistika, Antipyretika, Antiseptika, Antitumormittel, Antitussiva (Asthmamittel), Antivirus- und Antikrebsmittel, Betablocker, Blutfaktoren, Branchodilatoren, Chemotherapeutika, cholesterinsenkende Mittel, diagnostische Mittel, Enzyme, Fibrinolytika, Gaba-Antagonisten, gastrointestinale Hormone und Derivate, Geschlechtshormone, Glutamat-Antagonisten, Glycin-Antagonisten, Hämatopoietika, Hormone, Hypophysenhormone und Derivate, Hypothalamushormone und Derivate davon, Kardiotonika, Kortikosteroide und Derivate davon, Lokalanästhetika, Mittel gegen Demenz, Narkotika, Nebennierenhormone, Pankreashormone und Derivate, Parasympathomimetika, Parasympatholytika, Prostaglandine, Psychopharmaka, Schilddrüsenhormone und Derivate, Sedativa, Spasmolytika, Sympathomimetika, therapeutische Mittel . für Osteoporose, Vaccinen, Vasokonstrikoren, Vasodilatoren und Vitamine und Ähnliches.
Der Wirkstoff kann auch eine Nukleinsäure oder "Antisense"-Nukleinsäure oder ein Derivat davon sein.
"Antisense"-Moleküle oder "Antisense"-Nukleinsäuren können zur Regulierung, insbesondere der Reduktion der Expression einer Nukleinsäure verwendet werden. Der Begriff "Antisense-Molekül" oder "Antisense-Nukleinsäure" betrifft erfindungsgemäß ein Oligonukleotid, das ein Oligoribonukleotid, Oligodesoxyribonukleotid, modifiziertes Oligoribonukleotid oder modifiziertes Oligodesoxyribonukleotid ist und das unter physiologischen Bedingungen an DNA, die ein bestimmtes Gen umfasst, oder mRNA dieses Gens hybridisiert, wodurch die Transkription dieses Gens und/oder die Translation dieser mRNA gehemmt wird. Ein "Antisense-Molekül" umfasst erfindungsgemäß auch ein Konstrukt, das eine Nukleinsäure oder einen Teil davon in reverser Orientierung in Bezug auf ihren natürlichen Promotor enthält. Ein Antisense-Transkript einer Nukleinsäure oder eines Teils davon kann eine Duplex mit der natürlich vorkommenden mRNA, die das Enzym spezifiziert, eingehen und so eine Akkumulation von oder die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindern.
In bevorzugten Ausführungsformen ist ein Oligonukleotid ein "modifiziertes" Oligonukleotid. Dabei kann das Oligonukleotid, um beispielsweise seine Stabilität oder therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen, auf verschiedenste Art und Weise modifiziert sein, ohne dass seine Fähigkeit, an sein Ziel zu binden, beeinträchtigt wird. Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" bedeutet erfindungsgemäß ein Oligonukleotid, bei dem (i) mindestens zwei seiner Nukleotide durch eine synthetische Internukleosidbindung (d.h. eine Internukleosidbindung, die keine Phosphodiesterbindung ist) miteinander verknüpft sind und/oder (ii) eine chemische Gruppe kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden ist, die normalerweise nicht bei Nukleinsäuren auftritt. Bevorzugte synthetische Internukleosidbindungen sind Phosphorothioate, Alkylphosphonate, Phosphorodithioate, Phosphatester, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, Carbamate, Carbonate, Phosphattriester, Acetamidate, Carboxymethylester und Peptide.
Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" umfasst auch Oligonukleotide mit einer kovalent modifizierten Base und/oder Zucker. "Modifizierte Oligonukleotide" umfassen beispielsweise Oligonukleotide mit Zuckerresten, die kovalent an organische Gruppen mit einem geringen Molekulargewicht gebunden sind, die keine Hydroxylgruppe an der 3'-Position und keine Phosphatgruppe an der 5'-Position sind. Modifizierte Oligonukleotide können beispielsweise einen 2'-O-alkylierten Riboserest oder einen anderen Zucker anstelle von Ribose wie Arabinose umfassen.
Der Wirkstoff kann auch ein Polypeptid oder Protein oder ein Derivat davon sein. Ferner kann er ein Konjugat aus mehreren Peptiden oder Proteinen sein, die chemisch oder genetisch miteinander gekoppelt wurden. Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide oder Proteine können aus einer natürlichen Quelle abgeleitet oder rekombinant oder chemisch synthetisierte Substanzen sein. Die erfindungsgemäß eingesetzten Polypeptide und Proteine sind vorzugsweise isoliert. Die Begriffe "isoliertes Protein" oder "isoliertes Polypeptid" bedeuten, dass das Protein oder Polypeptid von seiner natürlichen Umgebung getrennt ist. Ein isoliertes Protein oder Polypeptid kann in einem im wesentlichen aufgereinigten Zustand vorliegen. Der Begriff "im wesentlichen aufgereinigt" bedeutet, dass das Protein oder Polypeptid im wesentlichen frei von anderen Substanzen vorliegt, mit denen es in der Natur oder in vivo vorliegt.
Die Polypeptide oder Proteine, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, umfassen in nicht begrenzender Weise Antibiotika, Hämatopoietika, antiinfektiöse Mittel, Mittel gegen Demenz, Antivirusmittel, Antitumormittel, Antipyretika, Analgetika, Antiphlogistika, Antiallergika, Antidepressiva, Psychopharmaka, Kardiotonika, Antiarrythmika, Vasodilatoren, Antihypertonika, Antidiabetika, Antikoagulanzien, cholesterinsenkende Mittel, therapeutische Mittel für Osteoporose, Hormone, Vaccinen und Ähnliches.
Besonders bevorzugte Peptide oder Proteine umfassen Cytokine, Peptidhormone, Wachstumsfaktoren, Faktoren des kardiovaskulären Systems, Faktoren des zentralen und peripheren Nervensystems, Faktoren des Gastrointestinalsystems, Faktoren des Immunsystems und Enzyme.
Besonders bevorzugt sind Lymphokine, Monokine, hämatopoietische Faktoren und Ähnliches.
Lymphokine umfassen Interferone (z.B. α-, β- und γ-Interferon), Interleukine (z.B. Interleukin 2-11) und Ähnliches.
"Interferon" ist ein Begriff, der im Allgemeinen eine Gruppe von Glykoproteinen und Proteinen aus Vertebraten umfasst, die bekanntlich verschiedene biologische Aktivitäten wie antivirale, antiproliferative und immunmodulierende Aktivitäten aufweisen. Interferone sind sekretorische Proteine, die in zwei verschiedene Subtypen unterteilt werden können.
Zu den Typ I Interferonen zählen insbesondere die Mitglieder der Interferon-α-Multigenfamilie (es existieren ca. 14-20 verschiedene IFN-α-Moleküle), IFN-τ (auch Trophoblast-IFN genannt), sowie IFN-β und IFN-ω. Die Typ I IFN-Gene liegen als „cluster" auf dem kurzen Arm des Chromosoms 9.
Während IFN-α und IFN-ω bevorzugt von Zellen des hämatopoietischen Systems gebildet werden, wird IFN-β von nicht-hämatopoietischen Zellen, insbesondere Fibroblasten gebildet. Bei IFN-β handelt es sich um ein Glykoprotein (N-Glykosylierung), während die meisten humanen IFN-α-Subspecies keine N-Glykosylierung aufweisen. In der aktiven Form bilden IFN-α wie auch IFN-β Dimere.
Im Unterschied zu den Intron-freien IFN-Type I-Genen enthält das huIFN-γ-Gen drei Introns. IFN-γ gehört zu den Typ II Interferonen. Es handelt sich bei IFN-γ um ein Glykoprotein, das in der aktiven Form ebenfalls als Dimer vorliegt. IFN-γ wird insbesondere in CD4+ T-Helferzellen und in nahezu allen CD8+ Zellen gebildet. Trotz einer großen funktionellen Ähnlichkeit besteht keine strukturelle Ähnlichkeit zwischen Typ I und Typ II Interferonen.
Interferone sind wichtige Pharmazeutika zur Therapie von z.B, viralen Erkrankungen, Tumorerkrankungen und Immundefekten. Die systemische Applikation erfolgt in der Regel intravenös, subkutan oder intramuskulär. Darüber hinaus gibt es auch die lokale Applikationsformen (z.B. intratumorale Injektion). Neben der fehlenden Resorbierbarkeit schränkt im Falle von IFN-γ auch die teilweise Säurelabilität des Moleküls eine orale Anwendung ein.
Monokine umfassen erfindungsgemäß Interleukin-1, Tumornekrosefaktoren (z.B. TNF-α und -β), LIF und Ähnliches.
Hämatopoietische Faktoren umfassen erfindungsgemäß beispielsweise Erythropoietin, Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagenstimulierender Faktor (GM-CSF) und Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF).
Peptidhormone umfassen beispielsweise Insulin, Glucagon, Wachstumshormon, luteinisierendes Hormon-freisetzendes Hormon (LH-RH), Adrenokortikotropin (ACTH), Amylin, Oxitozin, luteinisierendes Hormon und Ähnliches.
Wachstumsfaktoren umfassen erfindungsgemäß beispielsweise Nervenwachstumsfaktor (NGF), Epidermiswachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF}, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Hämatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Ähnliches.
Faktoren des kardiovaskulären Systems sind beispielsweise Faktoren, die den Blutdruck, Arterosklerose und Ähnliches regulieren wie Endotheline, Endothelinhemmer, Endothelin-Antagonisten, Vasopressin, Renin, Angiotensin und Ähnliches.
Faktoren, des zentralen oder peripheren Nervensystems, sind beispielsweise Opioidpeptide (z.B. Enkephaline, Endorphine, Kytorphine), neutrotrophischer Faktor (NTF), Tyroidhormon-freisetzendes Hormon (TRH), Neurotensin und Ähnliches.
Faktoren des Gastrointestinalsystems sind beispielsweise Sekretin und Gastrin.
Faktoren des Immunsystems sind beispielsweise Faktoren, die Entzündungen und Neoplasmen steuern und Faktoren, die infektiöse Mikroorganismen angreifen, wie Antikörper, chemotaktische Peptide oder Bradykinine.
Ein Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein. In weiteren Ausführungsformen ist der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper, ein Fragment eines natürlichen Antikörpers, oder ein synthetischer Antikörper, die durch kombinatorische Techniken hergestellt werden können.
Die vorstehend beschriebenen Antikörper und andere Bindemoleküle können beispielsweise für die Identifizierung von Gewebe verwendet werden. Antikörper können auch an spezifische diagnostische Stoffe für eine Darstellung von Zellen und Geweben gekoppelt werden. Sie können ferner an therapeutisch nützliche Stoffe gekoppelt werden. Diagnostische Stoffe umfassen in nicht begrenzender Weise Bariumsulfat, Iocetaminsäure, Iopansäure, Calcium-Ipodat, Natrium-Diatrizoat, Meglumin-Diatrizoat, Metrizamid, Natrium-Tyropanoat und Radiodiagnostika, einschließlich Positronen-Emitter wie Fluorin-18 und Carbon-11, gamma-Emitter wie Iodin-123, Technetium-99-m, Iod-131 und Indium-111, Nuklide für magnetische Kernresonanz wie Fluorin und Gadolinium.
Der Begriff "therapeutisch nützlicher Stoff' meint erfindungsgemäß jedes therapeutisch verwendbare Molekül, einschließlich Antikrebsmittel, mit radioaktivem Iod versehene Verbindungen, Toxine, cytostatische oder cytolytische Arzneistoffe, usw. Antikrebsmittel umfassen beispielsweise Aminoglutethimid, Azathioprin, Bleomycinsulfat, Busulfan, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Cytarabidin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubin, Doxorubicin, Taxol, Etoposid, Fluoruracil, Interferon-α, Lomustin, Mercaptopurin, Methotrexat, Mitotan, Procarbazin-HCl, Thioguanin, Vinblastinsulfat und Vincristinsulfat. Weitere Antikrebsmittel sind beispielsweise in Goodman und Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", B. Auflage, 1990, McGraw-Hill, Inc., insbesondere Kapitel 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi und Bruce A. Chabner)) beschrieben. Toxine können Proteine wie Pokeweedantivirales Protein, Choleratoxin, Pertussistoxin, Ricin, Gelonin, Abrin, Diphtherie-Exotoxin oder Pseudomonas-Exotoxin sein. Toxinreste können auch Hochenergieemittierende Radionuklide wie Kobalt-60 sein.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Mittel, das die Resorption einer Substanz durch die Haut oder Mucosa verstärkt, mit einem Partikel, vorzugsweise einem von einem Virus abgeleiteten Partikel (Virus-ähnliches Partikel), das vorzugsweise gezielt an Zellen binden und in diese eine Nukleinsäure einbringen kann, gekoppelt oder damit beladen. Das Partikel enthält eine Substanz wie vorstehend beschrieben, insbesondere eine Nukleinsäure oder ein Peptid oder Protein, die von der Haut oder Mucosa resorbiert werden soll. Solche Partikel sind beispielsweise in der WO-A-00/46376 beschrieben. Die Partikel umfassen vorzugsweise: (a) eine Proteinhülle, die vorzugsweise als Fusionsmolekül ein virales Protein, ein resorptionsverstärkendes Mittel, vorzugsweise ein Peptid oder Protein, und gegebenenfalls eine heterologe zellspezifische Bindungsstelle umfasst, und (b) eine in der Proteinhülle vorliegende Nukleinsäure, die Sequenzen für ein Virus-spezifisches Verpackungssignal und ein Struktur-Gen aufweist. Der Ausdruck "Virus" umfasst DNA- und RNA-Viren, insbesondere Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Vacciniaviren, Baculoviren, Hepatitis C-Viren, Hepatitis A-Viren, Influenzaviren und Hepadna-Viren. Beispiele letzterer sind HBV, WHV ("woodchuck hepatitis virus"), GSHV ("ground squirrel hepatitis virus"), RBSHV ("red-bellied squirrel hepatitis virus"), DHV ("Pekin duck hepatitis virus") und HHV ("heron hepatitis virus"), wobei HBV bevorzugt ist. Der Ausdruck "Strukturgen" umfasst jedes Gen, das für ein Polypeptid oder Protein kodiert, wie die vorstehend beschriebenen Polypeptide und Proteine.
Ein erfindungsgemäßes Partikel kann durch übliche Verfahren hergestellt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Unter dem Begriff Resorption wird erfindungsgemäß die Aufnahme von Stoffen von der Körperoberfläche verstanden. Die Resorption umfasst insbesondere eine Resorption über die Haut (d.h. transdermal, perkutan) oder über Mucosa (Schleimhaut) (d.h. transmucosal) vorzugsweise in Blut- oder Lymphbahnen, von wo aus die Verteilung in den gesamten Organismus erfolgen kann. Die Resorption kann über den passiven Mechanismus der Diffusion aber auch über aktive Transportmechanismen erfolgen.
Der Begriff "Verstärkung" betrifft eine Erhöhung, Steigerung oder Verbesserung gegenüber einem vorherigen Zustand. So betrifft zum Beispiel der Begriff "Verstärkung der Resorption" eine Erhöhung der Resorption, d.h. eine größere Menge eines Stoffs wird in einem bestimmten Zeitraum resorbiert, insbesondere dadurch, dass die Geschwindigkeit, bei der ein Stoff eine Körperbarriere wie Haut und Schleimhaut durchdringt, erhöht wird.
Dies kann den Fall betreffen, dass ein Stoff ursprünglich nicht in der Lage war, resorbiert zu werden, und der Stoff nach der "Verstärkung der Resorption" in der Lage ist, resorbiert zu werden. Es kann auch den Fall betreffen, dass ein Stoff ursprünglich schon resorbiert werden konnte, jedoch die Fähigkeit des Stoffs, resorbiert zu werden, nach der "Verstärkung der Resorption" gesteigert ist.
Der Begriff "Substanz, die schlecht resorbiert wird" bedeutet, dass die Substanz nicht oder nur gering resorbiert wird und somit bei einer gewöhnlichen Dosismenge keine therapeutisch wirksame Konzentration bereitstellt.
Die Begriffe "Verstärkung der Bioverfügbarkeit" und "Verstärkung der Permeabilität" sind in entsprechender Weise auszulegen.
Der Begriff "Permeabilität" betrifft die Eigenschaft, z.B. von Haut und Schleimhaut, einen Stoff durchtreten zu lassen. Der Begriff "Permeationsfähigkeit" betrifft die Fähigkeit einer Substanz, eine solche Barriere zu durchtreten.
"Transdermales oder transmucosales Präparat" bezeichnet erfindungsgemäß eine Substanz, insbesondere einen pharmazeutischen Wirkstoff, die ursprünglich nicht oder schlecht von Haut oder Mucosa resorbiert wurde, jedoch so verändert wurde, dass sie von der Haut oder Mucosa resorbiert wird und daher für eine Verabreichung an die Haut oder Mucosa geeignet ist.
"Mucosa" oder "Schleimhaut" kann erfindungsgemäß eine jegliche Schleimhaut eines Säugers sein.
Beispiele von Schleimhäuten umfassen erfindungsgemäß die Schleimhaut des Gastrointestinaltrakts (z.B. Darmschleimhaut, Magenschleimhaut), Augenschleimhaut, Nasenschleimhaut, Tracheal-/Bronchial-/Lungenschleimhaut, Schleimhaut der Mundhöhle, des Rektums, des Genitaltrakts, der Vagina, des Harnleiters und Ähnliches.
Vorzugsweise ist die Schleimhaut eine Schleimhaut der Nase, des Mundes oder des Gastrointestinaltrakts.
"Transdermale Verabreichung" oder "transmucosale Verabreichung" bedeutet eine Bereitstellung über die Haut oder Mucosa.
Resorptionsverstärker im Sinne der vorliegenden Erfindung sind solche Stoffe oder Präparate, welche den Transport anderer Stoffe über Barrieren und Konstriktionen, insbesondere Permeationshindernisse fördern. Zu den Permeationshindernissen zählen insbesondere menschliche und tierische Hautschichten, insbesondere Dermis und Mucosa.
Eine Nukleinsäure ist erfindungsgemäß vorzugsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA). Nukleinsäuren umfassen erfindungsgemäß genomische DNA, cDNA, mRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte Moleküle. Eine Nukleinsäure kann erfindungsgemäß als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen.
Mit "Derivat" einer Nukleinsäure ist erfindungsgemäß gemeint, dass einzelne oder multiple Nukleotidsubstitution, -deletion und/oder -addition in der Nukleinsäure vorliegen. Weiterhin umfasst der Begriff "Derivat" auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Nukleotidbase, am Zucker oder am Phosphat. Der Begriff "Derivat" umfasst auch Nukleinsäuren, die nicht in der Natur vorkommende Nukleotide und Nukleotidanaloga enthalten.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Nukleinsäuren sind vorzugsweise isoliert. Der Begriff "isolierte Nukleinsäure" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifiziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung produziert wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gelelektrophoretische Auftrennung, oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die füir eine Manipulierung durch rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung steht.
Der Begriff "Expression" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Protein. Er umfasst auch eine teilweise Expression von Nukleinsäuren. Des weiteren kann die Expression transient oder stabil erfolgen..
Der Begriff "von einer Aminosäuresequenz abgeleitete Sequenz" betrifft erfindungsgemäß Derivate der ersteren Sequenz.
"Derivate" eines Proteins oder Polypeptids oder einer Aminosäuresequenz im Sinne dieser Erfindung umfassen Aminosäure-Insertionsvarianten, Aminosäure-Deeetionsvaranten und/oder Aminosäure-Substitutionsvarianten.
Aminosäure-Insertionsvarianten umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in einer bestimmten Aminosäuresequenz. Bei Aminosäure-Sequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einer Aminosäuresequenz eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Aminosäure-Deletionsvarianten sind durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure-Substitutionsvarianten zeichnen sich dadurch aus, dass wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt wird. Vorzugsweise befinden sich die Modifikationen an Positionen in der Aminosäuresequenz, die zwischen homologen Proteinen oder Polypeptiden nicht konserviert sind. Vorzugsweise werden Aminosäuren durch andere mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, Volumen der Seitenkette und ähnliches (konservative Substitution). Konservative Substitutionen betreffen beispielsweise den Austausch einer Aminosäure durch eine andere, nachstehend in derselben Gruppe wie die substituierte Aminosäure aufgeführte Aminosäure:

1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, Glu, Gln
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys
4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.

Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.
Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch "Solid Phase Synthesis" (Merrifield, 1964) und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulation hergestellt werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA einzubringen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und umfassen z.B. M13-Mutagenese. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben.
"Derivate" von Proteinen oder Polypeptiden umfassen erfindungsgemäß auch einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Enzym assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide.
Ferner erstreckt sich der Begriff "Derivat" auch auf alle funktionellen chemischen Äquivalente der Proteine oder Polypeptide.
Ein Teil oder Fragment eines Polypeptids oder Proteins weist erfindungsgemäß eine funktionelle Eigenschaft des Polypeptids oder Proteins auf, aus dem es abgeleitet ist. Solche funktionellen Eigenschaften umfassen die Interaktion mit anderen Molekülen wie Antikörpern, Polypeptiden oder Proteinen, die selektive Bindung von Nukleinsäuren und eine enzymatische Aktivität. Vorzugsweise umfasst ein Teil oder Fragment eines Peptids oder Proteins erfindungsgemäß eine Sequenz von mindestens 6, insbesondere mindestens 8, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30 oder mindestens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus dem Peptid oder Protein.
Die Begriffe "pharmazeutischer Wirkstoff', "pharmazeutisch wirksame Substanz" oder "pharmazeutisch wirksam" betreffen erfindungsgemäß jedes in der Therapie oder Diagnose einsetzbare Mittel. Das Mittel ist insbesondere jedes therapeutische oder prophylaktische Mittel, das bei der Behandlung (einschließlich Prävention, Linderung oder Heilung) einer Erkrankung, von Beschwerden oder einer Verletzung eines Patienten eingesetzt werden kann und die gewünschte biologische oder pharmakologische Wirkung aufweist.
Der pharmazeutische Wirkstoff kann auch ein Arzneimittelvorläufer sein, der vor, während oder nach einer Penetration des Wirkstoffs durch die Haut oder Mucosa aktivierbar ist.
Der Begriff "Arzneimittelvorläufer" betrifft ein Mittel, das inaktiv ist, jedoch in eine aktive Form über eine enzymatische, chemische oder physikalische Aktivierung umwandelbar ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und enthalten gewöhnlich geeignete pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und Trägerstoffe.
Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" betrifft einen Stoff, der keine signifikante Reizung oder Toxizität bei dem behandelten Patienten hervorruft und die biologische Aktivität und Eigenschaften des wirksamen Bestandteils nicht aushebt oder damit wechselwirkt. Der Begriff "Trägerstoff" betrifft erfindungsgemäß einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Kapselsubstanzen, die für eine Verabreichung an einen Menschen geeignet sind. Der Begriff "Träger" betrifft einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlicher oder synthetischer Natur, in dem der aktive Bestandteil kombiniert wird, um eine Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind gewöhnlich derart, dass keine Interaktion auftritt, die die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt.
Beispiele für Hilfs- und Trägerstoffe sind Acryl- und Methacrylderivate, Alginsäure, Sorbinsäurederivate wie Alpha-octadecyl-omegahydroxypoly-(oxyethylen)-5-sorbinsäure, Aminosäuren und deren Derivate, insbesondere Aminverbindungen wie Cholin, Lecithin und Phosphatidylcholin, Gummi arabicum, Aromastoffe, Ascorbinsäure, Carbonate wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calciumcarbonat und – hydrogencarbonat, Hydrogenphosphate und Phosphate von Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium, Carmellosenatrium, Dimeticon, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, Verdickungsmittel, Weichmacher, Gelatine, Glucosesirupe, hochdisperses Siliziumdioxid, Hydromellose, Benzoate, insbesondere Natrium- und Kaliumbenzoat, Macrogol, Magnesiumoxid, Fettsäuren und deren Derivate und Salze wie Stearinsäure und Stearate, insbesondere Magnesium- und Calciumstearat, Fettsäureester sowie Mono- und Diglyceride von Speisefettsäuren, natürliche und künstliche Wachse wie Bienenwachs, gelbes Wachs und Montanglycolwachs, Chloride, insbesondere Natriumchlorid, Polyvidon, Polyethylenglykole, Polyvinylpyrrolidon, Povidon, Öle wie Rizinusöl, Sojaöl, Cocosnussöl, Palmkernöl, Zucker und Zuckerderivate, insbesondere Mono- und Disaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Lactose, Maltose, Xylose, Saccharose, Dextrose und Cellulose und deren Derivate, Schellack, Stärke und Stärkederivate, insbesondere Maisstärke, Talkum, Titandioxid, Weinsäure, Zuckeralkohole wie Mannit, Sorbit und Xylit und deren Derivate, und Mischungen derselben.
Da eine Vielzahl proteolytischer Enzyme in der Mucosa und in ihrer Umgebung auftritt, kann ein Protease-Inhibitor in die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingebaut werden_; um einen Abbau eines Peptid- oder Proteinwirkstoffs zu vermeiden und dadurch die Bioverfügbarkeit zu erhöhen. Beispiele für Protease-Inhibitoren umfassen in nichtbegrenzender Weise Aprotinin, Leupepsin, Pepstatin, α2-Makroglobulin und Trypsin-Inhibitor. Diese Inhibitoren können alleine oder in Kombination verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können mit einer oder mehreren Beschichtungen versehen sein. Vorzugsweise sind die festen oralen Darreichungsformen mit einer magensaftresistenten Beschichtung versehen oder liegen in Form einer magensaftresistenten, gehärteten Weichgelatinekapsel vor.
Die Dosierungsformen können Materialien umfassen, die die pharmazeutisch wirksame Substanz in einem spezifischen Abschnitt des Gastrointestinaltrakts freisetzen, wodurch eine stellengerichtete Bereitstellung verstärkt wird.
Die hier beschriebenen Zusammensetzungen können auch als Formulierung mit einer verzögerten Freisetzung verabreicht werden (d.h. eine Formulierung, die eine langsame Freisetzung des Arzneimittels nach einer Verabreichung bewirkt). Solche Formulierungen mit verzögerter Freisetzung sind bekannt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können erfindungsgemäß für eine Verabreichung auf irgendeinem transdermalen oder transmucoslen Weg formuliert sein, einschließlich z.B. für eine topische, orale, enterale, intrakraniale, sublinguale, nasale, buccale, vaginale oder urethrale Verabreichung. Besonders bevorzugt sind enterale, noch stärker bevorzugt orale Darreichungsformen, insbesondere magensaftresistente Formulierungen und retardierte Formulierungen oraler Formen. Möglich sind aber auch rektale Arzneiformen wie Zäpfchen, vaginale Arzneiformen wie Suppositorien, sowie nasal anwendbare Zubereitungen wie Nasensprays.
Die pharmazeutischen Formulierungen liegen beispielsweise in Form von Tabletten, Suppositorien, Pastillen, Dragees, Tropfen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Gelen, Filmen, Säften, Sirupen, Nasensprays, Vaginalzäpfchen oder -tabletten, Kapseln,. Granulaten, Pellets, Mikrotabletten, Pulvern, Rektalzäpfchen, Rektalkapseln, Aerosolen oder Sprays vor. Besonders bevorzugt sind Hart- oder Weichgelatinekapseln, gegebenenfalls mit magensaftresistenter Beschichtung, ganz besonders bevorzugt sind gehärtete Weichgelatinekapseln.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann erfindungsgemäß eine indirekte Dosisform sein wie eine orale Formulierung für eine Verabreichung an die Magen- oder Darmschleimhaut. Die Zusammensetzung kann jedoch auch direkt an eine Schleimhaut verabreicht werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind erfindungsgemäß vorzugsweise oral verabreichbare Medikamente für eine Resorption im Gastrointestinaltrakt.
Der Begriff "Patient" bedeutet erfindungsgemäß Mensch, nicht menschlicher Primat oder ein anderes Tier, insbesondere Säugetier wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze oder Nagetier wie Maus und Ratte. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Patient ein Mensch.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind vorzugsweise steril und werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine "wirksame Menge" betrifft die Menge, die alleine oder zusammen mit weiteren Dosen eine gewünschte Reaktion oder eine gewünschte physiologische Wirkung erzielt. Im Fall einer Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder eines bestimmten Zustands betrifft die gewünschte Reaktion die Hemmung des Krankheitsverlaufs. Dies umfasst die Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung und insbesondere eine Unterbrechung des Fortschreitens der Erkrankung. Die gewünschte Reaktion bei einer Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands kann auch die Verzögerung des Ausbruchs oder eine Verhinderung des Ausbruchs der Krankheit oder des Zustands sein.
Die wirksame Menge kann gemäß der Aktivität des spezifischen pharmazeutischen Wirkstoffs und seiner therapeutisch wirksamen Dosis ausgewählt werden. Jedoch ist bevorzugt, eine etwas größere Menge als die gewünschte Dosis einzubauen, da die Bioverfügbarkeit einer jeglichen aktiven Substanz niemals 100% betragen kann, d.h. die verabreichte Dosis wird nicht vollständig resorbiert. Beispielsweise werden physiologisch aktive Peptide oder Proteine durch Verdauungssäfte im Gastrointestinaltrakt abgebaut oder durch Enzyme im Gastrointestinaltrakt hydrolysiert.
Eine wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung wird auch durch Faktoren wie dem zu behandelnden Zustand des Patienten, der Schwere der Erkrankung, den individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, physiologischer Zustand, Größe und Gewicht, der Dauer der Behandlung, der Art einer begleitenden Therapie (falls vorhanden), dem spezifischen Verabreichungsweg, dem gewünschten Verabreichungszeitraum und ähnlichen Faktoren abhängen.
Für den Fall, dass eine Reaktion bei einem Patienten bei einer anfänglichen Dosis unzureichend ist, können höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen, die durch einen anderen, stärker lokalisierten Verabreichungsweg erzielt werden) eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele ausführlich beschrieben, die ausschließlich der Erläuterung dienen und nicht begrenzend zu verstehen sind. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls erfindungsgemäß umfasst sind.
Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung und Verwendung von Proteinexpressionskonstrukten
a. Klonierung
Es wurden pQe8-Expressionsvektoren hergestellt, die für IFN-β in Fusion mit der Sequenz P-L-S-S-I-F-S-R-I-G-D-P (TLM) am 5'- bzw. 3'-Ende kodierten. Für Kontrollexperimente wurden die entsprechenden Konstrukte ohne TLM hergestellt. Die Identität dieser Konstrukte wurde durch Sequenzierung sichergestellt. Ausgehend von dem Konstrukt pCI-effNb.mv das eine huIFN-β spezifische cDNA enthält, wurden mittels PCR cDNAs amplifiziert, die für IFN-β-spezifische Fusionsproteine kodieren, welche N- oder C-terminal die TLM-Sequenz umfassen. Die fw-Primer wiesen an ihrem 5'-Ende eine BamHI-spezifische Schnittstelle und am 3'-Ende eine HindIII-spezifische Schnittstelle auf. Im Einzelnen wurden folgende Primer verwendet:

A) ggg aag ctt tca agg gtc ccc aat cct cga gaa gat tga cga taa ggg gtt tcg gag gta acc tgt aag
B) ggg aag ctt tca gtt tcg gag gta acc tgt
C) ggg gga tcc atg agc tac aac ttg ctt gga
sD) ggg gga tcc ccc tta tcg tca atc ttc tcg agg att ggg gac cct atg agc tac aac ttg ctt gga

Durch Kombination der Primer D/B wurde eine cDNA amplifiziert, welche die für das TLM kodierende Sequenz am 5'-Ende beinhaltet. Durch Kombination der Primer C/A wurde eine Sequenz amplifiziert, welche die TLM-spezifische Sequenz am 3'-Ende beinhaltet.
Für Kontrollexperimente wurde die IFN-β-spezische cDNA ohne 5'- oder 3'-spezifische Extensionen durch Kombination der Primer C/B amplifiziert.
Die jeweiligen PCR-Produkte wurden mittels "PCR-purification spin colums" gemäß den Anweisungen des Herstellers (Quiagen) gereinigt, BamHI/HindIII gespalten und erneut gereinigt. Die so restringierten Fragmente wurden in den BamHI/HindIII gespaltenen und dephosphorylierten bakteriellen Expressionsvector pQe8 (Quiagen) ligiert. Der Vektor pQe8 enthält die für einen aminoterminalen hexa-His-Tag kodierende Sequenz, so dass sämtliche IFN-β-spezifischen Proteine als hexa-His-Fusionsproeine gebildet wurden.
Der Ligationsansatz wurde zur Transformation kompetenter Bakterien (DHSα) verwendet. Die auf dem Plasmid pQe8 kodierte Amp-Resistenz erlaubte eine Selektion auf Amp-haltigen Medien.
Aus den unter diesen Bedingungen wachsenden Klonen wurde Plasmid-DNA isoliert und mittels BamHI/HindIII-Restriktion analysiert. Positive Klone wurden anschließend mittels Sequenzierung charakterisiert.
b. Expression
Die Induktion der Bildung IFN-β-spezifischer Fusionsproteine erfolgte wie folgt: 900 ml Amp-haltiges LB-Medium (c_AmP 100mg/l) wurden mit 100 ml einer stationär gewachsenen Vorkultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0.8 vermehrt. Die Induktion der Genexpression erfolgte durch Zusatz von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM (Die Expression von Genen, die in pQe8 inseriert sind, erfolgt unter der Kontrolle des lac-Repressors). Das Abernten erfolgte 2-3h nach Beginn der Induktion.
Beispiel 2: Proteinisolierung
Das in PBS zweifach gewaschene Bakterienpellet wurde in 50 mM NaH₂PO₄/300 mM NaCl/8 mM Imidazol, pH 8.0 resuspendiert (native Aufreinigung) und die Bakterien mittels Ultraschall aufgeschlossen. Nicht-aufgeschlossene Bakterien, sowie Bakterientrümmer wurden durch Zentrifugation sedimentiert.
Der Überstand wurde auf eine mit 50 mMNaH₂PO₄/300 mM NaCl/8 mM Imidazol, pH 8.0 äquilibrierte Ni-NTA-Agarose-Säule geladen (Ni-NTA-Agarose ermöglicht die affinitätschromatographische Aufreinigung hexa-His-getagter Proteine). Das Beladen der Säule erfolgte bei einer Flussrate von 1 ml/min.
Nach dem Beladen der Säule und dem Auswaschen ungebundener Proteine erfolgte die Elution schwach gebundener Proteine mittels eines Puffers mit 50 mMNaH₂PO₄/300 mM NaCl/20mM Imidazol, pH 8.0. Die Elution der spezifisch gebundenen hexa-His-getagten IFN-β Fusionsproteine erfolgte durch einen linearen Gradienten zwischen einem Puffer mit 50 mM NaH₂PO₄/300 mM NaCl/20 mM Imidazol, pH 8.0 und einem Puffer mit 50 mM NaH₂PO₄/300 mM NaCl/250 mM Imidazol, pH 8.0. Die Detektion eluierter Proteine erfolgte durch simultane Detektion der Absorption bei 215, 260 und 280 nm. Das Eluat wurde in Fraktionen zu 1 ml gesammelt.
Die Isolierung erfolgte unter Verwendung eines AEKTA-Explorer- bzw. AEKTA-Purifier-Systems.
Zur weiteren Reinigung wurde in Einzelfällen unter Verwendung einer RP18-Säule noch eine "reversed phase"-Chromatographie durchgeführt. Dazu wurde das Eluat der Ni-NTA-Säule 1:5 mit dem Laufpuffer der RP-Säule (0.1% TFA in H₂O) verdünnt und auf die Säule geladen. Die Elution erfolgte mittels eines linearen Gradienten zwischen 0.1/TFA in H₂O und 80% Acetontril/H₂O.
Analyse der Proteine:
Die Reinheit der so isolierten Proteine wurde mittels SDS-PAGE nach Laemmli analysiert. Die Gele wurden mittels Coomassie gefärbt oder einer Silberfärbung (nach Heukeshoven/Dernick) unterzogen.
Die Identität der nachgewiesenen Proteinbanden mit IFN-β wurde mittels Western-Blottings nachgewiesen. Der Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran erfolgte mittels Elektroblottings nach dem semi-dry-Verfahren (Kyshe/Andersen). Zur Markierung des transferierten IFN-β-spezifischen Proteins diente ein IFN-β-spezifisches Schafserum. Der Nachweis erfolgte fluorographisch mittels eines Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpers unter Verwednung des ECL-Systems (Amersham).
Es konnte so mit über 95% Reinheit IFN-β bzw. TLM-IFN-β isoliert werden. Die Ausbeute lag bei ca. 400-700 μg pro Liter.
Durch reversed phase-Chromatographie konnte TLM-IFN-β von über 98% Reinheit isoliert werden.
Beispiel 3: Nachweis der Zellpermeabilität
a. Zellfraktionierung
Die humane Hepatomzelllinie huH7 wurde 30 min in Gegenwart von 0.5 μM IFN-β-spezifischer Proteine in Medium inkubiert. Zum Entfernen Oberflächen-gebundener IfNs wurden die Zellen nach dem Entfernen des Mediums für 5 sec mit Na₂CO₃/NaHCO₃-Puffer, pH 9.5 gewaschen und anschließend in PBS gewaschen. Nach dem Abschaben wurden die Zellen mittels eines Potter-Homogenisators schonend aufgeschlossen. Nach dem Abtrennen nicht-aufgeschlossener Zellen und der Zellkerne durch 30 sec. Zentrifugation bei 13 krpm in einer Eppendorf-Zentrifuge wurde das Lysat einer differentiellen Zentrifugation unterzogen. Durch Ultra-Zentrifugation bei 100.000 rpm (430.000g) für 18 min konnte das Cytosol sowie die microsomale Fraktion isoliert werden. Die so isolierten Zellfraktionen wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend mittels Western-Blottings unter Verwendung des IFN-β-spezifischen Serums analysiert.
Die Western-Blotting-Analyse der subzellulären Fraktionierung zeigte, dass nur TLM-IFN-β, nicht jedoch wt-IFN im Cytosol nachweisbar ist. Der Nachweis von extrazellulär zugegebenem TLM-IFN im Cytosol bestätigt die Zellpermeabilität und unterstreicht, dass die Aufnahme nicht über einen Endosomen-assoziierten Weg erfolgt ist.
b. Immunfluoreszenzmikroskopie
Die humane Hepatomzelllinie huH7 sowie COS-Zellen (Hamster) wurden für 30 min in Gegenwart von 0.5 μM IFN-β-spezifischer Proteine im Medium inkubiert. Zum Entfernen Oberflächen-gebundener IFNs wurden die Zellen nach dem Entfernen des Mediums 5 sec mit Na₂CO₃/NaHCO₃-Puffer, pH 9.5 und anschließend in PBS gewaschen. Die Fixierung der gewaschenen Zellen erfolgte für 10 min in eiskaltem Ethanol/DAPI (zur Färbung des Zellkerns).
Nach der Fixierung erfolgte die Rehydratisierung für 30 min in PBST. Die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen erfolgte mittels 10% BSA. Zur Markierung des IFN-β diente huIFN-β-spezifisches Schafserum. Der Nachweis erfolgte durch einen Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper. Zur Auswertung wurde ein Leica Fluoreszenzmikroskop verwendet.
Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte, dass im Unterschied zum wtIfN, das nur ein sehr schwaches Hintergrundsignal ergab, TLM-ffN-β gut in den huH7-, wie auch in den COS-Zellen nachweisbar ist. Es ist in nahezu allen Zellen nachweisbar. TLM-IFN-β ist homogen über die Zelle verteilt, eine spezifische Anreicherung in einzelnen subzellulären Kompartimenten ist nicht zu beobachten.
Beispiel 4: Nachweis der oralen Verfügbarkeit durch Fütterungsversuche
B6-Mäuse wurden über Nacht ohne Futter gehalten. Am nachfolgenden Morgen bekamen die Tiere einen gewogenen Futterpressling, der mit IFN-β-spezifischer Proteinlösung durchtränkt war. Durch Wiegen des Presslings nach dem Ende des Fütterungsversuchs konnte auf die Menge des oral aufgenommenen IFNs rückgeschlossen werden. Die Tiere wurden mittels CO₂ getötet und das Blut mittels Herzpunktion als EDTA-Blut entnommen. Nach dem Abtrennen zellulärer Bestandteile wurde das Serum mittels Western-Blottings bzw. eines huIFN-β-spezifischen ELISAs analysiert.
Die Elisa-Werte wurden auf die aufgenommene IFN-β-Menge (Futtermenge) normiert und in Relation zum c/o-Wert gesetzt. Der c/o Wert wurde auf 1 gesetzt.
Es ergaben sich folgende Werte bei den Tieren, an die TLM-IFN-β verfüttert wurde (Tiere 1-4) und bei den Tieren, die wtIfN erhielten (Tiere 5-7):
Diese Ergebnisse zeigen, dass oral verabreichtes TLM-IFN deutlich im Serum nachweisbar war, während oral verabreichtes wtIFN nur in geringen Mengen nachgewiesen wurde.

Claims

Verfahren zur Verstärkung der Fähigkeit einer Substanz, bei einer Applikation an die Haut oder Mucosa von dieser resorbiert zu werden, umfassend die Kopplung der Substanz mit mindestens einem Mittel, das die Resorption der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bioverfügbarkeit der Substanz bei einer Applikation an die Haut oder Mucosa durch das Verfahren erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel, das die Resorption der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt, die Resorptionsquote und/oder Permeationsfähigkeit der Substanz durch Haut oder Mucosa verstärkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das resorptionsverstärkende Mittel kovalent mit der Substanz gekoppelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das resorptionsverstärkende Mittel ein Polypeptid oder Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid oder Protein die Sequenz: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 umfasst, worin X1, X6, X7, X9, X10 und X12 variabel sind, X2 und X5 hydrophobe Aminosäurereste und X3, X4, X8 und X11 hydrophile Aminosäurereste sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid oder Protein die Sequenz P-L-S-S-I-F-S-R-I-G-D-P umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei die Substanz, die mit dem resorptionsverstärkenden Mittel gekoppelt wird, ein Polypeptid oder Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Substanz, die mit dem resorptionsverstärkenden Mittel gekoppelt wird, ein Interferon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei die Substanz, die mit dem resorptionsverstärkenden Mittel gekoppelt wird, ein Virus oder Virus-ähnliches Partikel ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei die Mucosa eine Mucosa des Gastrointestinaltrakts (z.B. Darmschleimhaut, Magenschleimhaut), Augenschleimhaut, Nasenschleimhaut, Tracheal-Bronchial-/Lungenschleimhaut, Schleimhaut der Mundhöhle, des Rektums, des Genitaltrakts oder der Vagina ist.
Transdermales oder transmucosales Präparat, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein transdermales oder transmucosales Präparat nach Anspruch 12 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie für eine orale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung eines transdermalen oder transmucosalen Präparats nach Anspruch 12 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 zur Applikation an die Haut oder Mucosa.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Mucosa eine Mucosa des Gastrointestinaltrakts (z.B. Darmschleimhaut, Magenschleimhaut), Augenschleimhaut, Nasenschleimhaut, Tracheal-/Bronchial-/Lungenschleimhaut, Schleimhaut der Mundhöhle, des Rektums, des Genitaltrakts oder der Vagina ist.